Фосфолипаза D растений: распространение, возможная физиологическая роль тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, кандидат биологических наук Некрасов, Эдуард Витальевич

• Некрасов, Эдуард Витальевич
• кандидат биологических наук
• 2000

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Некрасов, Эдуард Витальевич

СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ "ФОСФОЛИПАЗА D РАСТЕНИЙ"

1.1. Введение

1.2. История исследования фосфолипазы D растений

1.3. Реакции, катализируемые фосфолипазой D. Гидролазная и трансферазная активности фермента

1.4. Методы исследования фосфолипазы D

1.5. Распространение фосфолипазы D среди низших и высших растений

1.6. Тканевое и внутриклеточное распределение фосфолипазы D

1.7. Свойства фосфолипазы D

1.8. Регуляция активности фосфолипазы D в условиях in vivo

1.9. Физиологическая роль фосфолипазы D растений

1.10. Практическое значение растительной фосфолипазы D

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Фосфолипаза D растений: распространение, возможная физиологическая роль»

Фосфолипаза D (фосфатидилхолин-фосфатидилгидролаза, НФ 3.1.4.4.) является одной из четырех фосфолипаз, способных расщеплять сложноэфирные связи в молекулах глицерофосфолипидов (рис. 1). фосфолипаза Ai

Ч\. О фосфолипаза Аг ||

СН2—О+С—R1

R2—с—н |> о СН2—0-(-Р + о—СН2— СН2— N(CH3)3 1\ фосфолипаза С фосфолипаза D

Рис. 1. Связи в молекуле фосфатидилхолина, атакуемые фосфолипазами.

Особенностью этого фермента, отличающей его от других фосфолипаз, является трансфосфатидилазная активность - способность переносить фосфатидильную часть молекулы на акцептор, содержащий гидроксильную группу. Образование фосфатидилпроизводных спиртов в результате трансферазной реакции может служить убедительным доказательством присутствия фермента в биологических образцах и нашло применение для определения его активности [1]. Благодаря трансферазной активности фосфолипазу D используют как "инструмент" для получения редких фосфолипидов и фосфатидилпроизводных различных соединений [2].

Фосфолипаза D впервые была обнаружена в растениях [3] и долгое время ее исследовали как фермент этой группы организмов. Однако позже выяснилось, что фосфолипаза D широко распространена в природе. В 60-70-е годы этот фермент был найден в бактериях [4, 5], красной микроводоросли [6], тканях млекопитающих [7], слизевике [8], дрожжах [9].

До середины 80-х годов количество работ, посвященных фосфолипазе D, не превышало десятка-полутора в год, большинство из них относилось к ферменту из растений. Ситуация резко изменилась во второй половине 80-х, когда число публикаций, обсуждающих фермент, быстро достигло нескольких сотен в год и продолжало сохраняться на высоком уровне на протяжении 90-х годов. Однако при этом главным объектом исследований стала фосфолипаза D животных. За последние 10 лет появились многие сотни экспериментальных статей и несколько десятков обзоров, освещающих различные аспекты исследований фосфолипазы D. Полагают, что фермент участвует во многих физиологических процессах, обнаружены разнообразные пути регуляции его активности [10-12]. Основную роль для фосфолипазы D животных отводят в передаче клеточных сигналов, что можно видеть из заголовков ряда обзоров [1,13-15].

В настоящее время фосфолипаза D растений привлекает заметно меньшее внимание мировой науки, она оказалась во многих аспектах менее исследованной, чем этот фермент животных. Однако следует напомнить, что многие важные открытия при изучении фосфолипазы D выполнены на препаратах фермента, выделенных из растений [16]. Некоторые авторы рассматривают ее, как ключевой фермент катаболизма фосфолипидов в мембранах растений [17-19]. Возросший интерес к фосфолипазе D животных в 90-е годы отразился также на исследованиях этого фермента из растений, о чем говорит появление в последнее время нескольких обзоров [20-23].

Все сказанное выше говорит о необходимости дальнейших исследований растительной фосфолипазы D. Для России эта проблема особенно актуальна, так как в нашей стране исследованиями фермента в последнее десятилетие занимались очень мало. Ведущий научный коллектив СССР по изучению фосфолипазы D растений, возглавляемый М.М. Рахимовым, оказался ныне за рубежом.

Наше внимание к фосфолипазе D растений привлек не только всплеск интереса к нему в мировой науке, но, главным образом, отсутствие информации или противоречивые литературные данные по многим важным вопросам. Так, хорошо известно, что фермент присутствует в покрытосеменных растениях, но не было четких представлений о его распространении в других отделах высших и низших растений. Физиологическая роль этого фермента в растениях до сих пор не выяснена [24].

Решению вопроса о физиологической роли фосфолипазы D в растениях во многом препятствовало отсутствие знаний о механизмах регуляции активности фермента в живых клетках, хотя возможности регуляции его активности в условиях in vitro известны относительно давно [16].

С целью выяснить распространение фосфолипазы D и ее участие в физиологических процессах у растений мы провели исследования в трех направлениях. Во-первых, проверили, присутствуют ли в других отделах сосудистых растений, кроме покрытосеменных, фосфолипаза D, проявляющая гидролазную активность наряду с трансферазной. Кроме того, на примере семян покрытосеменных растений мы попытались выяснить, существует ли зависимость активности фермента от систематического положения растений на уровне крупных и мелких таксономических единиц. Во-вторых, используя быстрый и надежный метод определения активности фосфолипазы D, модифицированный в ходе этой работы, мы проанализировали изменения активности фермента в растениях при разных физиологический состояниях: при поражении паразитическим растением, при прорастании семян и в ходе развития побегов в течение вегетационного периода. В-третьих, провели предварительный поиск природных регуляторов активности фосфолипазы D. Помимо экспериментальных исследований мы уделили большое внимание сбору информации о фосфолипазе D растений.

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Некрасов, Эдуард Витальевич

ВЫВОДЫ

1. Разработан реагент на основе смеси молибдатов с небольшим добавлением хлорной кислоты, позволяющий обнаруживать фосфолипиды на тонкослойных хроматограммах, а затем при нагревании быстро разлагать их и другие фосфорсодержащие вещества до неорганического фосфата для последующего обнаружения малахитовым зеленым и количественного определения фосфора.

2. Показано, что в красных водорослях (Rhodophycota) и ряде отделов сосудистых растений (Lycopodiophyta, Filicophyta, Pinophyta), где ранее фосфолипазу D обнаруживали только как трансферазу, присутствует фермент, обладающий также гидролазной активностью.

3. Найдено, что фосфолипаза D присутствует в семенах всех исследованных 28 видов, представляющих 10 семейств двудольных и однодольных культурных растений. Не обнаружено четкой взаимосвязи активности фермента и систематического положения вида растений, однако вариации активности фосфолипазы D в пределах одного вида меньше, чем в более крупных таксонах - семействах и классах.

4. Показано, что покоящиеся семена ряда культурных растений - подсолнечника, гороха, некоторых сортов сои, видов рода Brassica - могут служить удобными источниками для получения высокоактивных препаратов фосфолипазы D.

5. Вопреки имеющимся литературным данным, не обнаружено устойчивого повышения активности фосфолипазы D в растениях, пораженных повиликой.

6. Показано, что активность фосфолипазы D изменяется во время развития растений. В прорастающих семенах изменения активности фермента имеют сложный характер, что, вероятно, обусловлено участием фосфолипазы D в нескольких процессах, одновременно протекающих в разных тканях проростков.

7. Обнаружено, что у семенных растений активность фосфолипазы D возрастает во время роста побегов, а иногда, хотя и в меньшей степени, в ходе старения листьев. Во всех исследованных видах растений активность фермента была максимальной в молодых тканях.

8. Показано, что в побегах растений присутствуют ингибиторы и активаторы фосфолипазы D. Так как некоторые из них приурочены к определенным стадиям развития побегов, то они могут участвовать в регуляции активности фермента в условиях in vivo.

1.11. Заключение

Несмотря на более чем полувековую историю исследований, фосфолипаза D растений все еще остается загадочным ферментом, как ее недавно определили К. Паппан и К. Вонг [22]. Как видно из результатов работ, приведенных выше, вопросы сохраняются или появляются новые практически по всем направлениям исследований этого фермента. Можно говорить лишь об относительном решении той или иной проблемы.

Например, утверждается вездесущность фосфолипазы D среди растений [26], однако, в действительности, убедительно показано ее присутствие только у покрытосеменных растений и некоторых водорослей. Противоречивые данные имеются по субклеточному распределению фермента.

Хорошо исследованы свойства фосфолипазы D в условиях in vitro, хотя мало что известно о ее поведении в живых клетках. Проводимые в этом направлении исследования оперируют, прежде всего, достижениями молекулярной биологии, возможностью в настоящее время говорить о потенциальных сайтах взаимодействия белковой молекулы с определенными регуляторами активности фермента, которые могут действовать внутри клеток. Другие авторы исследуют механизмы внутриклеточной регуляции активности фосфолипазы D с использованием приемов, применяемых при изучении фермента из животных.

Обсуждается участие фосфолипазы D в широком спектре физиологических процессов - от роста и старения до ответов растений на стрессовые воздействия. Однако, как меняется активность фосфолипазы D в течение всех фаз развития органов или тканей растений, не известно. В итоге оказывается, что отсутствие превалирующей в растениях формы фосфолипазы D, вообще, не отражается на их нормальном развитии. Предположения об участии этого фермента в передаче клеточных сигналов сталкиваются с проблемой высокого уровня его активности в растительных тканях.

Наконец, не решен основной вопрос: сколько же все-таки ферментов, действующих на фосфолипиды по типу фосфолипазы D, присутствуют в растениях, как они отличаются по свойствам и взаимосвязаны между собой?

Имеющиеся в настоящее время факты позволяют выдвигать предположения, объясняющие эти вопросы, однако многие из них требуют экспериментального подтверждения.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Объекты исследования

В экспериментах, преследующих разные цели, использовали отличающиеся по видовому составу наборы растений. Поэтому описание объектов исследования приведены для каждого эксперимента отдельно с указанием принадлежности видов к классам и отделам.

Виды водорослей и сосудистых растений, которые были исследованы на присутствие в них фосфолипазы D как трансферазы и гидролазы, представлены в таблице 3.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Некрасов, Эдуард Витальевич, 2000 год

1. Shukla S.D., Halenda S.P, Phospholipase D in cell signalling and its relationship to phospholipase С // Life Sci. 1991. V. 48. № 9. P. 851-866.

2. Yamane Т., Juneja L.R., Li D., Shimizu S. Enzymatic preparation of phospholipids containing various polar head groups // Ann. New York Acad. Sci. 1990. V. 613. P. 686690.

3. Hanahan D.J., ChaikofFI.L. A new phospholipide-splitting enzyme specific for the ester linkage between the nitrogenous base and the phosphoric acid grouping // J. Biol. Chem. 1947. V. 169. P. 699-705.

4. Soucek A., Michalec C., Souckova A. Enzymic hydrolisis of sphingomielins by a toxin of Corynebacterium ovis II Biochim. Biophys. Acta. 1967. V. 144. P. 180-182.

5. Yamaguchi Т., Okawa Y., Sakaguchi K., Muto N. Screening and identification of the phospholipase D-producing Streptomyces П Agr. Biol. Chem. 1973. V. 37. № 7. P. 16671672.

6. Antia N.J., Bilinski E., Lau Y.C. Identification and characterization of phospholipase D in a unicellular red alga (Porhyridium omentum) // Can. J. Biochem. 1970. V. 48. № 6. P. 643-648.

7. Saito M., Kanfer J. Solubilization and properties of a membrane-bound enzyme from rat brain catalyzing a base-exchange reaction // Biochem. Biophys. Res. Comm. 1973. V. 53. P. 391-398.

8. Comes P., Kleinig H. Phospholipids and phospholipase D in the true slime mold Physarumpolycephalum // Biochim. Biophys. Acta. 1973. V. 316. P. 13-18.

9. Cockcroft S, Phospholipase D: regulation by GTPases and protein kinase С and physiological relevance//Prog. Lipid Res. 1997. V. 35. P. 345-370.

10. Exton J.H. Phospholipase D: enzymology, mechanisms of regulation, and function // Physiol. Rev. 1997. V. 77. P. 303-320.

11. Exton J.H. New developments in phospholipase D // J. Biol. Chem. 1997. V. 272. P. 15579-5582.

12. Cook S.J., Wakelam M.J.O. Phospholipase С and phospholipase D in mitogenic signal transduction//Rev. Physiol. Biochem. Pharmac. 1992. V. 119. P. 13-45.14