Флуоресцентная время-разрешенная микроскопия с применением флуорогенных красителей арилиден-азолонового ряда тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Гильванов Айдар Римович

• Гильванов Айдар Римович
• кандидат наук
• 2026

Оглавление диссертации кандидат наук Гильванов Айдар Римович

Введение

1 Обзор литературы

1.1 Явление флуоресценции и флуоресцентная микроскопия

1.1.1 Явление флуоресценции

1.1.2 Флуоресцентная микроскопия

1.2 Химические флуоресцентные метки

1.2.1 Сольватохромные и флуорогенные красители

1.2.2 Арилиден-азолоны: структура, свойства и биологические приложения

1.3 Генетически кодируемые флуоресцентные метки

1.3.1 Белки

1.3.2 Прочие генетически кодируемые метки

1.4 Флуороген-активирующий белок FAST: варианты, лиганды и особенности применения

1.5 Флуоресцентная время-разрешенная микроскопия

1.5.1 Подходы к определению времени жизни флуоресценции

1.5.2 Основные подходы к обработке данных

1.5.3 Особенности применения FLIM

2 Материалы и методы

2.1 Молекулярно-биологические и биохимические методы

2.1.1 Генетические конструкции

2.1.2 Трансформация химически компетентных клеток E. Coli

2.1.3 Анализ бактериальных колоний методом ПЦР

2.1.4 Выделение плазмидной ДНК из культуры клеток E. Coli

2.1.5 Получение очищенных препаратов белков

2.2 Работа с культурами эукариотических клеток

2.2.1 Поддержание клеточной линии HeLa Kyoto

2.2.2 Транзиентная трансфекция клеток HeLa Kyoto

2.3 Определение свойств «сенсоров полярности» и их применение во FLIM

2.3.1 «Сенсоры полярности»

2.3.2 Определение времени жизни флуоресценции в растворителях с различной полярностью

2.3.3 FLIM-микроскопия с применением «сенсоров полярности»

2.4 Определение свойств комплексов FAST:флуороген, обладающих эмиссией в зелено-оранжевой области и их применение во FLIM

2.4.1 Флуорогены

2.4.2 Определение времен жизни флуоресценции комплексов FAST:флуороген на установке макро-FLIM

2.4.3 Определение значений константы диссоциации комплексов FAST:флуороген

2.4.4 Регистрация спектров комплексов FAST:флуороген

2.4.5 Определение коэффициентов молярной экстинкции комплексов FAST:флуороген

2.4.6 Определение квантового выхода флуоресценции комплексов FAST:флуороген

2.4.7 Определение времени жизни флуоресценции комплексов FAST:флуороген

2.4.8 Анализ структур комплексов и их связи со временем жизни флуоресценции

2.4.9 Конфокальная FLIM-микроскопия

2.5 Определение свойств комплексов FAST:N871b, обладающих эмиссией в оранжево-красной области и их применение во FLIM

2.5.1 Флуороген N871b и его оптические свойства

2.5.2 Определение времен жизни флуоресценции комплексов FAST:N871b

2.5.3 Конфокальная FLIM-микроскопия

2.6 Определение свойств комплексов FAST:MMV32.4, обладающих эмиссией в дальне-красной области и их применение во FLIM

2.6.1 Флуороген MMV32

2.6.2 Определение времен жизни флуоресценции комплексов FAST:MMV32

2.6.3 Конфокальная FLIM-микроскопия

2.7 Анализ данных и обработка изображений

2.7.1 Общий протокол обработки изображений

2.7.2 Обработка изображений с окрашенными ЭПР и адипосомами

2.7.3 Обработка изображений с несколькими локализациями с помощью параметрической гистограммы

2.7.4 Обработка изображений с несколькими локализациями с помощью фазорной диаграммы

2.7.5 Обработка изображений с пространственно наложенными сигналами

3 Результаты и обсуждение

3.1 Применение арилиден-азолоновых «сенсоров полярности» во время-разрешенной микроскопии живых клеток млекопитающих

3.1.1 Определение времени жизни флуоресценции в растворителях с различной полярностью

3.1.2 FLIM-микроскопия живых клеток HeLa Kyoto, окрашенных «сенсорами полярности»

3.1.3 Заключение

3.2 Применение комплексов FAST:флуороген, обладающих эмиссией в зелено-оранжевой области видимого спектра в мультиплексной FLIM

3.2.1. Определение времен жизни флуоресценции комплексов FAST:флуороген на установке макро-FLIM

3.2.2 Определение свойств комплексов FAST:флуороген

3.2.3. Анализ структур комплексов и их связи со временем жизни флуоресценции

3.2.4. Измерения времени жизни флуоресценции в живых клетках HeLa Kyoto

3.2.5. Визуализация двух внутриклеточных структур с помощью FLIM

3.2.6. Визуализация трех внутриклеточных структур с помощью FLIM

3.2.7. Разделение пространственно наложенных сигналов

3.2.8. Заключение

3.3 Применение комплексов FAST:флуороген, обладающих эмиссией в оранжево-красной области видимого спектра в мультиплексной FLIM

3.3.1 Измерение времен жизни флуоресценции in vitro

3.3.2 Измерение времени жизни флуоресценции в живых клетках HeLa Kyoto

3.3.3 Визуализация нескольких внутриклеточных структур с помощью FLIM

3.3.4 Заключение

3.4 Применение комплексов FAST:флуороген, обладающих эмиссией в дальне-красной области видимого спектра в мультиплексной FLIM

3.4.1 Измерение времен жизни флуоресценции in vitro

3.4.2 FLIM микроскопия в живых клетках HeLa Kyoto

3.4.3 Заключение

Заключение

Выводы

Список сокращений и условных обозначений

Список литературы

Приложения

Приложение А

Приложение Б

Введение

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Флуоресцентная время-разрешенная микроскопия с применением флуорогенных красителей арилиден-азолонового ряда»

Актуальность работы

Флуоресцентная микроскопия является одним из ключевых методов в современной молекулярной и клеточной биологии. На данный момент существует большое разнообразие флуоресцентных меток, покрывающих практически весь спектр видимого излучения. Комбинация нескольких спектрально различных флуоресцентных меток позволяет осуществлять мультиплексную микроскопию - одновременное наблюдение за несколькими внутриклеточными процессами. Однако ширина спектра видимого излучения ограничена, что позволяет одновременное применение в большинстве случаев только 3-4 флуоресцентных меток, сигналы которых не перекрываются. И хотя разделение сигналов спектрально накладывающихся меток возможно, данная процедура представляет собой достаточно сложную вычислительную задачу, в особенности при работе с живыми клетками [1; 2]. Альтернативой традиционной многоцветной флуоресцентной микроскопии является флуоресцентная время-разрешенная микроскопия (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy, FLIM). Методика FLIM опирается на измерение времени жизни флуоресценции, и данная характеристика может служить уникальным идентификатором конкретного флуорофора, что позволяет детектирование нескольких спектрально схожих флуоресцентных меток, возбуждаемых единственным источником. Одновременное использование нескольких спектральных каналов позволяет существенно увеличить объем получаемой информации в рамках одного эксперимента по сравнению с обычной флуоресцентной микроскопией.

На данный момент известно большое количество химических и генетически кодируемых флуоресцентных меток, многие из которых успешно применяются во FLIM. Тем не менее, применение нескольких химических меток в рамках одного эксперимента может потребовать использования нескольких различных протоколов окрашивания [3]. Кроме того, данные метки могут неспецифически окрашивать внутриклеточные компоненты, быть токсичными или плохо проникать через клеточные мембраны. Альтернативой химическим меткам являются генетически кодируемые метки, экспрессия которых в слиянии с белками интереса или сигналами внутриклеточной локализации позволяет осуществлять селективное мечение различных внутриклеточных структур. Наиболее широко применяемыми генетически кодируемыми метками являются флуоресцентные и самомодифицирующиеся белки. Однако данные белки обладают большим размером (молекулярная масса - 20-33 кДа) и тем самым могут оказывать негативное влияние на структуру и функции исследуемых внутриклеточных белков.

В последние годы большой интерес у научного сообщества вызывает новый класс химических меток - флуорогенные красители. Данные красители в свободной форме обладают

крайне низким квантовым выходом, который возрастает на порядки при связывании с молекулой-мишенью. Из этого класса особенно выделяются арилиден-азолоны - структурные аналоги зрелого хромофора зеленого флуоресцентного белка. Данные соединения хорошо растворимы в воде, нетоксичны, а простота синтеза и модификаций позволяет получать красители с различными свойствами. Последняя особенность позволяет применение арилиден -азолонов в качестве самостоятельных меток или лигандов флуороген-активирующих белков. Так, описаны арилиден-азолоновые красители, селективно окрашивающие внутриклеточные структуры, например, эндоплазматический ретикулум (ЭПР) [4-6]. Описанные соединения обладают выраженным сольватохромизмом и могут быть использованы в качестве «сенсоров полярности» - красителей, чей максимум эмиссии изменяется в зависимости от полярности окружающей среды. Особенно примечательна возможность применения арилиден-азолоновых красителей в комплексе с флуороген-активирующим белком FAST (Fluorescence-Activating and Absorption-Shifting Tag). Данный белок значительно меньше флуоресцентных или самомодифицирующихся белков (молекулярная масса - 14 кДа), а нековалентное связывание флуорогена существенно повышает фотостабильность системы. На данный момент создано большое количество мутантных вариантов белка FAST и еще большее - арилиден-азолоновых флуорогенов к ним, для которых было продемонстрировано применение в обычной флуоресцентной микроскопии, но не во FLIM. Учитывая, что время жизни флуоресценции конкретного флуорофора может изменяться в зависимости от свойств окружающей среды, комбинация из нескольких вариантов белка FAST с одним флуорогеном может позволить получить несколько комплексов с различными временами жизни флуоресценции.

Сказанное выше свидетельствует о том, что арилиден-азолоны как самостоятельные метки, так и как компоненты комплексов с белком FAST, являются отличной основой для разработки новых флуоресцентных меток, в особенности - для FLIM.

Цель исследования

Целью настоящей работы является разработка новых методов мечения живых систем с использованием флуоресцентной время-разрешенной микроскопии с применением красителей арилиден-азолонового ряда, в том числе на основе их комплексов с флуороген-активирующими белками.

Задачи исследования

В рамках поставленной цели исследования были сформулированы следующие задачи:

1. Изучить возможность применения арилиден-имидазолоновых «сенсоров полярности» во время-разрешенной микроскопии (FLIM) живых клеток млекопитающих;

2. Изучить возможность применения комплексов вариантов флуороген-активирующего белка FAST с точечными заменами и красителей арилиден-азолонового ряда, обладающих эмиссией в зелено-оранжевой области (500-600 нм) видимого спектра в мультиплексной время-разрешенной микроскопии;

3. Изучить возможность применения комплексов вариантов флуороген-активирующего белка FAST с точечными заменами и флуорогена N871b, обладающих эмиссией в оранжево-красной области (600-650 нм) видимого спектра в мультиплексной время-разрешенной микроскопии;

4. Изучить возможность применения комплексов вариантов флуороген-активирующего белка FAST с точечными заменами и флуорогена MMV32.4, обладающих эмиссией в дальне-красной области (650-700 нм) видимого спектра в мультиплексной время-разрешенной микроскопии.

Научная новизна

Данная работа посвящена изучению особенностей применения арилиден-азолоновых красителей во время-разрешенной микроскопии живых клеток млекопитающих.

В результате проведенной работы впервые показано, что применение FLIM позволяет осуществить разделение сигналов, которые наблюдаются при окрашивании живых клеток HeLa Kyoto «сенсорами полярности» арилиден-имидазолонового ряда и тем самым повысить специфичность микроскопии.

Также в данной работе впервые продемонстрировано применение арилиден-азолоновых красителей в комплексе с вариантами белка FAST, содержащими точечные аминокислотные замены, в мультиплексных приложениях FLIM. Показано, что разница во временах жизни флуоресценции комплексов FAST:флуороген позволяет осуществлять селективное мечение до трех внутриклеточных структур. Примечательно, что время жизни флуоресценции большинства комплексов FAST:флуороген практически не изменяется в различных клеточных локализациях, что делает данные комплексы крайне удобной меткой для мультиплексных FLIM-приложений.

Теоретическая и практическая значимость исследования

Результаты, описанные в данной работе, могут быть использованы при разработке новых подходов к микроскопии клеток млекопитающих.

Данные о применении во FLIM арилиден-имидазолоновых «сенсоров полярности» могут быть учтены при разработке подходов для трекинга адипосом. Данные о свойствах комплексов вариантов белка FAST и арилиден-азолоновых флуорогенов, а также особенностях мультиплексных систем для FLIM на их основе могут привести к появлению новых вариантов белка FAST, флуорогенов к ним или новых подходов к мечению внутриклеточных структур.

Методология и методы исследования

Результаты, представленные в настоящей работе, были получены с помощью различных методов физико-химической биологии. Создание новых генетических конструкций, применяемых в работе, выполнено с помощью стандартных генно-инженерных методов. В работе также применялись стандартные подходы выделения и очистки белков. Определение оптических свойств флуоресцентных комплексов вариантов белка FAST с арилиден-азолоновыми флуорогенными лигандами было выполнено с помощью подходов оптической спектроскопии. В том числе было выполнено определение времени жизни флуоресценции с помощью TCSPC-спектроскопии. В качестве живых объектов в данной работе были использованы клетки линии HeLa Kyoto, внутренние структуры которых были окрашены «сенсорами полярности» или мечены комплексами FAST:флуороген. FLIM клеток HeLa Kyoto с мечеными внутриклеточными структурами был выполнен совместно с коллегами из лабораторий А.П. Савицкого (ФИЦ «Фундаментальные основы биотехнологии РАН», Москва) и Е.Г. Максимова (МГУ, Москва).

Положения, выносимые на защиту

1. Показано, что применение FLIM позволяет повысить специфичность микроскопии при использовании арилиден-имидазолоновых «сенсоров полярности».

2. Показано, что флуоресцентные комплексы вариантов белка FAST (F62L, P68K, P68T R52K) и флуорогенов HMBR и HMR-2,5-DM, обладающие эмиссией в зеленой-оранжевой области видимого спектра могут быть использованы в мультиплексной FLIM с разделением сигналов от двух и трех меченых внутриклеточных структур соответственно;

3. Показано, что флуоресцентные комплексы вариантов белка FAST (D65K, F62L, P68K R52Y) и флуорогена N871b, обладающие эмиссией в оранжево-красной области видимого

спектра могут быть использованы в мультиплексной FLIM с разделением сигналов от трех меченых внутриклеточных структур; 4. Показано, что флуоресцентные комплексы вариантов белка FAST (pFAST и F62L) и флуорогена MMV32.4, обладающие эмиссией в дальне-красной области видимого спектра могут быть использованы в мультиплексной FLIM с разделением сигналов от двух меченых внутриклеточных структур.

Степень достоверности и апробация результатов

Основные результаты работы изложены в следующих публикациях:

1. А.Р. Гильванов, А.Ю. Смирнов, С.А. Краснова, И.Д. Соловьев, А.П. Савицкий, Ю.А. Богданова, М.С. Баранов. Использование флуоресцентной времяразрешенной микроскопии для повышения селективности флуорогенных красителей ряда арилиден-имидазолонов в отношении эндоплазматического ретикулума // Биоорганическая химия. -2024. - Т. 50. - №5. - с. 691-698.

2. Yu.A. Bogdanova, I.D. Solovyev, N.S. Baleeva, I.N. Myasnyanko, A.A. Gorshkova, D.A. Gorbachev, A.R. Gilvanov, S.A. Goncharuk, M.V. Goncharuk, K.S. Mineev, A.S. Arseniev, A.M. Bogdanov, A.P. Savitsky, M.S. Baranov. Fluorescence lifetime multiplexing with fluorogen activating protein FAST variants // Communications Biology. - 2024. - Vol. 7. - 799.

3. A.R. Gilvanov, I.N. Myasnyanko, S.A. Goncharuk, M.V. Goncharuk, V.S. Kublitski, D.V. Bodunova, S.V. Sidorenko, E.G. Maksimov, M.S. Baranov, Yu.A. Bogdanova. Fluorescencce Lifetime Multiplexing with Fluorogen-Activating FAST Protein Variants and Red-Shifted Arylidene-Imidazolone Derivative as Fluorogen // Biosensors. - 2025. - Vol. 15. - № 5. - 274.

4. A.R. Gilvanov, I.D. Solovyev, A.P. Savitsky, M.S. Baranov, Yu. A. Bogdanova. Fluorescence Lifetime-Based Separation of FAST-Labeled Cellular Compartment // Bio-Protocol. - 2025. -Vol. 15. - № 19. - e5460.

5. A.R. Gilvanov*, M.V. Molchanova*, S.A. Krasnova, A.V. Eshtukov-Shcheglov, A.A. Mikhaylov, S.A. Goncharuk, M.V. Goncharuk, S.V. Sidorenko, E.G. Maksimov, M.S. Baranov, Y.A. Bogdanova. Bathochromic Shift via C=O to C=S Substitution: A Far-Red Fluorogen for Multiplexed FLIM with FAST Fluorogen-Activating Protein // International Journal of Molecular Sciences. - 2026. - Vol. 27. - № 1. - 23. (* - авторы внесли равный вклад).

Отдельные результаты работы были представлены на XXXVII международной зимней молодежной научной школе (Москва, 2025). Опубликован тезис доклада:

1. Применение флуороген-активирующих белков FAST во флуоресцентной время-разрешенной микроскопии живых клеток HeLa Kyoto / А.Р. Гильванов, Ю.А. Богданова, Е.Г. Максимов, М.С. Баранов. // Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии: Сборник тезисов XXXVII международной зимней молодежной научной школы, Москва, 10-13 февраля 2025 года. - Москва: Институт биоорганической химии им. Академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 2025. - С. 48.

Структура и объем работы

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, обсуждения результатов, заключения, списка сокращений, списка литературы и двух приложений. Диссертация изложена на 138 страницах, содержит 53 рисунка, 14 таблиц, 244 литературных источника и 2 приложения.

1 Обзор литературы 1.1 Явление флуоресценции и флуоресцентная микроскопия

Явление флуоресценции впервые было описано в середине XIX века, а первый флуоресцентный микроскоп был представлен в начале XX века [7]. В последствии, более глубокое понимание явления флуоресценции, в частности первое измерение времени жизни флуоресценции Гавиолой в 1927 году [8], а также постепенное совершенствование микроскопов и появление новых средств мечения различных внутриклеточных мишеней сделало флуоресцентную микроскопию одним из основных методов молекулярной и клеточной биологии.

В данном разделе кратко изложены основные сведения о флуоресценции и флуоресцентной микроскопии.

1.1.1 Явление флуоресценции

Флуоресценция - это тип люминесценции, при котором происходит поглощение флуорофором излучения (света) одной длины волны и последующее испускание более длинноволнового света. Процессы, происходящие при поглощении света флуорофором схематически могут быть представлены с помощью диаграммы Яблонского (рисунок 1.1).

Рисунок 1.1 - Диаграмма Яблонского. Адаптировано из [8]. Пояснения даны в тексте.

Когда молекула флуорофора, находящаяся в основном состоянии ^0) поглощает свет равный или превосходящий по энергии разницу между этим энергетическим состоянием и энергией высших энергетических уровней ^1, S2 ... Sn), возбужденный электрон переходит на более высокоэнергетические уровни. В последствии данный электрон за счет колебательной релаксации, как правило, переходит на более низкий уровень возбужденного состояния ^1). Далее с уровня Sl молекула возвращается в основное состояние через излучательную или безызлучательную релаксацию. Флуоресценция является излучательным процессом, в ходе которого флуорофор переходит из возбужденного в основное состояние, обычно с излучением детектируемых фотонов. Испускание фотонов, как правило, происходит при переходе с низших электронных уровней возбужденного состояния ^1), при этом энергия испускаемых фотонов оказывается ниже энергии поглощенных фотонов из-за потери энергии в процессах колебательной релаксации и внутренней конверсии. Другой важный люминесцентный процесс -фосфоресценция, возникает в тех случаях, когда возбужденная молекула из синглетного состояния Sl переходит в триплетное состояние Т1 в ходе интеркомбинационной конверсии. Электроны в триплетном состоянии имеют параллельный («запрещенный») спин, что приводит к медленному возвращению молекулы в основное состояние с испусканием фосфоресцентного фотона [8].

Важной характеристикой флуоресценции является квантовый выход (КВФ), который определяется по формуле [8]:

^ет

Ф = тр, (1.1)

Мех

где Nem - количество излученных фотонов; Nex - количество поглощенных фотонов.

Величина квантового выхода флуоресценции зависит от различных факторов, например, структуры флуорофора и свойств окружающей среды. Во флуоресцентной микроскопии в основном используются флуорофоры с высокими значениями квантового выхода.

Еще одной важной характеристикой является время жизни флуоресценции (т), которое является кинетическим параметром и обратно пропорционально сумме констант скорости излучательных и безызлучательных процессов [9]:

кг+къ

(1.2)

т

где kf - константа скорости излучательных процессов;

кпг - сумма констант скорости безызлучательных процессов.

При проведении измерений времени жизни флуоресценции невозможно оценить количество молекул в возбужденном состоянии. В связи с этим, проводится оценка изменения интенсивности флуоресценции во времени [10]:

г

/(О = 10е~, (1.3)

где 1о - интенсивность флуоресценции в нулевой момент времени;

1 - время в момент t.

Уравнение 1.3 описывает кривую затухания флуоресценции, представленную на рисунке 1.2. Таким образом, время жизни флуоресценции может быть определено как время, за которое изначальная интенсивность флуоресцентного сигнала снижается до уровня 1/е (~36,9%) [8].

Время Время

Рисунок 1.2 - Затухание флуоресценции в линейном (слева) и логарифмическом представлениях. Адаптировано из [11].

Уравнение 1.3 корректно только в случае наиболее простых, одиночных, процессов затухания. На практике, в особенности при работе с биологическими объектами, процессов затухания флуоресценции как излучательных, так и безызлучательных может быть несколько (мультикомпонентное или мультиэкспоненциальное затухание). В таком случае кривая затухания флуоресценции описывается уравнением [10]:

/(О = X

п

С

Аке ъ, (1.4)

к=1

где Тк - время жизни флуоресценции к-ого компонента;

Ак - амплитуда к-ого компонента.

Исходя из этого, определение времени жизни флуоресценции как просто среднего времени пребывания молекулы в возбужденном состоянии не является корректным. В таких случаях применяется среднее взвешенное время жизни флуоресценции [9].

Среднее время жизни флуоресценции может быть взвешено по амплитуде (тт), в таком случае оно определяется по следующему уравнению [12]:

1/к=1Актк (л уп л , (1.5)

где Тк - время жизни флуоресценции к-ого компонента; Ак - амплитуда к-ого компонента.

Или же среднее время жизни флуоресценции может быть взвешено по интенсивности (т^ и определяется по уравнению [12]:

К^к=1-пкгк

Ук=1Актк у1к=1^ктк

(1.6)

1.1.2 Флуоресцентная микроскопия

Флуоресцентная микроскопия является одним из основных методов современной молекулярной и клеточной биологии, позволяющим наблюдение за внутриклеточными процессами в реальном времени. Постепенное усложнение аппаратуры для флуоресцентной микроскопии привело к возникновению более совершенных методов, таких как флуоресцентная микроскопия сверхвысокого разрешения, позволяющая получать изображения с субдифракционным разрешением [7], и время-разрешенная флуоресцентная микроскопия (Fluorescence lifetime imaging microscopy, FLIM), представляющая собой визуализацию на основе времени жизни флуоресценции образца [8].

Биологические объекты, такие как клетки и ткани, содержат множество эндогенных флуорофоров [9], которые, как правило, обладают крайне низким квантовым выходом. Поэтому во флуоресцентной микроскопии используются химические и генетически кодируемые метки с высоким квантовым выходом, позволяющие получить контрастный флуоресцентный сигнал. Комбинация нескольких флуоресцентных меток также позволяет изучение белок-белковых взаимодействий с применением Ферстеровского переноса энергии (Förster resonance energy transfer, FRET). На данный момент известно большое количество флуоресцентных меток, покрывающих весь видимый спектр.

В следующих разделах обзора литературы рассмотрены различные типы химических и генетически кодируемых флуоресцентных меток, а также особенности применения FLIM.

1.2 Химические флуоресцентные метки

С момента синтеза первых флуоресцентных красителей во второй половине XIX века -флуоресцеина и родамина [13], было создано неисчислимое количество как их производных, так и красителей других групп. Множество этих соединений нашли применение в молекулярной и клеточной биологии в виде конъюгатов с антителами [14-16] и другими биомолекулами [17], или в качестве самостоятельных меток [18; 19].

Условно, химические метки можно разделить на два класса: флуоресцентные красители -соединения, которые обладают стабильной интенсивностью флуоресценции в различных средах и флуорогенные красители - соединения, интенсивность флуоресценции которых зависит от свойств окружающей среды [20]. В отдельных случаях также выделяют так называемые сольватохромные красители - соединения, спектральная область возбуждения и/или эмиссии которых изменяется в зависимости от свойств окружающей среды [21], что при подборе источников возбуждения флуоресценции или эмиссионных фильтров позволяет получать флуоресцентный сигнал только в определенных частях исследуемых биологических объектов.

Главными преимуществами химических меток являются их малый размер (во многих случаях - до 1 кДа) и возможность их использования с объектами, плохо поддающимися трансфекции (например, клетками первичных культур). Недостатками некоторых химических меток являются токсичность, неспособность к проникновению через клеточную мембрану и/или плохая растворимость в воде. Также при необходимости одновременного мечения нескольких внутриклеточных структур может потребоваться комбинация нескольких протоколов окрашивания [3]. Кроме того, внесение химических меток может приводить к возникновению фонового сигнала с высокой интенсивностью или неспецифическому мечению. Последнее особенно критично для FLIM, так как неспецифическое мечение может приводить к возникновению областей с разными временами жизни флуоресценции, что делает невозможным мультиплексный анализ [22].

В данной главе обзора литературы внимание будет сконцентрировано на сольватохромных и флуорогенных красителях: основных механизмах возникновения флуоресценции и структурах молекул.

1.2.1 Сольватохромные и флуорогенные красители

Применение сольватохромных и флуорогенных красителей позволяет осуществлять не только микроскопию с минимальным фоновым сигналом, но и проводить качественную и количественную оценку различных внутриклеточных параметров (например, вязкости, полярности и значений pH) с применением FLIM и других видов флуоресцентной микроскопии.

Классификация механизмов возникновения интенсивной флуоресценции флуорогенных красителей или смещения спектральных максимумов сольватохромных красителей дана в замечательном обзоре Климченко [21]. Согласно данной классификации, все это возможно по одному из следующих механизмов (рисунок 1.3): внутримолекулярный перенос заряда; внутримолекулярный перенос протона; конформационные изменения молекулы; изомеризация и агрегация (которая, как правило, ведет к тушению флуоресценции).

Рисунок 1.3 - Основные механизмы возникновения флуоресценции сольватохромных и флуорогенных красителей согласно классификации Климченко. Адаптировано с изменениями из [21].

Внутримолекулярный перенос заряда свойственен, например, нафталиновым и антраценовым производным, содержащим донорную и акцепторную группы. После поглощения света молекулой красителя, заряд переносится с донорной на акцепторную группу, что переводит молекулу в диполярное возбужденное состояние. Возвращение молекулы в основное состояние

происходит через взаимодействие с диполями растворителя и приводит к значительному батохромному сдвигу в полярных средах [21]. Примерами таких соединений являются Dansyl, Anthradan и нильский красный. Данные соединения и их производные широко применяются для мечения клеточных мембран. В работе [23] описано применение нильского красного для оценки полярности мембран клеток HeLa с помощью FLIM.

Флуоресцентный ответ некоторых сольватохромных красителей может быть вызван внутримолекулярным переносом протона в возбужденном состоянии (Excited-State Intramolecular Proton Transfer, ESIPT). В данном случае внутримолекулярная водородная связь ослабляется при наличии соседствующих донорных или акцепторных заместителей. Примерами соединений с данным свойством являются 3-гидроксихромон (3HC) и его структурные аналоги - 3-гидроксифлавон (3HF) и 3-гидроксихинолины (3HQ) [21]. Данные соединения также используются для окрашивания мембран. В работе [24] описано применение производного 3HF для наблюдения с помощью FLIM за ремоделированием клеточных мембран в ходе апоптоза.

Примерами красителей, свойства которых основанных на конформационных изменениях молекулы, являются производные красителя BODIPY, структурные аналоги хромофора зеленого флуоресцентного белка (GFP) и производные малахитового зеленого. Данные соединения относятся к так называемым «молекулярным роторам», так как вращение определенных частей молекулы не позволяет соединению находиться в полностью планарной конформации и способствует безызлучательной релаксации [21]. При замедлении или блокировании такого вращения, например, в более вязких средах или связывающих карманах белков, значительно возрастает интенсивность флуоресценции красителя. «Молекулярные роторы», в частности, производные BODIPY, в комбинации с FLIM могут быть использованы для оценки вязкости мембран живых клеток [25-27], а структурные аналоги хромофора GFP и малахитового зеленого могут быть использованы в качестве лигандов для генетически кодируемых меток, что будет рассмотрено в следующих разделах.

Изомеризация молекулы флуорофора в основном состоянии свойственна, например, производным родаминовых красителей, в частности кремнийсодержащим производным (SiR). В данном случае нуклеофильная карбоксилатная группа, находящаяся в орто-положении фенильной части молекулы может атаковать электрофильный центр гетероцикла, что приводит к формированию спиролактона. Данный процесс обратим и происходит только в неполярных средах [21]. Конъюгаты SiR с лигандами, связывающимися с самомодифицирующимися белками [28], тубулином и актином [29] позволяют селективное мечение внутриклеточных структур с высокой контрастностью флуоресцентного сигнала.

Учитывая, что химические метки представляют собой плоские ароматические структуры, они имеют высокую тенденцию к п-стэкингу и, как следствие, формированию нефлуоресцентных

агрегатов (Aggregation Induced Quenching, AIQ). В водных средах, в виду гидрофобных взаимодействий, красители подвергаются тушению, вызванному агрегацией, тогда как в неполярном окружении агрегаты раскрываются и возникает флуоресцентный сигнал [21]. Примером соединений с данным типом возникновения флуоресцентного сигнала являются красители YOYO-1 и TMR-DN [30; 31]. YOYO-1 - димерный цианиновый краситель, не флуоресцирующий в воде, но способный к флуоресценции в комплексе с молекулами ДНК. TMR-DN представляет собой производное родамина, связанное с тушителем флуоресценции, а флуоресцентный сигнал возникает при связывании с РНК-аптамером. В некоторых случаях процесс бывает обратным: агрегация молекул нефлуоресцирующего в растворе соединения приводит к возникновению флуоресцентного сигнала (Aggregation Induced Emission, AIE) [32]. Данный процесс вызван нарушением безызлучательного затухания при формировании агрегатов и свойственен полиароматическим соединениям. Примеры применения красителей со свойствами AIQ и AIE во FLIM описаны в работах [33] и [34] соответственно. В первом случае был использован краситель YOYO-1, время жизни флуоресценции которого оказалось различным при связывании с AT- и GC-богатыми участками геномной ДНК клеток мышиных фибробластов 3T3, что позволило визуализировать пространственное разделение соответствующих участков ДНК в различных фазах клеточного цикла. Во втором случае модифицированные 1,8-нафталимиды были использованы для визуализации адипосом в живых клетках линии рака молочной железы MDA-MB 231.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Гильванов Айдар Римович, 2026 год

Источник

излучения

ЛШЬсиу fg00

Адаптер I

1 _

Чашка Петри

Рисунок 2.1 - Фотография системы макро-FLIM. Адаптировано из [224].

Система состоит из камеры LIFA vTAU SPAD (Lambert Instruments, Нидерланды), эмиссионного фильтра Chroma LP510nm (Chroma Technology, США) и объектива для цифровой фотокамеры Nikon 70-300 mm f/4.5-6.3 G ED VR AF-P DX (Nikon Corporation, Япония). Для возбуждения флуоресценции использовали источник излучения Multi-LED light source (Lambert Instruments, Нидерланды), оборудованный расширителем луча. Для калибровки установки макро-FLIM использовали 10 мкМ раствор флуоресцеина в 0,1 М Трис-HCl (pH 10). Для управления системой использовали программное обеспечение LIFA Software 1.1.4 (Lambert Instruments, Нидерланды).

Химически компетентные клетки E. coli Bl21(DE3) трансформировали плазмидами pET24b(+), кодирующими последовательности вариантов FAST по протоколу, указанному выше. Клетки отдельной колонии каждого варианта FAST переносили в 50 мл стерильного фосфатно-солевого буфера (pH 7,4) (Amresco, США), 5 мкл полученной суспензии наносили на агаризованную среду LB, содержащую ампициллин. Выращивали бактериальные колонии до достижения ими диаметра 5 -7 мм. Непосредственно перед экспериментом на каждую колонию наносили 10 мкл 10 мкМ раствора флуорогена.

Съемку проводили при следующих параметрах: длина волны источника возбуждения -471 нм; эмиссионный фильтр - Chroma LP510nm (Chroma Technology, США); частота модуляции - 20 МГц; количество фаз - 12; усиление сигнала - 2; выдержка - 300 мс; количество кадров на фазу - 10; разрешение фотографии - 512*504 пикселей.

Время жизни флуоресценции определяли в программе LIFA Software 1.1.4. В качестве области интереса на фотографии выбирали колонии размером 300-500 пикселей. Для области

интереса определяли средние значения интенсивности флуоресценции, фазового и модуляционного времен жизни; вычисляли стандартное отклонение для каждого параметра.

Полученные данные представлены в таблице 3.6 и приложении Б (таблицы Б.1-Б.4).

2.4.3 Определение значений константы диссоциации комплексов FAST:флуороген

Значения констант диссоциации (Kd) комплексов FAST:флуороген определяли с помощью спектрофлуориметрического титрования. Для этого готовили растворы белков с концентрацией 0,10 мкМ и растворы флуорогенов с концентрацией от 0 до 5 мкМ путем последовательного разбавления натрий-фосфатным буфером (pH 7,4). Регистрацию спектров флуоресценции выполняли на планшетном ридере Tecan Infinite 200 Pro M Nano (Tecan Group, Швейцария) при 25 °С. Анализ данных и построение кривых титрования проводили в программном пакете Origin 2021 (OriginLab Corporation, США).

Результаты анализа данных представлены в таблице 3.7.

2.4.4 Регистрация спектров комплексов FAST:флуороген

Спектры поглощения и эмиссии комплексов FAST:флуороген регистрировали на спектрофотометре Cary Varian 100 Bio (Varian Inc., США) и спектрофлуориметре Cary Eclipse (Agilent Technologies, США) соответственно. Регистрацию спектров выполняли в натрий-фосфатном буфере (pH 7,4). Для регистрации спектров поглощения использовали концентрацию комплексов 5 мкМ, для регистрации спектров возбуждения и эмиссии флуоресценции - 0,5 мкМ.

Результаты анализа данных представлены в таблице 3.7. Спектры поглощения и эмиссии представлены на рисунке 3.5.

2.4.5 Определение коэффициентов молярной экстинкции комплексов FAST:флуороген

Растворы флуорогенов смешивали с растворами белков FAST в натрий-фосфатном буфере (pH 7,4). Конечная концентрация флуорогенов составляла 5 мкМ. Белки добавляли в концентрации, приводящей к формированию комплексов FAST:флуороген с долей а>97%.

Концентрацию белков определяли по уравнению:

Ка х (ах [Скг0]) [СВД - (ах [СВД

М = т , ' пл + (ах [СВД, (2.1)

где Kd - константа диссоциации;

[СЬго] - концентрация флуорогена; а - доля комплекса FAST:флуороген.

Коэффициенты молярной экстинкции определяли по уравнению:

А

где А - максимум интенсивности поглощения;

с - молярная концентрация комплексов FAST:флуороген;

1 - длина оптического пути.

Результаты анализа данных представлены в таблице 3.7.

2.4.6 Определение квантового выхода флуоресценции комплексов FAST:флуороген

Квантовый выход флуоресценции определяли, следуя процедуре, описанной в работе [225]. В качестве стандарта использовали краситель родамин 6G. Концентрация флуорогенов составляла 5 мкМ для регистрации спектров поглощения и 1,67, 0,5 и 0,167 мкМ для регистрации спектров эмиссии. Белки добавляли в концентрации, приводящей к формированию комплексов FAST:флуороген с долей а>97%, определенной по уравнению 2.1. Квантовый выход флуоресценции рассчитывали по формуле:

= (2.3)

^ Ух П^

где Фst - квантовый выход флуоресценции стандарта;

Бх, Fst - площадь под пиками эмиссии исследуемого комплекса и стандарта;

Гх, fst - абсорбционные факторы исследуемого комплекса и стандарта;

Пх, nst - коэффициент преломления растворов исследуемого комплекса и стандарта.

Абсорбционные факторы определяли по формуле:

f = 1- 10-A, (2.4)

где A - интенсивность поглощения при длине волны возбуждения.

Результаты анализа данных представлены в таблице 3.7.

2.4.7 Определение времени жизни флуоресценции комплексов FAST:флуороген

Время жизни флуоресценции комплексов вариантов белка FAST (FAST, R52K, F62L, P68K, P68T) и арилиден-азолоновых флуорогенов (HBR-2,5-DM, HMBR, 25DOM-HBI-2T, HBR-DOM2) определяли с помощью TCSPC-спектроскопии на время-разрешенном флуоресцентном спектрофотометре miniTau (Edinburgh Instruments, Великобритания). Регистрацию фотонов проводили в 10*10*45 мм прозрачных оптических кюветах (Sarstedt, Германия). Аппаратную функцию прибора (IRF) определяли с использованием аэрированной водопроводной воды, следуя рекомендациям производителя прибора.

Очищенные белковые препараты вариантов FAST (FAST, R52K, F62L, P68K, P68T) смешивали с флуорогенами в стерильном натрий-фосфатном буфере. Конечные концентрации составляли 10 мкМ и 0,2 мкМ соответственно. Регистрацию кривых затухания флуоресценции проводили во временных окнах 20 нс (для флуорогенов HBR-2,5-DM, HMBR и 25DOM-HBI-2T) или 50 нс (HBR-DOM2), разделенных соответственно на 1024 или 2048 временных канала. Для возбуждения флуоресценции использовали пикосекундный лазер EPL-450 (Edinburgh Instruments, Великобритания) с центральной длиной волны излучения 445.6 нм и частотой повторений 20 МГц. Регистрацию фотонов осуществляли в спектральном диапазоне 550/25 нм.

Для обработки полученных данных использовали программу Fluoracle 2.5.1. (Edinburgh Instruments, Великобритания). Аппроксимацию кривых затухания флуоресценции осуществляли через деконволюцию с аппаратной функцией прибора (IRF).

Результаты анализа данных представлены в таблице 3.7.

Анализ структур комплексов FAST:флуороген и их связи со временем жизни флуоресценции был выполнен сотрудниками лаборатории биомолекулярной ЯМР-спектроскопии ГНЦ ИБХ РАН.

Измеренные квантовый выход флуоресценции и времена жизни флуоресценции комплексов FAST:флуороген были использованы для расчета значений констант излучательных (kr) и безызлучательных (W) переходов по следующим уравнениям:

Ф

кг = —, (2.5)

т

_ 1 - Ф

k-nr = ~ , (2.6)

где Ф - квантовый выход флуоресценции;

т - время жизни флуоресценции.

При расчете значений kr и knr для т принимали значения, соответствующие Т1, представленные в таблице 3.7.

Анализ влияния структур комплексов FAST:флуороген на их время жизни флуоресценции был выполнен в программном пакете PyMOL (Schrodinger LLC, США) с использованием пространственной структуры комплекса nanoFAST:HBR-DOM2 (PDB: 8AOO). Аминокислотная последовательность модели была адаптирована под последовательность оригинального белка FAST добавлением 26 аминокислотных остатков к N-концу. Аминокислотные замены были внесены в модель стандартными средствами PyMOL. Для визуализации отбирался один из возможных ротамеров с наименьшим числом стерических столкновений.

2.4.9 Конфокальная FLIM-микроскопия

FLIM-микроскопию проводили на живых клетках HeLa Kyoto, трансфецированных плазмидами, кодирующими белки слияния вариантов FAST с сигналами локализации. Непосредственно перед проведением FLIM-микроскопии, среду DMEM в чашке заменяли на раствор солей Хэнкса (Панэко, Россия) с добавлением 20 мМ HEPES (Corning, США), содержащий один из флуорогенов, разведенный из стокового раствора в ДМСО. Концентрация красителей составляла 5 мкМ. После замены среды проводили инкубацию при комнатной температуре в течение 5 мин.

Микроскопию проводили на микроскопе TE-2000U с иммерсионным объективом 100* S Fluor 0.5-1.3 (Nikon Corporation, Япония), оборудованном сканирующим конфокальным модулем DCS-120 и детектором PMC-100-1 (Becker&Hickl, Германия). Для возбуждения флуоресценции использовали источник Fianium WhiteLase SC-480-6 с акустооптическим фильтром (AOTF) (NKT Photonics, Дания) с частотой повторения импульсов 60 МГц (HBR-DOM2) или 40 МГц (HBR-2,5-DM, HMBR и 25DOM-HBI-2T). Использовали следующие наборы эмиссионных фильтров: HQ495LP и HQ525/50 (HBR-2,5-DM и HMBR) (Chroma Technology, США) или HQ495LP и 580bp40 (HBR-DOM2 и 25DOM-HBI-2T) (Omega Optical, США). Регистрацию фотонов выполняли в течение 120 с.

2.5 Определение свойств комплексов FAST:N871b, обладающих эмиссией в оранжево-

красной области и их применение во FLIM

2.5.1 Флуороген N871b и его оптические свойства

Арилиден-имидазолоновый флуороген N871b был синтезирован ранее в лаборатории химии гетероциклических соединений ГНЦ ИБХ РАН в рамках оригинального исследования [179]. Оптические свойства комплексов FAST:N871b были определены ранее [182] и приведены в таблице 3.10.

Стоковый раствор флуорогена N871b с концентрацией 10 мМ готовили в ДМСО (Sigma Aldrich, США) и разводили до целевой концентрации непосредственно перед проведением экспериментов.

2.5.2 Определение времен жизни флуоресценции комплексов FAST:N871b

Время жизни флуоресценции комплексов вариантов белка FAST и арилиден-имидазолонового флуорогена N871b определяли с помощью TCSPC-спектроскопии на время-разрешенном флуоресцентном спектрофотометре miniTau (Edinburgh Instruments, Великобритания). Регистрацию фотонов проводили с использованием осветленных бактериальных лизатов в 10*10*45 мм прозрачных оптических кюветах (Sarstedt, Германия). Аппаратную функцию прибора (IRF) определяли с использованием аэрированной водопроводной воды, следуя рекомендациям производителя прибора. Протоколы получения осветленных бактериальных лизатов и проведения измерений приведены ниже.

Химически компетентные клетки E. coli Bl21(DE3) трансформировали плазмидами pET24b(+), кодирующими последовательности вариантов FAST, указанных в таблице А. 1 (кроме варианта pFAST), по протоколу, указанному выше.

Клетки отдельной колонии каждого варианта FAST переносили в 5 мл стерильной среды LB, содержащей 100 мкг/мл ампициллина и инкубировали в течение 16 часов на орбитальном шейкере при 220 об/мин и 37 °С.

Бактериальные клетки осаждали центрифугированием в течение 10 мин при 1700* g и ресуспендировали в стерильном натрий-фосфатном буфере (pH 7,4). Ресуспендированную биомассу лизировали на ультразвуковом гомогенизаторе VCX500 с использованием 2 мм зонда (Sonics&Material Inc., США). Лизис проводили на льду в течение 20 мин при амплитуде осцилляции 40% с циклами: активный интервал 5 с, охлаждение 15 с. Полученные лизаты осветляли центрифугированием при 14000* g и 4 °С в течение 30 мин. К 900 мкл супернатанта добавляли флуороген N871b до конечной концентрации 1 мкМ.

Наличие флуоресценции комплексов вариантов FAST с флуорогеном N871b оценивали на флуоресцентном спектрометре Cary Eclipse (Agilent Technologies, США). Флуоресценцию возбуждали излучением при длине волны 540 нм и регистрировали спектр эмиссии в диапазоне 590-700 нм. В качестве отрицательного контроля использовали бактериальные клетки, трансформированные вектором pcDNA3.1(+) не содержащим кодирующей последовательности FAST. Лизаты, обладающие флуоресценцией, были использованы для регистрации кривых затухания флуоресценции.

Регистрацию кривых затухания флуоресценции проводили во временном окне 50 нс, разделенном на 1024 временных канала. Для возбуждения флуоресценции использовали пикосекундный лазер EPLED-590 (Edinburgh Instruments, Великобритания) с центральной длиной волны излучения 589,1 нм и частотой повторений 20 МГц. Регистрацию фотонов осуществляли в спектральном диапазоне 600/25 нм.

Для обработки полученных данных использовали программу Fluoracle 2.5.1. (Edinburgh Instruments, Великобритания). Аппроксимацию кривых затухания флуоресценции осуществляли через деконволюцию с аппаратной функцией прибора.

Результаты анализа данных представлены в таблице 3.10.

2.5.3 Конфокальная FLIM-микроскопия

FLIM-микроскопию проводили на живых клетках HeLa Kyoto, трансфецированных плазмидами, кодирующими белки слияния вариантов FAST с сигналами локализации. Непосредственно перед проведением FLIM-микроскопии, среду DMEM в чашке заменяли на раствор солей Хэнкса (Панэко, Россия) с добавлением 10 мМ HEPES (Corning, США), содержащий флуороген N871b, разведенный из стокового раствора в ДМСО. Концентрация

красителя составляла 5 мкМ. После замены среды проводили инкубацию при комнатной температуре в течение 5 мин.

Микроскопию времени жизни флуоресценции проводили на микроскопе Eclipse Ti2 с 60* 1.4 иммерсионным объективом (Nikon Corporation, Япония), оборудованном сканирующим конфокальным модулем DCS-120 и детектором HMP-100-40C с модулем SPC-150 (Becker&Hickl, Германия). Для возбуждения флуоресценции использовали пикосекундный лазер BDS-SM-LS-101 с длиной волны 473 нм, продолжительностью импульсов - 30 пс и частотой повторения импульсов - 50 МГц (Becker&Hickl, Германия). Средняя мощность лазера была настроена на 57% от максимальной. Использовали следующий набор эмиссионных фильтров: 485LP и HQ590/40 (Chroma Technology, США). Регистрацию фотонов проводили в течение 120 с.

2.6 Определение свойств комплексов FAST:MMV32.4, обладающих эмиссией в дальне-

красной области и их применение во FLIM

2.6.1 Флуороген MMV32.4

Арилиден-тиазолидиндитионовый флуороген MMV32.4 был синтезирован в лаборатории химии гетероциклических соединений ГНЦ ИБХ РАН в рамках оригинального исследования [226] (другое обозначение данного флуорогена - HBTR-3,5-DOM). Оптические свойства комплекса pFAST:MMV32.4 (значения Kd, спектры поглощения, возбуждения и эмиссии флуоресценции, коэффициенты молярной экстинкции, квантовый выход флуоресценции) были определены по методам, описанным выше в разделах 2.4.3-2.4.7.

Стоковый раствор флуорогена MMV32.4 с концентрацией 10 мМ готовили в ДМСО (Sigma Aldrich, США) и разводили до целевой концентрации непосредственно перед проведением экспериментов.

2.6.2 Определение времен жизни флуоресценции комплексов FAST:MMV32.4

Время жизни флуоресценции комплексов вариантов белка FAST (pFAST, D65K, F62L, P68K, R52A, R52K, R52Y) и арилиден-тиазолидиндитионового флуорогена MMV32.4 определяли с помощью TCSPC-спектроскопии на время-разрешенном флуоресцентном спектрофотометре miniTau (Edinburgh Instruments, Великобритания). Регистрацию фотонов проводили с использованием осветленных бактериальных лизатов в 10*10*45 мм прозрачных оптических кюветах (Sarstedt, Германия). Аппаратную функцию прибора (IRF) определяли с использованием аэрированной водопроводной воды, следуя рекомендациям производителя прибора.

Очищенные белковые препараты вариантов FAST (pFAST, D65K, F62L, P68K, R52A, R52K, R52Y) смешивали с флуорогеном в стерильном натрий-фосфатном буфере. Белки добавляли в концентрации, приводящей к формированию комплексов FAST:флуороген с долей а>97%, определенной по уравнению 2.1, конечная концентрация флуорогена MMV32.4 составляла 0,5 мкМ. Регистрацию кривых затухания флуоресценции проводили во временном окне 50 нс, разделенном на 2048 временных каналов. Для возбуждения флуоресценции использовали пикосекундный лазер EPLED-590 (Edinburgh Instruments, Великобритания) с центральной длиной волны излучения 589,1 нм и частотой повторений 20 МГц. Регистрацию фотонов осуществляли в спектральном диапазоне 650/25 нм.

Для обработки полученных данных использовали программу Fluoracle 2.5.1. (Edinburgh Instruments, Великобритания). Аппроксимацию кривых затухания флуоресценции осуществляли через деконволюцию с аппаратной функцией (IRF).

Результаты анализа данных представлены в таблице 3.13.

2.6.3 Конфокальная FLIM-микроскопия

FLIM-микроскопию проводили на живых клетках HeLa Kyoto, трансфецированных плазмидами, кодирующими белки слияния вариантов FAST с сигналами локализации. Непосредственно перед проведением FLIM-микроскопии, среду DMEM в чашке заменяли на раствор солей Хэнкса (Панэко, Россия) с добавлением 10 мМ HEPES (Corning, США), содержащий флуороген MMV32.4, разведенный из стокового раствора в ДМСО. Концентрация красителя составила 1 мкМ. После замены среды проводили инкубацию при комнатной температуре в течение 5 мин.

Микроскопию времени жизни флуоресценции проводили на микроскопе Eclipse Ti2 с 60* 1.4 иммерсионным объективом (Nikon Corporation, Япония), оборудованном сканирующим конфокальным модулем DCS-120 и детектором ИМР-100-40С с модулем SPC-150 (Becker&Hickl, Германия). Для возбуждения флуоресценции использовали пикосекундный лазер BDS-SM-LS-101 с длиной волны 640 нм, продолжительностью импульсов - 30 пс и частотой повторения импульсов - 50 МГц (Becker&Hickl, Германия). Средняя мощность лазера была настроена на 57% от максимальной. Использовали следующий набор эмиссионных фильтров: 485LP и ET660LP (Chroma Technology, США). Регистрацию фотонов проводили в течение 120 с.

2.7.1 Общий протокол обработки изображений

В качестве области интереса выбирали наиболее равномерный по интенсивности флуоресценции участок меченой внутриклеточной структуры. Для области интереса устанавливали значение пространственного биннинга ("Bin" в окне "Decay-Graph") на уровне, соответствующем 700-1000 анализируемых фотонов. Рамки временного канала устанавливали с помощью значений T1 и T2, захватывая всю кривую затухания флуоресценции за исключением региона базовой линии. Устанавливали значение порога визуализации флуоресценции ("Threshold") на уровне 20-600 в зависимости от применяемой метки (сенсоры полярности, комплексы вариантов FAST с исследуемыми флуорогенами); подбирали экспоненциальную функцию затухания (моноэкспоненциальное, биэкспоненциальное или триэкспоненциальное затухание) в окне "Multiexponential Decay". В случае если при аппроксимации кривой затухания критерий согласия соответствовал значению х2-13, принимали параметры и осуществляли расчет матрицы затухания флуоресценции (Calculate>Decay Matrix). Для каждого эксперимента проводили измерения времен жизни флуоресценции в случайно отобранных клетках из 4-6 полей зрения. Проекцию полной интенсивности, а также цветные изображения пространственного распределения времени жизни флуоресценции (т), средних взвешенных по амплитуде (тт) и/или интенсивности (Ti) времен жизни флуоресценции экспортировали в формате .tiff (File>Export..., "Color-coded image" и "Gray-scale image"). Результаты аппроксимации (значения т, Tm, Ti, относительные вклады компонент затухания, критерий согласия х2) анализировали с помощью программного пакета Origin 2021 (OriginLab Corporation, США), микрофотографии обрабатывали с помощью программы Fiji 1.54k (NIH, США).

Результаты анализа данных и обработки изображений представлены в таблицах 3.5, 3.8, 3.11 и на рисунках 3.2, 3.7, 3.8, 3.9, 3.10 А, 3.11 А, 3.12, 3.13 А, 3.18, 3.19 А, 3.21 Б, 3.23, 3.24 А.

2.7.2 Обработка изображений с окрашенными ЭПР и адипосомами

В программном пакете SPCImage 8.8 (Becker&Hickl, Германия) изменяли цветовой код изображения на дискретный и задавали цвета следующим образом: красный - для адипосом, зеленый - для ЭПР и остальных областей клеток. Изображение с дискретным цветовым кодом и проекцию полной интенсивности экспортировали в формате .tiff. Экспортированные

изображения обрабатывали с помощью программного пакета FIJI 1.54k (NIH, США): цветное изображение разделяли по цветовым каналам (Image>Color>Split Channels). Изображение для красного канала, содержащее липидные капли, отбрасывали. Изображение для зеленого канала, содержащее ЭПР и остальные части клеток, сохраняли в формате .tiff.

Результат обработки изображений представлен на рисунке 3.3.

2.7.3 Обработка изображений с несколькими локализациями с помощью параметрической

гистограммы

Параметры, необходимые для расчета матрицы затухания флуоресценции устанавливали аналогично описанным выше. Цветовой код, соответствующий пространственному распределению времени жизни флуоресценции (т) (в случае моноэкспоненциального затухания) или среднему, взвешенного по интенсивности, времени жизни флуоресценции (Ti) (в случае биэкспоненциально затухания) изменяли на дискретный (Options>Color, "Mode discrete"), и назначали область значений т или Ti для красного, зеленого и синего каналов. Полученные изображения экспортировали в формате .tiff и импортировали в FIJI 1.54k как RGB-файлы.

RGB-файлы трансформировали в RGB-стеки (Image>Type>RGB stack), которые разделяли на три изображения (Image>Stacks>Stack to images), одно из которых, в случаях с двумя локализациями, оставалось пустым. Полученные изображения содержали пиксели со значениями т или Ti из назначенных областей. Конвертировали каждое изображение в 16-битный формат (Image>Type>16 bit). Для визуализации финальных изображений была выбрана палитра, обеспечивающая корректное восприятие при дефиците цветового зрения (Image>Lut).

Результаты обработки изображений представлены на рисунках 3.10 Б, 3.11 Б, 3.12, 3.13 Б, 3.13 Г, 3.19 Б, 3.24 Б.

2.7.4 Обработка изображений с несколькими локализациями с помощью фазорной

диаграммы

Параметры, необходимые для расчета матрицы затухания флуоресценции устанавливали аналогично описанным выше. Рассчитывали фазорную диаграмму (кнопка "Phasor plot").

Цветовой код изменяли на дискретный (Options>Color, "Mode discrete") и назначали область значений т или т для красного канала 1-3000 пс, зеленый и синий каналы были оставлены пустыми. Была включена опция выбора кластера ("Select cluster") и был выбран кластер, соответствующий ядру, после чего изображение было экспортировано в формате .tiff. Аналогично была назначена область значений т или т для зеленого канала (1-3000 пс) и был выбран кластер, соответствующий виментину (в случае рисунка 3.13 - аппарату Гольджи), после

чего изображение было экспортировано в формате .tiff. В случае изображений с тремя мечеными локализациями (рисунки 3.13 и 3.21) аналогично была назначена область значений т или Ti для синего канала (1-3000 пс) и был выбран кластер, соответствующий митохондриям, после чего изображение было экспортировано в формате .tiff. Полученные изображения импортировали в FIJI 1.54k как RGB-файлы. Конвертировали каждое изображение в 16-битный формат (Image>Type>16 bit). Для визуализации финальных изображений была выбрана палитра, обеспечивающая корректное восприятие при дефиците цветового зрения (Image>Lut).

Результаты обработки изображений представлены на рисунках 3.10 В, 3.11 В, 3.12, 3.13 В, 3.13 Д, 3.19 В, 3.24 В.

2.7.5 Обработка изображений с пространственно наложенными сигналами

Параметры, необходимые для расчета матрицы затухания флуоресценции устанавливали аналогично описанным выше. Устанавливали биэкспоненциальную функцию затухания в окне "Multiexponential Decay". Компоненты времени жизни флуоресценции т1 и т2 были зафиксированы на значениях, полученных для белков слияния FAST с гистоном H2B, окрашенных флуорогеном HBR-2,5-DM (таблица 3.8). Осуществляли расчет матрицы затухания флуоресценции (Calculate>Decay Matrix). Матрицы, содержащие значения амплитуды компонент затухания (A1, A2) и интенсивности флуоресценции в каждом пикселе изображения экспортировали в формате .asc (File>Export..., "a1[%]", "a2[%]" и "Pixel Intensities"). Полученные матрицы импортировали в FIJI 1.54k как 32-битные файлы. Всем пикселям со значениями <0,1% на изображениях "a1[%]" и "a2[%]" было присвоено значение «не число» (not-a-number, NaN) (Image>Adjust>Threshold...). Выполняли попиксельное умножение изображений "Pixel intensity" и "a1[%]" или "a2[%]". В результате были получены два изображения: первое содержало пиксели только со значениями т1, второе - только со значениями т2. Для визуализации финальных изображений была выбрана палитра, обеспечивающая корректное восприятие при дефиците цветового зрения (Image>Lut).

Результаты обработки изображений представлены на рисунке 3.16.

Ранее в лаборатории химии гетероциклических соединений ГНЦ ИБХ РАН была синтезирована и охарактеризована серия арилиден-имидазолоновых флуорогенных красителей, обладающих выраженным сольватохромизмом и селективно окрашивающих ЭПР («сенсоры полярности») (рисунок 3.1) [4-6].

Рисунок 3.1 - Структуры и максимумы поглощения и эмиссии арилиден-имидазолоновых «сенсоров полярности». Для соединений Zs216, А1123 и 8А440 указаны максимумы поглощения и эмиссии в воде; для соединения А1445 - в метаноле.

ЭПР представляет собой клеточную органеллу, состоящую из сети полостей и трубочек, отделенную липидной мембраной от цитоплазмы, и играет ключевую роль во множестве внутриклеточных процессов: выступает в качестве депо ионов Са2+ [227], принимает участие в синтезе и транспорте липидов [228], мембранных и секреторных белков [229]. Ввиду того, что нарушение любой из указанных функций ведет к серьезным патологиям [230-234], ЭПР является важным объектом для наблюдения. Часто в процессе микроскопии возникает необходимость в селективном мечении ЭПР, а также четком визуальном отделении от других внутриклеточных структур. Примером таких структур являются адипосомы, образующиеся из ЭПР [235]. Ранее

было обнаружено, что некоторые из упомянутых выше красителей также окрашивают и адипосомы.

Адипосомы являются самостоятельными органеллами и обладают рядом собственных функций таких как хранение и компартментализация жиров и участие в метаболизме внутриклеточных белков [236]. Структурно адипосомы представляют собой фосфолипидный монослой со включенными белками, внутри которого содержатся триацилглицериды и эфиры стеринов. Учитывая важность перечисленных функций, адипосомы, как и ЭПР, являются важной внутриклеточной структурой для визуализации. Однако разделение ЭПР и адипосом при использовании только спектральных подходов в микроскопии не всегда является возможным. В связи с этим было выдвинуто предположение, что при инкубации живых клеток HeLa Kyoto с «сенсорами полярности» Zs216, Al123, Al445, SA440 возможно визуальное разделение ЭПР и адипосом по времени жизни флуоресценции в виду различной полярности среды.

3.1.1 Определение времени жизни флуоресценции в растворителях с различной

полярностью

Для понимания тенденции изменения времен жизни флуоресценции выбранных «сенсоров полярности» в различных средах, было проведено определение времен жизни флуоресценции красителей в органических растворителях с различной полярностью (Таблицы 3.1.-3.4). Установлено, что затухание флуоресценции исследуемых красителей описывается би-или триэкспоненциальными моделями. Данная особенность говорит о существовании множества механизмов релаксации возбужденного состояния исследуемых молекул.

Данный эффект оказался наименее выраженным для соединения Zs216, у которого вклад минорной короткоживущей компоненты составлял менее 10% во всех растворителях кроме гексана (17%) (таблица 3.1). У соединения Al123 оказалась более сложная природа релаксации: вклад короткоживущей компоненты значительно возрастал в более полярных средах (метанол, этанол) (Таблица 3.2). Наиболее сложной оказалась природа затухания флуоресценции у соединений Al445 и SA440, описываемая в некоторых случаях триэкспоненциальной моделью, со значительным вкладом всех компонент (таблицы 3.3 и 3.4). Квантовый выход соединения Al445 в некоторых полярных растворителях был крайне низким, что не позволило зарегистрировать достаточного количества фотонов и, как следствие, определить время жизни флуоресценции (таблица 3.3). Для данного красителя характерным было затухание флуоресценции по триэкспоненциальной модели в двух растворителях: хлористом метилене и тетрагидрофуране. Для соединения SA440 вклад третьей компоненты проявлялся при переходе к менее полярным средам (диоксан, толуол, гексан) (таблица 3.4).

растворителях, характеризующихся разной полярностью [237]

Растворитель Т1, ИБ А1, % Т2, ИБ А2, % Тт, нс КВФ, % [5]

МеОН 0,07 8 0,95 92 0,88 1,7

БЮН 0,08 7 1,26 93 1,18 4,6

Ацетонитрил 0,07 3 2,09 97 2,03 8,9

ДМСО 0,10 5 1,99 95 1,90 9,3

Диметилформамид 0,07 4 2,02 96 1,94 10,5

БЮАе 0,13 4 1,59 96 1,53 8,8

Диоксан 0,08 7 1,24 93 1,16 6,3

Ацетон 0,05 3 1,92 97 1,86 10,2

Тетрагидрофуран 0,07 5 1,44 95 1,37 8,8

СН2С12 0,11 3 1,85 97 1,80 12,2

Б12О 0,20 3 1,15 97 1,12 8,2

Толуол 0,09 8 1,04 92 0,96 5,9

Гексан 0,16 17 0,67 83 0,58 -

Таблица 3.2. Время жизни и квантовый выход флуоресценции соединения Л1123 в

растворителях, характеризующихся разной полярностью [237]

Растворитель Т1, ИБ А1, % Т2, ИБ А2, % Тт, нс КВФ, % [5]

МеОН 0,09 92 1,40 8 0,19 0,8

БЮН 0,11 59 0,51 41 0,27 16,0

Ацетонитрил 0,12 5 1,75 95 1,67 8,7

ДМСО 0,14 12 1,47 88 1,31 7,1

Диметилформамид 0,12 7 1,76 93 1,65 10,0

БЮАе 0,08 4 3,75 96 3,60 34,7

Диоксан 0,08 5 4,04 95 3,84 41,1

Ацетон 0,07 7 2,38 93 2,22 16,0

Тетрагидрофуран 0,08 4 3,78 96 3,63 31,2

СН2С12 0,08 5 3,27 95 3,11 23,4

Б12О 0,11 4 4,39 96 4,22 50,1

Толуол 0,10 5 4,03 95 3,83 38,3

Гексан 0,11 5 3,57 95 3,40 -

растворителях, характеризующихся разной полярностью [237]

Растворитель Т1, ИБ А1, % Т2, ИБ А2, % Т3, нс А3, % Тт, нс КВФ, % [4]

МеОН Низкая интенсивность флуоресценции 0,14

БЮН Низкая интенсивность флуоресценции 0,67

Ацетонитрил Низкая интенсивность флуоресценции 0,29

ДМСО Низкая интенсивность флуоресценции 0,73

Диметилформамид Низкая интенсивность флуоресценции 0,75

БЮАе 0,16 17 0,87 83 - - 0,75 5,86

Диоксан 0,09 8 2,48 92 - - 2,29 28,4

Ацетон Низкая интенсивность флуоресценции 0,57

Тетрагидрофуран 0,11 16 0,73 80 2,57 4 0,70 5,44

СН2С12 0,15 32 0,63 57 2,72 11 0,70 2,89

Б12О 0,07 5 2,95 95 - - 2,81 36,3

Толуол 0,10 6 3,25 94 - - 3,06 46,2

Гексан 0,10 6 3,13 94 - - 2,95 68,5

Таблица 3.4. Время жизни и квантовый выход флуоресценции соединения SA440 в

растворителях, характеризующихся разной полярностью [237]

Растворитель Т1, ИБ А1, % Т2, ИБ А2, % Т3, нс А3, % Тт, нс КВФ, % [6]

МеОН 0,15 80 0,46 20 - - 0,21 0,14

БЮН 0,15 78 0,52 22 - - 0,23 0,67

Ацетонитрил 0,14 43 0,46 57 - - 0,32 0,29

ДМСО 0,17 41 0,57 59 - - 0,41 0,73

Диметилформамид 0,18 44 0,56 56 - - 0,39 0,75

БЮАе 0,21 54 0,70 46 - - 0,44 5,86

Диоксан 0,13 21 0,52 49 1,49 30 0,73 28,4

Ацетон 0,18 55 0,54 45 - - 0,34 0,57

Тетрагидрофуран 0,23 55 0,84 45 - - 0,50 5,44

СН2С12 0,17 48 0,53 52 - - 0,36 2,89

Б12О 0,16 37 0,52 49 1,39 14 0,51 36,3

Толуол 0,15 23 0,56 46 1,52 31 0,76 46,2

Гексан 0,13 24 0,44 51 1,40 25 0,61 68,5

Необходимо отметить, что во всех случаях не было обнаружено какой-либо корреляции между временами жизни и квантовым выходом флуоресценции. Тем не менее, было обнаружено что времена жизни флуоресценции всех красителей существенно изменяются при переходе от наиболее полярного (метанол) к растворителю средней полярности (диоксан) и наименее полярному растворителю (гексан). Это позволило предположить, что применение FLIM позволит разделить сигналы от внутриклеточных структур, характеризующихся существенной разницей в полярности - ЭПР и адипосом.

При инкубации живых клеток HeLa Kyoto с красителями Zs216, A1123, A1445 и SA440 наблюдалось окрашивание ЭПР, а в трех случаях (Zs216, A1445, SA440) - и отдельных адипосом (Рисунок 3.2).

1.20f 0.70Г ^^^^Hi.oo

Рисунок 3.2 - FLIM-изображения живых клеток HeLa Kyoto, окрашенных исследуемыми «сенсорами полярности». Взято в оригинальном виде из [237]. (А) Zs216; (Б) A1123; (В) A1445; (Г) SA440. Цветовой код и диапазон времен жизни флуоресценции в наносекундах указан под каждой микрофотографией. Для красителей с биэкспоненциальным затуханием флуоресценции (A1123, A1445 и SA440) цветовой код соответствует среднему амплитудно-взвешенному времени жизни флуоресценции (тт). Масштабный отрезок - 10 мкм.

Характер затухания флуоресценции в органеллах живых клеток был во многом схожим с тем, что наблюдался в растворителях с различной полярностью (Таблица 3.5). Так, для красителя Zs216 было характерно затухание, описываемое моноэкспоненциальной моделью, в то время как для остальных красителей (A1123, A1445, SA440) затухание лучше описывалось биэкспоненциальной моделью. При анализе изображений, полученных при инкубации с

Таблица 3.5 - Значения времени жизни флуоресценции анализируемых красителей в ЭПР и адипосомах [237]. ББ - стандартное отклонение; п - соответствует числу индивидуальных клеток, отобранных для анализа

Краситель Локализация T1±SD, нс Al, % T2±SD, нс Л2, % Тт, НС п

Zs216 ЭПР 1,45±0,01 - - - - 30

Al123 1,32±0,12 44 3,63±0,19 56 2,60±0,04 30

Al445 0,64±0,09 46 2,27±0,15 54 1,51±0,07 30

SA440 0,65±0,02 92 2,96±0,70 8 0,81±0,03 30

Zs216 Адипосомы 1,35±0,04 - - - - 23

Al123 - - - - - -

Al445 0,71±0,17 40 2,45 ±0,30 60 1,74±0,10 13

SA440 0,65±0,03 89 2,67±0,63 11 0,86±0,03 17

При инкубации клеток с красителем Al123 было выявлено только равномерное окрашивание ЭПР. Значение среднего времени жизни флуоресценции составило Тт = 2,60 нс, что наиболее соответствует значению мажорной компоненты для данного красителя в ацетоне (т2 = 2,38 нс).

Инкубация с красителями Zs216, Al445 и SA440 приводила как к окрашиванию ЭПР, так и адипосом. Значения Тт между клеточными структурами оказались разными в каждом случае.

Для красителя Zs216 разница в значениях Тт между ЭПР и адипосомами была близка к 0,1 нс (ЭПР: 1,45 нс; адипосомы: 1,35 нс). Полученные значения соответствуют мажорным компонентам в тетрагидрофуране (т2 = 1,44 нс) и этаноле (т2=1,26 нс). Для красителя Al445 разница составила около 0,2 нс (ЭПР: 1,51 нс; адипосомы: 1,74 нс), однако эти значения не соответствуют данным, полученным в органических растворителях. Для красителя SA440 разница в значениях Тт у ЭПР и адипосом составила всего около 50 пс (0,81 нс и 0,86 нс соответственно). Полученные значения соответствовали минорной компоненте в тетрагидрофуране (Т2 = 0,84 нс). Столь незначительная разница в среднем времени жизни флуоресценции не позволяет четкого разделения между ЭПР и адипосомами на БЫМ-изображениях.

Таким образом, различие в среднем времени жизни флуоресценции как минимум в 0,1 нс делает возможным хоть и грубое, но достаточно корректное разделение микрофотографии по цветовым каналам и удаление определенных областей (в данном случае - с адипосомами) (рисунок 3.3).

Рисунок 3.3 - Микрофотографии живых клеток HeLa Kyoto, окрашенных красителями Zs216 и A1445. Взято в оригинальном виде из [237]. (А), (В) До удаления областей изображений, содержащих адипосомы. (Б), (Г) После удаления областей изображений, содержащих адипосомы. Масштабный отрезок - 10 мкм.

3.1.3 Заключение

В данной серии экспериментов с помощью FLIM был изучен набор ранее синтезированных «сенсоров полярности» арилиден-имидазолонового ряда, окрашивающих преимущественно ЭПР живых клеток. Было проведено сравнение поведения красителей в растворителях с различной полярностью, а также в живых клетках HeLa Kyoto. Не было выявлено какой-либо существенной корреляции между значениями времени жизни флуоресценции, полученными в разных органических растворителях, ЭПР и адипосомах. Было установлено, что с помощью FLIM возможно разделение флуоресцентно меченных органелл в случае, если разница в среднем времени жизни флуоресценции составляет не менее 0,1 нс. Таким образом, показано, что применение FLIM позволяет повысить специфичность микроскопии при окрашивании ЭПР исследованными флуорогенными красителями.

Флуороген-активирующий белок FAST является крайне перспективной генетически кодируемой меткой, для различных вариантов которой было продемонстрировано множество областей применения (см. раздел 1.4 обзора литературы). Данный белок обладает молекулярной массой всего 14 кДа, а нековалентное связывание лигандов делает метку более фотостабильной по сравнению с флуоресцентными или самомодифицирующимися белками.

Ранее в одной из наших работ, выполненной совместно с лабораторией биомолекулярной ЯМР-спектроскопии ГНЦ ИБХ РАН, был представлен 21 вариант белка FAST с точечными аминокислотными заменами [182]. Учитывая, что время жизни флуоресценции флуорофора зависит от его окружения, было выдвинуто предположение, что внесенные замены могут изменять окружение флуорогена в связывающем кармане белка и обеспечивать разное время жизни флуоресценции комплексов, образованных разными вариантами FAST и одним флуорогеном. Поэтому, такая система может быть использована для мультиплексных приложений во FLIM. Данный набор белков был использован в настоящей работе (приложение А).

Данная часть работы была направлена на разработку системы с эмиссией в зелено-оранжевой области видимого спектра. Для этого были использованы ранее синтезированные флуорогены, структуры которых представлены на рисунке 3.4.

Рисунок 3.4 - Арилиден-азолоны, использованные в данной части работы. Приведены свойства для комплексов с оригинальным белком FAST.

Для определения наиболее оптимальных комплексов FAST:флуороген, в первую очередь было проведено измерение времен жизни флуоресценции с использованием установки макро-FLIM на базе частотно-доменного оборудования Lambert Instruments FLIM Attachment (LIFA). Варианты FAST были экспрессированы в бактериях, после чего на колонии, соответствующие каждому варианту FAST, наносился раствор флуорогена. Система макро-FLIM позволяет проводить съемку всей поверхности чашки Петри для последующего анализа отдельных колоний (см. раздел 2.4.2).

В первую очередь из дальнейшей работы были исключены варианты FAST, экспрессия которых в бактериях приводила к образованию колоний с низкой интенсивностью флуоресценции при окрашивании используемыми флуорогенами (приложение Б, таблицы Б.1-Б.4): R52D, R52E, R52E/D65R, R52F, R52L, R52Y, P97T, P97T/T98G и V105I. Низкая интенсивность флуоресценции в данном случае может свидетельствовать о высоких значениях константы диссоциации (Kd), низком квантовом выходе и/или низком коэффициенте экстинкции комплексов FAST:флуороген. Впоследствии было отобрано 4 варианта, комплексы которых сохраняли тенденцию по временам жизни с каждым из исследуемых флуорогенов: F62L - с наибольшим временем жизни; P68T и R52K - с наименьшим; P68K - с промежуточными значениями времени жизни флуоресценции (таблица 3.6).

Таблица 3.6 - Результаты определения времен жизни флуоресценции на установке макро-FLIM

[224]. SD - стандартное отклонение.

Флуороген Варианты FAST Интенсивность, отн. ед. ± SD T9±SD, нс tm±SD, нс

HBR-2,5-DM F62L 4059±302 2,70±0,05 3,09±0,29

P68K 3727±198 2,48±0,06 2,95±0,38

P68T 3535±188 2,30±0,11 2,90±0,44

R52K 3360±126 2,18±0,06 2,99±0,40

HMBR F62L 3081±128 2,52±0,06 3,00±0,39

P68K 3421±147 2,16±0,06 2,79±0,42

P68T 3157±205 2,06±0,08 2,84±0,44

R52K 2824±137 2,13±0,07 3,00±0,42

HBR-DOM2 F62L 3232±470 3,15±0,09 3,51±0,22

P68K 3385±503 3,41±0,10 3,67±0,20

P68T 3478±532 3,39±0,12 3,67±0,20

R52K 3196±509 3,50±0,11 3,82±0,16

25DOM-HBI-2T F62L 1568±113 2,74±0,12 3,80±0,30

P68K 2705±74 2,37±0,07 3,15±0,36

P68T 2361±110 2,19±0,10 3,24±0,41

R52K 2989±120 2,47±0,07 3,29±0,35

Для определения свойств комплексов FAST:флуороген отобранных вариантов, были использованы очищенные препараты белков. Была проведена регистрация спектров комплексов FAST:флуороген, определены значения константы диссоциации комплексов (Ка), а также определено время жизни флуоресценции комплексов с помощью TCSPC-спектроскопии (рисунок 3.5, таблица 3.7).

450 500 550 600 Длина волны, нм

Рисунок 3.5 - Нормализованные спектры поглощения и эмиссии исследуемых комплексов FAST^yoporeH. Адаптировано из [224].

Таблица 3.7 - Свойства комплексов отобранных ^ вариантов FAST с флуорогенами [224]. SD - стандартное отклонение.

Флуороген Вариант Kd, мкМ s, M-1-cm-1 КВФ, % Яркость (=£-КВФ) Ex, нм Em, нм ti±SD, нс Ai, % T2±SD, нс A2, % Tm, нс Ti, нс X2

HBR-2,5-DM FAST 0,008 50000 29 14500 494 552 2,48±0,01 95 0,13±0,01 5 2,36 2,47 1,09

F62L 0,120 40500 43 17250 495 550 2,33±0,01 94 0,16±0,01 6 2,20 2,32 1,18

P68K 0,084 38500 34 13150 498 549 2,00±0,01 92 0,19±0,01 8 1,86 1,99 1,13

P68T 0,090 38500 31 11800 497 551 1,75±0,01 91 0,17±0,01 9 1,61 1,73 1,17

R52K 0,046 37500 25 9350 494 549 1,43±0,01 89 0,15±0,01 11 1,29 1,41 1,25

HMBR FAST 0,130 45000 31 13900 483 540 2,19±0,01 90 0,21±0,01 10 1,99 2,17 1,21

F62L 0,250 39500 33 12850 481 544 2,05±0,01 93 0,18±0,01 7 1,92 2,04 1,17

P68K 0,160 39500 30 11950 482 542 1,74±0,01 83 0,42±0,01 17 1,52 1,68 1,16

P68T 0,190 41500 34 14200 478 539 1,55±0,01 89 0,28±0,02 11 1,41 1,52 1,14

R52K 0,130 40000 22 8850 479 542 1,36±0,01 89 0,21±0,01 11 1,24 1,34 1,11

HBR-DOM2 FAST 0,021 30500 54 16500 510 566 3,74±0,01 98 0,43±0,03 2 3,68 3,73 1,14

F62L 0,036 31000 46 14400 502 565 2,88±0,01 97 0,46±0,04 3 2,81 2,87 1,15

P68K 0,030 30500 47 14400 505 568 3,53±0,01 100 - - 3,52 3,52 1,091

P68T 0,036 30000 52 15600 504 565 3,30±0,01 100 - - 3,30 3,30 1,29

R52K 0,035 35500 50 17700 524 567 3,55±0,01 98 0,22±0,02 2 3,48 3,55 1,12

25DOM-HBI-2T FAST 0,520 92000 21 19300 523 539 2,92±0,08 472 1,70±0,07 44 2,13 2,47 1,24

F62L 0,970 69000 20 13450 522 539 1,98±0,01 84 0,19±0,01 16 1,70 1,95 1,30

P68K 0,340 69500 26 18200 524 540 1,96±0,01 88 0,21±0,01 12 1,75 1,93 1,29

P68T 0,520 68000 20 13350 524 540 1,72±0,01 85 0,19±0,01 15 1,49 1,69 1,24

R52K 0,440 70500 29 20350 524 540 2,32±0,01 88 0,28±0,01 12 2,08 2,29 1,27

Примечания 1 При определении времени жизни флуоресценции комплекса P68K:HBR-DOM2 была выполнена аппроксимация "tail-fit" 2 При определении времени жизни флуоресценции комплекса FAST:25DOM-HBI-2T была обнаружена третья компонента тз = 0.145±0.007 нс (9%)

Данные, полученные с помощью TCSPC-спектроскопии, показали, что комплексы оригинального белка FAST со всеми флуорогенами, обладают наибольшим временем жизни флуоресценции (таблица 3.7). Также было обнаружено, что константа диссоциации комплекса FAST:HBR-2,5-DM имеет крайне низкое значение (Kd=0,008 мкМ). Одной из ключевых особенностей FAST как метки является нековалентное связывание лиганда и, как следствие, повышенная фотостабильность из-за постоянного обновления лиганда в комплексе. Низкое значение Kd существенно сказывается на кинетике данного процесса и может привести к значительному снижению фотостабильности и осложнить работу в мультиплексных приложениях. Более того, при мечении нескольких внутриклеточных компонентов большая разница в значениях Kd комплексов может привести к неравномерному насыщению вариантов FAST флуорогеном и, как следствие, существенной разнице в интенсивности флуоресцентного сигнала. В связи с этим оригинальный вариант FAST не был включен в дальнейшие эксперименты на живых клетках. Значения Kd комплексов остальных вариантов FAST со всеми флуорогенами были достаточно близки. Среди отобранных вариантов F62L имеет наименьшую аффинность ко всем исследуемым флуорогенам, что, вероятно, связано с утратой эффективного п-стэкинга с их бензилиденовым фрагментом (таблица 3.7).

Необходимо отметить, что не было обнаружено прямой корреляции между значениями константы диссоциации и квантовым выходом или временами жизни флуоресценции. И в данном случае нет возможности предсказать влияние параметров друга на друга: эффективное связывание флуорогена (низкие значения Kd) не гарантирует высокого квантового выхода или продолжительных времен жизни флуоресценции. В более ранних работах нашей лаборатории и других авторов [181; 182; 219; 223; 238] также не наблюдалось корреляции между значениями Kd и квантовым выходом флуоресценции. Данная особенность может быть объяснена тем, что более сильное связывание флуорогена белком не всегда гарантирует жесткое блокирование молекулы флуорогена в конформации, способствующей возникновению флуоресценции.

В зависимости от структуры флуорогена, отобранные варианты (F62L, P68K, P68T, R52K) оказывают разнонаправленные эффекты на квантовый выход и коэффициент экстинкции комплексов (таблица 3.7). Однако комплексы всех вариантов белка и флуорогенов характеризуются схожими показателями яркости.

Практически для всех комплексов FAST:флуороген наблюдалось биэкспоненциальное затухание флуоресценции (таблица 3.7). Однако в большинстве случаев вклад второй компоненты не был существенным. Заметное отклонение было зафиксировано только у комплекса FAST:25DOM-HBI-2T (A1 = 47%, A2 = 44%). При анализе было выявлено только два комплекса, обладающих моноэкспоненциальным затуханием флуоресценции (P68T:HBR-DOM2 и P68K:HBR-DOM2); остальные 14 комплексов, аппроксимация кривых затухания которых

соответствовала биэкспоненциальной модели, содержали минорную флуоресцентную компоненту с очень короткими временами жизни флуоресценции (100-300 пс) и малым относительным вкладом в среднее время жизни флуоресценции (~10%). Учитывая, что при проведении FLIM-микроскопии регистрируется меньшее количество фотонов по сравнению с TCSPC-спектроскопией, данные компоненты могут быть неразличимы, что в итоге приведет к получению сигнала, описываемого моноэкспоненциальной моделью затухания. Присутствие минорных компонент может быть объяснено наличием дополнительных конформационных форм флуорогена, образуемых ввиду его подвижности. Среди потенциальных областей такой подвижности можно отметить экзо^^-связь имидазолонового фрагмента и C-C связь арилиденового фрагмента флуорогенов, что было ранее показано для других арилиден-азолонов. Изменение геометрии молекулы затруднительно для лигандов с крупными заместителями, таких как HBR-DOM2, в то время как соединения HMBR и HBR-2,5-DM более подвержены данному процессу.

3.2.3. Анализ структур комплексов и их связи со временем жизни флуоресценции

Время жизни флуоресценции зависит от двух параметров: скорости излучательных (kr) и безызлучательных (knr) переходов. Скорость излучательных переходов зависит главным образом от электронной структуры флуорогена, в то время как скорость безызлучательных переходов зависит от нескольких факторов. В отсутствии FRET, переноса протонов, тушения флуоресценции или изомеризации флуорогена, главным фактором является молекулярная динамика. Скорость переходов может быть оценена для заданных времен жизни флуоресценции и квантового выхода [239]. В случае нашего набора данных такой анализ предполагает, что влияние на время жизни флуоресценции аминокислотных замен, внесенных в FAST, наиболее вероятно определяется knr и динамикой флуорогена и его окружения внутри связывающего кармана белка. Таким образом, времена жизни флуоресценции в конкретном комплексе FAST:флуороген можно проанализировать с точки зрения возможных изменений в локальной подвижности белка, вызванных внесенной заменой. Чтобы получить наиболее полное представление о влиянии аминокислотных замен на структуры комплексов FAST:флуороген, наши коллеги из лаборатории биомолекулярной ЯМР-спектроскопии ГНЦ ИБХ РАН с помощью программного пакета PyMOL сгенерировали набор моделей вариантов белка FAST на основе данных, ранее полученных для комплекса nanoFAST:HBR-DOM2 [240] и провели тщательный анализ (рисунок 3.6).

Рисунок 3.6 - Результаты анализа структур комплексов вариантов FAST и флуорогенов. Адаптировано из [224]. (А), (Б) Корреляция между временами жизни основных (продолжительных) компонент (значения Т1 из таблицы 3.7) и константами излучательных (А) и безызлучательных переходов (Б), рассчитанных для каждого комплекса FAST:флуороген. (В)-(Е) Модели, сгенерированные с помощью PyMOL, демонстрирующие возможные эффекты замен (созданы на основе пространственной структуры комплекса nanoFAST:HBR-DOM2 (код PDB: A8O0)) [240]. Боковая цепь изначальной аминокислоты окрашена серым; внесенные замены окрашены желтым, синим и оранжевым; молекула флуорогена окрашена голубым.

Замена F62L оказывает влияние на время жизни флуоресценции комплексов с двумя флуорогенами: HBR-DOM2 и 25DOM-HBI-2T. В отличие от HMBR и HBR-2,5-DM, данные флуорогены имеют метокси-группы в арилиденовой части молекулы и, таким образом, занимают большее пространство в связывающем кармане белка. Аминокислотный остаток 62 находится очень близко к бензильному фрагменту флуорогенов, что было показано как для FAST, так и для его производного - nanoFAST [240]. По-видимому, фенилаланин, который крупнее лейцина, в положении 62 оказывает существенное влияние на стабилизацию крупных метокси-замещенных лигандов в связывающем кармане, но не влияет на процесс связывания меньших метил-замещенных соединений (рисунок 3.6 В). Кроме того, фенилаланин может входить в п-стэкинг с бензильным фрагментом лиганда, а наличие метокси-групп вместо метильных групп может изменять форму электронных орбиталей и, как следствие, влиять на конфигурацию и силу п-стэкинга.

Схожая зависимость была обнаружена для замены R52K (рисунок 3.6 Г), которая, напротив, приводит к формированию менее стабильных комплексов с метил-замещенными флуорогенами. В комплексе nanoFAST:HBR-DOM2 [240], боковая цепь R52 входит в контакт с 5-метокси группой, которая отсутствует у флуорогенов HMBR и HBR-2,5-DM. Это говорит о том, что в случае менее объемных метил-замещенных лигандов, остаток R52 может образовывать стабилизирующий полярный контакт с роданиновым фрагментом молекулы. Данное предположение согласуется с предыдущими исследованиями, в которых была показана важность остатка R52, участвующего в п-катионных взаимодействиях с некоторыми арилиден-имидазолоновыми флуорогенами [181; 182]. В данном случае замена аргинина с ригидной боковой цепью на более подвижный остаток лизина дестабилизирует связывающий карман и приводит к снижению времени жизни флуоресценции комплексов с метил-замещенными лигандами.

Замены P68K и P68T сокращают время жизни флуоресценции комплексов со всеми исследуемыми флуорогенами. P68 соседствует с G69 - одним из ключевых аминокислотных остатков в FAST. Согласно структуре комплекса nanoFAST: HBR-DOM2, остаток G69 способен к формированию полярных контактов с атомом азота в арилиден-роданиновых флуорогенах. Поэтому данная область белка должна быть стабилизирована. Пролин является одним из наиболее ригидных аминокислотных остатков из-за конформационных ограничений в боковой цепи, поэтому ожидаемо, что замены P68K и P68T усиливают динамику остатка G69 и сокращают время жизни флуоресценции.

Учитывая, что значение времени жизни флуоресценции, полученное при измерениях in vitro может существенно отличаться от значений, полученных in cellulo, отобранные варианты FAST в первую очередь были экспрессированы в клетках HeLa Kyoto в виде белков слияния с гистоном H2B (рисунок 3.7).

HBR-2,5-DM HBR-DOM2 HMBR 25DOM-HBI-2T

1.39* 1.69* 1.93* 2.20*

3.62* 3.47* 3.51* 3.07*

1.27** 1.42** 1.53** 1.93**

2.16** 1.60** 1.53** 1.77**

Общая интенсивность

Время жизни флуоресценции

* - моноэкспоненциальная ** - биэкспоненциальная модель модель (т.)

i

I» %

s

%

Рисунок 3.7 - Измерение времени жизни флуоресценции в живых клетках HeLa Kyoto. Адаптировано из [224]. (А) Времена жизни флуоресценции флуорогенов в комплексах с вариантами FAST, экспрессированными в виде белков слияния с гистоном H2B. Приведены усредненные значения, полученные при анализе n>16 клеток. (Б) Микрофотографии клеток HeLa Kyoto, меченных комплексами вариантов R52K, P68T, P68K и F62L (слева направо) с флуорогеном HBR-2,5-DM. Цветовой код показывает время жизни флуоресценции, полученное в результате аппроксимации по моноэкспоненциальной модели. Масштабный отрезок - 20 мкм.

Ядерная локализация с использованием гистона H2B позволяет получить относительно равномерное распределение флуоресцентной метки и, как следствие, сигнала, что позволяет корректное определение кинетики затухания флуоресценции в живых клетках. В процессе анализа изображений была использована функция пространственного биннинга - суммирования данных о затухании флуоресценции в смежных пикселях. При значениях пространственного биннинга 4-5, кинетика затухания комплекса FAST:флуороген показывала около 1000 фотонов, позволяя адекватно использовать мультикомпонентные модели.

Было обнаружено, что кривая затухания флуоресценции комплексов с флуорогенами HBR-2,5-DM и HBR-DOM2 адекватно описывается моноэкспоненциальной моделью, со значениями х2 меньшими, чем при использовании биэкспоненциальной модели (таблица 3.8). Данная особенность может быть связана с минимальным вкладом минорной компоненты. Для комплексов с флуорогенами HMBR и 25DOM-HBI-2T характерным остался биэкспоненциальный спад флуоресценции, а содержание минорной компоненты увеличилось по сравнению с данными, полученными in vitro. Наибольшие изменения в значениях времени жизни флуоресценции и кинетики затухания были свойственным комплексам с 25DOM-HBI-2T, что может свидетельствовать о повышенной чувствительности флуорогена к условиям окружающей среды.

Таблица 3.8 - Сравнение времен жизни флуоресценции комплексов FAST:флуороген, полученных в живых клетках HeLa Kyoto (ядерная локализация) [224]. Приведены данные с использованием аппроксимации по моно- и биэкспоненциальной моделям. SD - стандартное

отклонение. Во всех случаях число клеток, отобранных для анализа п=16.

Флуороген FAST Моно- Биэкспоненциальная модель

экспоненциальная

модель

t±SD, нс х2 T1±SD, нс A1±SD, % T2±SD, нс A2± SD, % Tm±SD, нс Ti±SD, нс х2

HBR-2,5-DM H2B-F62L 2,20±0,01 <1,2 1,37±0,28 20,2±6,3 2,36±0,03 79,8±6,3 2,17±0,03 2,24±0,01 <1,2

H2B-R52K 1,39±0,01 <1,2 1,26±0,04 66,6±8,3 1,64±0,11 33,4±8,3 1,38±0,01 1,40±0,01 <1,2

H2B-P68K 1,93±0,02 <1,2 1,29±0,17 33,9±11,0 2,20±0,09 66,1±11,0 1,89±0,04 1,99±0,03 <1,2

H2B-P68T 1,69±0,02 <1,2 1,48±0,04 81,9±5,3 2,58±0,19 18,1±5,3 1,67±0,02 1,77±0,03 <1,2

HBR-DOM2 H2B-F62L 3,07±0,07 <1,2 2,81±0,23 54,0±9,1 3,53±0,39 46,0±9,1 3,10±0,07 3,17±0,08 >1,2

H2B-R52K 3,62±0,05 <1,2 3,31±0,28 49,6±5,9 3,97±0,27 50,4±5,9 3,65±0,05 3,70±0,11 >1,2

H2B-P68K 3,51±0,08 <1,2 3,16±0,35 48,9±6,4 3,92±0,34 51,1±6,4 3,55±0,07 3,61±0,13 >1,2

H2B-P68T 3,46±0,06 <1,2 3,28±0,17 51,2±5,7 3,70±0,17 48,8±5,7 3,48±0,06 3,50±0,06 <1,2

HMBR H2B-F62L 1,90±0,02 >1,2 0,56±0,16 22,0±3,4 2,04±0,03 77,6±3,4 1,71±0,05 1,93±0,02 <1,2

H2B-R52K 1,24±0,01 >1,2 0,70±0,08 42,7±7,8 1,47±0,06 57,3±7,8 1,14±0,01 1,27±0,01 <1,2

H2B-P68K 1,47±0,01 >1,2 0,80±0,05 48,9±4,6 1,84±0,05 51,1±4,6 1,33±0,01 1,53±0,01 <1,2

H2B-P68T 1,40±0,02 >1,2 0,68±0,08 31,9±6,6 1,57±0,05 68,1±6,6 1,29±0,03 1,42±0,02 <1,2

25DOM-HBI- H2B-F62L 1,66±0,02 >2,0 0,69±0,09 43,9±5,1 2,06±0,09 56,1±5,1 1,46±0,03 1,77±0,03 <1,2

2T H2B-R52K 1,97±0,02 >1,2 1,21±0,06 54,0±2,5 2,67±0,05 46,0±2,5 1,88±0,02 2,16±0,02 <1,2

H2B-P68K 1,78±0,02 >1,2 1,28±0,11 58,2±8,7 2,36±0,14 41,2±8,7 1,72±0,04 1,89±0,02 <1,2

H2B-P68T 1,51±0,02 >1,2 0,96±0,06 55,6±5,9 1,99±0,06 44,4±0,1 1,42±0,03 1,60±0,02 <1,2

Дополнительный анализ, проведенный с помощью фазорной диаграммы подтвердил изменения во временах жизни и характере затухания флуоресценции, полученные с помощью аппроксимации кривой затухания: центры кластеров распределения флуоресцентного сигнала для комплексов с флуорогенами HBR-2,5-DM и HBR-DOM2, показавшие затухание флуоресценции по моноэкспоненциальной модели, были расположены прямо на полукруге фазорной диаграммы, что соответствует моноэкспоненциальному затуханию (рисунок 3.8).

Рисунок 3.8 - Фазорные диаграммы комплексов вариантов FAST с флуорогенами. Ядерная локализация. Взято в оригинальном виде из [224].

Для каждого из четырех флуорогенов оказалось возможным подобрать пару вариантов FAST, комплексы которых обладают существенной разницей во временах жизни флуоресценции. Однако узкий диапазон значений времен жизни флуоресценции для комплексов с HBR-DOM2 и 25DOM-HBI-2T может существенно усложнить мультиплексинг во FLIM, поэтому, данные флуорогены были исключены из экспериментов по мечению нескольких внутриклеточных структур.

Для экспериментов, связанных с мечением двух локализаций, внутриклеточные мишени отбирались по следующим принципам: (1) мишень должна иметь характерный и ярко выраженный структурный паттерн; (2) представлять некоторую степень пространственного наложения сигнала с другими мечеными локализациями. Таким образом, для парного мечения были использованы ядерная локализация (гистон Н2В) и расположенный в цитоплазме, но примыкающий к ядру виментин - белок промежуточных филаментов [241].

В первую очередь, было проведено парное мечение комплексами флуорогена ИМВЯ, с использованием, в общей сложности, шести пар (рисунок 3.9), три из которых (Н2В-F62L/виментин-R52K, H2B-F62L/виментин-P68K, H2B-F62L/виментин-P68T) показали существенную разницу во временах жизни.

А _ А А __ А __

Q&lg 1 Ж -

Общая интенсивность г m X. 1

В

Ф : щ Щ 1.. ^ ' W

Общая интенсивность X m X.

1 f ЛГ^ gt Vv;

Общая интенсивность X m т.

T § ' Jt

0 в ■ g> ь t $

Общая интенсивность X m X. 1

r«i

s

II ! t$ , 1 f

Общая интенсивность X m T. 1

«

Общая интенсивность

Рисунок 3.9 - FLIM-изображения живых клеток HeLa Kyoto, меченых комплексами вариантов FAST (в виде белков слияния с H2B и виментином) с флуорогеном HMBR. Адаптировано из [224]. Приведены изображения со средними взвешенными по амплитуде (im) и интенсивности (ii) временами жизни флуоресценции. Цветовой код соответствует диапазону 1,2-2,2 нс. (А) H2B-F62L/виментин-R52K. (Б) H2B-F62L/виментин-P68K. (В) H2B-F62L/виментин-P68T, (Г) H2B-R52K/виментин-P68K. (Д) H2B-R52K/виментин-P68T. (Е) H2B-P68T/виментин-P68K.

VO

Общая интенсивность

гт\ )

Анализ по значениям т

Наложение

' » л

* 1 L_

1.4 1.7 1.8 2.1

шк. ш

vimentin-P68K

H2B-F62L

В Анализ по фазорной диаграмме

Наложение \1 ns

vimentin-P68K H2B-F62L

Рисунок 3.10 - Анализ изображения, полученного в результате мечения двух внутриклеточных структур комплексами вариантов FAST (в виде белков слияния H2B-F62L и виментин-Р68К) с флуорогеном HMBR. Адаптировано из [224]. (А) Изображение общей интенсивности и FLIM-изображения полученные аппроксимацией по моно- (т) и биэкспоненциальной моделям (Ti).

(Б) Результат назначения псевдоцветов в диапазонах 1,4-1,7 нс для виментин-Р68К и 1,8-2,1 нс для H2B-F62L. (В) Результат назначения псевдоцветов с помощью фазорной диаграммы по специфическим кластерам для комплексов вариантов P68K и F62L. Масштабный отрезок - 10 мкм.

Подобное распределение позволяет осуществить дифференциальное назначение псевдоцветов для меченых областей клетки, соответствующее значениям средних взвешенных по интенсивности времен жизни флуоресценции (ц). Аналогично, опираясь на специфические

кластеры на фазорной диаграмме, соответствующие белкам слияния с H2B и виментином, возможна дискретная визуализация локализованных вариантов белка FAST.

Далее был проведен аналогичный анализ данных, полученных для комплексов с флуорогеном HBR-2,5-DM (рисунок 3.11).

Рисунок 3.11 - Анализ изображения, полученного в результате мечения двух внутриклеточных структур комплексами вариантов FAST (в виде белков слияния H2B-F62L и виментин-Я52К) с флуорогеном HBR-2,5-DM. Адаптировано из [224]. (А) Изображение общей интенсивности и FLIM-изображения, полученные аппроксимацией по моно- (т) и биэкспоненциальной моделям (Ti). (Б) Результат назначения псевдоцветов в диапазонах 1,3-1,6 нс для виментин-Я52К и 1,8-2,3 нс для H2B-F62L. (В) Результат назначения псевдоцветов с помощью фазорной диаграммы по специфическим кластерам для комплексов вариантов R52K и F62L. Масштабный отрезок - 10 мкм.

В эксперименте с использованием ядерной локализации, описанном выше, комплексы вариантов FAST с данным флуорогеном показали затухание флуоресценции описываемое моноэкспоненциальной моделью. Также в измерениях проведенных in vitro, для комплексов с

данным флуорогеном наблюдались наиболее выраженные вариации во временах жизни флуоресценции. Аналогично эксперименту с HMBR, на параметрической гистограмме наблюдались четко выраженные пики для разных вариантов FAST (рисунок 3.11 Б). В данном случае было возможно одинаково успешное разделение со схожими результатами с использованием аппроксимации как по моноэкспоненциальной, так и по биэкспоненциальной модели. Важно отметить, что такое разделение могло быть получено не только из-за моноэкспоненциального характера затухания флуоресценции, но и из-за минимального пространственного наложения между мечеными областями. Анализ с использованием фазорной диаграммы привел к получению аналогичных результатов (рисунок 3.11 В).

Аналогичные результаты были получены и для двух других пар: Н2В-Р68Т/виментин-R52K и H2B-F62L/виментин-P68T (рисунок 3.12)

Рисунок 3.12 - Анализ изображения, полученного в результате мечения двух внутриклеточных структур комплексами вариантов FAST. Адаптировано из [224]. Цветные FLIM-изображения на верхней панели получены аппроксимацией по моноэкспоненциальной (т) и биэкспоненциальной моделям (Ti) комплексов флуорогена HBR-2,5-DM. (А) H2B-Р68Т/виментин-К52К (Б) H2B-F62L/виментин-P68T.

Учитывая успешный анализ парных локализаций с вариантами R52K, P68T и F62L, в дальнейшем было проведено мечение трех локализаций в одной клетке с использованием флуорогена HBR-2,5-DM. Ввиду того, что время жизни флуоресценции чувствительно к изменениям окружающей среды флуорофора, предварительно был проведен анализ времен жизни флуоресценции комплексов вариантов FAST с HBR-2,5-DM в дополнительных клеточных

локализациях: межмембранном пространстве митохондрий (IMS) и аппарате Гольджи (P4Gal-T1) (таблица 3.9). Существенных изменений во временах жизни флуоресценции в различных локализациях обнаружено не было, что позволило перейти к экспериментам с мечением трех мишеней.

Таблица 3.9 - Времена жизни флуоресценции комплексов вариантов FAST с флуорогеном HBR-2,5-DM, экспрессированных в ядре, виментине, межмембранном пространстве митохондрий (IMS) и аппарате Гольджи (P4Gal-T1) [224]. Аппроксимация по моноэкспоненциальной модели. SD - стандартное отклонение; n - соответствует числу индивидуальных клеток, отобранных для анализа.

Вариант FAST H2B, т ± SD, ns Виментин, т ± SD, ns IMS, т ± SD, ns P4Gal-T1, т ± SD, ns

F62L 2,20 ± 0,03 n = 23 2,20 ± 0,03 n = 23 2,17 ± 0,02 n = 25 2,24 ± 0,04 n = 24

P68K 1,91 ± 0,02 n = 21 1,88 ± 0,01 n = 21 1,87 ± 0,02 n = 23 1,81 ± 0,02 n = 20

P68T 1,67 ± 0,01 n = 24 1,68 ± 0,03 n = 27 1,66 ± 0,04 n = 22 1,59 ± 0,03 n = 21

R52K 1,37 ± 0,01 n = 22 1,32 ± 0,02 n = 24 1,31 ± 0,02 n = 24 1,29 ± 0,02 n = 23

3.2.6. Визуализация трех внутриклеточных структур с помощью FLIM

Для одновременной визуализации трех внутриклеточных структур в качестве мишеней были использованы ядерная (H2B), митохондриальная (IMS) и Гольджи (P4Gal-T1) локализации, комбинация которых может приводить к пространственному наложению сигналов [242; 243].

В целом, одновременная визуализация трех внутриклеточных мишеней с использованием флуорогена HBR-2,5-DM была успешной, с получением сигналов со схожей амплитудой. Разница во временах жизни флуоресценции позволила четко разделить флуоресцентные сигналы в областях без наложения как с помощью аппроксимации, так и с помощью фазорной диаграммы (рисунок 3.13).

Рисунок 3.13 - Анализ изображения, полученного в результате мечения трех внутриклеточных структур комплексами вариантов FAST (в виде белков слияния H2B-P68T, IMS-F62L и p4Gal-T1-R52K) с флуорогеном HBR-2,5-DM. Адаптировано из [224]. (А) Изображение общей интенсивности и FLIM-изображения, полученные аппроксимацией по моно-(т) и биэкспоненциальной моделям (Ti). (Б) Результат назначения псевдоцветов в диапазонах 1,31,6 нс для p4Gal-T1-R52K, 1,6-1,8 нс для H2B-P68T и 1,8-2,3 нс для IMS-F62L. (В) Результат назначения псевдоцветов с помощью фазорной диаграммы по специфическим кластерам для комплексов вариантов F62L, R52K и P68T. (Г) Параметрическая гистограмма. (Д) Фазорная диаграмма. Масштабный отрезок - 10 мкм.

Биэкспоненциальная модель Триэкспоненциальная модель

Значение х2

Значение т.

'life

: f

J'Л

Л г

ЩШ'

А

о

2,5 не

о.

1,4 не

Рисунок 3.14 - FLIM-изображения живых клеток HeLa Kyoto, меченых комплексами трех вариантов белка FAST (в виде белков слияния H2B-P68T, IMS-F62L, p4Gal-T1-R52K), с флуорогеном HBR-2,5-DM, с аппроксимацией по би- и триэкспоненциальной моделям. Адаптировано из [224]. Верхняя панель: Цветовой код отображает значения х2. Голубые области на изображении с триэкспоненциальной моделью соответствуют значениям х2> 10. Нижняя панель: Цветовой код отображает значения Ti. Артефакты цветового кода видны в областях со значениями х2>10

Несмотря на одновременное присутствие в клетке комплексов трех вариантов FAST с различными временами жизни флуоресценции, использование биэкспоненциальной модели показало наилучшие результаты. Применение триэкспоненциальной модели приводило к возникновению областей с очень низким качеством аппроксимации (х2> 10) и некорректными значениями Ti, что может быть связано с отсутствием областей с перекрыванием сигнала от трех меток, а это делает применение триэкспоненциальной модели избыточным и неуместным.

Учитывая, что для комплексов с флуорогеном ИБК-2,5-ВМ характерно затухание флуоресценции по моноэкспоненциальной модели, был проведен анализ пространственно наложенных сигналов при мечении нескольких внутриклеточных структур.

В процессе обработки микрофотографий с тремя мечеными внутриклеточными структурами (H2B-P68K, виментин-R52K, IMS-F62L), были обнаружены несколько областей с выраженно перекрывающимися флуоресцентными сигналами от комплексов белков слияния виментин-К52К и IMS-F62L. С помощью анализа по аппроксимации было установлено, что значения времени жизни флуоресценции в перекрывающихся областях соответствуют значениям, полученными для одиночных комплексов R52K:HBR-2,5-DM и F62L:HBR-2,5-DM (рисунок 3.15).

Рисунок 3.15 - Пример анализа областей с перекрывающимися сигналами, выполненный с помощью аппроксимации. Адаптировано из [224]. (А) Схематическое изображение, показывающие наложение сигналов между мечеными виментином и митохондриями. (Б) FLIM-изображение живых клеток HeLa Kyoto, меченых комплексами трех вариантов FAST (в виде белков слияния H2B-P68K, виментин-R52K, IMS-F62L) с флуорогеном HBR-2,5-DM. Обведенные участки показывают три области интереса с перекрывающимися сигналами от виментин-К52К и IMS-F62L. (В) Данные из программы Becker&Hickl SPCImage, показывающие кривые затухания флуоресценции в областях интереса. Во всех случаях применение биэкспоненциальной модели без фиксирования значений т адекватно описывает затухание флуоресценции и приводит к получению значений времени жизни, схожих с таковыми у одиночных комплексов R52K:HBR-2,5-DM и F62L:HBR-2,5-DM.

При мечении парами mB-P68K^MeHTOH-R52K, mB-F62L^MeHTOH-P68T, H2B-R52K/виментин-P68T и H2B-F62L/p4Gal-T1-R52K разделение сигналов, в том числе перекрывающихся, было возможным при использовании данных, полученных для одиночных локализаций с затуханием флуоресценции по моноэкспоненциальной модели. Для этого при анализе изображений была выполнена аппроксимация по биэкспоненциальной модели, а значения времени жизни флуоресценции Т1 и Т2 фиксировались и соответствовали значениям т каждого варианта FAST в слиянии с гистоном H2B из таблицы 3.8 (см. раздел 2.7.5) (рисунок 3.16).

Вариант FAST Цветовой код т, не

R52K 1,4

Р68Т I- 1 1,7

F62L 1 J 2,2

Общая

интенсивность Наложение Виментин Н2В

-

/ ^^кЧ Г

Общая интенсивность Наложение P4Gal-Tl H2B