Флуоресцентный время-разрешенный имиджинг энергетического метаболизма опухолевых клеток тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, доктор наук Ширманова Марина Вадимовна

• Ширманова Марина Вадимовна
• доктор наук
• 2024

Оглавление диссертации доктор наук Ширманова Марина Вадимовна

2. ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ ДОКЛАДА

2.1. Основы оптического метаболического имиджинга

2.2. Методики оценки энергетического метаболизма клеток с помощью

FLIM

2.2.1. FLIM-микроскопия НАД(Ф)Н и ФАД, редокс-отношение

2.2.2. FLIM НАД(Ф)Н на макро-уровне

2.3. Принципы мультипараметрического имиджинга с использованием

FLIM НАД(Ф)Н

2.4. Особенности энергетического метаболизма опухолей в условиях естественного роста по данным FLIM

2.4.1. FLIM-микроскопия опухолевых сфероидов, опухолей мышей

in vivo и образцов опухолей пациентов

2.4.2. Возможности макро-FLIM для дифференцирования опухоли от нормальной ткани

2.5. Исследование метаболических изменений при апоптозе опухолевых клеток с использованием FLIM НАД(Ф)Н и генетически кодируемого сенсора активности каспазы-3

2.6. Оценка ответа опухолей на химиотерапию с помощью оптического метаболического имиджинга

2.6.1. Изменение энергетического метаболизма опухолевых клеток

при химиотерапии в экспериментах in vitro и in vivo........................,

2.6.2. Химиотерапия первичных культур опухолевых клеток

2.7. Метаболический ответ опухолевых клеток на ФДТ по данным FLIM

2.7.1 FLIM НАД(Ф)Н при ФДТ с генетически кодируемым фотосенсибилизатором KillerRed

2.7.2 FLIM НАД(Ф)Н при ФДТ c фотодитазином

2.8. Взаимосвязь энергетического метаболизма и кислородного статуса опухолевых клеток по данным FLIM и PLIM

2.8.1. Методики комбинированной оценки фосфоресценции кислородных сенсоров и автофлуоресценции НАД(Ф)Н в опухолях с помощью PLIM и FLIM

2.8.2. PLIM и FLIM при химиотерапии и ФДТ

2.9. Связь энергетического метаболизма с физико-химическими показателями опухолевых клеток - рН и микровязкостью

3. ЗАКЛЮЧЕНИЕ И ВЫВОДЫ

4. СПИСОК НАУЧНЫХ ПУБЛИКАЦИЙ ЗА ПОСЛЕДНИЕ 10 ЛЕТ, В КОТОРЫХ ИЗЛОЖЕНЫ ОСНОВНЫЕ НАУЧНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ДИССЕРТАЦИИ

5. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. ВВЕДЕНИЕ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Флуоресцентный время-разрешенный имиджинг энергетического метаболизма опухолевых клеток»

Актуальность темы

Злокачественные опухоли отличаются от нормальных тканей целым рядом биологических особенностей, включая неконтролируемую пролиферацию, способность к инвазии и метастазированию, адаптацию к гипоксии и стимуляцию ангиогенеза, устойчивость к апоптозу, уклонение от иммунного надзора и др. [1]. Существенную роль в поддержании опухолевого роста и регуляции жизнедеятельности опухолевой клетки играют изменения в клеточном метаболизме, касающиеся в первую очередь процессов дыхания. Согласно современным представлениям, эти метаболические перестройки являются не просто следствием молекулярно-генетических нарушений, лежащих в основе патогенеза опухоли, а необходимым условием опухолевой прогрессии [2]. Метаболические пути, обеспечивая клетку энергией и субстратами, как бы опосредуют все проявления особого биологического поведения опухолей и устойчивость к цитотоксическим воздействиям. Поэтому исследование опухолевого метаболизма имеет огромное значение для понимания механизмов канцерогенеза и разработки новых диагностических и терапевтических подходов.

Злокачественная трансформация клеток приводит к кардинальным изменениям всех видов обменных процессов, что обусловлено, прежде всего, высокой потребностью опухолевых клеток в энергии и макромолекулах для пролиферации и интенсивного роста клеточной массы. К наиболее значимым метаболическим изменениям относят повышенный уровень гликолиза, как анаэробного, так и аэробного (эффект Варбурга), митохондриальную дисфункцию, активацию пентозофосфатного пути, использование глутамина и жирных кислот в качестве альтернативных энергетических субстратов, активный биосинтез липидов и нуклеотидов [3, 4]. Результатом активации гликолиза является продукция лактата и, как следствие, обратный градиент внутри- и внеклеточного рН, который способствует развитию и выживанию опухоли [5].

Исследования последних лет выявили, что нет единой, универсальной метаболической программы, свойственной всем опухолям и даже клеткам внутри одной опухоли [6]. Опухолевые клетки способны активировать различные пути получения энергии в зависимости от текущих потребностей и условий микроокружения. Большинство раковых клеток используют гликолиз и митохондриальное дыхание одновременно, а интенсивность этих процессов определяется множеством факторов, относящихся как к самим опухолевым клеткам, так и их микроокружению [А49]. К эндогенным факторам относят тканевое происхождение опухоли, специфику метаболических процессов в том типе ткани и органе, где локализована опухоль, генетические характеристики и молекулярный подтип, степень дифференцировки. Факторами, связанными с микроокружением, являются

распределение кислорода, доступность и состав питательных веществ, рН микросреды, взаимодействие со стромальными клетками, плотность коллагенового матрикса. Очевидно, что опухоли гетерогенны на генетическом, молекулярном и клеточном уровне, что в совокупности с неоднородным и постоянно меняющимся микроокружением обуславливает высокую внутри- и межопухолевую гетерогенность их энергетического метаболизма. Присутствие внутри одной опухоли клеток с преобладанием разных путей получения энергии повышает вероятность выживания отдельных клеточных клонов при терапии и развития резистентности, а метаболические отличия между опухолями одного типа и стадии у разных пациентов подчеркивают необходимость персонализированного лечения. Высокая пластичность катаболических процессов в опухолевых клетках позволяет им приспосабливаться к неблагоприятным условиям, например, недостатку кислорода, питательных веществ, а в ряде случаев - к действию противоопухолевых препаратов.

Важным аспектом в исследованиях опухолевого метаболизма является связь энергетического метаболизма клеток с ответом на лечение [7, 8]. Так, аэробный гликолиз обычно ассоциируется с агрессивностью опухоли и лекарственной устойчивостью [9]. В то же время, цитотоксическая терапия наиболее эффективна в отношении активно пролиферирующих клеток, для которых так же свойствен гликолиз, а более резистентные субпопуляции опухолевых стволовых клеток имеют окислительный метаболизм [10]. При этом сама противоопухолевая терапия может менять метаболизм опухолевых клеток посредством множества путей, например, при прямом действии на митохондрии или косвенно в ответ на повреждение ядерной ДНК клеток или снабжающих опухоль кровеносных сосудов [11-15]. Идентификация метаболических «маркеров» терапевтического ответа или резистентности является актуальной задачей и может стать основой для разработки новых способов прогнозирования и мониторинга эффективности противоопухолевой терапии.

Механизмы, с помощью которых раковые клетки координируют свою биоэнергетику, и условия, при которых активируются те или иные пути получения энергии, до сих пор малопонятны. Это диктует необходимость поиска новых методов оценки энергетического метаболизма с возможностью динамического наблюдения как за индивидуальными клетками, так и опухолью в «макро» масштабе. Особый интерес представляют мультипараметрические исследования с одновременной оценкой сразу нескольких комплементарных параметров в одной и той же опухоли или отдельно взятой клетке.

Развитие методов флуоресцентного имиджинга с временным разрешением (Fluorescence Lifetime Imaging, FLIM) привело к созданию новых подходов для исследования различных биологических процессов и физико-химических параметров клеток и тканей [16-18, A21]. Подобно

другим методам оптического биоимиджинга, FLIM является неинвазивным с точки зрения безопасности оптического излучения и позволяет проводить наблюдения в динамике, в живых клетках и тканях in vivo на разных уровнях - от (суб)клеточного до целого организма. Однако FLIM имеет преимущества перед традиционными методами флуоресцентной визуализации на основе интенсивности. Время жизни флуоресценции является собственной характеристикой флуорофора, которая определяется его химической структурой и локальным окружением и в определенной степени не зависит от концентрации [19]. Так что FLIM является количественным по своей сути и минимизирует артефакты, связанные с неоднородным распределением флуорофора в образце, рассеянием и поглощением света, фокусировкой, различиями в конфигурациях оптических систем, геометрией самого объекта, что особенно ценно при работе с тканями [20]. Опция временного разрешения расширяет возможности флуоресцентных методов от простого наблюдения за локализацией флуорофора или рациометрических измерений до количественного охарактеризования молекулярного окружения флуорофора.

Высокая чувствительность и молекулярная специфичность FLIM сделали возможным анализ энергетического метаболизма клеток путем регистрации эндогенной флуоресценции кофакторов ферментов дегидрогеназ - восстановленного никотинамиддинуклеотида (фосфата) НАД(Ф)Н и окисленных флавинадениндинуклеотида ФАД и флавинмононуклеотида ФМН [21, 22, A8]. Из них, связь кинетики флуоресценции НАД(Ф)Н с процессами клеточного дыхания охарактеризована наиболее полно. Две формы этого кофактора - свободная и связанная с белками - могут быть идентифицированы по времени жизни флуоресценции. В типичном случае, в раковых клетках вклад свободной формы НАД(Ф)Н в затухание флуоресценции коррелирует с интенсивностью гликолиза, а вклад связанной формы - с уровнем митохондриального дыхания. Разработка ряда новых генетически кодируемых и синтетических сенсоров, работающих в красной области спектра, открыла перспективу одновременного наблюдения НАД(Ф)Н и других функциональных показателей [23].

До недавнего времени подходы к применению FLIM для изучения онкологических процессов были слабо развиты. Примеры применения FLIM, в том числе с использованием эндогенной флуоресценции клеток, ограничивались в основном экспериментами на монослойных клеточных культурах. Так что актуальной задачей современной биофизики является разработка подходов к использованию FLIM в многоклеточных моделях in vitro и опухолях in vivo и трансляция этих разработок в клинику.

Данная работа посвящена разработке подходов к применению FLIM в экспериментальной онкологии и изучению с его помощью энергетического

метаболизма опухолевых клеток при естественном росте и противоопухолевой терапии.

Степень разработанности темы исследования

Сложная биологическая природа опухолей, которая предполагает влияние не только (эпи)генетических факторов, но и взаимодействие опухоли с организмом хозяина, существование опухолевых клеток в условиях гетерогенного микроокружения и фенотипическую пластичность, делает проблему изучения рака - одной из самых сложных в биологии, а проблему лечения - одной из самых сложных в медицине. Во многом понимание природы рака усложняется тем, что подавляющее большинство исследований проводится на чрезмерно упрощенных моделях - культурах опухолевых клеток животных и человека in vitro, отдельных выделенных из клеток и тканей компонентах. Тогда как информация о пространственной организации опухоли, ее гетерогенности, влиянии микроокружения на опухолевые клетки, динамике биологических процессов полностью теряется. В изучении биологических, в том числе метаболических, свойств опухолей принципиальную важность имеют два момента: 1) использование опухолевых моделей, которые в наибольшей степени отражают свойства опухолей человека; 2) проведение исследований прижизненными, неинвазивными методами без влияния на физиологическое состояние клеток и тканей. Однако проведению исследований in vivo препятствует отсутствие неинвазивных селективных методов, позволяющих наблюдать и количественно оценить отдельные функциональные показатели опухолевой ткани в динамике.

На протяжении последних нескольких десятилетий неуклонно растет интерес к теме опухолевого метаболизма. За последние 20 лет количество научных публикаций в этой области выросло в 2 раза (с 31600 до 72700 по данным PubMed). Благодаря современным высокоинформативным омикс-технологиям, аналитическим, биохимическим, иммуногистохимическим

методам и широкому внедрению в клинику методов метаболической

18 1

визуализации, таких как позитронно-эмиссионная томография с F-ФДГ, H-магнитно-резонансная спектроскопия, достигнуто серьезное понимание особенностей биоэнергетики рака [24, 25]. Идентифицированы изменения в клеточном дыхании, отличающие опухоли от нормальных тканей, установлена их связь с генетическими нарушениями и сигнальными путями. Укрепилось мнение, что опухолевый метаболизм - это крайне вариабельная система. В зависимости от текущих потребностей и условий микроокружения (в первую очередь, количества питательных веществ и кислорода) раковые клетки способны активировать различные пути получения энергии - бескислородное расщепление глюкозы (гликолиз) или аэробное дыхание. Кроме того, раковые клетки находятся под постоянным влиянием других типов клеток в опухолевом микроокружении (эндотелиальных клеток, фибробластов и иммунных клеток) и внеклеточного

матрикса. Однако вопросы пластичности и гетерогенности энергетического метаболизма опухолей, особенно на клеточном уровне, - одни из наименее изученных в этой области.

Все большую популярность в биомедицинских исследованиях в последние годы приобретают методы флуоресцентного имиджинга с временным разрешением FLIM. Приложения FLIM в экспериментальной онкологии можно условно разделить на три группы: 1) «метаболический» имиджинг с использованием эндогенной флуоресценции кофакторов дегидрогеназ, восстановленного НАД(Ф)Н и окисленных флавинов ФАД и ФМН, 2) изучение молекулярных взаимодействий с помощью Фостеровской резонансной передачи энергии FRET, 3) зондирование физико-химических параметров с помощью синтетических или генетически кодируемых сенсоров [21-23, 26, 27]. Среди них, «метаболический» FLIM является, пожалуй, наиболее распространенным приложением. В основном, он реализуется в виде двухфотонной лазерной сканирующей микроскопии с опцией временного разрешения флуоресценции. Примеры исследований с применением FLIM НАД(Ф)Н и ФАД до недавнего времени ограничивались работами на клеточных культурах и несколькими работами in vivo [28-30]. За последние пять лет появились работы, выполненные на органотипичных опухолевых культурах (органоидах) и операционных образцах тканей пациентов [31-34]. Принимая во внимание преимущества метода FLIM перед другими методами изучения энергетического метаболизма, мы ставили одной из задач проведение исследований на сложных моделях опухолевого роста и образцах опухолевой ткани.

В настоящее время идет активная работа в химии и генной инженерии по созданию новых сенсоров с чувствительным временем жизни люминесценции и улучшенными спектральными характеристиками для биологических приложений [35]. По сравнению с сенсорами на основе интенсивности, главное преимущество сенсоров на основе времени жизни состоит в возможности более точной количественной оценки изучаемого параметра. Особый интерес для исследований на многоклеточных моделях и тканях представляют сенсоры, работающие в красной области спектра. Среди флуоресцентных сенсоров доступны сенсоры рН, мембранного потенциала, активных форм кислорода и азота, редокс-статуса, вязкости, температуры, содержания различных ионов, активности протеаз, фаз клеточного цикла и др. [36-39]. Фосфоресцентные сенсоры проявляют чувствительность преимущественно к кислороду [40]. Лишь единичные работы демонстрируют примеры мультипараметрического имиджинга с одновременным наблюдением флуоресценции НАД(Ф)Н и/или ФАД и какого-либо другого физиологического параметра(ов) [41-44]. Хотя очевидно, что только комплексное исследование метаболического состояния клетки в комбинации с другими индикаторами ее функциональной активности или состояния микроокружения может дать наиболее полное представление о метаболических аспектах канцерогенеза.

Цель и задачи исследования

Цель диссертационной работы заключалась в комплексном изучении энергетического метаболизма опухолевых клеток и тканей в условиях естественного роста и при противоопухолевой терапии с помощью мультипараметрических подходов на основе FLIM.

Для достижения цели работы были поставлены и реализованы следующие задачи:

1. Разработать методики флуоресцентного время-разрешенного имиджинга FLIM окислительно-восстановительных кофакторов НАД(Ф)Н и ФАД в сложных моделях - сфероидах и опухолях животных in vivo - и образцах опухолевой ткани ex vivo, а также методики мультипараметрического имиджинга на основе регистрации флуоресценции НАД(Ф)Н одновременно c флуоресценцией генетически кодируемых сенсоров или фосфоресценцией кислород-чувствительных красителей.

2. Исследовать особенности энергетического метаболизма опухолей в условиях естественного роста с помощью FLIM. Оценить возможность наблюдения метаболической гетерогенности на клеточном уровне и ее связь с морфофункциональными характеристиками опухолей. Продемонстрировать влияние пролиферативной активности и опухолевого микроокружения на энергетический метаболизм опухолевых клеток.

3. Изучить метаболические изменения при апоптозе опухолевых клеток с использованием автофлуоресценции НАД(Ф)Н и ФАД и генетически кодируемого сенсора активности каспазы-3. Установить корреляции параметров затухания флуоресценции НАД(Ф)Н, активности каспазы-3 и внутриклеточного уровня АФК.

4. Изучить изменения кинетики флуоресценции НАД(Ф)Н в опухолевых клетках в моделях in vitro и in vivo при химиотерапии препаратами различных классов. Оценить возможность применения FLIM для анализа химиочувствительности опухолевых клеток, выделенных из опухолей пациентов. Исследовать ответ опухолевых клеток на ФДТ с химическим и генетически кодируемым фотосенсибилизаторами с помощью FLIM НАД(Ф)Н.

5. Оценить связь энергетического метаболизма и кислородного статуса опухолей in vivo при естественном росте, химиотерапии и ФДТ, используя FLIM НАД(Ф)Н и PLIM c фосфоресцентными сенсорами молекулярного кислорода.

6. Исследовать связь физико-химических показателей опухолевых клеток - рН цитозоля и микровязкости цитоплазматической мембраны - с метаболическим состоянием опухолевых клеток.

Объект и предмет исследования

Объектами исследования служили культивируемые опухолевые клетки, опухолевые модели у лабораторных животных, в том числе экспрессирующие генетически кодируемые флуоресцентные белки, операционные образцы опухолей пациентов. Основным предметом исследования были показатели метаболического статуса в живых клетках и тканях, регистрируемые с помощью методов FLIM по автофлуоресценции кофакторов НАД(Ф)Н и ФАД.

Научная новизна работы

Для изучения особенностей биоэнергетики опухолевых клеток в диссертационной работе использованы новейшие технологии флуоресцентной и фосфоресцентной визуализации с временным разрешением (FLIM и PLIM), автофлуоресценция собственных компонентов тканей, флуоресцентные генетически кодируемые белки, в том числе новые сенсоры, химические сенсоры. С использованием двухфотонной флуоресцентной микроскопии с временным разрешением и новых флуоресцентных время-разрешенных методов - оптоволоконной спектроскопии и конфокального макроимиджинга, разработан ряд оригинальных методик и протоколов оценки метаболизма опухолей на разном уровне - от клеточного до целой опухоли. Разработаны принципы мультипараметрических исследований на основе комбинации автофлуоресценции НАД(Ф)Н и ФАД и флуоресценции красных флуоресцентных белков - сенсоров рН, апоптоза, фаз клеточного цикла, а также фосфоресцентых сенсоров молекулярного кислорода.

Впервые выполнено сравнительное исследование метаболической гетерогенности на клеточном уровне в опухолевых сфероидах, опухолях мышей in vivo, образцах опухолей пациентов ex vivo и выделенных из них клетках с помощью FLIM НАД(Ф)Н. Продемонстрировано, что на процессы клеточного дыхания оказывают влияние множество факторов, так что гетерогенность может быть обусловлена различной пролиферативной активностью опухолевых клеток, их взаимодействием с фибробластами, присутствием коллагена, распределением кислорода в опухолевом микроокружении.

Впервые на основе количественной оценки относительной фракции свободной формы НАД(Ф)Н в образцах колоректального рака пациентов установлена связь внутриопухолевой клеточной метаболической гетерогенности со степенью злокачественности опухоли.

Впервые показана возможность дифференцирования глиобластомы от белого вещества мозга по показателям затухания флуоресценции в спектральном канале НАД(Ф)Н с помощью FLIM-макроимиджинга, что позволяет рассматривать этот метод как новый способ оптической экспресс -биопсии.

Впервые установлено, что химиотерапия различными препаратами вызывает схожие изменения параметров времени жизни флуоресценции НАД(Ф)Н в опухолевых клетках in vitro и in vivo, указывающие на изменение баланса энергетического обмена в сторону окисления. Данные изменения были связаны со снижением пролиферации и наблюдались независимо от индукции апоптоза. Предложены новые подходы к оценке химиочувствительности опухолевых клеток, выделенных из материала опухоли пациентов, на основе FLIM-микроскопии НАД(Ф)Н. При исследовании метаболических изменений в процессе апоптотической гибели продемонстрированы связи активности каспазы-3 и активации окислительного фосфорилирования с уровнем активных форм кислорода в клетках. Впервые с помощью FLIM зарегистрирована фосфорилированная форма НАДН - НАДФН - в опухолевых клетках при индуцированном апоптозе.

Впервые с помощью FLIM НАД(Ф)Н исследованы изменения в энергетическом метаболизме опухолевых клеток при ФДТ с «клеточным» и преимущественно сосудистым механизмами действия. Предложены методики и показана возможность индукции фототоксических эффектов в модели опухолевых сфероидов и опухолях мышей с использованием генетически кодируемого фотосенсибилизатора KillerRed. Показано, что ФДТ может вызывать разнонаправленные изменения в показателях затухания флуоресценции НАД(Ф)Н на фоне развития гипоксии в зависимости от уровня кислорода в клетках.

Путем одновременного анализа кинетик флуоресценции НАД(Ф)Н и фосфоресценции кислородных сенсоров в опухолях in vivo методами FLIM и PLIM впервые показана умеренная связь состояния биоэнергетики клеток с содержанием кислорода на клеточном уровне и зарегистрировано разобщение кислородной регуляции клеточного дыхания при химиотерапии и ФДТ.

Впервые исследована роль внутриклеточного рН и микровязкости мембран в регуляции энергетического метаболизма опухолевых клеток. Показана возможность измерения внутриклеточного рН с помощью нового генетически кодируемого сенсора SypHerRed и FLIM. Впервые получены абсолютные значения рН в опухолях in vivo с помощью FLIM. Показана возможность одновременной визуализации флуоресценции сенсора SypHerRed и кофактора НАД(Ф)Н. Впервые показано, что изменения рН цитозоля в опухолевых клетках могут быть как следствием перестроек в клеточном дыхании, так и развиваться независимо от них, например, при химиотерапии. При исследовании микровязкости впервые показано, что в условиях естественного роста микровязкость плазматической мембраны имеет стабильное значение, характерное для данного типа клеток, и не зависит от их пролиферативной и метаболической активности.

Новизна результатов диссертационного исследования отражена в научных публикациях в передовых международных изданиях и подтверждена патентами на изобретения РФ:

1. Способ фотодинамической терапии опухолей / Патент на изобретение № RU 2519936. Авторы: Ширманова М.В., Загайнова Е.В., Лукьянов С.А., Серебровская Е.О., Снопова Л.Б., Бугрова М.Л., Турчин И.В., Сироткина М.А., Каменский В.А. (2014 г.)

2. Способ регистрации внутриклеточного рН опухолевых клеток / Патент на изобретение № RU 2565377. Авторы: Ширманова М.В., Дружкова И.Н., Лукина М.М., Загайнова Е.В., Лукьянов С.А., Белоусов В.В., Матдашов М.Е., Снопова Л.Б. (2014 г.)

3. Порфиразин, порфиразиновый комплекс гадолиния и их применение / Патент на изобретение № RU 2621710. Клапшина Л.Г., Лермонтова С.А., Пескова Н.Н., Балалаева И.В., Шилягина Н.Ю., Ширманова М.В., Гаврина А.И., Южакова Д.В. (2016 г.).

Теоретическая и практическая значимость работы

С фундаментальной точки зрения, результаты данной работы расширяют существующие представления об опухолевом метаболизме. Выполненные на живых опухолевых клетках и опухолях in vivo исследования методом FLIM привнесли новые данные о внутриопухолевой гетерогенности энергетического метаболизма на клеточном уровне, роли различных факторов, относящихся к самим клеткам и их микроокружению, в формировании метаболического фенотипа. Получены экспериментальные подтверждения выраженной метаболической гетерогенности опухолей пациентов, выполнена ее количественная оценка. Выявлены изменения в клеточном энергетическом метаболизме, сопровождающие ответ опухолевых клеток на химиотерапию и ФДТ препаратами различного механизма действия, изучена их связь с внутриклеточным содержанием кислорода. Отдельно исследованы метаболические реакции при развитии апоптоза в динамике, установлена последовательность клеточных событий и корреляция метаболических показателей с уровнем активных форм кислорода (АФК). С помощью новых флуоресцентных сенсоров исследованы in vitro и in vivo и количественно охарактеризованы физико-химические показатели опухолевых клеток - pH цитозоля и микровязкость мембраны, исследована их связь с метаболическим статусом.

С практической точки зрения, разработанные нами подходы к оценке энергетического метаболизма опухолей на клеточном и макро-уровне с помощью FLIM предоставляют методологическую базу для разработки новых способов клинической интраоперационной диагностики опухолей и прогнозирования эффективности терапии. В качестве метода диагностики (экспресс-биопсии) наиболее релевантным нам кажется флуоресцентный время-разрешенный макроимиджинг, позволяющий быстро получать информацию о метаболических или биохимических параметрах довольно

крупных образцов тканей. Наработки по части оптоволоконной время-разрешенной спектроскопии НАД(Ф)Н представляют интерес для развития БЫМ-эндоскопии и волоконных систем для зондирования операционного поля. В качестве прогностического критерия представляется перспективной оценка уровня метаболической гетерогенности на клеточном уровне. Разработанные нами методики анализа ответа первичных опухолевых культур на химиотерапию с помощью БЫМ НАД(Ф)Н могут быть использованы для индивидуального подбора лекарственных препаратов и скрининга новых потенциальных противоопухолевых агентов.

Результаты исследований используются в специальных дисциплинах «Биология и моделирование опухолевого роста» и «Флуоресцентный имиджинг и его приложения» в магистратуре ПИМУ и могут быть включены в соответствующие разделы лекций общего курса по биофизике, медицинской физике, биохимии и физиологии человека и животных.

Список литературы диссертационного исследования доктор наук Ширманова Марина Вадимовна, 2024 год

5. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. D. Hanahan; Hallmarks of Cancer: New Dimensions. Cancer Discov 2022; 12 (1): 31-46

2. DeBerardinis RJ, Lum JJ, Hatzivassiliou G, Thompson CB. The biology of cancer: metabolic reprogramming fuels cell growth and proliferation. Cell Metab. 2008 Jan;7(1):11-20.

3. Potter M, Newport E, Morten KJ. The Warburg effect: 80 years on. Biochem Soc Trans. 2016 Oct 15;44(5):1499-1505.

4. R. J. DeBerardinis, N. S. Chandel, Fundamentals of cancer metabolism. Sci. Adv. 2,e1600200 (2016).

5. Casey, J., Grinstein, S. avdeep& Orlowski, J. Sensors and regulators of intracellular pH. Nat Rev Mol Cell Biol 11, 50-61 (2010).

6. Camille Lehuede, Fanny Dupuy, Rebecca Rabinovitch, Russell G. Jones, Peter M. Siegel; Metabolic Plasticity as a Determinant of Tumor Growth and Metastasis. Cancer Res 15 September 2016; 76 (18): 5201-5208.

7. Gon9alves AC, Richiardone E, Jorge J, Polonia B, Xavier CPR, Salaroglio IC, Riganti C, Vasconcelos MH, Corbet C, Sarmento-Ribeiro AB. Impact of cancer metabolism on therapy resistance - Clinical implications. Drug Resist Updat. 2021 Dec;59:100797.

8. Zaal EA, Berkers CR. The Influence of Metabolism on Drug Response in Cancer. Front Oncol. 2018 Nov 2;8:500.

9. Chelakkot C, Chelakkot VS, Shin Y, Song K. Modulating Glycolysis to Improve Cancer Therapy. Int J Mol Sci. 2023 Jan 30;24(3):2606.

10. Zhao Z, Mei Y, Wang Z, He W. The Effect of Oxidative Phosphorylation on Cancer Drug Resistance. Cancers (Basel). 2022 Dec 22;15(1):62.

11. R. M. Mariaa, W. F. Alteib, H. S. Selistre-de-Araujob, Luiz A. Colnago, Impact of chemotherapy on metabolic reprogramming: Characterization of the metabolic profile of breast cancer MDA-MB-231 cells using1H HR-MAS NMR spectroscopy / Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 146 (2017) 324-328

12. Turgeon MO, Perry NJS, Poulogiannis G. DNA Damage, Repair, and Cancer Metabolism. Front Oncol. 2018 Feb 5;8:15.

13. Missiroli S, Perrone M, Genovese I, Pinton P, Giorgi C. Cancer metabolism and mitochondria: Finding novel mechanisms to fight tumours. EBioMedicine. 2020 Sep;59:102943.

14. de Heer EC, Jalving M, Harris AL. HIFs, angiogenesis, and metabolism: elusive enemies in breast cancer. J Clin Invest. 2020 Oct 1;130(10):5074-5087.

15. Bhatnagar R, Dixit NM, Yang EH, Sallam T. Cancer therapy's impact on lipid metabolism: Mechanisms and future avenues. Front Cardiovasc Med. 2022 Aug 9;9:925816.

16. Becker, W. Fluorescence lifetime imaging - techniques and applications. Journal of Microscopy, (2012), 247: 119-136.

17. K., Karsten. Brief history of fluorescence lifetime imaging. In Multiphoton Microscopy and Fluorescence Lifetime Imaging: Applications in Biology and Medicine, edited by Karsten König, Berlin, Boston: De Gruyter, 2018, pp. 3-16.

18. X. F. Wang, A. Periasamy, B. Herman & D.M. Coleman (1992) Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM): Instrumentation and Applications, Critical Reviews in Analytical Chemistry, 23:5, 369-395

19. Berezin MY, Achilefu S. Fluorescence lifetime measurements and biological imaging. Chem Rev. 2010 May 12;110(5):2641-84.

20. K. Suhling, L. M. Hirvonen, J.A. Levitt, P.-H. Chung, C. Tregidgo, A. Le Marois, D. A. Rusakov, K. Zheng, S. Ameer-Beg, S. Poland, S. Coelho, R.Henderson, N. Krstajic, Fluorescence lifetime imaging (FLIM): Basic concepts and some recent developments, Medical Photonics, 27, 2015, Pages 3-40,

21. I. Georgakoudi and K.P. Quinn, Label-Free Optical Metabolic Imaging in Cells and Tissues, Annu Rev Biomed Eng. 2023 25:1, 413-443

22. Kolenc OI, Quinn KP. Evaluating Cell Metabolism Through Autofluorescence Imaging of NAD(P)H and FAD. Antioxid Redox Signal. 2019 Feb 20;30(6):875-889.

23. Datta R, Gillette A, Stefely M, Skala MC. Recent innovations in fluorescence lifetime imaging microscopy for biology and medicine. J Biomed Opt. 2021 Jul;26(7):070603.

24. Schmidt DR, Patel R, Kirsch DG, Lewis CA, Vander Heiden MG, Locasale JW. Metabolomics in cancer research and emerging applications in clinical oncology. CA Cancer J Clin. 2021 Jul;71(4):333-358.

25. Kang, Y.P., Ward, N.P. & DeNicola, G.M. Recent advances in cancer metabolism: a technological perspective. Exp Mol Med 50, 1-16 (2018).

26. R. Shilpi, Z. Lingling, I. Xavier and B. Margarida, FLIM-FRET for Cancer Applications, Current Molecular Imaging (Discontinued) 2014; 3(2)

27. Periasamy, A., Mazumder, N., Sun, Y., Christopher, K.G., Day, R.N. (2015). FRET Microscopy: Basics, Issues and Advantages of FLIM-FRET Imaging. In: Becker, W. (eds) Advanced Time-Correlated Single Photon Counting Applications. Springer Series in Chemical Physics, vol 111. Springer, Cham.

28. Skala MC, Riching KM, Bird DK, Gendron-Fitzpatrick A, Eickhoff J, Eliceiri KW, Keely PJ, Ramanujam N. In vivo multiphoton fluorescence lifetime imaging of protein-bound and free nicotinamide adenine dinucleotide in normal and precancerous epithelia. J Biomed Opt. 2007 Mar-Apr;12(2):024014.

29. Stringari, C., Abdeladim, L., Malkinson, G., Mahou, P., Solinas, X., Lamarre, I., Brizion, S., Galey, J., Supatto, W., Legouis, R., Pena, A., Beaurepaire, E. (2017). Multicolor two-photon imaging of endogenous fluorophores in living tissues by wavelength mixing. Scientific Reports. 7.

30. M. A. Yaseen, S. Sakadzic, W. Wu, W. Becker, K. A. Kasischke, and D A. Boas, "In vivo imaging of cerebral energy metabolism with two-photon fluorescence lifetime microscopy of NADH," Biomed. Opt. Express 4, 307-321 (2013)

31. Skala MC, Deming DA, Kratz JD. Technologies to Assess Drug Response and Heterogeneity in Patient-Derived Cancer Organoids. Annu Rev Biomed Eng. 2022 Jun 6;24:157-177.

32. Suarez-Ibarrola R, Braun L, Pohlmann PF, Becker W, Bergmann A, Gratzke C, Miernik A, Wilhelm K. Metabolic Imaging of Urothelial Carcinoma by Simultaneous Autofluorescence Lifetime Imaging (FLIM) of NAD(P)H and FAD. Clin Genitourin Cancer. 2021 Feb;19(1):e31-e36.

33. Erkkilä MT, Reichert D, Gesperger J, Kiesel B, Roetzer T, Mercea PA, Drexler W, Unterhuber A, Leitgeb RA, Woehrer A, Rueck A, Andreana M, Widhalm G. Macroscopic fluorescence-lifetime imaging of NADH and protoporphyrin IX improves the detection and grading of 5-aminolevulinic acid-stained brain tumors. Sci Rep. 2020 Nov 24;10(1):20492.

34. Blacker TS, Sewell MDE, Szabadkai G, Duchen MR. Metabolic Profiling of Live Cancer Tissues Using NAD(P)H Fluorescence Lifetime Imaging. Methods Mol Biol. 2019;1928:365-387.

35. Sarder P, Maji D, Achilefu S. Molecular probes for fluorescence lifetime imaging. Bioconjug Chem. 2015 Jun 17;26(6):963-74.

36. Shi Y, Zhang W, Xue Y, Zhang J. Fluorescent Sensors for Detecting and Imaging Metal Ions in Biological Systems: Recent Advances and Future Perspectives. Chemosensors. 2023; 11(4):226.

37. Jena S, Parker LL. Fluorescence Lifetime Imaging Probes for Cell-Based Measurements of Enzyme Activity. Methods Mol Biol. 2022;2394:133-162.

38. Adair LD, New EJ. Molecular fluorescent sensors for in vivo imaging. Curr Opin Biotechnol. 2023 Oct;83:102973.

39. Berlin S, Carroll EC. Editorial: Next-Generation Genetically-Encoded Fluorescent Sensors. Front Cell Neurosci. 2020 Dec 3;14:627792.

40. Chelushkin, P. & Tunik, S. (2019). Phosphorescence Lifetime Imaging (PLIM): State of the Art and Perspectives: Recent Advances. In book: Progress in Photon Science (pp.109-128) Springer Series in Chemical Physs

41. Kalinina, S, Breymayer, J, Reeß, K, Lilge, L, Mandel, A, Rück, A. Correlation of intracellular oxygen and cell metabolism by simultaneous PLIM of phosphorescent TLD1433 and FLIM of NAD(P)H. J. Biophotonics. 2018; 11:e201800085.

42. Penjweini R, Roarke B, Alspaugh G, Gevorgyan A, Andreoni A, Pasut A, Sackett DL, Knutson JR. Single cell-based fluorescence lifetime imaging of intracellular oxygenation and metabolism. Redox Biol. 2020 Jul;34:101549.

43. Ghazi S, Bourgeois S, Gomariz A, Bugarski M, Haenni D, Martins JR, Nombela-Arrieta C, Unwin RJ, Wagner CA, Hall AM, Craigie E. Multiparametric imaging reveals that mitochondria-rich intercalated cells in the kidney collecting duct have a very high glycolytic capacity. FASEB J. 2020 Jun;34(6):8510-8525.

44. Okkelman IA, Neto N, Papkovsky DB, Monaghan MG, Dmitriev RI. A deeper understanding of intestinal organoid metabolism revealed by combining fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) and extracellular flux analyses. Redox Biol. 2020 Feb;30:101420.

45. Д. С. Билан, А. Г. Шохина, С. А. Лукьянов, В. В. Белоусов. Основные редокс-пары клетки. Биоорганическая химия. 2015, том 41, № 4, с. 385-402

46. Cannon TM, Lagarto JL, Dyer BT, Garcia E, Kelly DJ, Peters NS, Lyon AR, French PMW, Dunsby C. Characterization of NADH fluorescence properties under one-photon excitation with respect to temperature, pH, and binding to lactate dehydrogenase. OSA Contin. 2021 May 10;4(5):1610-1625.

47. van den Berg PA, Widengren J, Hink MA, Rigler R, Visser AJ. Fluorescence correlation spectroscopy of flavins and flavoenzymes: photochemical and photophysical aspects. Spectrochim Acta A Mol Biomol Spectrosc. 2001 Sep 14;57(11):2135-44.

48. Hühner J, Ingles-Prieto A, Neusüß C, Lämmerhofer M, Janovjak H. Quantification of riboflavin, flavin mononucleotide, and flavin adenine dinucleotide in mammalian model cells by CE with LED-induced fluorescence detection. Electrophoresis. 2015 Feb;36(4):518-25.

49. R.S. Rivlin, R. Hornibrook, M. Osnos. Effects of riboflavin deficiency upon concentrations of riboflavin, flavin mononucleotide, and flavin adenine dinucleotide in Novikoff hepatoma in rats. Cancer Res. 33(11), 3019-23 (1973).

50. Nsiah-Sefaa A, McKenzie M. Combined defects in oxidative phosphorylation and fatty acid ß-oxidation in mitochondrial disease. Bioscience Reports. 2016 Feb;36(2):e00313.

51. Chance B, Schoener B, Oshino R, Itshak F, Nakase Y. Oxidation-reduction ratio studies of mitochondria in freeze-trapped samples. NADH and flavoprotein fluorescence signals. J Biol Chem. 1979 Jun 10;254(11):4764-71.

52. Liu Z, Pouli D, Alonzo CA, Varone A, Karaliota S, Quinn KP, Münger K, Karalis KP, Georgakoudi I. Mapping metabolic changes by noninvasive, multiparametric, high-resolution imaging using endogenous contrast. Sci Adv. 2018 Mar 7;4(3):eaap9302.

53. J.R. Lakowicz, H. Szmacinski, K. Nowaczyk, M.L. Johnson. Fluorescence lifetime imaging of free and protein-bound NADH. Proc Natl Acad Sci U S A. 89(4), 1271-5 (1992)

54. Sharick, J., Favreau, P., Gillette, A., Sdao, S., Merrins, M., Skala, M. Protein-bound NAD(P)H Lifetime is Sensitive to Multiple Fates of Glucose Carbon. Scientific Reports. 8. (2018).

55. Rooney, M., Neto, N., Monaghan, M. G., Hill, E., Porter, R. Conditionally immortalised equine skeletal muscle cell lines for in vitro analysis. Biochemistry and Biophysics Reports. 33. 101391. (2023).

56. Blacker, T., Mann, Z. , Gale, J., Ziegler, M., Bain, A., Szabadkai, G., Duchen, M. Separating NADH and NADPH fluorescence in live cells and tissues using FLIM. Nature communications. 5. 3936. (2014).

57. Qian, T., Heaster, T., Houghtaling, A., Sun, K., Samimi, K., Skala, M. Label-free imaging for quality control of cardiomyocyte differentiation. Nature Communications. 12. (2021).

58. Kalinina S, Freymueller C, Naskar N, von Einem B, Reess K, Sroka R, Rueck A. Bioenergetic Alterations of Metabolic Redox Coenzymes as NADH, FAD and FMN by Means of Fluorescence Lifetime Imaging Techniques. Int J Mol Sci. 2021 May 31;22(11):5952.

59. Becker, W., Shcheslavskiy, V., Studier, H. (2015) TCSPC FLIM with different optical scanning techniques in Advanced Time-Correlated Single Photon Counting Applications, Springer, Switzerland, 65-117.

60. W. Becker, H. Stiel, E. Klose; Flexible instrument for time-correlated single-photon counting. Rev. Sci. Instrum. 1 December 1991; 62 (12): 2991-2996.

61. Shirmanova, M.V., Shcheslavskiy, V.I., Lukina, M.M., Becker, W., Zagaynova, E.V. (2020). Exploring Tumor Metabolism with Time-Resolved Fluorescence Methods: from Single Cells to a Whole Tumor. In: Tuchin, V.V., Popp, J., Zakharov, V. (eds) Multimodal Optical Diagnostics of Cancer. Springer, Cham.

62. Skala MC, Riching KM, Gendron-Fitzpatrick A, Eickhoff J, Eliceiri KW, White JG, Ramanujam N. In vivo multiphoton microscopy of NADH and FAD redox states, fluorescence lifetimes, and cellular morphology in precancerous epithelia. Proc Natl Acad Sci U S A. 2007 Dec 4;104(49):19494-9.

63. Zagaynova E.V., Druzhkova I.N., Mishina N.M., Ignatova N.I., Dudenkova V.V., Shirmanova M.V. Imaging of Intracellular pH in Tumor Spheroids Using Genetically Encoded Sensor SypHer2. In: Dmitriev R. (eds) Multi-Parametric Live Cell Microscopy of 3D Tissue Models. Advances in Experimental Medicine and Biology, vol 1035. Springer, Cham Adv Exp Med Biol. 2017;1035:105-119.

64. Shirmanova M.V., Shimolina L.E., Lukina M.M., Zagaynova E.V., Kuimova M.K. Live Cell Imaging of Viscosity in 3D Tumour Cell Models. In: Dmitriev R. (eds) Multi-Parametric Live Cell Microscopy of 3D Tissue Models. Adv Exp Med Biol. 2017; 1035:143-153.

65. A. D. Komarova, V. I. Shcheslavskiy, A. A. Plekhanov, M. A. Sirotkina, L. N. Bochkarev, M. V. Shirmanova, Oxygen assessment in tumors in vivo using phosphorescence lifetime imaging microscopy. In: Gilkes, D.M. (eds) Hypoxia. Methods in Molecular Biology, vol 2755. Humana, New York, NY. 2024, 2755:91-105. doi: 10.1007/978-1-0716-3633-6_6.

66. Ochoa M, Rudkouskaya A, Smith JT, Intes X, Barroso M. Macroscopic Fluorescence Lifetime Imaging for Monitoring of Drug-Target Engagement. Methods Mol Biol. 2022; 2394: 837-856.

67. Reichert D, Erkkilä MT, Holst G, Hecker-Denschlag N, Wilzbach M, Hauger C, Drexler W, Gesperger J, Kiesel B, Roetzer T, Unterhuber A, Widhalm G, Leitgeb RA, Andreana M. Towards real-time wide-field fluorescence lifetime imaging of 5-ALA labeled brain tumors with multi-tap CMOS cameras. Biomed Opt Express. 2020 Feb 26;11(3):1598-1616.

68. Rusanov AL, Ivashina TV, Vinokurov LM, Fiks II, Orlova AG, Turchin IV, Meerovich IG, Zherdeva VV, Savitsky AP. Lifetime imaging of FRET between red fluorescent proteins. J Biophotonics. 2010 Dec;3(12):774-83.

69. Weyers, B., Marsden, M., Sun, T., Bec, J., Bewley, A., Gandour-Edwards, R., Moore, M., Farwell, D., Marcu, L., Fluorescence Lifetime Imaging (FLIm) for Intraoperative Cancer Delineation in Transoral Robotic Surgery (TORS). Translational Biophotonics. 1. (2019).

70. Weyers BW, Birkeland AC, Marsden MA, Tam A, Bec J, Frusciante RP, Gui D, Bewley AF, Abouyared M, Marcu L, Farwell DG. Intraoperative delineation of p16+ oropharyngeal carcinoma of unknown primary origin with fluorescence lifetime imaging: Preliminary report. Head Neck. 2022 Aug;44(8):1765-1776.

71. Ovechkina VS, Zakian SM, Medvedev SP, Valetdinova KR. Genetically Encoded Fluorescent Biosensors for Biomedical Applications. Biomedicines. 2021 Oct 24;9(11):1528

72. Chudakov DM, Matz MV, Lukyanov S, Lukyanov KA. Fluorescent proteins and their applications in imaging living cells and tissues. Physiol Rev. 2010 Jul;90(3):1103-63.

73. Papkovsky DB, Dmitriev RI. Imaging of oxygen and hypoxia in cell and tissue samples. Cell Mol Life Sci. 2018 Aug;75(16):2963-2980.

74. Wilson, D.F., Vinogradov, S., Lo, LW., Huang, L. (1996). Oxygen Dependent Quenching of Phosphorescence. In: Ince, C., Kesecioglu, J., Telci, L., Akpir, K. (eds) Oxygen Transport to Tissue XVII. Advances in Experimental Medicine and Biology, vol 388. Springer, Boston, MA.

75. Fercher A, Borisov SM, Zhdanov AV, Klimant I, Papkovsky DB. Intracellular O2 sensing probe based on cell-penetrating phosphorescent nanoparticles. ACS Nano. 2011 Jul 26; 5(7):5499-508.

76. Yoshihara T, Hosaka M, Terata M, Ichikawa K, Murayama S, Tanaka A, Mori M, Itabashi H, Takeuchi T, Tobita S. Intracellular and in vivo oxygen sensing using phosphorescent Ir(III) complexes with a modified acetylacetonato ligand. Anal Chem. 2015 Mar 3;87(5):2710-7.

77. Nunes AS, Barros AS, Costa EC, Moreira AF, Correia IJ. 3D tumor spheroids as in vitro models to mimic in vivo human solid tumors resistance to therapeutic drugs. Biotechnol Bioeng. 2019 Jan;116(1):206-226.

78. M. Shirmanova, T. Sergeeva, I. Druzhkova, A. Meleshina, M. Lukina, V. Dudenkova, V. Shcheslavskiy, W. Becker, V. Belousov, N. Mishina, and E. Zagaynova, Metabolic shifts and intracellular pH in cell proliferation and differentiation, Chapter 10 in Multiphoton Microscopy and Fluorescence Lifetime Imaging. Applications in Biology and Medicine Ed. by König, Karsten, De Gruyter, January 2018, ISBN 978-3-11-042998-5

79. Kopeina GS, Zhivotovsky B. Programmed cell death: Past, present and future. Biochem Biophys Res Commun. 2022 Dec 10;633:55-58.

80. Bayir, H., Kagan, V.E. Bench-to-bedside review: Mitochondrial injury, oxidative stress and apoptosis - there is nothing more practical than a good theory. Crit Care 12, 206 (2008).

81. White KA, Grillo-Hill BK, Barber DL. Cancer cell behaviors mediated by dysregulated pH dynamics at a glance. J Cell Sci. 2017 Feb 15;130(4):663-669.

82. Meleshina AV, Dudenkova VV, Shirmanova MV, Shcheslavskiy VI, Becker W, Bystrova AS, Cherkasova EI, Zagaynova EV. Probing metabolic states of differentiating stem cells using two-photon FLIM. Sci Rep. 2016 Feb 25;6:21853.

83. Maldonado EB, Parsons S, Chen EY, Haslam A, Prasad V. Estimation of US patients with cancer who may respond to cytotoxic chemotherapy. Future Sci OA. 2020 May 25; 6(8): FSO600

84. Schaefer, Patrick & Hilpert, Diana & Niederschweiberer, Moritz & Neuhauser, Larissa & Kalinina, Sviatlana & Calzia, Enrico & Rueck, Angelika & Einem, Bjoern & von Arnim, Christine. Mitochondrial matrix pH as a decisive factor in neurometabolic imaging. Neurophotonics. 4. 1. (2017)

85. Damian K. Bird, Long Yan, Kristin M. Vrotsos, Kevin W. Eliceiri, Emily M. Vaughan, Patricia J. Keely, John G. White, Nirmala Ramanujam; Metabolic Mapping of MCF10A Human Breast Cells via Multiphoton Fluorescence Lifetime Imaging of the Coenzyme NADH. Cancer Res 2005; 65 (19): 8766-8773.

86. Shah AT, Demory Beckler M, Walsh AJ, Jones WP, Pohlmann PR, Skala MC. Optical metabolic imaging of treatment response in human head and neck squamous cell carcinoma. PLoS One. 2014 Mar 4;9(3):e90746.

87. Rück A, Hauser C, Mosch S, Kalinina S. Spectrally resolved fluorescence lifetime imaging to investigate cell metabolism in malignant and nonmalignant oral mucosa cells. J Biomed Opt. 2014 Sep;19(9):96005.

88. Correia JH, Rodrigues JA, Pimenta S, Dong T, Yang Z. Photodynamic Therapy Review: Principles, Photosensitizers, Applications, and Future Directions. Pharmaceutics. 2021 Aug 25;13(9):1332.

89. Golding JP, Kemp-Symonds JG, Dobson JM. Glycolysis inhibition improves photodynamic therapy response rates for equine sarcoids. Vet Comp Oncol. 2017 Dec; 15(4): 1543-1552.

90. Chelakkot C, Chelakkot VS, Shin Y, Song K. Modulating Glycolysis to Improve Cancer Therapy. International Journal of Molecular Sciences. 2023; 24(3):2606.

91. Mascaraque-Checa M, Gallego-Rentero M, Nicolás-Morala J, Portillo-Esnaola M, Cuezva JM, González S, Gilaberte Y, Juarranz Á. Metformin overcomes metabolic reprogramming-induced resistance of skin squamous cell carcinoma to photodynamic therapy. Mol Metab. 2022 Jun;60:101496.

92. Kessel D, Luo Y. Mitochondrial photodamage and PDT-induced apoptosis. J Photochem Photobiol B. 1998 Feb;42(2):89-95.

93. Hilf R. Mitochondria are targets of photodynamic therapy. J Bioenerg Biomembr. 2007 Feb;39(1):85-9.

94. Bérard V, Rousseau JA, Cadorette J, Hubert L, Bentourkia M, van Lier JE, Lecomte R. Dynamic imaging of transient metabolic processes by small-animal PET for the evaluation of photosensitizers in photodynamic therapy of cancer. J Nucl Med. 2006 Jul;47(7):1119-26.

95. Broekgaarden, M., Weijer, R., van Gulik, T.M. et al. Tumor cell survival pathways activated by photodynamic therapy: a molecular basis for pharmacological inhibition strategies. Cancer Metastasis Rev 34, 643-690 (2015).

96. Bulina ME, Chudakov DM, Britanova OV, Yanushevich YG, Staroverov DB, Chepurnykh TV, Merzlyak EM, Shkrob MA, Lukyanov S, Lukyanov KA. A genetically encoded photosensitizer. Nat Biotechnol. 2006 Jan;24(1):95-9.

97. Shirmanova, M.V., Serebrovskaya, E.O., Lukyanov, K.A., Snopova, L.B.,Sirotkina, M.A., Prodanetz, N.N., Bugrova, M.L., Zagaynova, E.V. Phototoxic effects of fluorescent protein KillerRed on tumor cells in mice. Journal of Biophotonics. 2013;6(3): 283 - 290

98. М.В. Ширманова, Л.Б. Снопова, Н.Н. Проданец, Е.О. Серебровская, Н.И. Евтеева, Е.А. Сергеева, В.А.Каменский, Н.В. Клементьева, К.А. Лукьянов, С.А. Лукьянов, Е.В. Загайнова Патоморфологическое исследование фототоксичности генетически-кодируемого фотосенсибилизатора KillerRed на опухолях животных. Современные технологии в медицине, т 5. №1. 2013, 6-13

99. E.O. Serebrovskaya, A.P. Ryumina, M.E. Boulina, M.V. Shirmanova, E.V. Zagaynova, E.A. Bogdanova, S.A. Lukyanov, K.A. Lukyanov. Phototoxic effects of lysosome-associated genetically encoded photosensitizer Killer Red. Journal of Biomedical Optics. 2014; 19(7): 071403.

100. Muz B, de la Puente P, Azab F, Azab AK. The role of hypoxia in cancer progression, angiogenesis, metastasis, and resistance to therapy. Hypoxia (Auckl). 2015 Dec 11; 3:83-92.

101. Eales, K., Hollinshead, K. & Tennant, D. Hypoxia and metabolic adaptation of cancer cells. Oncogenesis 5, e190 (2016).

102. Bedi M, Ray M, Ghosh A. Active mitochondrial respiration in cancer: a target for the drug. Mol Cell Biochem. 2022 Feb;477(2):345-361.

103. Лукьянова Л.Д. Сигнальные механизмы гипоксии / Л.Д. Лукьянова, - М: РАН, 2019. - 215 с.

104. Gorenkova N, Robinson E, Grieve DJ, Galkin A. Conformational change of mitochondrial complex I increases ROS sensitivity during ischemia. Antioxid Redox Signal. 2013 Nov 1;19(13):1459-68.

105. Damaghi, Mehdi & Wojtkowiak, Jonathan & Gillies, Robert. (2013). pH Sensing and Regulation in Cancer. Frontiers in physiology. 4. 370.

106. Swietach P. What is pH regulation, and why do cancer cells need it? Cancer Metastasis Rev. 2019 Jun;38(1-2):5-15.

107. Fei W, Yan J, Wu X, Yang S, Zhang X, Wang R, Chen Y, Xu J, Zheng C. Perturbing plasma membrane lipid: a new paradigm for tumor nanotherapeutics. Theranostics. 2023 Apr 23;13(8):2471 -2491.

108. Matlashov ME, Bogdanova YA, Ermakova GV, Mishina NM, Ermakova YG, Nikitin ES, Balaban PM, Okabe S, Lukyanov S, Enikolopov G, Zaraisky AG, Belousov VV.

Fluorescent ratiometric pH indicator SypHer2: Applications in neuroscience and regenerative biology. Biochim Biophys Acta. 2015 Nov;1850(11):2318-28.

109. Ermakova, Y., Bilan, D., Matlashov, M. et al. Red fluorescent genetically encoded indicator for intracellular hydrogen peroxide. Nat Commun 5, 5222 (2014).

110. MV Shirmanova, DV Yuzhakova, MM Lukina, AI Gavrina, AV Meleshina, IV Turchin, and EV Zagaynova. Whole-body fluorescence imaging in cancer research. In: Barroso, M. (Ed.) and Intes, X. (Ed.) Imaging from Cells to Animals In Vivo, Chapter 21. New York: CRC Press, Taylor & Francis Group, 2020. ISBN 9781138041097.

111. Paez-Perez, Miguel, Kuimova, Marina, Molecular rotors: Fluorescent Sensors for Microviscosity and Conformation of Biomolecules, Angew. Chem. Int. Ed. 2023, e202311233.

112. Mayevsky A, Barbiro-Michaely E. Use of NADH fluorescence to determine mitochondrial function in vivo. Int J Biochem Cell Biol. 2009 Oct;41(10):1977-88.

113. Avraham Mayevsky and Gennady G. Rogatsky. Mitochondrial function in vivo evaluated by NADH fluorescence: from animal models to human studies. American Journal of Physiology-Cell Physiology 2007 292:2, C615-C640

114. Georgakoudi I, Quinn KP. Optical imaging using endogenous contrast to assess metabolic state. Annu Rev Biomed Eng. 2012;14:351-67.

115. Heikal AA. Intracellular coenzymes as natural biomarkers for metabolic activities and mitochondrial anomalies. Biomark Med. 2010 Apr;4(2):241-63.

116. Blacker TS, Duchen MR. Investigating mitochondrial redox state using NADH and NADPH autofluorescence. Free Radic Biol Med. 2016 Nov;100:53-65.

117. Kalinina S, Breymayer J, Schäfer P, Calzia E, Shcheslavskiy V, Becker W, Rück A. Correlative NAD(P)H-FLIM and oxygen sensing-PLIM for metabolic mapping. J Biophotonics. 2016 Aug;9(8):800-11.

118. Liu, X., Xiang, K., Geng, G. Y., Wang, S. C., Ni, M., Zhang, Y. F., Pan, H. F., & Lv, W. F. Prognostic Value of Intratumor Metabolic Heterogeneity Parameters on 18F-FDG PET/CT for Patients with Colorectal Cancer. Contrast media & molecular imaging, 2022, 2586245.

119. Xie Y, Liu C, Zhao Y, Gong C, Li Y, Hu S, Song S, Hu X, Yang Z, Wang B. Heterogeneity derived from 18 F-FDG PET/CT predicts immunotherapy outcome for metastatic triple-negative breast cancer patients. Cancer Med. 2022 May;11(9):1948-1955.

120. Liu, J., Si, Y., Zhou, Z. et al. The prognostic value of 18F-FDG PET/CT intra-tumoural metabolic heterogeneity in pretreatment neuroblastoma patients. Cancer Imaging 22, 32 (2022).

121. Senjo H, Hirata K, Izumiyama K, Minauchi K, Tsukamoto E, Itoh K, Kanaya M, Mori A, Ota S, Hashimoto D, Teshima T; North Japan Hematology Study Group. High metabolic heterogeneity on baseline 18FDG-PET/CT scan as a poor prognostic factor for newly diagnosed diffuse large B-cell lymphoma. Blood Adv. 2020 May 26;4(10):2286-2296.

122. Evers TMJ, Hochane M, Tans SJ, Heeren RMA, Semrau S, Nemes P, Mashaghi A. Deciphering Metabolic Heterogeneity by Single-Cell Analysis. Anal Chem. 2019 Nov 5;91(21):13314-13323.

123. Li Q, Zhang X, Ke R. Spatial Transcriptomics for Tumor Heterogeneity Analysis. Front Genet. 2022 Jul 5;13:906158.

124. Huang, D., Ma, N., Li, X. et al. Advances in single-cell RNA sequencing and its applications in cancer research. J Hematol Oncol 16, 98 (2023).

125. Walsh AJ, Cook RS, Sanders ME, Aurisicchio L, Ciliberto G, Arteaga CL, Skala MC. Quantitative optical imaging of primary tumor organoid metabolism predicts drug response in breast cancer. Cancer Res. 2014 Sep 15;74(18):5184-94.

126. Shah AT, Heaster TM, Skala MC. Metabolic Imaging of Head and Neck Cancer Organoids. PLoS One. 2017 Jan 18;12(1):e0170415.

127. Alam, S.R., Wallrabe, H., Svindrych, Z. et al. Investigation of Mitochondrial Metabolic Response to Doxorubicin in Prostate Cancer Cells: An NADH, FAD and Tryptophan FLIM Assay. Sci Rep 7, 10451 (2017).

128. Wang C, Zhang H, Liu Y, Wang Y, Hu H, Wang G. Molecular subtyping in colorectal cancer: A bridge to personalized therapy (Review). Oncol Lett. 2023 Apr 18;25(6):230.

129. Salgia R. Mutation testing for directing upfront targeted therapy and postprogression combination therapy strategies in lung adenocarcinoma. Expert Rev Mol Diagn. 2016 Jul;16(7):737-49.

130. Имянитов Е.Н. Молекулярная диагностика в онкологии: новые тенденции, Том 19, № 4 (2019) 25-32

131. Klinghammer K, Walther W, Hoffmann J. Choosing wisely - Preclinical test models in the era of precision medicine. Cancer Treat Rev. 2017 Apr;55:36-45.

132. Morelli M, Lessi F, Barachini S, Liotti R, Montemurro N, Perrini P, Santonocito OS, Gambacciani C, Snuderl M, Pieri F, Aquila F, Farnesi A, Naccarato AG, Viacava P, Cardarelli F, Ferri G, Mulholland P, Ottaviani D, Paiar F, Liberti G, Pasqualetti F, Menicagli M, Aretini P, Signore G, Franceschi S, Mazzanti CM. Metabolic-imaging of human glioblastoma live tumors: A new precision-medicine approach to predict tumor treatment response early. Front Oncol. 2022 Sep 5;12:969812.

133. Y. Chung, J.A. Schwartz, C. Gardner, R.E. Sawaya, S.L. Jacques, Diagnostic potential of laser-induced autofluorescence emission in brain tissue, Journal of Korean medical science 12, 135-142 (1997)

134. Koenig F, McGovern FJ, Althausen AF, Deutsch TF, Schomacker KT. Laser induced autofluorescence diagnosis of bladder cancer. J Urol. 1996 Nov;156(5):1597-601.

135. Andersson-Engels, S., Johansson, J., Svanberg, K., & Svanberg, S. Laser-induced fluorescence in medical diagnostics. In T. J. Dougherty (Ed.), Photodynamic Therapy: Mechanisms II (Vol. 1203, pp. 76-96). (1990).

136. Lentsch G, Valdebran M, Saknite I, Smith J, Linden KG, König K, Barr RJ, Harris RM, Tromberg BJ, Ganesan AK, Zachary CB, Kelly KM, Balu M. Non-invasive optical biopsy by multiphoton microscopy identifies the live morphology of common melanocytic nevi. Pigment Cell Melanoma Res. 2020 Nov;33(6):869-877.

137. Seidenari S, Arginelli F, Dunsby C, French PM, König K, Magnoni C, Talbot C, Ponti G. Multiphoton laser tomography and fluorescence lifetime imaging of melanoma: morphologic features and quantitative data for sensitive and specific non-invasive diagnostics. PLoS One. 2013 Jul 26;8(7):e70682.

138. Suarez-Ibarrola R, Braun L, Pohlmann PF, Becker W, Bergmann A, Gratzke C, Miernik A, Wilhelm K. Metabolic Imaging of Urothelial Carcinoma by Simultaneous Autofluorescence Lifetime Imaging (FLIM) of NAD(P)H and FAD. Clin Genitourin Cancer. 2021 Feb;19(1):e31-e36.

139. Wittenberg, T., Hackner, R., Bocklitz, T., Krafft, C., Becker, W., Braun, L., Pohlmann, P., Miernik, A., Suarez-Ibarrola, R. and Lemke, M. N.. "First results of computer-enhanced optical diagnosis of bladder cancer" Current Directions in Biomedical Engineering, vol. 6, no. 3, 2020, pp. 246-249.

140. Wang M, Tang F, Pan X, Yao L, Wang X, Jing Y, Ma J, Wang G, Mi L. Rapid diagnosis and intraoperative margin assessment of human lung cancer with fluorescence lifetime imaging microscopy. BBA Clin. 2017 Apr 27;8:7-13.

141. S.R. Kantelhardt, J. Leppert, J. Krajewski, N. Petkus, E. Reusche, V.M. Tronnier, G. Hüttmann, and A. Giese, Imaging of Brain and Brain Tumor Specimens by Time-Resolved Multiphoton Excitation Microscopy Ex Vivo, Neuro Oncol. 9, 103-112 (2007).

142. Shen B, Yan J, Wang S, Zhou F, Zhao Y, Hu R, Qu J, Liu L. Label-free whole-colony imaging and metabolic analysis of metastatic pancreatic cancer by an autoregulating flexible optical system. Theranostics. 2020 Jan 1;10(4):1849-1860.

143. Jo JA, Cheng S, Cuenca-Martinez R, Duran-Sierra E, Malik B, Ahmed B, Maitland K, Cheng YL, Wright J, Reese T. Endogenous Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM) Endoscopy For Early Detection Of Oral Cancer And Dysplasia. Annu Int Conf IEEE Eng Med Biol Soc. 2018 Jul;2018:3009-3012.

144. Sun Y, Phipps JE, Meier J, Hatami N, Poirier B, Elson DS, Farwell DG, Marcu L. Endoscopic fluorescence lifetime imaging for in vivo intraoperative diagnosis of oral carcinoma. Microsc Microanal. 2013 Aug;19(4):791-8.

145. Kennedy, G.T., Coda, S., Thompson, A.J., Elson, D.S., Neil, M.A., Stamp, G., Thillainayagam, A.V., Viellerobe, B., Lacombe, F., Dunsby, C., & French, P.M. (2011). Fluorescence lifetime imaging endoscopy. BiOS.

146. N.P. Galletly, J. McGinty, C. Dunsby, F. Teixeira, J. Requejo-Isidro, I. Munro, D.S. Elson, M.A.A. Neil, A.C. Chu, P.M.W. French, G.W. Stamp, Fluorescence lifetime imaging distinguishes basal cell carcinoma from surrounding uninvolved skin, British Journal of Dermatology, 159, 1, 2008, 152-161

147. Lagarto JL, Shcheslavskiy V, Pavone FS, Cicchi R. Real-time fiber-based fluorescence lifetime imaging with synchronous external illumination: A new path for clinical translation. J Biophotonics. 2020 Mar;13(3):e201960119.

148. Zherebtsov EA, Potapova EV, Mamoshin AV, Shupletsov VV, Kandurova KY, Dremin VV, Abramov AY, Dunaev AV. Fluorescence lifetime needle optical biopsy discriminates hepatocellular carcinoma. Biomed Opt Express. 2022;13(2):633-646.

БЛАГОДАРНОСТИ

Выражаю огромную и искреннюю признательность своему научному консультанту и учителю Елене Вадимовне Загайновой за чуткое руководство, бесценную поддержку, доверие мне и всестороннее участие в нашем общем деле. Особая роль в данной работе принадлежит Сергею Анатольевичу Лукьянову - «мегагрант» под его руководством стал импульсом для начала исследований и моего профессионального роста.

Я глубоко благодарю своих коллег и друзей - сотрудников НИИ ЭО и БМТ В.И. Щеславского, Л.Е. Шимолину, И.Н. Дружкову, А.Д. Комарову, Д.В. Южакову, Н.И. Игнатову, Е.Б. Киселеву, Д.С. Кузнецову, М.М. Карабут, В.В. Елагина, В.В. Дуденкову, А.М. Можерова, А.А. Плеханова, А.И. Гаврину, А.В. Полозову и др., а также директора М.А. Сироткину за многолетнюю совместную работу и помощь в выполнении исследований. Слова сердечной благодарности адресую М.М. Лукиной, которая работала в нашем коллективе ранее и вместе со мной осваивала новое научное направление.

Эта работа не могла состояться без тесной коллаборации со многими талантливыми учеными из других организаций - К.А. Лукьяновым (ИБХ РАН), В.В. Белоусовым (ФцМн ФМБА), В.П. Баклаушевым (ФНКЦ ФМБА), Е.А. Ширшиным (МГУ), А.А. Гулиным (ИХФ РАН), С.П. Туником (сПбГу), Л.Н. Бочкаревым (ИМХ РАН), В.А. Каменским, И.В. Турчиным, А.Г. Орловой (ИПФ РАН), М.К. Kuimova (Imperial College London), W. Becker (Becker&Hickl) и их коллегами. Безмерно благодарю каждого из них.

Отдельное спасибо клиницистам В.Е. Загайнову (ПИМУ, НОКОД), К.С. Яшину (ПИМУ), С.В. Гамаюнову (НОКОД) и их коллегам за проявленный интерес к новому методу и сотрудничество.

Благодарю также всех тех, с кем довелось работать над проектами и публикациями, вошедшими в диссертацию, и кого не упомянула выше.