Формирование неселективных пептид-липидных пор как модель процесса белковой трансдукции с помощью поликатионных аналогов грамицидина A тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.10, кандидат химических наук Ковальчук, Сергей Игоревич

• Ковальчук, Сергей Игоревич
• кандидат химических наук
• 2010

Оглавление диссертации кандидат химических наук Ковальчук, Сергей Игоревич

Оглавление.

Список сокращений.

1 Введение.

2 Литобзор.

2.1 Введение.

2.2 Катионные амфипатичные пептиды.

2.2.1 Состав и свойства АМП.

2.2.2 Мембранная активность катионных амфипатичных РАМП.

2.2.2.1 Индивидуальная структура молекул РАМП.

2.2.2.2 Надмолекулярная организация РАМП в мембране.

2.2.2.2.1 Связывание пептидов с мембранами.

2.2.2.2.1.1 Агрегация пептидов на поверхности мембраны.

2.2.2.2.2 Транслокация.

2.2.2.2.2.1 Механизм «тонущего рафта».

2.2.2.2.2.2 Молекулярная электропорация.

2.2.2.2.2.3 Тороидальная пора.

2.2.2.2.2.4 Альтернативные варианты пор.

2.2.2.2.2.5 Потенциал-зависимость.

2.2.2.2.2.6 «Всё-или-ничего» У8 ступенчатый выход.

2.2.2.2.2.6.1 «Всё-или-ничего».

2.2.2.2.2.6.2 Ступенчатый выход.

2.2.2.2.2.6.3 Интегральная утечка.

2.2.2.2.3 Глобальные структурные изменения мембран.

2.2.2.2.3.1 Механизм ковра, или детергент-подобный механизм.

2.2.2.2.3.2 Слияние мембранных везикул.

2.2.2.2.4 Селективность утечки.

2.2.2.3 Принцип определения механизма активности АМП.

2.2.2.3.1 Спонтанная кривизна мембраны.

2.2.2.3.2 Влияние пептидов на спонтанную кривизну.

2.2.2.3.3 Изменение толщины мембраны.

2.2.2.3.4 Факторы, влияющие на активность АМП.

2.2.2.3.4.1 Мембранные факторы.

2.2.2.3.4 1.1 Влияние заряда мембраны.

2.2 2 3.4 1.2Зависимость от модуляторов спонтанной кривизны мембраны.

2 2.2.3.4.1 3 Влияние фазы липидов на активность АМП.

2 2 2.3.4.1.4 Влияние АМП на ламеллярные фазы липидов.

2 2 2.3 4 1.5 Влияние АМП на форму везикул.

2.2.2 3.4.2 Влияние состава пептидов.

2.2.2.3.4.2.1 Гидрофобность.

2 2.2.3.4 2 2Глубина секторов.

2.2.2.3.4.2.3 Другие факторы

2.2.2.3.4 3 Влияние рН и температуры.

2.2.2.3 5 Теория «двух состояний».

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Формирование неселективных пептид-липидных пор как модель процесса белковой трансдукции с помощью поликатионных аналогов грамицидина A»

3 2 Синтез пептидов. . 90

3 3 Анализ уровня димеризации цистеин-содержащих пептидов. . 92

3 4 Взаимодействие КГА с мембранами 93

3.4.1 Исследование селективности пептид-индуцированной мембранной проводимости .93

3.4.2 Исследование проводимости одиночных КГА-индуцированных мембранных дефектов (пор).98

3 4.3 Структура КГА.102

3.4.4 Исследование природы неселективных пор.105

3.4 4.1 Утечка карбоксифлуоресцеина из липосом.106

3.4 4.2 Измерение скорости трансбислойной диффузии липидов (флип-флопа) на пиренил-меченных липосомах.108

3.4 4 2 1 Проверка асимметричности липосом.110

3 4 4 2.2 Температурозависимый флип-флоп. 111

3 4.4 2 3 Исследование флип-флопа на модельных АМГТ мелиттине и магайнине-2 .113

3.4 4 2.4 Влияние пептидов на симметрично меченные липосомы.115

3.4.4.3 Сравнение утечки красителя из липосом и флип-флопа, индуцированных КГА.117

3.4.4.4 Временная зависимость мембранной активности КГА .122

3.4.4.4.1 Восстановление NBD-групп дитионитом натрия на симметрично меченных липосомах . 122

3 4 4.4.2 Метод изучения временной зависимости уровня мембранной активности пептидов . 125

3 4.4.4.3 Исследование временной зависимости взаимодействия КГА с мембранами. 127

3 4 5 Заключение по разделу «Взаимодействие КГА с мембранами».129

3 5 Агрегация КГА и формирование нековалентных комлпексов с белками в растворе . . 130

3.5.1 Агрегация КГА в растворе.131

3.5.2 Формирование нековалентных комплексов с белками.133

3 б Взаимодействие пептид-белковых комплексов с искусственными мембранами . .135

3 7 Корреляция поробразующей и трапсдукционнои активности в ряду направленно модифицированных КГА . . . 138

3.7.1 Уровень димеризации пептидов.139

3 7.2 Локализация поликатионной последовательности .140

3.7.3 Состав катионной последовательности.142

3.7.4 Длина катионного домена (заряд).142

3.7.5 Длина гидрофобного домена.143

3.7.6 Замена остатков триптофана на изолейцин.145

3.7.7 Заключение по влиянию модификаций аминокислотной последовательности пептидов на их активность.146

3.8 Сравнегше механизмов трансдукциогтой активности рер-1 и КГА.147

4 Материалы и методы.153

4.1 Получение Fmoc-производных D-аминокислош (Fmoc-D- Val и Fmoc-D-Leu) . 153

4.2 Пептидный синтез.154

4.2.1 Присоединение первой аминокислоты к хлор-тритильной смоле.154

4.2.1.1 Анализ нагрузки первой аминокислоты на хлор-тритильной смоле. 155

4.2.2 Наращивание полипептидной цепи.155

4.2.2.1 Ручной синтез.155

4.2.2.2 Автоматический синтез.156

4.2.3 Модификация а-ЬШЬ-группы пептидил-полимера.157

4.2.3.1 Ацетилирование пептидил-полимеров по a-NH2-rpynne.157

4.2.3.2 Присоединение Вос-защиты.157

4.2.3.3 Присоединение родамина (получение лиссамин родамин В сульфонил -пептидов).157

4.2.4 Тест Кайзера — качественный тест на наличие аминогрупп на пептид ил-полимере.158

4.2.5 Отщепление пептидов от полимеров.158

4.2.5.1 Отщепление пептидов с одновременным деблокированием.158

4.2.5.2 Отщепление пептидов без деблокирования (с сохранением защитных групп).159

4.2.6 Выделение продукта из реакционной смеси.159

4.2.6.1 Аналитическая ОФ-ВЭЖХ.159

4.2.6.2 Масс-спектрометрия.160

4.3 Измерение концентрации пептидов.160

4.4 Анализ уровня димеризации Cys-содержащих пептидов.160

4.4.1 Тест Эллмана.160

4.5 Исследование пептидов на искусственных мембранных системах.161

4.5.1 Измерение проводимости на Б ДМ.161

4.5.2 Приготовление моноламеллярных липосом.161

4.5.3 Измерение электрического потенциала на мембране.162

4.5.4 КД спектроскопия.162

4.5.5 Измерение утечки карбоксифлуоресцеина из липосом.163

4.5.6 Измерение скорости флип-флопа с использованием 1-лауроил-2-(1-пиренбутироил)-зп-глицеро-3-фосфатидилхолина (руРС).164

4.5.6.1 Синтез 1-лауроил-2-(1-пиренбутироил)-зп-глицеро-3-фосфатидилхолина (руРС).164

4.5.6.2 Приготовление меченых липосом.165

4.5.6.3 Подтверждение асимметричности липосом.166

4.5.6.3.1 Спонтанный флип-флоп.166

4.5.6.3.2 Межлипосомный обмен липидами.166

4.5.6.4 Измерение скорости пептид-опосредованного флип-флопа.166

4.5.6.5 Влияние пептидов на симметрично меченные липосомы.167

4.5.6.6 Измерение пептид-опосредованного флип-флопа.167

4.5.7 Исследование стабильности каналов.168

4.5.7.1 Приготовление симметрично меченных липосом.168

4.5.7.2 Влияние пептидов на тушение флуоресценции симметрично меченных липосом при добавлении SDT.168

4.6 Изучения самоагрегации пептидов и их связывания с белками в растворе. 169

4.6.1 Теоретические основы метод флуоресцентной корреляционной спектроскопии (ФКС).169

4.6.2 Получение родамин-меченного производного БСА.173

4.6.3 Флуоресцентная корреляционная спектроскопия.174

4.6.4 Исследование формирования нековалентных комплексов.174

4.7 Исследование пептидов in vitro на эукариотических клетках.174

4.7.1 Клеточные культуры.174

4.7.2 Трансдукция клеток Р-галактозидазой.175

5 Выводы.176

6 Литература.178

Список сокращений

Вос20 ди-трет-бутил пирокарбонат

СРР cell penetrating peptides - мембрано-проникающие пептиды

DCM дихлорметан

DIC ]Ч,]Ч-диизопропил-карбодшшид

DIPEA N -эти л дииз опро пи л амин

DMEM питательная среда (Dulbecco's Modified Eagle's Medium)

DMF ]\Ш'-диметилформамид

DMPC димиристоилфосфатидилхолин

DMSO диметисульфоксид

DOPC дио л ео ил ф о с ф атиди лхо л ин

DOPE-NBD 1,2-диолеоил-8п-глицеро-3-фосфоэтаноламин-Н-(7-нитро-2

1,3-бензоксадиазол-4-ил) DPhPC дифитаноилфосфатидилхолин DSPG дистеароилфосфатидилхолин DTT дитиотреитол EDT этандитиол ЕЮН этанол

Fmoc флуоренилметоксикарбонил GA грамицидин А

GUV гигантские моноламеллярные везикулы HOBt 1-гидрокси-бензтриазол MES 2-(К-морфолино)этансульфоновая кислота NBD 7-нитробенз-2-окса-1,3 -диазол

NBD-OPC 1-олеоил-2-(12-((7-нитро-2-1,3-бензоксадиазол-4-ил) амино) лауроил)-.ул-глицеро-3-фосфатидилхолин NLS сигнал ядерной локализации NMP N-метил-пирролидон oNPG о-нитрофенил-р-В-галактопиранозид РА фосфатидная кислота

PC фосфатидилхолин

РЕ фосфатидилэтаноламин

PG фосфатидилглицерол

PS фосфатидилсерин

PTD protein transduction domain - домен белковой трансдукции py PC 1 -лауроил-2-( 1 -пиренбутироил)-8П-глицеро-3 -фосфатидилхолин

SDS додецилсульфат натрия

SDT sodium dithionite, дитионит натрия, Na2S204

SoyPC соевый фосфатидилхолин

ВиОН трет-бутанол

TFA трифторуксусная кислота

TFE трифторэтанол

THF тетрагидрофуран

ТТЗтриизопронилсилаи

Tris трис-(гидроксиметил)-аминометан гидрохлорид

X-Gal 5-бромо-4-хлоро-3-индолил-|3-0-галактозид аАМП а-спиральные АМП p-Gal р-галактозидаза

ЗАМП АМП, образующие р-шпильку

АА аминокислота

АМП антимикробные пептиды

БЛМ бислойная липидная мембрана

БСА бычий сывороточный альбумин

ВЭЖХ высокоэффективная жидкостная хроматография

ГФ гель фаза

ЖКФ жидкокристаллическая фаза

КГ А катионные грамицидиновые аналоги

КД круговой дихроизм

КФ/CF карбоксифлуоресцеин л/п соотношение липид/пептид (моль/моль) (используется в разделе «результаты»)

М метанол

МС масс-спектрометрия НАМП нерибосомальные АМП НК нуклеиновая кислота ОФ-ВЭЖХ обращено-фазовая ВЭЖХ ПААГ-электрофорез электрофорез в полиакриламидном геле п/аДСк[^5'6 параллельная/антипараллельная правозакрученная/левозакрученная двойная спираль с 5,6 аминокислотными остатками на виток п/аОСяд6'3 параллельная/антипараллельная правозакрученная/левозакрученная одиночная спираль с 6,3 аминокислотными остатками на виток п/л соотношение пептид/липид (моль/моль) (используется в разделе «литобзор»)

РАМП рибосомальные АМП тдс теория двух состояний тех тонкослойная хроматография

ФКС флуоресцентная корреляционная спектроскопия

X хлороформ цпм цитоплазматическая мембрана

1 Введение

Цитоплазматическая мембрана (ЦПМ) является физическим барьером, отделяющим клетку от окружающей среды и препятствующим свободному обмену химических соединений между ними. Для транспортировки через ЦПМ и доставки внутрь клеток крупных молекул, например белков или нуклеиновых кислот, используются разнообразные приёмы, которые можно условно разделить на две основные группы: транспорт с использованием липидных везикул и транспорт через искусственные мембранные дефекты.

К липосомальному транспорту можно отнести как полученные in vitro из синтетических или природных липидов липосомы, нагруженные целевым веществом, так и использование способности клеток к эндоцитозу, когда часть цитоплазматической мембраны уходит в цитоплазму в виде эндосом, при этом всё, что было сорбировано на поверхности данного участка мембраны, оказывается внутри липидных везикул в цитоплазме клеток. Выход целевых соединений непосредственно в цитоплазму может осуществляться в результате утечки при актах слияния и сортинга эндосом в аппарате Голь-джи. Наряду с широкими возможностями, данный подход также имеет ряд недостатков, связанных со сложностью формирования и использования терапевтически активных лекарственных форм препаратов, а также с проблемами высвобождения агентов внутри клеток в интактной форме.

К методам внутриклеточной доставки через искусственно созданные мембранные дефекты относятся такие подходы как электропорация, бомбардировка частицами золота с нанесёнными терапевтически активными соединениями, обработка клеток ультразвуком и т.д., т.е. воздействия, приводящие к появлению в ЦПМ физических повреждений. Минусом подобных подходов является серьёзное нарушение мембранного барьера клеток, что, в конечном итоге, часто приводит к их гибели. Кроме того, к этой же группе методов можно отнести использование различных нелипосомальных векторных систем, позволяющих временно локально изменять проводимость мембран, например системы на основе вирусных частиц или химические агенты, нарушающие упорядоченность БЛМ. Данные методы лишены как основного минуса липосомальных систем, т.е. проблемы попадания внутрь клеток интакт-ного материала, так и в достаточно малой степени и очень локально затрагивают целостность мембранного барьера.

В последние годы в связи с широким распространением методов автоматического секвенирования ДНК появилось множество задач, связанных с поиском биологической активности теоретически предполагаемых белковых продуктов экспрессии найденных генов. Однако, в то время как технология доставки нуклеиновых кислот разрабатывалась в течение десятилетий, что к сегодняшнему дню привело к появлению множества высокоэффективных подходов и препаратов (преимущественно, предполагающих нековалентное связывание с НК) для трансфекции эукариотических клеток, методология доставки белков находится на очень низком уровне развития.

Гидрофильные цитоплазматические белки не способны самопроизвольно пересекать клеточную мембрану за исключением очень небольшой группы, в которую входят, например, Tat-белок вируса иммунодефицита человека, белок vp22 вируса простого герпеса и ещё ряд белков различного, в т.ч. невирусного, происхождения. Их транслокационная способность обеспечивается содержанием в последовательности небольших доменов, основной чертой которых является высокое содержание основных аминокислот (т.н. PTD (protein transduction domains) - домены белковой трансдукции). Более того, синтетические пептиды, соответствующие таким доменам, а также синтезированные по аналогии с ними поликатионные пептиды случайного состава, например гомоолигомер аргинина, оказались способны проникать через цито-плазматическую мембрану и без остального белкового окружения. Все подобные пептиды (как природные, так и сконструированные по аналогии искусственные) были условно объединены в группу т.н. «мембрано-проникающих пептидов» (СРР - cell penetrating peptides). К сожалению, механизм процесса транслокации как целых белков, так и их пептидных фрагментов однозначно до конца не выяснен, хотя существует ряд работ, описывающих возможные схемы взаимодействия отдельных представителей с мембранами [1,2].

На основании этих данных было предложено ввести в последовательность белков, которые нужно было транспортировать внутрь клеток, дополнительную пептидную последовательность домена белковой трансдукции. Самый прямой и логичный способ, использующийся на данный момент, предполагает их предварительную ковалентную конъюгацию, которая может достигаться при помощи нескольких подходов, например создание плазмиды, кодирующей конъюгат целевого белка и домена белковой трансдукции, с последующей экспрессией in vitro и выделением продукта (например, [3, 4]), или химическая конъюгация предварительно полученных или выделенных белков с PTD-пептидами в растворе (например, [5]). Наряду с высокой эффективностью данные подходы имеют также и свои недостатки. В частности, синтез конъюгатов через плазмиды является чрезвычайно трудоёмким и сложным процессом, т.к. включает в себя большое количество стадий, а также сталкивается с проблемами, связанными с особенностями системы белковой экспрессии обычно используемых для наработки белков прокариотиче-ских клеток, не способных корректно синтезировать белки эукариот. Химическая конъюгация проще и удобнее для практического использования, однако ограничениями данного метода является необходимость наличия свободных активных групп на поверхности белка, а также невозможность заранее предсказать, как подобная необратимая модификация скажется на биологической активности макромолекулы.

Альтернативой ковалентной конъюгации белков с PTD-домеиами является использование пептидных векторов, способных обратимо сорбироваться на поверхности белков за счёт образования лабильных нековалентных связей (гидрофобные, электростатические и т.д.) [6, 7], которые бы при попадании в клетку разрушались, освобождая при этом нативную молекулу белка. Данный подход был реализован в 2001 г. группой французских учёных с исполь

12 зованием пептида рер-1 [8, 9], который состоит из гидрофобного триптофан-содержащего домена и гидрофильного поликатионного домена, обогащенного остатками лизипа. Для рер-1, а позднее и для ряда его аналогов, была показана высокая трансдукционная активность с сохранением функциональной активности белков после переноса [9-12].

Некоторое время назад в нашей лаборатории способность переносить белки в эукариотические клетки (с использованием в качестве модельного белка фермента р-галактозидазы) была обнаружена у пептидов - аналогов природного антибиотика грамицидина А, несущих обогащенную основными аминокислотами концевую гидрофильную последовательность - катионными гра-мицидиновыми аналогами (КГА) [13]. Было показано, что подобные пептиды, аналогично пептиду рер-1, способны формировать нековалентные комплексы с белками с их последующим переносом через клеточную мембрану. Важным преимуществом КГА перед рер-1 являлось снижение активного соотношения пептид/белок и повышение эффективности переноса, по всей видимости связанных с использованием в качестве гидрофобного домена последовательности грамицидина. Также отличительными чертами КГА являлась их способность в отсутствие белков формировать в мембранах катион-селективные каналы, свойственные природному грамицидину А, а также вызывать в некоторых условиях неселективную проводимость мембран.

В то же время возможности оптимизации метода внутриклеточного транспорта белков в составе нековалентных комплексов с пептидами-переносчиками и расширения спектра трансдукционно-активных соединений значительно ограничивались недостаточной изученностью механизма доставки как с помощью рер-1, так и с помощью КГА. Единственным общепринятым фактом являлась энергетическая независимость транслокации пептид-белковых комплексов, а также локализация белков внутри клетки вне маркерных областей какого-либо из вариантов эндоцитоза [8, 10-12]. Таким образом, транспорт осуществлялся в процессе прямого взаимодействия ком-( плексов с липидами мембран, а, поскольку белки не в состоянии самопроиз

13 ь вольно проникать в клетку, основной вклад в данное взаимодействие, очевидно, вносят пептиды-переносчики.

Целью настоящей работы являлось детальное исследование взаимодействия КГА с модельными мембранными системами и с транспортируемыми белками как в растворе, так и в присутствии липосом. Кроме того, в культуре эукариотических клеток НеЬа была изучена пептид-опосредованная трансдукция модельного белка Р-га лактозттдазы и прослежена корреляция транспортной активности с поведением тех же пептидов в искусственных мембранных системах. С этой целью наряду с ранее описанными КГА нами была также получена серия новых производных, отличающихся по таким признакам как длина катионного и гидрофобного доменов и их относительная локализация в последовательности пептида.

Полученные в результате работы данные позволили существенно продвинуться в понимании физико-химических механизмов, лежащих в основе трансдукции белков катионными грамицидиновыми аналогами. Обнаруженная нами полная корреляция между эффективностью транспорта и каналооб-разователыюй активностью КГА на искусственных мембранных системах позволяет рассматривать формирование ими пептид-липидных пор как необходимое условие и существенный этап процесса транслокации нековалент-ных пептид-белковых комплексов.

2 Литобзор

Взаимодействие катионных амфипатичных пептидов и грамицидина А с мембранами

2.1 Введение

Как было отмечено выше, данная работа посвящена изучению поведения катионных аналогов грамцидина А (КГА) в искусственных мембранных системах. Поскольку все пептиды этой группы представляют собой «химеры», построенные из двух доменов: с одной стороны, гидрофобного грамицидина А или его аналога, а с другой, катионного олигопептида,— в литературном обзоре мы знакомим читателя с имеющимися данными о структурно-функциональных взаимоотношениях обширного семейства катионных амфипатичных пептидов.

Кроме того, учитывая уникальные структурные особенности грамицидина А. а также его каналообразующие свойства, отдельный раздел будет посвящен пептидам этой группы.