Фотоаффинные липидные зонды с диазоциклопентадиен-2-илкарбонильной меткой: синтез и применение в мембранных исследованиях тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, доктор химических наук Водовозова, Елена Львовна

• Водовозова, Елена Львовна
• доктор химических наук
• 2007

Оглавление диссертации доктор химических наук Водовозова, Елена Львовна

1. ВВЕДЕНИЕ

2. Метод фотоаффинного мечения и его примение в структурно-биологических исследованиях (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

2.1. Основные принципы метода фотоаффинного зондирования

2.2. Схема проведения экспериментов по фотоаффинному мечению

2.3. Применение фотореактивных лигандов для разработки лекарственных средств

2.3.1. Поиск потенциальных мишеней лекарств

2.3.2. Транспортные процессы

2.3.3. Стереохимия взаимодействия G-белок-сопряженных рецепторов с лигандами

2.3.4. Исследования структуры ацетилхолинового рецептора никотинового типа

2.4. Применение фотоаффинных липидных зондов для изучения липид-белковых взаимодействий

2.4.1. Фотоаффинные ганглиозидные зонды

2.4.2. Фотоаффинные фосфолипидные зонды

2.4.3. Фотоаффинные нуклеотидные зонды

2.4.4. Фотоаффинные гликоконъюгаты

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Изучение фотохимических свойств диазоциклопентадиен-2-илкарбонильной группы

3.2. Синтез 14С-меченых фосфолипидных зондов, содержащих диазоциклопентадиен-2-илкарбонильную группу • 63 3.2.1. Новый основный катализатор О-ацилирования

3.3. Изучение топографии цитохрома Р-450 2В4 в мембране с помощью фотоаффинных 14С-меченых фосфолипидных зондов

3.4. Иодирование диазоциклопентадиен-2-илкарбонильной группы

3.5. Синтез фосфатидилхолинового и ганглиозидных зондов, содержащих диазоциклопентадиен-2-илкарбонильную группу

3.6. Фотоаффинное зондирование белков мембраны вируса гриппа

3.7. Взаимодействие различных субъединиц рецепторов интерлейкинови -4 с ганглиозидом GM1 в активированных Т-лимфоцитах

3.8. Определение фрагментов молекулы IL-4, участвующих во взаимодействии с ганглиозидом GM

3.9. Идентификация субъединиц субкомплекса F0 митохондриальной Н+-АТР-азы, контактирующих с липидами мембраны

3.10. Поиск лектинов опухолевых клеток с помощью фотоаффинного мечения

4. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Синтезы зондов

К разделу 3.3.

К разделу 3.6.

К разделам 3.7. и 3.8.

К разделу 3.9.

К разделу 3.10.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Фотоаффинные липидные зонды с диазоциклопентадиен-2-илкарбонильной меткой: синтез и применение в мембранных исследованиях»

В связи с важной ролью биологических мембран и липид-белковых комплексов в функционировании клетки и процессах метаболизма в организме, продолжается разработка оптимальных методов исследования молекулярной организации этих объектов. Наряду с такими физическими методами изучения строения мембран как электронная микроскопия, спектроскопия ЯМР, ЭПР, флуоресцентная спектроскопия, а также химическими методами с использованием различных моно-и бифункциональных реагентов, разработаны методы исследования мембран с помощью липофильных фотоаффинных зондов. Главной отличительной чертой фотоаффинных (фотореактивных, фотоактивируемых) зондов является то, что они при освещении способны к образованию ковалентной связи с находящимися рядом молекулами или частями макромолекул. В результате анализа продуктов сшивки можно однозначно определить, с какими молекулами мембраны находился в контакте зонд в момент фотолиза.

Особенности фотоаффинного мечения белков липидными зондами в мембранных системах состоят в том, что зонды расходуются большей частью на сшивки с молекулами липидов, формирующими матрицу этих систем. Очевидно, что домены интегральных и периферических мембранных белков, а также участки апо-белков в липид-белковых комплексах, непосредственно контактирующие с гидрофобными зонами, обогащены аминокислотными остатками с неполярными боковыми цепями. Поэтому эффективное мечение этих областей возможно лишь при использовании фотоаффинных группировок (фотофоров), обладающих чрезвычайно высокой реакционной способностью, обеспечивающей взаимодействие даже с неактивированными СН-связями. С другой стороны, гидрофобные зоны липид-белковых систем обогащены СН-связями жирнокислотных остатков липидов. Как следствие, образуются множественные липид-липидные сшивки, а также полимерные продукты (смолы) за счет побочных вторичных радикальных реакций, что существенно осложняет выделение и анализ целевых продуктов фотохимической реакции. Тем не менее, фотоаффинное зондирование в мембранологии является весьма ценным методом исследования, поскольку позволяет получать прямую информацию о непосредственных контактах молекулярных компонентов в нативных системах. Основные принципы метода фотоаффинного мечения, некоторые зако-номерости фотохимических реакций и характеристики наиболее широко применяемых фотореактивных группировок изложены в Обзоре литературы.

Пионерами в исследовании мембран с помощью фотоаффинных липофиль-ных зондов были Клип и Житлер, применившие для этой цели 1-азидо-4-иодбензол и 1-азидонафталин [1]. Однако эти и им подобные аполярные нелипидные зонды имеют существенный недостаток: их расположение в мембране неопределенно1, кроме того, они могут нарушать упаковку бислоя, особенно при локализации вблизи полярной части мембраны. На ранних этапах применения фотоаффинных зондов в мембранологии, когда строение биологических мембран было известно лишь в общих чертах, некоторое распространение получил биосинтетический метод (например, [3]): в среду для выращивания микроорганизмов или культуры ткани добавляли фотореактивномеченую жирную кислоту, которая вступала в метаболизм и входила в состав клеточных липидов. Фотолиз и анализ продуктов сшивок позволял судить о характере липид-белковых взаимодействий в мембране. Однако такой метод применим лишь к ограниченному числу объектов, и с его помощью можно получить информацию, касающуюся только общей картины липид-белковых взаимодействий в мембране. Поэтому применение в мембранных исследованиях нашел другой подход — синтез индивидуальных фотореактивномеченых липидов с последующим введением их в изучаемую систему (мембрану). Такой подход позволяет изучать взаимодействие зондов с отдельными компонентами мембран, причем точно определять участок взаимодействия в цепи макромолекулы (например, конкретный аминокислотный остаток в белке). Закрепление фотореактивной группировки в определенном положении молекулы мембранного липида позволяет изучать участки мембраны на различной глубине липидного бислоя. Метод был предложен и развит Кораной, Штоффелем, Бруннером и др.

Корана с сотр. [4,5] первыми разработали вариант синтеза фосфатидилхоли-новых зондов, содержащих в определенном положении ацильного остатка при sn-2 положении глицерина фотореактивные (карбен- и нитрен-генерирующие) группировки - трифторметилдиазоацетильную, диазиринофенильную, азидофенильную

1 Для флуоресцентных нелипидных гидрофобных зондов, локализация которых в мембране изучена подробно, показано, что они могут находиться в различных областях бислоя. Например, пирен в фосфатидилхо-линовом бислое находится как в его средней зоне (плоскость молекулы параллельна поверхности мембраны), так и между жирнокислотными цепями, перпендикулярно поверхности мембраны [2]. или азидную. Масс-спектрометрический анализ продуктов сшивки указанных зондов (после переэтерификации в Ме-эфиры) в модельной мембране показал, что максимальное связывание приходится на метилен углеводородной цепи, сдвинутый примерно на 3 С-атома в сторону полярной головки фосфолипида по сравнению с позицией фотофора [6]. Это согласуется с представлениями об упаковке фосфолипидов в бислое выше температуры фазового перехода.

Для детектирования продуктов фотохимической реакции зонд должен содержать репортерную группу (радиоактивную или иную метку). Даже при использовании современных масс-спектрометрических методов исследования, наличие такой группы существенно облегчает предварительную подготовку и анализ образцов. Штоффель с сотр. [7,8] разработали методы получения фосфатидилхолинов, сфингомиелинов и эфиров холестерина, несущих азидо-группу в различных положениях [ Н]меченых насыщенных, моноеновых или диеновых углеводородных цепей (для введения трития в схеме синтеза использовали ацетиленовые производные). С помощью этих зондов авторы исследовали организацию частиц липопро-теинов высокой плотности плазмы крови человека [9,10]. В своих ранних работах Бруннер с сотр. [12] использовали твердофазный метод выделения низкомолекулярных фрагментов фотолиза нерадиоактивных фосфатидилхолиновых зондов в мембранах. Для этого авторы разработали синтезы фотоаффинных зондов, содержащих л-(3-трифторметилдиазирино)фенильную или я-азидофенильную группировки, присоединенные через S-S-связь к жирнокислотной цепи. После фотолиза следовало восстановление дисульфидной связи в продуктах пришивки и последующее присоединение тиолсодержащих веществ к твердой матрице, представляющей собой пористые стеклянные шарики, содержащие N-замещенный малеи-мид. В исследованиях мембран такой метод не получил дальнейшего развития. Наиболее рациональным с точки зрения уменьшения вероятности получения артефактов и внесения существенных нарушений в упаковку мембраны, а также увеличения чувствительности является использование радиоизотопных меток.

Практически одновременно двумя группами авторов были разработаны синтезы радиомеченых фосфолипидных зондов с 2-нитро-4-азидофенильным (Nap) фотофором: Молотковский с сотр. [13] синтезировали фосфатидилхолин и фосфа-тидилэтаноламин с остатком N-Nap-11-амино[С-3Н]ундекановой кислоты в sn-2 положении глицерина, а Монтекукко с сотр. [14] - 14С- и 3Н-меченые по кватерни-зованному азоту холина фосфатидилхолины, несущие остаток N-Nap-12-аминодо-декановой кислоты или 2-нитро-4-азидобензоил. Nap-rpynna при фотолизе дает нитрен, который лишь с незначительным выходом образует сшивки с насыщенными углеводородными цепями [13], но довольно энергично сшивается с молекулами окружающих белков, такими как цитохром Ь5, цитохром с оксидаза, митохондри-альная и (На++К+)-активированная АТРазы (обзор [15]). Достоинство метода синтеза [14] заключается в том, что радиоактивность вводится на последней стадии схемы с помощью 14С- или 3Н-метилиодида. Кроме того, введение 3-х нуклидов 14С <1 или 9-ти Н позволило получить высокие уровни радиоактивности зондов (до 177 и 3900 Ки/моль, соответственно). Однако для изучения продуктов фотоаффинного мечения важно, чтобы радиометка располагалась в молекуле зонда по-возможности близко к фотофору и оставалась в исследуемых фрагментах межмолекулярных сшивок на большей части этапов анализа. Поэтому для зондирования гидрофобных областей мембран, в основном, используются фосфолипиды, несущие фотофор и радиометку в одной ацильной цепи.

Ранее мы синтезировали ,4С-меченые фосфатидилхолины и сфингомиелины - наиболее распространенные фосфолипиды животных тканей, - несущие Nap-группу на различном расстоянии от полярной головки [16]. Зонды получены на основе Н-№р-12-амино-[12-14С]додекановой кислоты и N-Nap-[l-14C]nnmHHa. С помощью спектроскопии 'Н-ЯМР показано, что в фосфолипидном бислое Nap-фотофор, закрепленный в со-положении ацильной цепи, не всплывает на поверхность мембраны, а располагается в неполярной зоне, вблизи жирнокислотных углеводородных остатков [16]. Уровень удельной радиоактивности зондов при введении ,4С химическим синтезом определялся уровнем исходного [,4C]KCN (48 Ки/моль), который мог оказаться недостаточным для получения достоверных результатов при исследовании биологических систем. В связи с этим нами также был разработан новый путь получения третированных фотореактивных фосфатидилхо-лина и сфингомиелина с высоким уровнем радиоактивности (0.9 Ки/ммоль и более), основанный на восстановлении 11-цианундекановой кислоты чистым тритием над катализатором [17]., Ранее метод термической активации позволил получить N-Нар-11-амино[С-3Н]ундекановую кислоту с активностью ~300 Ки/моль [13], но попытка повысить уровень введенной метки путем более длительного облучения исходной 11-аминоундекановой кислоты приводила к значительной изомеризации ее углеводородного скелета.

Синтезированные нами 14С- и 3Н-меченые Nap-содержащие фосфолипиды и жирные кислоты были с успехом применены для изучения доменной организации липидов и липид-белковых взаимодействий в мембране вируса гриппа [18,19]. В частности, показано, что малая субъединица гемагглютинина и нейраминидаза погружены в неполярную область вирусной мембраны, тогда как М-белок контактирует лишь с внутренней поверхностью липидного бислоя; большая субъединица гемагглютинина ремантадинустойчивого штамма в отличие от дикого типа обладает гидрофобным участком, погруженным в мембрану. Тритиймеченые фосфолипиды с Nap-группой на конце длинной цепи использованы также, в комплексе с флуоресцентномечеными фосфолипидами, для исследования взаимодействия вируса гриппа с ганглиозидами [20]. Показано, что ганглиозид GTlb, в отличие от GM1, при связывании с гемагглютинином вызывает перестройки в липидном бислое, которые существенно увеличивают его жидкостность, что, в свою очередь, способствует слиянию с клеткой-мишенью. Наконец, фотомечение длинноцепными Nap-зондами позволило выявить специфические перегруппировки липидов на поверхности глобул липопротеинов низкой плотности плазмы крови человека, индуцируемые взаимодействием антиатерогенного простагландинаПГЕ1 с аполипопро-теином В [21] (липопротеины низкой плотности осуществляют перенос холестерина из плазмы к периферическим клеткам).

В качестве фотофоров в мембранных исследованиях чаще всего применялись ароматические азиды и фенилдиазирины. Арилазиды относительно легко синтезировать, и они фотолизуются в довольно мягких условиях [15], однако, генерируемые при этом нитрены имеют лишь невысокую реакционную способность [22]. Фенилдиазириновая и «-(З-трифторметилдиазирино)фенильная группы при фотолизе образуют более реакционноспособные карбены, однако синтезы соединений, меченных этими группировками, трудны ([23] и [24], соответственно). Поэтому поиск новых фотореактивных группировок и синтез на их основе фотоаффинных липидов является актуальной задачей мембранологии. В этой связи наше внимание привлекла диазоциклопентадиен-2-илкарбонильная (Dcp) группа. Исходное соединение для ее введения - 2-диазоциклопентадиенкарбоновая кислота - описано давно [25], однако до наших исследований Dcp-rpynna лишь однажды применялась для создания фотореактивных зондов, причем нелипидной природы [26]. Эта фотореактивная метка, имея значительное поглощение в ближней УФ-области (А,макс 313 нм, б 16000), легко подвергается фотолизу в мягких условиях, образуя карбен, обладающий значительной активностью - он способен эффективно внедряться в простые СН-связи [26]. Еще одно достоинство Dcp-группы - ее компактность. Получение 2-диазоциклопентадиенкарбоновой кислоты не представляет большой трудности [25]. В отсутствие актиничного света вещество устойчиво к действию разнообразных физико-химических факторов, таких как нагревание (>150 С), мягкие основания и кислоты [25]. Впервые синтез фосфатидилхолинов и сфингомиелинов, несущих остаток 12-(диазоциклопентадиен-2-илкарбониламино)додекановой ки-. слоты, имеющей также радиоактивную метку (14С или 3Н) был осуществлен Карю-хиной и сотр. [27] с использованием разработанных ранее подходов [16,17]. Сравнительное исследование реакционной способности фосфатидилхолиновых зондов, несущих в sn-2 положении остатки N-Nap-аминоундекановой или N-Dcp-аминодо-декановой кислот, в везикулах из димиристоилфосфатидилхолина, содержащих [14С]дипальмитоилфосфатидилхолин или [14С]холестерин, показало, что при фотолизе Dcp-rpynna генерирует карбен, отличающийся значительно большей по сравнению с ароматическими нитренами активностью [27].

Целью настоящей работы явились дальнейшее исследование фотохимических свойств Dcp-группы, разработка и усовершенствование методов синтеза разнообразных липидных зондов на ее основе, разработка метода получения зондов,

125 содержащих высокоактивный радионуклид I, применение полученных зондов для исследования ряда мембранных биологических систем.

Обзор литературы посвящен краткому рассмотрению основных теоретических аспектов метода фотоаффинного мечения и примерам его применения в самых разных областях структурной биологии, не только в мембранных исследованиях, за последние 5-10 лет. Мы постарались охватить все основные современные методологические тенденции и подходы, использующиеся при фотоафинном зондировании, и показать актуальность дальнейшего развития данного метода.

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Водовозова, Елена Львовна

5. ВЫВОДЫ

1. Впервые детально исследованы фотохимические свойства диазоциклопента-диен-2-илкарбонильной (Dcp) группы. Показано, что она является высокоэффективной карбен-генерирующей меткой, превосходящей по ряду параметров, в том числе, компактности и реакционной способности при возбуждении акгиничным светом, известные и широко применяемые фотофоры. Существенно, что фотолиз этой группы проходит в мягких условиях, не повреждающих белки и нуклеиновые кислоты. Высокая реакционная способность особенно важна при зондировании мембранных систем, обогащенных неактивированными СН-связями.

2. Обнаружена способность Dcp-группы подвергаться прямому иодированию в условиях окислительного процесса, при этом фотохимические свойства сохраняются. Указанное качество превращает Dcp-метку в высокоэффективный и удобный в применении фотофор, поскольку позволяет проводить синтез холодных зондов с последующим введением высокоактивного радиоизотопа 1251 в готовую молекулу зонда непосредственно перед применением в биологической системе. Положение изотопа в фотофоре делает более надежным анализ продуктов фотомечения. Эффективность применения радиоиодированного Dcp-фотофора для зондирования мембранных систем подтверждена с помощью фосфатидилхолинового зонда на хорошо изученной биологической модели - вирионе гриппа.

3. Предложен новый основный катализатор - 4-аминопиридин - для проведения реакции О-ацилирования в условиях карбодиимидного синтеза в среде органических растворителей. Применение 4-аминопиридина особенно эффективно в синтезах фосфо- и гликолипидов и позволяет существенно увеличить выход при аци-лировании вторичного гидроксила глицеридного остатка, что имеет принципиальное значение при получении микромолярных количеств радиоактивномеченых или дорогостоящих соединений.

4. Разработаны синтезы новых 14С-меченых фосфатидилхолиновых зондов, содержащих Dcp-rpynny при концевом атоме углерода ацильных остатков в sn-2 положении на различном расстоянии от полярной головной группы. Зонды предназначены для мембранных исследований на различной глубине погружения в ли-пидный бислой.

5. Разработан синтез нового фосфатидилхолинового зонда, несущего в sn-2 положении алифатическую кислоту, содержащую при ш-углероде Dcp-фотофор, присоединенный через сложноэфирную связь, лабильную в щелочной среде, что облегчает анализ продуктов фотомечения. Кислота служит синтопом при получении различных липидных зондов, предназначенных для изучения неполярной области мембран.

6. Разработаны синтезы новых ганглиозидных зондов на основе лизоганглио-зида GM1, несущих Dcp-фотофор, присоединенный через сложноэфирную связь, в церамидном остатке на различном расстоянии от олигосахаридной части молекулы. Синтез оптимизирован для субмикромолярных количеств.

7. С помощью 14С-меченых фосфолипидных зондов исследована топография цитохрома Р450 2В4 в мембране. Результаты хорошо коррелируют с данными расчетов конформационного анализа, а также подтверждаются более поздними публикациями других исследователей, применивших независимые методы.

8. С помощью 1251-меченых ганглиозидных зондов исследовано взаимодействие субъединиц рецепторов интерлейкинов-2 и -4 с ганглиозидом GM1 в активированных Т-лимфоцитах (клетки линии CTLL-2). Полученные данные важны для понимания механизма сборки рецепторов и проведения сигнала.

9. В рамках изучения молекулярных механизмов иммуносупрессии ганглиози-дами, определены сайты связывания иитерлейкина-4 с 1251-меченым GMl-зондом -новым аналогом GM1, несущим Dcp-фотофор вместо ацетила в остатке сиаловой кислоты. Показано, что ганглиозид взаимодействует с фрагментами 19-25 (QKTLCTE) и 103-113 (ANQSTLENFLE).

10. С помощью фосфатидилхолинового зонда идентифицированы субъединицы субкомплекса F0 митохондриалыюй Н+-АТР-азы, контактирующие с липидами мембраны.

11. С целью изучения механизма взаимодействия липосом, оснащенных углеводными детерминантами (адресных липосом), с опухолевыми клетками разработан метод синтеза фотоаффинных неогликолипидных зондов, предназначенных для встраивания в липидный бислой липосом.

12. Фотоаффинное зондирование показало, что взаимодействие адресных липо-сом с опухолевыми клетками опосредовано рецепторами, экспонированными на поверхности исследованных клеток; некоторые из этих рецепторов могут быть отнесены к известным лектинам клеток млекопитающих.

Заключение

Здесь дан представительный набор примеров использования метода фотоаффинного зондирования для исследования самых разнообразных биологических систем. Если в конце 90-х и в самом начале 2000-х годов наблюдался некоторый спад в публикациях на эту тему, то за последние 3-4 года можно видеть увеличение количества работ. Очевидно, что применение PAL в сочетании с новыми мощными методами инструментального анализа и компьютерного моделирования остается важнейшим и перспективным подходом в структурной биологии.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Изучение фотохимических свойств диазоциклопентадиен-2-илкарбонильной группы

Синтез 2-диазоциклопентадиенкарбоной кислоты (DcpOH) 1 осуществляли по методу, описанному Мартином с сотр. [25], из изомерной дициклопентадиенди-карбоновой кислоты, которую получали карбоксилированием циклопентадиенилл натрия при пониженной температуре [194,195] (Схема 1).

Na / iPrOH

Na

1. С02/ -20 -30°С

2. Н

COOSiMe

СООН

СООН

SiMe3CI / Ру П

COOSiMe, Д

COOSiMe,

COOSiMe.

COOSiMe, N,

СООН

СООН

N,

-1.7:1

Схема 1. Синтез 2-диазоциклопентадиенкарбоновой кислоты.

Димерные триметилсилильные эфиры расщепляли до мономера термической обработкой (165°С, с последующей очисткой перегонкой в вакууме), вводили в реакцию с тозилазидом и получали смесь TMS-эфиров диазоциклопентадиенкарбо

2 При низких температурах карбоксилирования повышается выход эюо-изомера дициклопентадиендикарбо-новой кислоты [194], производные которого легче расщепляются с образованием мономеров. Дициклопен-тадиендикарбоновая кислота применяется в качестве пластификатора для улучшения свойств традиционных термопластичных материалов, а также для создания новых терморегенерируемых полимеров (например, [196]), где для образования термически обратимых ковалентных связей используется обратимая димериза-ция циклопентадиенов циклоприсоединением по реакции Дильса-Альдера. новых кислот. Последние легко гидролизуются с образованием DcpOH (1) и 3-диазоциклопентадиенкарбоной кислоты, которые разделяются хроматографией на силикагеле.

По нашим данным, в отсутствие УФ-облучения кислота 1 может годами сохраняться в низкотемпературном холодильнике без разложения. Как оказалось, вещество не только устойчиво к действию мягких кислот и щелочей [25], но и выдерживает действие надуксусной кислоты и других окислителей (см. далее в разделе о введении I-метки). Нильсен с сотр. [26] первыми показали фотохимическую эффективность Dcp-группы на примере мечения бычьего сывороточного альбумина (БСА), гистонов в составе хроматина, гРНК и ДНК, в сравнительном исследовании с применением производных 9-аминоакридина (флуоресцентная метка), несущих различные диазо- и арилазидные фотофоры, присоединенные через гексаме-тиленовый линкер. В ряду меток-, Nap, Dcp, диазоциклопентадиен-З-илкарбонил3, этилдиазомалонил - первые три были наиболее эффективными: они метили БСА с выходами 22,9 и 9%, соответственно, с относительными скоростями 0.25:0.06:1. Очевидно, самый высокий уровень PAL в случае 4-азидобензоилыюй метки объясняется перегруппировкой незамещенного фенилазида в более долгоживущие элек-трофильные интермедиаты (Обзор литературы, с. 18). Карбен-генерирующая группа Dcp была особенно рекомендована для зондирования гидрофобных объектов, обогащенных неактивированными СН-связями [26]. Молотковский с сотр. исследовали способность Dcp-фотофора, связанного с со-положением жирнокислотной цепи, связываться с циклогексаном и изопропанолом, а также внедряться в СН-связи в модельных мембранах [27]. Наличие продуктов пришивки регистрировалось наличием соответствующих молекулярных пиков в масс-спектрах, либо радиоактивностью на пластинках ТСХ. При фотолизе в изопропаноле, кроме смолы, детектировались (ТСХ и ВЭЖХ) множественные продукты реакции, которые являлись, очевидно, изомерами внедрения карбена в ОН и СН-связи изопропанольного остатка [27]; фотолиз в циклогексане давал индивидуальное вещество (ВЭЖХ) -продукт пришивки к циклогексану (MS).

Мы поставили задачу определить структуру аддукта Dcp-еодержащей моле

3 Эффективность диазоциклопентадиен-3-илкарбонильной группы как фотофора существенно ниже, чем Dcp-группы [26]. кулы и циклогексана и получить количественные характеристики реакции фотолиза в циклогексане, поскольку именно способность к внедрению в неактивированные СН-связи является показателем максимальной реакционной способности и, следовательно, неизбирательности фотоаффинной группировки. Для изучения фотохимических свойств Dcp-метки был получен зонд минимального размера, несущий эту группу - метиловый эфир кислоты 1 (DcpOMe 2). Эфир 2 получали метилированием DcpOH диазометаном.

Химические свойства циклопентадиенилидена, карбена, генерируемого при фотоактивации диазоциклопентадиена, хорошо изучены. Его основным состоянием является триплетное, однако химические реакции в растворах протекают на базе синглетного состояния, причем внедрение в СН-связи происходит очень эффективно [197,198]. Ход реакции фотолиза Dcp-rpynnbi представлен на Рис. 1. Раствор эфира 2 в циклогексане (6 мМ) облучали в течение 3 мин светом ртутной лампы среднего давления мощности 30 Вт (А.макс 365 нм) на расстоянии 7 см, используя в качестве светофильтра пробирку из стекла Пирекс, которое отсекает излучение с А>300 нм. Время полужизни диазогруппы в этих условиях составило менее 30 сек. После фотолиза раствор не подвергали концентрированию, поскольку летучесть

314 нм

200

260

320

X/ям

380

Рис. 1. Фотолиз DcpOMe в циклогексане (6 мМ); А>300 нм. продуктов могла привести к непропорциональным потерям. К раствору добавляли дейтероциклогексан (C6D12,10 % объемных) и регистрировали 'Н-ЯМР-спектр, который анализировали с помощью двойного резонанса (Рис. 2). По данным ТСХ, с максимальным выходом образовался самый неполярный продукт, кроме того, Л

Заб

Я.

JL

JU

Заб Заб

Заб I I I I | I I I I | I I I I I I I I I IIII I[I I I I II III I I II \I I I II II ) I I I I I I I I I II [ I I I I | I I М I I I III I I I II I I I I I I И I I I I I И IIII I I I III I I I II IIIIII I II

6.80 6.70 6.60 6.00 5.90 3.70 3.60 3.50 3.10 3.00 S (ррт)

Рис. 2. Спектры 'Н-ЯМР (C6Di2) DcpOMe 2 до (верхний) и после (нижний) фотолиза в циклогексане; фотолиз проводился до 80%-ной конверсии. наблюдались менее полярные минорные компоненты реакционной смеси, соотношение которых варьировало в зависимости от процедур упаривания и разделения; на старте обнаруживалось небольшое количество смолы. Спектр 'Н-ЯМР фотоли-зованного раствора оставался неизменным при хранении в течение нескольких дней при 4 С. Это позволило нам интерпретировать единственный основной продукт фотолиза, кроме смолы, как структуры За или 36 (Схема 2). То, что сигнал циклогексилыюго протона HI действительно находится в очень слабом поле (химический сдвиг 3.55 м.д.), полностью подтвердилось с помощью двойного резонанса на соседних циклогексильных протонах в сильном поле (1.53 м.д.) при изучении спектров в сЦ-метаноле.

О существовании изомеров по эндоциклическим двойным связям замещенных циклопентадиенов сообщается в цикле работ наших соотечественников (например, [199]). Такие изомеры находятся в термодинамическом равновесии; пере

СООМе а

СООМе

СООМе 2

За

36

Схема 2. a) h ц Л > 300 нм, 3 мин, циклогексан. ходы осуществляются путем переноса протона от С-5 к соседнему С-атому, при этом вероятными промежуточными состояниями являются комплексы протон -циклопентадиениланион. Структуры и соотношения изомеров зависят, главным образом, от характера заместителя(ей) [199], например, метилциклопентадиенкар-боксилат представлен исключительно или в основном 1,3-диеном (в нашем случае структура 36) [200].

Визуальная оценка после разделения продуктов фотолиза DcpOMe в цикло-гексане на пластинках ТСХ показала очень незначительное количество смолы. Однако при соотнесении интегральных интенсивностей резонансных сигналов в спектрах 'Н-ЯМР эфира 2 до и после фотолиза 6 мМ-раствора в циклогексане продукт внедрения в СН-связь составил 42%. Для сравнения, при фотолизе Tfd-производно-го в циклогексане наблюдалось образование нескольких соединений, среди которых продукт внедрения в СН-связь составлял 58% при исходной концентрации фотофора 2 мМ и 28% - при 30 мМ, как показал ГЖХ-анализ [158]. Таким образом, можно отметить, что способность карбена, генерированного Dcp-группой, внедряться в простые СН-связи вполне сравнима с таковой Tfd-метки, которая на сегодня фактически признана лучшим фотофором (см. Обзор литературы). Важно также и то, что молярная экстинкция актиничного света Dcp-метки (8-16000 при Х=314 нм) существенно выше, чем в случае Tfd-группы (е~300 при Я,=353 нм; время полужизни диазирина при фотолизе ~3 мМ раствора в циклогексане облучением ртутной лампой мощностью 450 Вт на расстоянии 4 см - 25 сек [24]). Это обстоятельство делает Dcp-rpynny еще более привлекательной в качестве эффективной фотоаффинной метки для исследования динамических систем. И наконец, еще раз отметим, что Dcp-метка гораздо более доступна с точки зрения простоты ее получения.

3.2. Сиитез 14С-меченых фосфолипидных зондов, содержащих диазоциклопен-тадиеп-2-илкарбо11илы1ую группу

Как уже отмечалось, Dcp-метка представляет особый интерес для зондирования гидрофобной области биологических мембран. За 25 лет было синтезировано множество фотореактивных фосфолипидов, которые использовались для структурных и функциональных исследований [4-21,23,30,36,156,158-161,165,166,169,201208]. Большинство этих липидов - фосфатидилхолины и сфинголипиды, содержащие фотореакгивные группы (трифторметилдиазоацетильную [4-6], азидофениль-ную [4-6,202,165], диазиринофенильную [4-6,23,203], азидную [4-10], Nap [1321,204,205], Tfd [30,31,158-161,169,205,206], азидоформильную [207], бензофено-новую [208], диазоциклогексадиеноновую [156]), соединенные амидной, сложно-эфирной или простой эфирной связями с ш-положением жирнокислотной цепи. Фосфатидилхолины и сфингомиелины, меченные Dcp-rpynnoft путем присоединения к NH2-rpynne 12-аминододекановой кислоты, имеющей также радиоактивную метку (14С или 3Н), впервые синтезировали авторы [27] по схеме, использованной ранее для синтеза Nap-меченых зондов [16,17] (Схема 3).

3Н]12-Аминододекановая кислота 4 была синтезирована из доступной 11-йодундекановой кислоты конденсацией с KCN и последующим каталитическим тритиированием образовавшейся 11-цианундекановой кислоты [16,17]. Ацилиро-вание кислоты 4 2-диазоциклопентадиенкарбоновой кислотой приводило к фотореактивной кислоте 5, которая, в свою очередь, вводилась в реакции ацилирования лизофосфатидилхолина и сфингозин-1-фосфохолина с образованием фосфатидил-холинового 6 и сфингомиелинового 7 зондов. Выходы целевых продуктов на стадиях (<)) и (е) были весьма низкими (20% и 30%, соответственно, при избытке кислоты 5 10-20%), что обусловлено, в том числе, необратимой адсорбцией Dcp-содержащих соединений на силикагеле в ходе хроматографического разделения (темновая реакция пришивки). Подобная сорбция наблюдалась нами ранее и для Nap-содержащих веществ, но в меньшей степени [16]. Кроме того, при проведении синтезов с микромолярными количествами реагентов, что характерно для работы с h2n PHI PH] соон а,б,в,г

N2 О рн] рн]

СООН 4 5 е п = 1 (-78%) п = 3 (-22%) рН] рН] О N2 6 о-р-о

I. о о

II но, „н 7 рн] РН] о N2

Схема 3. а) МеОН/НС1; б) DcpOH/DCC/DMAP; в) КОН, iPr0H-H20; г) НС1; д) ли-зофосфатидилхолин, DCC/DMAP; ё) сфингозин-1-фосфохолин, DCC/DMAP. радиоактивномечеными соединениями, выходы продуктов, как правило, уменьшаются. В случае многостадийного синтеза одним из вариантов увеличения выхода конечного продукта является введение фотофора на последней стадии [16], что было применено авторами [27] при получении [14С]фосфатидилхолинового зонда 9 по Схеме 4. Фосфатидилхолин 8 был синтезирован ацилированием лизофосфатидил-холина 11-[14С]цианундекановой кислотой [16]. После каталитического гидрирования [14C]H2NH2-rpynny ацилировали 2-диазоциклопентадиенкарбоновой кислотой, что приводило к зонду 9 с выходом 29% [27]. Очевидно, что такой путь синтеза обеспечивал лишь небольшое увеличение выхода целевого продукта, кроме того, он не пригоден для получения Dcp-сфингомиелина.

В связи с изложенным, нами была поставлена задача оптимизации всех стадий схемы синтеза Dcp-фоефолипидов. В качестве радионуклида мы остановились на 14С, низкоэнергетичном р-излучателе, поскольку содержащие его соединения

0 N2 9

Схема 4. a) H2/Pt; б) DcpOH/DCC/DMAP. мало подвержены радиолизу, а эффективность жидкостно-сцинтилляционного счета радиоактивности проб очень высока (96-98%). Последнее обстоятельство позволяет избежать артефактов при анализе в ходе проведения синтеза или биохимического эксперимента. Удельная радиоактивность нуклида 3Н существенно выше, чем 14С, ср.: 29 Ки/ммоль, период полураспада, 12.43 года, против 62 Ки/моль, Т]/2 5730 лет. Однако 3Н-меченые соединения довольно быстро, менее, чем за 1 год, деградируют из-за радиолиза. Кроме того, энергия Р-излучения трития настолько невелика, что надежные результаты счета радиоактивности можно получить только для истинного раствора пробы в жидкостном сцинтилляторе (т.н. «гомогенный счет»); даже в этом случае эффективность счета не превышает 40-60%. Таким образом, более высокая чувствительность PAL Н-мечеными зондами нивелируется необходимостью частых повторных синтезов и низкой эффективностью детектирования радиоактивности.

Для синтеза «длинноцепных» фосфолипидных зондов мы использовали разработанную ранее схему синтеза [16,27] (Схема 5), заменив лишь способ получения Ме-эфира N-Dcp-12-аминододекановой кислоты (Схема 3, стадия б).

При получении N-Dcp- 12-амино[ 12-иС]додекановой кислоты мы вводили радиоактивную метку реакцией [14С]цианистого калия с кальциевой солью 11-иодундекановой кислоты 10 в водном изопропаноле. (Такой вариант обеспечивает больший выход (79%) для немеченой кислоты 11 против 40-50% после реакции калиевой соли 11-иодундекановой кислоты с KCN в водном этаноле или метаноле [16]). Гидрирование кислоты 11 приводит к 12-аминододекановой кислоте, кото

Схема 5. a) K[HC]N; 6) НС1; в) H2/Pt; г) МеОН/НС1; д) S02Cl/Na2C03; е) DcpCl + 12/ТЕА; ж) КОН, /Рг0Н-Н20; з) НС1; и) лизофосфатидилхолин, DCC/DMAP; к) сфингозин-1-фосфохолин, DCC/DMAP. рая переводится в метиловый эфир 12 и подвергается ацилированию хлорангидри-дом Dcp-киелоты (DcpCl) 13. Надо отметить, что ацилирование по аминофункции эквивалентным количеством DcpCl протекает очень быстро с полной конверсией, в отличие от конденсации с DcpOH в течение суток в присутствии дициклогексил-карбодиимида (DCC) [27]; однако потери в ходе хроматографического разделения на силикагеле (темповая реакция пришивки) реакционной смеси привели к 60%-ному выходу Ме-эфира N-Dcp-12-амино[ 12- 14С]додекановой кислоты, как и в работе [27]. Последующее омыление эфира в мягких условиях приводит к кислоте 14.

На заключительной стадии фотореактивная кислота 14 вводится в реакцию ацилирования лизофосфатидилхолина или сфингозин-1-фосфохолина путем конденсации в присутствии DCC и основного катализатора (4-диметиламинопиридина, DMAP; 4-пиперидинопиридина; 4-пирролидинопиридина). Механизм реакции заключается в том, что сначала происходит быстрое ацилирование DCC карбоксильной компонентой с образованием О-ацилизомочевины, интермедиата, обладающего высокой ацилирующей реакционной способностью, а далее следует стадия ацилирования спиртовой или амино-компоненты. Скорость протекания второй стадии зависит от реакционной способности гидроксила или аминогруппы и от активности катализатора. Если кинетика этой стадии медленная, то О-ацилизомочевина необратимо перегруппировывается в N-ацилмочевину, которая является практически неизбежным побочным продуктом реакции ацилирования. В случае сфингоидной аминогруппы реакция ацилирования в присутствии DMAP протекает достаточно эффективно, с невысоким образованием N-ацилмочевины (данные ТСХ). А замена хроматографии на силикагеле разделением на обращенной фазе после предварительной гель-фильтрации на липофильном сефадексе позволила получить фотоаффинный сфингомиелин 15 с выходом около 60% при эквимольных количествах кислоты 14 и сфингозин-1-фосфохолина.

3.2.1. Новый основный катализатор О-ацнлнрованнп

Очевидно, что ацилирование ОН-группы, и особенно малореакционноспо-собной вторичной, в условиях, описанных для ацилирования сфингоидной аминогруппы, протекает гораздо медленнее. Поэтому при синтезе фосфатидилхолина 9 из лизофосфатидилхолина наблюдалось активное образование N-ацилмочевины, и максимальные выходы продукта, даже при использовании тех же условий выделения, что для сфингомиелина 15, не превышали 25-30%. Ранее при ацилировании лизофосфатидилхолина со-цианундекановой кислотой в присутствии DCC и DMAP мы получили фосфатидилхолин с выходом 48% [16] (нерадиоактивный аналог PC 8, Схема 4), однако в этом синтезе использовался избыток ацилирующей компоненты (1.6 экв). В случае маломасштабных синтезов с применением дорогостоящих радиоактивных синтонов желательно минимизировать их потери. В связи с этим мы исследовали влияние замены катализатора на эффективность реакции ацилиро-вания лизофосфатидилхолина (лизо-РС) фотореактивной кислотой 14.

Вообще, оптимизации метода ацилирования 2-ОН-группы лизо-РС или гли-церофосфохолина модифицированными жирными кислотами является важной задачей в липидной химии и биохимии, так как различные модифицированные фос-фолипиды (фосфатидилэтаноламин, фосфатидилинозит и т.д.) обычно получают именно из синтезированных фосфатидилхолинов путем ферментативной переэте-рификации. В качестве ацилирующих по вторичному гидроксилу агентов было предложено множество производных жирных кислот: ацилхлориды [209], ангидриды [210], имидазолиды [211,212], ангидриды трифторуксусной кислоты [213], 2-тиопиридиловые эфиры [214]. Все эти методы не лишены недостатков, таких как образование побочных продуктов [209], использование повышенной температуры [209,211] и сильных оснований [212], необходимость избытка производных жирных кислот, а также низкие выходы [209,213].

Ранее Корана с сотр. [5] предложили решать задачу получения сложных эфиров глицерофосфолипидов ацилированием ангидридами кислот в присутствии DMAP (свойства DMAP, как эффективного катализатора в реакциях ацилирования были показаны ранее [219]); при введении 1.2-1.5 эквивалентов ангидрида на ОН-группу авторы получили 75-90% выходы целевых фосфолипидов. Однако данный путь требует проведения отдельной стадии получения ангидрида (с помощью DCC), а избыток самой фотореактивной кислоты, в пересчете с ангидрида, составляет уже 2.4-3 эквивалента на ОН-группу. Метод получил дальнейшее развитие, и был предложен ряд его усовершенствований, в том числе использование 4-пирро-лидинопиридина (РРу) в качестве катализатора [215,216] (РРу является еще более сильным основанием, чем DMAP), а также ультразвуковой обработки для ускорения реакции [217]. Тем не менее, и в этих случаях необходим небольшой избыток ангидрида жирной кислоты. Детальное исследование кинетики реакции показало, что наилучший результат при ацилировании лизо-РС 1.5 эквивалентом ангидрида (5 мин, выход 90%) достигается при использовании 200-кратного избытка РРу [218]. Реакция очень чувствительна к следовым количествам воды, а в случае маломасштабного синтеза обеспечить такие безводные условия весьма затруднительно. И наконец, ацилирование ангидридами ведет к теоретической потере половины исходной жирной кислоты. Был предложен вариант ацилирования без выделения промежуточных продуктов, где лизо-РС, жирная кислота, DCC и катализатор реагируют в одну стадию [220,221]4; с небольшими избытками жирной кислоты такой способ обеспечивает приемлемые (20-50%) но не всегда воспроизводимые выходы конечного продукта. Для уменьшения образования N-ацилмочевины было предложено использовать л-толуолсульфокислоту [224]. Однако в случае синтеза фотоаффинного PC присутствие такого кислого катализатора нежелательно, так как он вызывает частичную деградацию Dcp-группы (собственные результаты).

В ходе оптимизации маломасштабного процесса ацилирования лизо-РС [14С]пальмитиновой кислотой мы нашли, что эквимольные количества РРу не приводят к увеличению выхода целевого продукта по сравнению с DMAP. Однако обнаружилось, что введение больших избытков РРу (5 и более эквивалентов) существенно ускоряет ход реакции и увеличивает выход [14С]РС. Для DMAP подобного эффекта не наблюдалось. Более того, улучшение ацилирования обеспечивало именно применение препарата РРу фирмы Fluka, содержащего до 12 % примесей, но не хроматографически чистого вещества. Дальнейшие исследования показали, что эффект обусловлен присутствующим в коммерческом препарате веществом, которое после выделения и спектрального анализа (!Н-ЯМР и MS) было идентифицировано нами как 4-гидрокси-пиридин (4РуОН). Еще одним доводом в пользу 4РуОН было то, что именно из него производят РРу [225]. Однако отсутствие аутентичного вещества привело к ложному выводу. Когда препарат 4РуОН фирмы Fluka был получен, между ним и «нашим» катализатором выявились различия в

4 Этот вариант представляет собой применение в химии липидов ранее предложенного метода ацилирования [222,223]. хроматографической подвижности (ТСХ высокого разрешения), основных свойствах и каталитической активности. В то же время, наблюдались полное совпадение масс-спектров (m/z: 95 (М*), 67, 54) и сходные характеристики спектров 'Н-ЯМР: в D6-DMSO, б, м.д.: 5.1 (ушир., Н, ОН), 6.22 (дд, 2Н, 3-Н и 5-Н), 7.74 (дц, 2Н, 2-Н и 6-Н) для 4РуОН, и, соответственно, 6.01, 6.46,7.97 для нашего катализатора. УФ-спектры также были похожи (Н20, Хмакс, нм (е): 200 (14000), 254 (15500) для 4РуОН и 206 (20100), 262 (22200) для катализатора). Поскольку наш катализатор был более сильным основанием, чем 4РуОН, мы предположили, что это 4-аминопиридин (4PyNH2), который также является побочным продуктом синтеза 4РРу. Прямое сравнение с аутентичным 4PyNH2 (Fluka) подтвердило предположение: вещества были идентичны по своим хроматографическим свойствам, температурам плавления (155-157°С), УФ-, 'Н-ЯМР и масс-спектрам (m/z: 95 [М+Н]+).

Сложно представить, чтобы соединение с первичной NH2-rpynnofi катализировало реакцию ацилирования по ОН-группе. Однако ранее показано, что ацилиро-вание 4PyNH2 проходит через стадию образования высокореакционноспособного интермедиата по эндоциклическому атому N [226]:

I I

R—С=0 R—С=0

Поэтому мы полагаем, что в результате быстрого l-N-ацилирования 4PyNH2 О-ацилизомочевиной образуется высокореакционноспособный енамид (*) (Схема 6), который, в свою очередь, ацилирует гидроксил соответствующего субстрата.

Косвенно такой механизм реакции подтверждается следующими данными. При введении в эквивалентных количествах, 4PyNH2 не катализировал ацилирова-ние (Табл. 1). Очевидно, это объясняется снижением скорости образования промежуточного енамида (*), и соответственно, ростом образования N-ацилмочевины. С другой стороны, умеренный избыток 4PyNH2 (2.5 экв.) в присутствии того же количества более сильного основания РРу приводит к значительному росту скорости ацилирования. Это может объясняться ускорением образования енамида в присутствии основания. В случае 5-кратного избытка, 4PyNH2 служит и субстратом, и основанием для быстрого образования промежуточного енамида. Побочным продуктом при использовании большого избытка (более 4-5 экв.) 4PyNH2 является продукт его ацилирования по экзоциклическому атому N (**), который, возможно, образуется также в результате необратимой перегруппировки енамида (*) в амид. Это вещество было выделено из реакционной смеси препаративной ТСХ (FAB-MS: 334 [М]+).

СН3(СН2)1414СООН +

DCC п = 1 (-72%) пОС П = 3 (-28%)

СН3(СН2)^

РРу или 4PyNH2

С=0

14С]РС N

CH3(CH2)f4

С)

4PyNH2 NH14CO(CH2)14CH3

Г)

Схема 6. Вероятный механизм катализа 4-аминопиридином реакции ацилирования лизо-РС жирной кислотой в присутствии DCC.

Объяснением ускорения катализа в присутствии 4PyNH2 может быть как большая реакционная способность интермедиата (*) по сравнению с О-ацилизо-мочевиной, так и меньшие стерические затруднения, которые он испытывает при ацилировании вторичного гидроксила. Кроме того, предположительно, О-ацили-рование енамидом не требует дополнительного основного катализа и, следовательно, образования промежуточного объемистого комплекса с РРу, в отличие от ацилирования О-ацилизомочевиной [222]. Ацилирование 1,2-диглицерида по первичному гидроксилу в присутствии 4PyNH2 резко ускоряется (несколько мин), по сравнению с катализом РРу [227].

Список литературы диссертационного исследования доктор химических наук Водовозова, Елена Львовна, 2007 год

1. Klip A., Gitler С. Photoactive covalent labeling of membrane components from within the lipid core. Biochim. Biophys Res. Commun. 1974, 60,1155-1162.

2. Podo F., Blasie J.K. Nuclear magnetic resonance studies of lecithin bimolecular leaflets with incorporated fluorescent probes. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 1977, 74, 10321036.

3. Greenberg G.R., Chakrabarti P., Khorana H.G. Incorporation of fatty acids containing photosensitive groups into phospholipids of Escherichia coli. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 1976, 73, 86-90.

4. Chakrabarti P., Khorana H.G. A new approach to the study of phospholipid-protein interactions in biological membranes. Synthesis of fatty acids and phospholipids containing photosensitive groups. Biochemistry, 1975,14, 5021-5033.

5. Gupta C.M., Radhakrishnan R., Khorana H.G. Glycerophospholipid synthesis: improve general method and new analogs containing photoactivable groups. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1977, 74,4315-4319.

6. Gupta C.M., Costello C.E., Khorana H.G. Sites of intermolecular crosslinking of fatty acyl chains in phospholipids carrying a photoactivable carbene precursor. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1979, 76,3139-3143.

7. Stoffel W., Schtreiber C., Scheefers H. Lipids with photosensitive groups as chemical probes for the structural analysis of biological membranes. Hoppe-Seyler^s Z. Physiol. Chem. 1978,359, 923-931.

8. Stoffel W., Salm K.P., Muller M. Syntheses of phosphatidylcholines, sphingomyelins and cholesterol substituted with azido fatty acids. Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem. 1982,363,1-18.

9. Stoffel W., Metz P. Covalent cross-linking of photosensitive phospholipids to human serum high density apolipoproteins (apo HDL). Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem. 1979, 360, 197-206.

10. Stoffel W., Metz P. Chemical studies on the structure of human serum high-density lipoprotein (HDL). Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem. 1982,363,19-31.

11. Richards F.M., Brunner J. General labeling of membrane proteins. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1980, 346, 144-163.

12. Молотковский Юл.Г., Лазуркина Т.Ю., Фаерман В.Н., Смоляков B.C., Бергельсон Л.Д. Синтез фотореактивных фосфатидилхолина и фосфатидилэтаноламина. Биоорган, химия 1980,6, 594-599.

13. Bisson R., Montecucco С. Photolabeling of membrane proteins with photoactive phospholipids. Biochemistry J. 1981,193,757-763.

14. Brunner J. Labelling the hydrophobic core of membranes. Trends Biochem. Sci. 1981, 6,44-46.

15. Водовозова Е.Л., Молотковский Юл.Г., Бергельсон Л.Д. Синтез фотореактивных фосфатидилхолинов и сфингомиелинов с различным расстоянием между меткой и полярной группировкой. Биоорган, химия 1984,10, 1688-1694.

16. Водовозова Е.Л., Шевченко В.П., Молотковский Юл.Г., Бергельсон Л.Д. Синтез фотореактивных фосфолипидов с высоким уровнем тритиевой метки. Биоорган, химия 1984,10, 1698-1699.

17. Молотковский Юл.Г., Маневич Е.М., Водовозова Е.Л., Букринская А.Г., Бергельсон Л.Д. Изучение молекулярной организации мембраны вируса гриппа с помощью фотореактивных и флуоресцентных фосфолипидных зондов. Биол. мембраны 1985, 2, 566-574.

18. Мартынова M.A., Маневич E.M., Водовозова Е.Л., Музя Г.И., Безуглов В.В., Молотковский Юл.Г., Бергельсон Л.Д. Взаимодействие простагландинов с липо-протеинами низкой плотности крови человека. Биохимия 1988,53,721-727.

19. Bayley Н., Knowles J.R. Photogenerated reagents for membrane labeling. 1. Phenyl-nitrene formed within the lipid bilayer. Biochemistry 1978,17,2414-2419.

20. Khorana H.G. Chemical studies of biological membranes. Bioorg. Chem. 1980,9, 363-405.

21. Brunner J., Senn H., Richards F.M. 3-Trifluoromethyl-3-phenyldiazirine. A new car-bene generating group for photolabeling reagents. J. Biol. Chem. 1980, 255, 3313-3318.

22. Martin J.C., Bloch D.R. The dehydrocyclopentadienyl anion. A new arm. J. Amer. Chem. Soc. 1971,93,451-459.

23. Nielsen P.E., Hansen J.B., Thomsen Т., Burhardt 0. Reagents for photoaffinity labeling. Photobinding efficiency of arylazido-, diazocyclopentadienyl- and ethyldiazomalo-nyl-derivatives of 9-aminoacridine. Experientia 1983,39, 1063-1072.

24. Карюхина M.O., Молотковский Юл.Г., Бергельсон Л.Д. Фотореактивные фос-фолипиды. Синтез и свойства фосфатидилхолина и сфингомиелина, меченных 2-диазоциклопентадиенкарбонильной группой. Биоорган, химия 1988,14,1256-1261.

25. Knowles J.K. Photogenerated reagents for biological receptor site labeling. Acc. Chem. Res. 1972, 5, 150-160.

26. Bayley H. Photogenerated reagents in biochemistry and molecular biology. In Laboratory techniques in biochemistry and molecular biology, vol. 10; Work T.S., Burdon R.H. Eds.; Elsevier: Amsterdam/New York/ Oxford, 1983.

27. Brunner J. Photochemical labeling of apolar phase of membranes. Methods Enzymol. 1989,172, 628-687.

28. Brunner J. New photolabeling and crosslinking methods. Annu. Rev. Biochem. 1993, 62,483-514.

29. Kotzyba-Hibert F., Kapfer I., Goeldner M. Recent trends in photoaffinity labeling. Angew. Chem., Int. Ed. 1995,34, 1296-1312.

30. Fleming S.A. Chemical reagents in photoaffinity labeling. Tetrahedron 1995,51, 12479-12520.

31. Hatanaka Y., Nakayama H., Kanaoka Y. Diazirine-based photoaffinity labeling: chemical approach to biological interfaces. Rev. Heteroatom Chem. 1996,14,213-243.

32. Dorman G., Prestwich G.D. Benzophenone photophores in biochemistry. Biochemistry \m, 33, 5661-5673.

33. F. Knoll, T. Kolter, Sandhoff K. The sphingolipid photoaffinity labels. Methods Enzymol. 2000,311,568.

34. Dorman G., Prestwich G.D. Using photolabile ligands in drug discovery and development. Trends Biotechnol. 2000,18, 64-77.

35. Hatanaka Y., Sadakane Y. Photoaffmity labeling in drug discovery and development: chemical gateway for entering proteomic frontier. Curr. Top. Med. Chem. 2002, 2,271288.

36. Singh A., Thornton E.R., Westheimer F.H. The photolysis of diazo-acetylchymotrypsin. J. Biol .Chem. 1962, 237, PC3006-PC3008.

37. Jahn 0., Eckart K., Tezval H., Spiess J. Characterization of peptide-protein interactions using photoaffmity labeling and LC/MS. Anal. Bioanal. Chem. 2004,378, 10311036.

38. Shacham S., Marantz Y., Bar-Haim S., Kalid O., Warshaviak D., Avisar N., Inbal В., Heifetz A., Fichman M., Topf M., Naor Z., Noiman S., Becker O.M. PREDICT modeling and in silico screening for G-protein coupled receptors. Proteins 2004,57, 51-86.

39. Zhang H., Karlin A. Identification of acetylcholine receptor channel-lining residues in the Ml segment of the beta-submit. Biochemistry 1997,36, 15856-15864.

40. Foucaud В., Perret P., Grutter Т., Goeldner M. Cystein mutants as chemical sensors for ligand-receptor interactions. Trends Pharmacol. Sci. 2001, 22, 170-173.

41. Fleet G.W.J., Porter R.R., Knowles J.R. The antibody binding site. Labeling of a specific antibody against the photo-precursor of an aryl nitrene. Nature 1969, 224, 511-512.

42. Smith R.A.G., Knowles J.R. Letter: Aryldiazirines. Potential reagents for photolabel-ing of biological receptor sites. J. Am. Chem. Soc. 1973, 95, 5072-5073.

43. Galardy R.E., Craig L.C., Printz M.P. Benzophenone triplet: a new photochemical probe of biological ligand-receptor interactions. Nature New Biol. 1973, 242,127-128.

44. Chowdhry V., Vaughan R., Westheimer F.H. 2-diazo-3,3,3-trifluoropropionyl chloride: reagent for photoaffmity labeling. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1976,73,1406-1408.

45. Goeldner M., Hirth C. Specific photoaffmity labeling induced by energy transfer: application to irreversible inhibition of acetylcholinesterase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1980, 77, 6439-6442.

46. Young M.J.T., Platz M.S. Polyfluorinated aryl azides as photoaffmity labelling reagents; the room temperature CH insertion reactions of singlet pentafluorophenyl nitrene with alkanes. Tetrahedron Lett. 1989,30,2199-2202.

47. Goeldner M., Hawkinson J.E., Casida J.E. Diazocyclohexadienones as photoaffmity ligands: synthesis of trioxabicyclooctane probes for the convulsant binding site of the GABAa receptor. Tetrahedron Lett. 1989,30, 823-826.

48. Колпащиков Д.М., Захаренко A.JL, Дежуров С.В., Речкунова Н.И., Ходырева С.Н., Дегтярев С.Х., Литвак В.В., Лаврик О.И. Новые реагенты для аффинной модификации биополимеров. Фотоаффинная модификация Tte-ДНК-полимеразы. Биоорган, химия 1999,25, 129-136.

49. Turro N.J. Structure and dynamics of important reactive intermediates involved in photobiological systems. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1980,346, 1-17.

50. Gritsan N.P., Yuzawa Т., Platz M.S. Direct observation of singlet phenylnitrene and measurement of its rate of rearrangement. J. Am. Chem. Soc. 1997,119, 5059-5060.

51. Lwowski W. Nitrenes in the photochemistry labeling: speculation of an organic chemist. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1980,346,491-500.

52. Borden W.T., Gritsan N.P., Hadad C.M., Karney W.L., Kemnitz C.R., Platz M.S. The interplay of theory and experiment in the study of phenylnitrene. Acc. Chem. Res. 2000, 33,765-771.

53. Gritsan N.P., Zhai H.B., Yazawa Т., Karweik D., Brooke J., Platz M.S. Spectroscopy and kinetics of singlet perfluoro-4-biphenylnitrene and singlet perfluorophenylnitrene. J. Phys. Chem. A 1997,107,2833-2840.

54. Ruhmann A., Wentrup C. Synthesis of a photoactivatable 9-Z-oleic acid for protein kinase С labeling. Tetrahedron 1994,50, 3785-3796.

55. Nassal M. 4'-(l-Azi-2,2,2-trifluoroethyl)phenylalanine, aphotolabile carbene-generating analog of phenylalanine. J. Am. Chem. Soc. 1984,106,7540-7545.

56. Platz M., Admasu A.S., Kwiatkowski S., Crocker P.J., Imai N., Watt D.S. Photolysis of 3-aryl-3-(trifluoromethyl)diazirines: a caveat regarding their use in photoaffinity probes. Bioconjugate chem. 1991, 2, 337-341.

57. Jahn O., Hofmann B.A., Brauns O., Spiess J., Eckart K. The use of multiple ion chromatograms in on-line HPLC-MS for the characterization of post-translational and chemical modifications of proteins. Int. J. Mass. Spectrom. 2002, 214, 37-51.

58. Hino N., Okazaki Y., Kobayashi Т., Hayashi A., Sakamoto K., Yokoyama S. Protein photo-cross-linking in mammalian cells by site-specific incorporation of a photoreactive amino acid. Nature Methods 2005,2, 201-206.

59. Farrelli I.S., Toroney R., Hazen J.L., Mehl R.A., Chin J.W. Photo-cross-linking interacting proteins with a genetically encoded benzophenone. Nature Methods 2005, 2, 377384.

60. Weber P.J.A., Becksickinger A.G. Comparison of the photochemical behavior of four different photoactivatable probes. J. Peptide Res. 1997, 49, 375-383.

61. Bisello A., Adams A.E., Mierke D.F., Pellegrini M., Rosenblatt M., Suva L.J., Chorev M. Parathyroid hormone-receptor interactions identified directly by photocross-linking and molecular modeling studies. J. Biol Chem. 1998, 273,22498-22505.

62. Behar V., Bisello A., Rosenblatt M., Chorev M. Direct identification of two contact sites for parathyroid hormone (PTH) in the novel PTH-2 receptor using photoaffinity cross-linking. Endocrinology 1999,140,4251-4261.

63. Tate J. J., Persinger J., Bartholomew B. Survey of four different photoreactive moieties for DNA photoaffinity labeling of yeast RNA polymerase III transcription complexes. Nucleic Acids Res. 1998,26, 1421-1426.

64. Gilbert B.A., Rando R.R. Modular design of biotinylated photoaffinity probes: synthesis and utilization of a biotinylated pepstatin photoprobe. J. Am. Chem. Soc. 1995, 117,8061-8066.

65. Hatanaka Y., Hashimoto M., Kanaoka Y. A rapid and efficient method for identifying photoaffinity biotinylated sites within proteins. J. Am. Chem. Soc. 1998,120,453-454.

66. Jahn O., Tezval H., Spiess J., Eckart K. Tandem mass spectrometric characterization of branched peptides derived from photoaffinity labeling. Int. J. Mass Spectrom. 2003, 228, 527-540.

67. Li C., Xu W., Vadivel S.K., Fan P., Makriyannis A. High affinity electrophilic and photoactivatable covalent endocannabinoid probes for the CB1 receptor. J. Med. Chem. 2005,48, 6423-6429.

68. Paul-Pletzer K., Yamamoto Т., Ikemoto N., Jimenez L.S., Morimoto H., Williams P.G., Ma J., Parness J. Probing a putative dantrolene-binding site on the cardiac ryanodine receptor. Biochem. J. 2005,387,905-909.

69. Kramer W., Corsiero D., Girbig F., Jahne G. Rabbit small intestine does not contain an annexin II/caveolin 1 complex as a target for 2-azetidinone cholesterol absorption inhibitors. Biochim. Biophys. Acta Biomembranes 2006,1758,45-54.

70. Lee H.K., Zheng Y.F., Xiao X.-Y., Bai M., Sakakibara J., Ono Т., Prestwich G.D. Photoaffinity labeling identifies the substrate-binding site of mammalian squalene epoxi-daxe. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2004, 315, 1-9.

71. Ohgami N., Ко C.D., Thomas M„ Scott P.M., Chang C.C.Y., Chang T.-Y. Binding between the Niemann-Pick CI protein and a photoactivatable cholesterol analog requires a functional sterol-sensing domain. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 2004,101,12473-12478.

72. Wu Z., Hasan A., Liu Т., Teller D.C., Crabb J.W. Identification of CRALBP ligand interactions by photoaffinity labeling, hydrogen/deuterium exchange, and structural modeling. J. Biol. Chem. 2004,279,27357-27364.

73. Borhan В., Souto M. L., Imai H., Shichida Y., Nakanishi K. Movement of retinal along the visual transduction path. Science 2000, 288,2209-2212.

74. Demers A., Mcnicoll N., Febbraio M., Servant M., Marleau S, Silverstein R., Ong H. Identification of the growth hormone-releasing peptide binding site in CD36: a photoaffinity cross-linking study. Biochem. J. 2004,382,417-424.

75. Alqwai О., Poelarends G., Konings W.N., Georges E. Photoaffmity labeling under non-energized conditions of a specific drug-binding site of the ABC multidrug transporter LmrA from Lactococcus lactis. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2003,311, 696701.

76. Vaughan R.A., Parnas M.L., Gaffaney J.D., Lowe M.J., Wirtz S., Pham A., Reed В., Dutta S.M., Murray K.K., Justice B.J. Affinity labeling the dopamine transporter ligand binding site. J. Neurosci. Meth. 2005,143, 33-40.

77. Vaughan R.A., Gaffaney J.D., Lever J.R., Reith M.E.A., Dutta A.K. Dual incorporation of photoaffmity ligands on dopamine transporters implicates proximity of labeled domains. Mol. Pharmacol. 2001, 59,1157-1164.

78. Dohlman H.G., Caron M.G., Strader C.D., Amlaiky N., Lefkowitz R.J. Identification and sequence of a binding site peptide of the beta 2-adrenergic receptor. Biochemistry 1988,27,1813-1817.

79. Janovick J. A., Haviv F., Fitzpatrick T.D., Conn P.M. Differential orientation of a GnRH agonist and antagonist in the pituitary GnRH receptor. Endocrinology 1993,133, 942-945.

80. Kennedy A.P., Mangum K.C., Linden J., Wells J.N. Covalent modification of trans^ membrane span III of the A1 adenosine receptor with an antagonist photoaffmity probe. Mol. Pharmacol. 1996, 50,789-798.

81. Li Y.M., Marnerakis M., Stimson E.R., Maggio J.E. Mapping peptide-binding domains of the substance P (NK-1) receptor from P388D1 cells with photolabile agonists. J. Biol. Chem. 1995, 270, 1213-1220.

82. Boucard A.A., Sauve S.S., Guillemette G., Escher E., Leduc R. Photolabelling the rat urotensin II/GPR14 receptor identifies a ligand-binding site in the fourth transmembrane domain, Biochem. J. 2003,370, 829-838.

83. Hein L., Barsh G.S., Pratt R.E., Dzau V.J., Kobilka B.K. Behavioural and cardiovascular effects of disrupting the angiotensin II type-2 receptor gene in mice. Nature 1995,377,744-747.

84. Hjorth S.A., Schambye H.T., Greenlee W.J., Schwartz T.W. Identification of peptide binding residues in the extracellular domains of the ATI receptor. J. Biol. Chem. 1994, 269, 30953-30959.

85. Nikiforovich G.V., Marshall G.R. 3D Model for TM Region of the AT-1 receptor in complex with angiotensin II independently validated by site-directed mutagenesis data. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2001,286,1204-1211.

86. Yamano Y., Ohyama K., Kikyo M., Sano Т., Nakagomi Y., Inoue Y., Nakamura N., Morishima I., Guo K.-F., Hamakubo Т., Inagami T. Mutagenesis and the molecular modeling of the rat angiotensin II receptor (ATj). J. Biol. Chem. 1995, 270,14024-14030.

87. Behar V., Bisello A., Rosenblatt M., Chorev M. Direct identification of two contact sites for parathyroid hormone (PTH) in the novel PTH-2 receptor using photoaffinity crosslinking. Endocrinology 1999,140,4251-4261.

88. Dong M., Pinon D.I., Cox R.F., Miller L.J. Molecular approximation between a residue in the amino-terminal region of calcitonin and the third extracellular loop of the class В G protein-coupled calcitonin receptor. J. Biol. Chem. 2004,279,31177-31182.

89. Tan Y.V., Couvineau A., Van Rampelbergh J., Laburthe M. Photoaffinity labeling demonstrates physical contact between vasoactive intestinal peptide and the N-terminal ectodomain of the human VP AC 1 receptor. J. Biol. Chem. 2003, 278, 36531-36536.

90. Pham V.I., Sexton P.M. Photoaffinity scanning in the mapping of the peptide receptor interface of class II G protein coupled receptors. J. Pept. Sci. 2004,10,179-203.

91. Assil I.Q., Qi L.J., Arai M., Shomali M., Abou-Samra A.B. Juxtamembrane region of the amino terminus of the corticotropin releasing factor receptor type 1 is important for ligand interaction. Biochemistry 2001,40, 1187-1195.

92. Klose J., Fechner K., Beyermann M., Krause E., Wendt N., Bienert M., Rudolph R., Rothemund S. Impact of N-terminal domains for corticotropin-releasing factor (CRF) receptor-ligand interactions. Biochemistry 2005,44,1614-1623.

93. Kraetke O., Holeran В., Berger H., Escher E., Bienert M., Beyermann M. Photoaffinity cross-linking of the corticotropin-releasing factor receptor type 1 with photoreac-tive urocortin analogues. Biochemistry 2005,44,15569-15577.

94. Bonk I., Ruhmann A. Development of a selective photoactivatable antagonist for corticotrophin-releasing factor receptor, type 2 (CRF2). Eur. J. Biochem. 2002,269, 5288-5294.

95. Grutter Т., Changeux J.P. Nicotinic receptors in wonderland. Trends Biochem. Sci. 2001,26,459-463.

96. Mourot A., Grutter Т., Goeldner M., Kotzyba-Hibert F. Dynamic structural investigations on the Torpedo nicotinic acetylcholine receptor by time-resolved photoaffinity labeling. ChemBioChem 2006, 7, 570-583.

97. Changeux J.P., Edelstein S.J. Allosteric receptors after 30 years. Neuron 1998,21, 959-980.

98. Hucho F., Tsetlin V.I., Machold J. The emerging three-dimensional structure of a receptor. The nicotinic acetylcholine receptor. Eur. J. Biochem. 1996, 239, 539-557.

99. Brejc K., van Dijk W.J., Klaassen R.V., Schuurmans M., van der Oost J., Smit A.B., Sixma Т.К. Crystal structure of an ACh-binding protein reveals the ligand-binding domain of nicotinic receptors. Nature 2001, 411, 269-276.

100. Unwin N. Refined structure of the nicotinic acetylcholine receptor at 4A° resolution. J. Mol. Biol. 2005,346, 967-989.

101. Middleton R.E., Cohen J.B. Mapping of the acetylcholine binding site of the nicotinic acetylcholine receptor: 3H.nicotine as an agonist photoaffinity label. Biochemistry 1991,30,6987-6997.

102. Kotzyba-Hibert F., Grutter Т., Goeldner M. Molecular investigations on the nicotinic acetylcholine receptor: conformational mapping and dynamic exploration using photoaffinity labeling. Mol. Neurobiol. 1999, 20,45-59.

103. Addona G.H., Kloczewiak M.A., Miller K.W. Time-resolved photolabeling of membrane proteins: application to the nicotinic acetylcholine receptor. Anal. Biochem. 1999,267,135-140.

104. Galzi J., Revah F., Bouet F., Menez A., Goeldner M., Hirth C., Changeux J. Allos-teric transitions of the acetylcholine receptor probed at the amino acid level with a photo-labile cholinergic ligand. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1991,88, 5051-5055.

105. Grutter Т., Bertrand S., Kotzyba-Hibert F., Bertrand D., Goeldner M. Structural reorganization of the acetylcholine binding site of the Torpedo nicotinic receptor as revealed by dynamic photoaffinity labeling. ChemBioChem 2002,3, 652-658.

106. Ziebell M.R., Nirthanan S., Husain S.S., Miller K.W., Cohen J.B. Identification of• • • 4 •binding sites in the nicotinic acetylcholine receptor for H.azietomidate, a photoactivatable general anesthetic. J. Biol. Chem. 2004,279,17640-17649.

107. Wiegandt H., in: Neuberger A., Van Deenen L.L.M. (Eds.). Gangliosides. New Comprechensive Biochemistry, vol. 10. Elsevier, Amsterdam, 1985, pp. 199-260.

108. Hakomori S.-I. Bifunctional role of glycosphingolipids. Modulators for transmembrane signaling and mediators for cellular interactions. J. Biol. Chem. 1990, 265,1871318716.

109. Yates A.J., Rampersaud A. Sphingolipids as receptor modulators. An overview. Ann. N.-Y. Acad. Sci. 1998, 845, 57-71.

110. Vanmeer G., Lisman Q. Sphingolipid transport: Rafts and translocators. J. Biol. Chem., 2002,277,25855-25858.

111. Bektas M., Spiegel S. Glycosphingolipids and cell death. Glycoconjugate J. 2003, 20,39-47.

112. Neuenhofer S., Schwarzmann G., Egge H., Sandhoff K. Synthesis of lysogan-gliosides. Biochemistry 1985,24, 525-532.

113. Anderson R.G.W. The caveolae membrane systems. Annu. Rev. Biochem. 1998, 67, 199-225.

114. Helms J.B., Zurzolo C. Lipids as targeting signals: lipid rafts and intracellular trafficking. Traffic 2004,5,247-254.

115. Fra M.A., Masserini M., Palestini P., Sonnino S., Simons K. A photo-reactive derivative of ganglioside GM1 specifically cross-links VIP21-caveolin on the cell surface. FEBSLett. 1995,375,11-14.

116. Mauri L., Prioni S., Loberto N., Chigorno V., Prinetti A., Sonnino S. Synthesis of radioactive and photoactivable ganglioside derivatives for the study of ganglioside-protein interactions. Glycoconjugate J. 2004,20,11-23.

117. Loberto N., Prioni S., Prinetti A., Ottico E., Chigorno V., Karagogeos D., Sonnino S. The adhesion protein TAG-1 has a ganglioside environment in the sphingolipidenriched membrane domains of neuronal cells in culture. J. Neurochem. 2003, 85,224233.

118. Palestini P., Pitto M., Tedeschi G., Ferraretto A., Parenti M., Brunner J., Masserini M. Tubulin anchoring to glycolipid-enriched, detergent-resistant domains of the neuronal plasma membrane. J. Biol. Chem. 2000, 275,9978-9985.

119. Wendeler M., Hoernschemeyer J., Hoffmann D., Kolter Т., Schwarzmann G., Sand-hoff K. Photoaffinity labelling of the human GM2-activator protein (mechanistic insight into ganglioside GM2 degradation). Eur. J. Biochem. 2004,271, 614-627.

120. Shapiro R.E., Specht C.D., Collins B.E., Woods A.S., Cotter R.J., Schpaar R.L. Identification of a ganglioside recognition domain of Tetanus Toxin using a novel ganglioside photoaffinity ligand. J. Biol. Chem. 1997, 272, 30380-30386.

121. Alcaraz M.-L., Peng L., Klotz P., Goeldner M. Synthesis and properties of photoac-tivatable phospholipid derivatives designed to probe the membrane associated domains of proteins. J. Org. Chem. 1996, 61,192-201.

122. Arnold B.R., Scaiano J.C., Bucher G.F., Sander W.W. Laser flash photolysis studies on 4-oxocyclohexa-2,5-dienylidenes. J. Org. Chem. 1992, 57, 6469-6474.

123. Weber Т., Brunner J. 2-(tributylstannyl)-4-3-(trifluoromethyl)-3tf-diazirin-3-yl.benzyl alcogol: a building reagents of very high specific radioactivity. J. Am. Chem. Soc. 1995,117,3084-3095.

124. Durrer P., Gaudin Y., Ruigrok R.W.H., Graf R., Brunner J. Photolabeling identifies a putative fusion domain in the envelope glycoprotein of rabies and esicular stomatitis viruses. J. Biol. Chem. 1995, 270, 17575-17581.

125. Peng Q., Xia Y., Qu F., Wu X., Campese D., Peng L. Synthesis of a photoactivat-able phospholipidic probe containing tetrafluorophenylazide. Tetrahedron Lett. 2005, 46, 5893-5897.

126. Delfino J.M., Schtreiber S.L., Richards M.F. Design, synthesis and properties of a photoactivatable membrane-spanning phospholipidic probe. J. Am. Chem. Soc. 1993, 115,3458-3474.

127. Zegers M.M.P., Kok J.W., Hoekstra D. Use of photoactivatable sphingolipid analogues to monitor lipid transport in mammalian cells. Biochem. J. 1997,328,489-498.

128. Prestwich G.D., in: Bruzik K.S. (Ed.). Phosphoinositides: Chemistry, Biochemistry and Biomedical Applications, vol. 818. Probing phosphoinositide polyphosphate binding to proteins, American Chemical Society, 1999, pp. 24-37.

129. Chaudhary A., Chen J., Gu Q.-M., Witke W., Kwiatkowski D.J., Prestwich G.D. Probing the phosphoinositide 4,5-bwphosphate binding site of human profilin I. Chem. Biol. 1998, 5,273-281.

130. Giraldo A.M.V., Castello P.R., Flechaa F.L.G., Moeller J.V., Delfino J.M., Rossi J.P.F.C. Stoichiometry of lipid-protein interaction assessed by hydrophobic photolabeling. FEBSLett. 2006, 580,607-612.

131. Persinger J., Bartholomew B. Mapping the contacts of yeast TFIIIB and RNA polymerase III at various distances from the major groove of DNA by DNA photoaffmity labeling./. Biol. Chem. 1996, 271, 33039-33046.

132. Кнорре Д.Г., Кудряшова Н.В., Лаврик О.И. Химические подходы к изучению матричного биосинтеза: исследование репликации и обратной транскрипции. Успехи химии 1998, 67, 486-502.

133. Lavrik O.I., Nasheuer Н.Р., Weisshart К., Wold M.S., Prasad R., Beard W.A., Wilson S.H., Favre A. Subunits of human replication protein A are crosslinked by photoreac-tive primers synthesized by DNA polymerases. Nucl. Acids Res. 1998,26, 602-607.

134. Kolpashchikov D.V., Khodyreva S.N., Khlimankov D.Y., Wold M.S., Favre A., Lavrik O.I. Polarity of human replication protein A binding to DNA. Nucl. Acids Res. 2001,29,373-379.

135. Лебедева H.A., Речкунова Н.И., Дежуров C.B., Дегтярев С.Х., Лаврик О.И. Фотоактивные аналоги dTTP как субстраты термостабильной ДНК-полимеразы из Thermus thermophilus В35. Биоорган, химия 2004,30, 369-374.

136. Dezhurov S.V., Khodyreva S.N., Plekhanova E.S., Lavrik O.I. A new highly efficient photoreactive analogue of dCTP. Synthesis, characterization, and application in photoaffinity modification of DNA binding proteins. Bioconjug. Chem. 2005,16,215222.

137. Свердлов Е.Д., Царев С.А. Субъединицы РНК-полимеразы Е. coli, контактирующие с 5'-концом РНК на разных стадиях транскрипции. Биоорган, химия 1980, 6, 1110-1113.

138. Годовикова Т.С., Березовский М.В., Кнорре Д.Г. Фотоаффинная модификация аминокислотных производных олигонуклеотидов в комплементарном комплексе. Биоорган, химия 1995, 21, 858-867.

139. Godovikova T.S., Knorre V.D., Maksakova G.A., Sil'nikov V.N. Synthesis of azi-doaniline derivatives of oligonucleotides and investigation of their photochemical behavior. Bioconjugate Chem. 1996, 7, 343-348.

140. Gabius H.-J., Siebert Н.-С., Andre S., Jimenez-Barbero J., Rudiger H. Chemical biology of the sugar code. ChemBioChem 2004, 5, 740-764.

141. Lauc G., Barisic K., Zanic T. The photoreactive carbohydrate probe: a novel method for detection of lectins. Eur. J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 1995,33, 933-937.

142. Lauc G., Lee R.T., Dumic J., Lee Y.C. Photoaffinity glycoprobes a new tool for the identification of lectins. Glycobiology 2000,10,357-364.

143. Hatanaka Y., Kempin U., Jongjip P. One-step synthesis of biotinyl photoprobes from unprotected carbohydrates. J. Org. Chem. 2000, 65, 5639-5643.

144. Hashimoto M., Yang J., Holman G.D. Cell-surface recognition of biotinylated membrane proteins requires very long spacer arms: an example from glucose-transporter probes. Chembiochem. 2001, 2, 52-59.

145. Hashimoto M., Okamoto S., Nabeta K., Hatanaka Y. Enzyme cleavable and biotinylated photoaffinity ligand with diazirine. Bioorgan. Med. Chem. Lett. 2004,14,24472450.

146. Ballell L., Alink K.J., Slijper M., Versluis C., Liskamp R.M.J., Pieters R.J. A new chemical probe for proteomics of carbohydrate-binding proteins. Chembiochem 2005, 6, 291-295.

147. Wiese K.H. Exoisomer of dicyclopentadiene dicarboxylic acid. U.S. Patent 2781395 (Feb. 1957).

148. Franklin W.E., Mack C.H., Rowland S.P. Dissociation and Diels-Alder reactions of dicyclopentadienedicarboxylic esters. J. Org. Chem. 1968,33, 626-632.

149. Chen X., Ruckenstein E. Thermally reversible covalently bonded linear polymers prepared from a dihalide monomer and a salt of dicyclopentadiene dicarboxylic acid. J. Polym. Sci., Part A, Polym. Chem. 2000,38,1662-1672.

150. Ando W., Sakai Y., Migita T. Photolysis of diazocyclopentadiene. Reactivity of cyclopentadienylidene in sulfides and ethers. Tetrahedron 1973, 29, 3511-3519.

151. Kassaee M.Z., Nimlos M.R., Downie K.E., Waali E.E. A mndo study of 3-, 5-, 7-and 9-membered carbocyclic, completely conjugated, planar carbenes and their nonplanar isomers. Tetrahedron 1985,41,1579-1586.

152. Mironov V.A., Sobolev E.V., Elizarova A.N. Some general characteristic properties of substituted cyclopentadienes. Tetrahedron 1963, 19, 1939-1958.

153. Peters D. Cyclopentadienecarboxylic acid. The structure of the monomer and the dimers. J. Chem. Soc. 1959,1761-1765.

154. Brunner J., Richards F.M. Analysis of membranes photolabeled with lipid analogues. Reaction of phospholipids containing a disulfide group and a nitrene or carbene precursor with lipids and with gramicidin A. J. Biol. Chem. 1980,255,3319-3329.

155. Schroit A.J., Madsen J., Ruoho A.E. Radioiodinated, photoactivatable phosphatidylcholine and phosphatidylserine: transfer properties and differential photoreactive interaction with human erythrocyte membrane proteins. Biochemistry 1987, 26,1812-1819.

156. Ross A.H., Radhakrishnan R., Robson R.J., Khorana H.G. The transmembrane domain of glycophorin A as studied by cross-linking using photoactivatable phospholipids. J. Biol. Chem. 1982, 257,4152-4161.

157. Bisson R., Steffens G.C.M., Buse G. Localization of lipid binding domains on sub-unit II of beef heart cytochrome с oxidase. J. Biol. Chem. 1982, 257, 6716-6720.

158. Montecucco C., Schiavo G., Brunner J., Duflot E., Boquet P., Roa M. Tetanus toxin is labeled with photoactivatable phospholipids at low pH. Biochemistry 1986, 25,919924.

159. Brunner J., Spiess M., Aggeler R., Huber F., Semenza G. Hydrophobic labeling of a single leaflet of the human erythrocyte membrane. Biochemistry 1983, 22,3812-3820.

160. Montecucco С., Schiavo G. l-Palmitoyl-2-(P-benzoyl)benzoyl phosphatidylcholine, a photoactive phospholipid for the labeling of membrane components. Biochem. J. 1986, 237,309-312.

161. Baer E., Buchnea D. Synthesis of saturated and unsaturated L-a-lecithins. Acylation of the cadmium chloride compound of L-a-glycerylphosphorylcholine. Can. J. Biochem. Physiol. 1959,37, 953-959.

162. Robles C.E., Van Den Berg D. Synthesis of lecithins by acylation of 0-(s«-glycero-3-phosphoryl)choline with fatty acid anhydrides. Biochim. Biophys. Acta. 1969,187, 520-526.

163. Boss W.F., Kelley C.J., Landsberger F.R. A novel synthesis of spin label derivatives of phosphatidylcholine. Anal. Biochem. 1975, 64,289-292.

164. Warner T.G., Benson A.A. An improved method for the preparation of unsaturated phosphatidylcholines: acylation of 5«-glycero-3-phosphorylcholine in the presence of sodium methylsulfinylmethide. J. Lipid Res. 1977,18, 548-552.

165. Pugh E.L., Kates M. A simplified procedure for synthesis of di-14C.acyl-labeled lecithins. J. Lipid Res. 1975,16, 392-394.

166. Nicholas A.W., Khouri L.G., Ellington J.C., Porter N.A. Synthesis of mixed-acid phosphatidylcholines and high pressure liquid chromatographic analysis of isomeric lysophosphatidylcholines. Lipids 1983,18, 434-438.

167. Patel K.M., Morrisett J.D., Sparrow J.T. A convenient synthesis of phosphatidylcholines: acylation of sn-glycero-3-phosphocholine with fatty acid anhydride and 4-pyrrolidinopyri-dine. J. Lipid Res. 1979, 20, 674-677.

168. Mason J.T., Broccoli A.V., Huang C. A method for the synthesis of isomerically pure saturated mixed-chain phosphatidylcholines. Anal. Biochem. 1981,113, 96-101.

169. Mena P.L., Djerassi C. Synthesis of 5,9-hexacosadienoic acid phospholipids. 11. Phospholipid studies of marine organisms. Chem. Phys. Lipids 1985, 37,257-270.

170. Mangroo D., Gerber G.E. Phospholipid synthesis: effects of solvents and catalysts on acylation. Chem. Phys. Lipids 1988,48,99-108.

171. Steglich W., Hoefle G. A^-DimethyM-pyridinamine, a very effective acylation catalyst. Angew. Chem., Int. Ed. Eng. 1969, 8,981.

172. Молотковский Юл.Г., Бергельсон Л.Д. Периленоилмеченые липид-специфические флуоресцентные зонды. Биоорган, химия 1982, 8,1256-1262.

173. Orlando P., Giordano С., Binaglia L., De Sanctis G. The synthesis of 1,2-dioleoyl-sn-2- H.glycero-3-phosphoserine. J. Labelled Сотр. Radiopharm. 1984, 21,497-505.

174. Hassner A., Alexanian V. Direct room temperature esterification of carboxylic acids. Tetrahedron Lett. 1978,19, 4475-4478.

175. Neises В., Steglich W. Simple method for the esterification of carboxylic acids. Angew. Chem., Int. Ed. Eng. 1978,17, 522-524.

176. Salari H., Eigendorf G.K. Detection of lyso-platelet-activating factor by high-performance liquid chromatography after derivatisation with fluorescent fatty acids. J. Chromatogr. A 1990, 527,303-314.

177. Fieser M., Fieser L.F., in: Reagents for Organic Synthesis, vol. 4. A Wiley-Interscience Publication, John Wiley & Sons, Inc., New York, 1974, p. 416.

178. Joule J.A., Smith G.F., in: Heterocyclic Chemistry, Chapter 3. Van Nostrand Rei-hold Co., London, 1972.

179. Водовозова E.JI., Евдокимов Д.В., Молотковский Юл.Г. Синтез липидного производного противоопухолевого препарата метотрексата. Биоорган, химия 2004, 30, 663-665.

180. Tretiakov V.E., Degtyarenko K.N., Uvarov V.Yu., Archakov A.I. Secondary structure and membrane topology of cytochrome P450s. Arch. Biochem. Biophys. 1989,275, 429-439.

181. Nelson D.R., Strobel H.W. On the membrane topology of vertebrate cytochrome P-450 proteins. J. Biol. Chem. 1988, 263, 6038-6050.

182. Vergeres G., Winterhalter K.H., Richter C. Identification of the membrane anchor of microsomal rat liver cytochrome P-450. Biochemistry 1989,28, 3650-3656.

183. Vergeres G., Winterhalter K.H., Richter C. Localization of the N-terminal methionine of rat liver cytochrome P-450 in the lumen of the endoplasmic reticulum. Biochim. Biophys. Acta 1991,1063,235-241.

184. Black S.D., Martin S.T., Smith C.A. Membrane topology of liver microsomal cytochrome P450 2B4 determined via monoclonal antibodies directed to the halt-transfer signal. Biochemistry 1994,33, 6945-6951.

185. Das М.К., Lindstrom J. Epitope mapping of antibodies to acetylcholine receptor alpha subunits using peptides synthesized on polypropylene pegs. Biochemistry 1991,30, 2470-2477.

186. Frey A.B., Waxman D.J., Kreibich G. The structure of phenobarbital-inducible rat liver cytochrome P-450 isoenzyme PB-4. Production and characterization of site-specific antibodies. J. Biol. Chem. 1985,260, 15253-15265.

187. Miller J.P., Herbette L.G., White R.E. X-ray diffraction analysis of cytochrome P450 2B4 reconstituted into liposomes. Biochemistry 1996,35, 1466-1474.

188. Shank-Retzlaff M.L., Raner G.M., Coon M.J., Sligar S.G. Membrane topology of cytochrome P450 2B4 in Langmuir-Blodgett monolayers. Arch. Biochem. Biophys. 1998, 359, 82-88.

189. Wu J., So S.-P., Ruan K.-H. Determination of the membrane contact residues and solution structure of the helix F/G loop of prostaglandin 12 synthase. Arch. Biochem. Biophys. 2003,411,27-35.

190. Deng H., Wu J., So S.-P., Ruan K.-H. Identification of the residues in the helix F/G loop important to catalytic function of membrane-bound prostacyclin synthase. Biochemistry 2003; 42, 5609-5617

191. Greenwood F.C., Hunter W.M., Glover J.S. The preparation of I-131-labelled human growth hormone of high specific radioactivity. Biochem. J. 1963, 89, 114-123.

192. Bayse G.S., Morrison M. Peroxidase catalyzed reactions of iodide at low pH. Arch. Biochem. Biophys. 1971,145,143-148.

193. Moerlein S.M., Beyer W, Stocklin G. No-carrier-added radiobromination and ra-dioiodination of aromatic rings using in situ generated peracetic acid. J. Chem. Soc. Perkin Trans. I 1988, 779-786.

194. Bolton A.E., Hunter W.M. The labelling of proteins to high specific radioactivity by conjugation to a 125I-containing acylating agent. Biochem. J. 1973,133, 529-539.

195. Macdonald S.G., Dumas J.J., Norman D.B. Chemical cross-linking of substance P (NK-1) receptor to the alpha subunits of the G proteins Gq and Gil. Biochemistry 1996, 35,2909-2916.

196. Hatanaka Y., Hashimoto M., Kurihara H., Nakayama H., Kanaoka Y. A novel family of aromatic diazirines for photoaffinity labeling. J. Org. Chem. 1994,59,383-387.

197. Li G.; Bittman R. Synthesis of novel phenoxy-linked diazirine glycero- and sphin-golipid probes via trialkylaryltin intermediates. Tetrahedron Lett. 2000,41, 6737-6741.

198. Hatanaka Y., Hashimoto M., Kurihara H., Nakayama H., Kanaoka Y. Versatile synthesis of phenoxydiazirine based fatty acid analogues and photoreactive galactosylcera-midc.J. Org. Chem. 1994,59,383-387.

199. Hashimoto M., Kato Y., Hatanaka Y. Simple method for the introduction of iodo-label on (3-trifluoromethyl) phenyldiazirine for photoaffinity labeling. Tetrahedron Lett. 2006,47,3391-3394.

200. Merkushev E.B., Simakhina N.D., Koveshnikova G.M. A new, convenient iodina-tion method of aromatic compounds. Synthesis 1980,486.

201. Farah K., Farouk N. Electrophilic radioiodination of tyrosine derivatives. J. Labelled Compd. Radiopharm. 1998, XL1,255-259.

202. Cram D.J., Partos R.D. Electrophilic substitution and other reactions of diazo-cyclopentadiene. J. Am. Chem. Soc. 1963, 85, 1273-1277.

203. Markwell M.A.K. A new solid-state reagents to iodinate proteins: conditions for the efficient labelling of antiserum. Anal. Bochem. 1982,125,427-432.

204. Turro N.J. Modern Molecular Photochemistry, Benjamin/Cummings, New York, 1978, pp. 125,126,192.

205. Watt D.S., Kawada K., Leyva E., Platz M.S. Exploratory photochemistry of iodi-nated aromatic azides. Tetrahedron Lett. 1989,30, 899-902.

206. Бюлер К., Пирсон Д. Органические синтезы: Пер. с англ. М.: Мир, 1973, Т. 1, С. 201. (Buehler С.А., Pearson D.E. Survey of Organic Syntheses. A division of John Wiley and Sons, Inc., New York, London, Sydney, Toronto, 1970).

207. Wilson J. A., Skehel J. J., Wiley D.C. Structure of the haemagglutinin membrane glycoprotein of influenza virus at ЗА resolution. Nature 1981, 289, 366-378.

208. Keil W., Niemann H., Schwarz R.T., Klenk H.-D. Carbohydrates of influenza virus. V. Oligosaccharides attached to individual glycosylation sites of the hemagglutinin of fowl plague virus. Virology 1984,133, 77-91.

209. Weber Т., Paesold G., Galli C., Mischler R., Semenza G., Brunner J. Evidence for H(+)-induced insertion of influenza hemagglutinin HA2 N-terminal segment into viral membrane. J. Biol. Chem. 1994, 269,18353-18358.

210. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophag T4. Nature 1970, 227, 680-685.

211. Masserini M., Palestini P., Pitto M. Glycolipid-enriched caveolae-like domains in the nervous system./. Neurochem. 1999, 73,1-11.

212. Hakomori S. Tumor malignancy defined by aberrant glycosylation and sphingo(glyco)lipid metabolism. Cancer Res. 1996, 56, 5309-5318.

213. Olshefski R., Ladisch S. Intercellular transfer of shed tumor cell gangliosides. FEBS Lett. 1996,386, 11-14.

214. Jackson K.M., Yates A.J., Orosz C.G., Whitacre C.C. Gangliosides suppress the proliferation of autoreactive cells in experimental allergic encephalomyelitis: ganglioside effects on IL-2 activity. Cell Immunol 1987,104,169-181.

215. Chu J.W., Sharom F.J, Gangliosides interact with interleukin-4 and inhibit inter-leukin-4-stimulated helper T-cell proliferation. Immunology 1995,84, 396-403.

216. Ярилин A.A. Основы иммунологии. M.: Медицина, 1999, С. 247-259.

217. Mott H.R., Driscoll Р.С., Boyd J., Cooke R.M., Weir M.P., Campbell I.D. Secondary structure of human interleukin 2 from 3D heteronuclear NMR experiments. Biochemistry 1992,31,7741-1744.

218. Kashima N., Nishi-Takaoka C., Fujita Т., Taki S., Yamada G., Hamuro J., Tanigu-chi T. Unique structure of murine interleukin-2 as deduced from cloned cDNAs. Nature 1985,313, 402-404.

219. Zurawski S.M., Mosmann T.R., Benedik G., Zurawski G. Alterations in the amino-terminal third of mouse interleukin 2: effects on biological activity and immunoreactiv-ity. J. Immunol. 1986,137, 3354-3360.

220. Leonard W.J., Depper J.M., Crabtree G.R., Rudikoff S., Pumphrey J., Robb R.J., Kronke M., Svetlik P.B., Peffer N.J., Waldmann T.A. Molecular cloning and expression of cDNAs for the human interleukin-2 receptor. Nature 1984,311,626-631.

221. Willerford D.M., Chen J., Ferry J.A., Davidson L., Ma A., Alt F.W. Interleukin-2 receptor alpha chain regulates the size and content of the peripheral lymphoid compartment. Immunity 1995,3, 521-530.

222. Bazan J.F. A novel family of growth factor receptors: a common binding domain in the growth hormone, prolactin, erythropoietin and IL-6 receptors, and the p75 IL-2 receptor beta-chain. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1989,164, 788-795.

223. Takeshita Т., Asao H., Ohtani K., Ishii N., Kumaki S., Tanaka N., Munakata H., Nakamura M., Sugamura K. Cloning of the gamma chain of the human IL-2 receptor. Science 1992,257, 379-382.

224. Waldmann T.A. The multi-subunit interleukin-2 receptor. Annu. Rev. Biochem. 1989, 58, 875-911.

225. Rickert M., Boulanger M.J., Goriatcheva N., Garcia K.C. Compensatory energetic mechanisms mediating the assembly of signaling complexes between interleukin-2 and its a, p, and yc receptors. J. Mol. Biol. 2004,339,1115-1128.

226. Тапака Т., Hu-Li J., Seder R.A., Fazekas de St Groth В., Paul W.E. IL-4 suppresses IL-2 and interferon-y production by naive T cells stimulated by accessory cell-dependent receptor engagement. Proc. Natl Acad. Sci. USA 1993,90, 5914-5918.

227. Powers R., Garrett D.S., March C.J., Frieden E.A., Gronenborn A.M., Clore G.M. Three-dimensional solution structure of human interleukin-4 by multidimensional het- ; eronuclear magnetic resonance spectroscopy. Science 1992,256,1673-1677.

228. Murata Т., Obiri N.I., Puri R.K. Structure of and signal transduction through interleukin-4 and interleukin-13 receptors. Int. J. Mol Med. 1998,1,551-557.

229. Kawakami K., Leland P., Puri R.K. Structure, function, and targeting of interleukin 4 receptors on human head and neck cancer cells. Cancer Res. 2000, 60, 2981-2987.

230. Zhang J.L., Simeonowa I., Wang Y., Sebald W. The high-affinity interaction of human IL-4 and the receptor alpha chain is constituted by two independent binding clusters. J. Mol Biol 2002,315,399-407.

231. Wang Y., Shen B.J., Sebald W. A mixed-charge pair in human interleukin 4 dominates high-affinity interaction with the receptor alpha chain. Proc. Natl Acad Sci. USA 1997,94,1657-1662.

232. Hage Т., Sebald W., Reinemer P. Crystal structure of the interleukin-4/receptor alpha chain complex reveals a mosaic binding interface. Cell 1999,97,271-281.

233. Sugamura K., Asao H., Kondo M., Tanaka N., Ishii N., Nakamura M., Takeshita T. The common gamma-chain for multiple cytokine receptors. Adv. Immunol. 1995, 59, 225-277.

234. Zhang J.L., Buehner M., Sebald W. Functional epitope of common gamma chain for interleukin-4 binding. Eur. J. Biochem. 2002, 269, 1490-1499.

235. Hemar A., Subtil A., Lieb M., Morelon E., Hellio R., Dautry-Varsat A. Endocytosis of interleukin 2 receptors in human T lymphocytes: distinct intracellular localization and fate of receptor a, p, and у chains. J. Cell Biol. 1995,129,55-64.

236. Friedrich K., Kammer W., Erhardt I., Brandlein S., Arnold S., Sebald W. The two subunits of the interleukin-4 receptor mediate independent and distinct patterns of ligand endocytosis. Eur. J. Biochem. 1999,265,457-465.

237. Холоденко И.В. Влияние опухолевых ганглиозидов на пролиферацию Т-лимфоцитов. Определение последовательностей IL-4, способных связывать ганглиозиды. Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук. Москва-2006.

238. Goebel J., Forrest К., Morford L., Roszman T.L. Differential localization of IL-2 and -15 receptor chains in membrane rafts of human T cells. J. Leuk. Biol. 2002, 72, 199206.

239. Marmor M., Julius M. Role for lipid rafts in regulating interleukin-2 receptor signaling. Blood 2001,98, 1489-1497.

240. Lauer S., Goldstein В., Nolan R.L., Nolan J.P. Analysis of cholera toxin-ganglioside interactions by flow cytometry. Biochemistry 2002,41, 1742-1751.

241. Muller Т., Oehlenschlager F., Buehner M. Human interleukin-4 and variant R88Q: phasing X-ray diffraction data by molecular replacement using X-ray and nuclear magnetic resonance models. J. Mol. Biol. 1995,247,360-372.

242. Boyer P.D. The ATP synthase a splendid molecular machine. Annu. Rev. Biochem. 1997, 66, 717-749.

243. Abrahams J.P., Leslie A.G., Lutter R., Walker J.E. Structure at 2.8 A resolution of FrATPase from bovine heart mitochondria. Nature 1994,370, 621-628.

244. Engelbrecht S., Junge W. ATP synthase: a tentative structural model. FEBSLett. 1997,414,485-491.

245. Зайцева JI.Г. FiFo-ATP-аза: строение мембранного сектора и импорт некоторых субъединиц в митохондриальный матрикс. Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук. Москва-2000.

246. Serrano R., Kanner B.J., Raker E.J. Purification and properties of the proton-translocating adenosine triphosphatase complex of bovine heart mitochondria. J. Biol. Chem. 1976,251,2453-2461.

247. Katz M.L., Gao C.L., Tompinks J.A., Bronson R.T., Chin D.T. Mitochondrial ATP synthase subunit с stored in hereditary ceroid-lipofuscinosis contains trimethyl-lysine. Biochem. J. 1995,310, 887-892.

248. Griffiths D.E., Buzy A., Jennings K.R., Millar A.L., Ryan E.M. Electrospray ionisa-tion studies of the interaction of N,N'-dicyclohexylcarbodiimide with ceroid lipofuscinosis protein (subunit c). Eur. J. Mass Spectrom. 1997,3, 81-88.

249. Walker J.E., Lutter R., Dupuis A., Runswick M.J. Identification of the subunits of FjFo-ATPase from bovine heart mitochondria. Biochemistry 1991,30, 5369-5378.

250. Walker J.E., Fearnley I.M., Gay N.J., Gibson B.W., Northrop F.D., Powell S.J., Runswick M.J., Saraste M., Tybulewicz V.L.J. Primary structure and subunit stoichiome-try of FrATPase from bovine mitochondria. J. Mol. Biol. 1985,184, 677-701.

251. Ernster L., Hundal Т., Norling В., Sandri G., Wojtszak L., Grinkevich V.A., Modyanov N.N., Ovchinnikov Yu.A. Structural, functional and evolutionary aspects of proton-translocating ATPase. Chemica Scripta 1986,26,273-279.

252. Walker J.E., Runswick M.J., Poulter L. ATP synthase from bovine mitochondria. The characterization and sequence analysis of two membrane-associated sub-units and of the corresponding cDNAs. J. Mol. Biol. 1987,197, 89-100.

253. Fearnley I.M., Walker J.E. Two overlapping genes in bovine mitochondrial DNA encode membrane components of ATP synthase. EMBO J. 1986, 5,2003-2008.

254. Groth G., Walker J.E. Model of the c-subunit oligomer in the membrane domain of F-ATPases. FEBSLett. 1997,410,117-123.

255. Gabius H.-J. Tumor lectinology: at the intersection of carbohydrate chemistry, biochemistry, cell biology and oncology. Angew. Chem. Int. Ed. Eng. 1988, 27,1267-1276.

256. Goldstein I.J., Hugues R.C., Monsigny M. What should be called a lectin? Nature 1980,285, 66.

257. Monsigny M., Roche A.C., Midoux P. Endogenous lectins and drug targeting. Ann. NY Acad. Sci. 1988,551,399-414.

258. Monsigny M., Roche A.-C., Midoux P. Glycoconjugates as carriers for specific delivery of therapeutic drugs and genes. Adv. DrugDeliv. Rev. 1994,14, 1-24.

259. Yamazaki N., Kojima S., Bovin N.V., Andre S., Gabius S., Gabius H.-J. Endogenous lectins as targets for drug delivery. Adv. Drug Deliv. Rev. 2000, 43,225-244.

260. Bies C., Lehr C.-M., Woodley J.F. Lectin-mediated drug targeting: history and applications. Adv. Drug Deliv. Rev. 2004,56,425-435.

261. DeFrees S.A., Phillips L., Guo L., Zalipsky S. Sialyl Lewis X liposomes as a multivalent ligand and inhibitor of E-selectin mediated cellular adhesion. J. Am. Chem. Soc. 1996,118, 6101-6104.

262. Vodovozova E.L., Gayenko G.P., Razinkov V.I., Korchagina E.Y., Bovin N.V., Molotkovsky J.G. Saccharide-assisted delivery of cytotoxic liposomes to human malignant cells. Biochem. Mol Biol. Int. 1998,44, 543-553.

263. Водовозова Е.Л., Хайдуков C.B., Гаенко Г.П., Бондарчук Т.И., Михалев И.И., Гречишникова И.В., Молотковский Юл.Г. Транспортировка цитотоксических ли-посом к злокачественным клеткам с помощью углеводных детерминант. Биоорган, химия 1998,24,760-767.

264. Водовозова Е.Л., Назарова А.И., Феофанов А.В., Холоденко Р.В., Пазынина Г.В., Гаенко Г.П., Бовин Н.В., Молотковский Юл.Г. Взаимодействие липосом, несущих углеводные детерминанты, с клетками меланомы. Биол. мембраны 2004,21, 53-64.

265. Moiseeva E., Vodovozova E., Chaadaeva A., Tuzikov A., Bovin N., Den Otter W., Molotkovsky J. Liposomal formulations of merphalan lipophilic prodrug equipped with1. X *

266. Bovin N.V., Korchagina E.Y., Zemlyanukhina T.V., Byramova N.E., Galanina O.E., Zemlyakov A.E., Ivanov A.E., Zubov V.P., Mochalova L.S. Synthesis of polymeric neoglycoconjugates based on N-substituted polyacrylamide. Glycoconjugate J. 1993,10, 142-151.

267. Бовин Н.В. Гликоконъюгаты на основе полиакриламида инструменты для изучения лектинов, антител, гликозилтрансфераз в гликобиологии, цитохимии и гистохимии. Биоорган, химия 1996,22,643-663.

268. Dodd R.B., Drickamer К. Lectin-like proteins in model organisms: implications for evolution of carbohydrate-binding activity. Glycobiology 2001,11,71R-79R.

269. In: Kishimoto Т., Kikutani H. (Eds.). Leucocyte typing VI. White cell differentiation antigens. Garland Publishing, N.-Y. & London, 1997, pp. И 58-1159.

270. Bevilacqua M.P., Pober J.S., Mendrick D.L., Cotran R.S., Gimbrown M.A. Identification of an inducible endothelial-leukocyte adhesion molecule. Proc. Natl Acad. Sci. USA 1987, 84,9238.

271. Lasky L.A. Selectins: interpreters of cell-specific carbohydrate information during inflammation. Science 1992,258,964-969.

272. Rice K.G., in: Gabius H.-J., Gabius S. (Eds.). Glycosciences. Glycoconjugate-mediated drug targeting. Chapman and Hall, Weinheim, 1997, pp. 471-483.

273. Zeisig R., Stahn R., Wenzel K., Behrens D., Fichtner I. Effect of sialyl Lewis X-glycoliposomes on the inhibition of E-selectin-mediated tumour cell adhesion in vitro. Biochim. Biophys. Acta 2004,1660,31 -40.

274. Gabius H.-J. Animal lectins. Eur. J. Biochem. 1997,243,543-548.

275. Drickamer K. Ca+-dependant carbohydrate-recognition domains in animal proteins. Curr. Opinion Struct. Biol 1993,3,393-400.

276. Kawakami S., Munakata C., Fumoto S., Yamashita F., Hashida M. Novel galactosy-lated liposomes for hepatocyte-selective targeting of lipophilic drugs. J. Pharm. Sci. 2001,90,105-113.

277. Engel A., Chatteijee. S.K., Alarifi A., Riemann D,, Langner J., Nuhn P. Influence of spacer length on interaction of mannosylated liposomes with human phagocytic cells. Pharm. Res. 2003,20, 51-57.

278. Nifant'ev N.E., Tsvetkov Y.E., Shashkov A.S., Kononov L.O., Menshov V.M., Tuzikov A.B., Bovin N.V. Selectin receptors 4: synthesis of tetrasaccharides sialyl Lewis A and sialyl Lewis X containing a spacer group. J. Carbohydr. Chem. 1996,15, 939-953.

279. Vaskovsky V.E., Kostetsky V.Y., Vasendin I.M. A universal reagent for phospholipid analysis. J. Chromatogr. 1975,114, 129-141.

280. Hanahan D.J., Rodell M., Turner L.D. Enzymatic formation ofmonopalmitoylleci-thin (lysolecithins). J. Biol Chem. 1954, 206, 431-441.

281. Hanahan D.J. Sphingomyelin. Biochemical preparations. J. Biol Chem. 1954, 206, 121-124.

282. Молотковский Юл.Г., Никулина Л.Ф., Бергельсон Л.Д. Синтез оптически активных а,Р-диглицеридов. Химия природ, соед. 1969, № 4, 210-214.

283. Sakakibara S., Inukai N. A new reagent for the/?-nitrophenylation of carboxylic acid. Bull Chem. Soc. Japan 1964,37, 1231-1232.

284. Корчагина Е.Ю., Бовин H.B. Синтез спейсерированных трисахаридов с групповой специфичностью крови А и В, их фрагментов и структурных аналогов. Биоорган. Химия 1992,18,283-298.

285. Likhosherstov L.M., Novikova O.S., Derevitskaja V.A., Kochetkov NX A new simple synthesis of amino sugar p-D-glycosylamines. Carbohydr. Res. 1986,146, Cl-C5.

286. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. Protein mesurment with the Folin phenol reagent. J. Biol Chem. 1951,193, 265-275.

287. Merril C.R., Dunau M.L. Goldman D. A rapid sensitive silver stain for polypeptides in polyacrylamid gels. Anal Biochem. 1981,110,201-207.

288. Peters D. Cyclopentadienecarboxylic acid. The structure of the monomer and the dimers. J. Chem. Soc. 1959,1761-1765.

289. In: Buckingham J., Donaghy S.M. (Eds.) Dictionary of organic compounds. Chapman and Hall, New York, 1982, vol. 3, p. 3262.

290. Bartlett G.R. Phosphorus assay in column chromatography. J. Biol. Chem. 1959, 234,466-468.

291. Poulos T.L., Finzel B.C., Howard A.J. High-resolution crystal structure of cytochrome P450cam. J. Mol. Biol. 1987,195, 687-700.

292. Hu-Li J., Ohara J., Watson C., Tsang W., Paul W.E. Derivation of a T cell line that is highly responsive to IL-4 and IL-2 (CT.4R) and of an IL-2 hyporesponsive mutant of that line (CT.4S). J. Immunology 1989,142, 800-807.

293. Brunette D.M;, Till J.E. A rapid method for the isolation of L-cell surface membranes using an aqueous two phase polymer system. J. Membrane Biol. 1971, 5,215-224.

294. Gruber M.Y., Cheng K.-H., Lepock J.R., Thompson J.E. Improved yield of plasma membrane from mammalian cells through modifications of the two-phase polymer isolation procedure. Anal. Biochem. 1984,138,112-118.

295. Heukeshoven J., Dernick R. Improved silver staining procedure for fast staining in PhastSystem Development Unit. I. Staining of sodium dodecyl sulfate gels. Electrophoresis 1988,9,28-32.

296. Friedl P., Schairer H.U. Preparation and reconstitution of FiF0 and ¥0from Escherichia coli. Methods Enzymol. 1986,126, 579-588.