Функции мультимеризующих доменов инсуляторных белков Drosophila melanogaster тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.07, кандидат биологических наук Бончук, Артем Николаевич

• Бончук, Артем Николаевич
• кандидат биологических наук
• 2011

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Бончук, Артем Николаевич

ОГЛАВЛЕНИЕ.

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Транскрипция у эукариот.

1.1 Эукариотические РНК-полимеразы.

1.2 Промоторы РНК-полимеразы II.

1.3 Сборка комплекса РНК-полимеразы II. Инициация транскрипции.

2. Энхансеры.

2.1 Открытие энхансеров.

2.2 Общие свойства и разновидности энхансеров.

2.2./ Структура энхансеров.

2.2.2 р-глобиновый локус.

2.3 Механизмы действия энхансеров.

2.3.1 Контактные модели. «Прямое» взаимодействие энхансера и промотора. Медиатор

2.3.2 Альтернативные модели. Взаимодействие транскрипционных факторов с энхансером

2.3.3 Пространственная структура хроматина и функционирование энхансеров.

3.3.4. Дальние взаимодействия в геноме прокариот.

4. Инсуляторы.

4.1 .Инсуляторы Drosophila melanogaster.

4.1.1.Gypsy.„

4.1.2.Scs/scs'.

4.1.3. Инсуляторы регуляторной области гена Abdominal-B.

4.2.Инсуляторные белки.

ДНК-связывающие инсуляторные белки, содержащие «цинковые пальцы».

CTCF.

BEAF-32.

Mod(mdg)4.

CP 190.

GAGA-фактор Drosophila melanogaster.

4.3 Мультимеризугощие домены в структуре транскрипционных факторов.

ВТВ-домен.

SCAN-домен.

ZAD-домен.

Обзор литературы

1. Транскрипция у эукариот

1.1 Эукариотические РНК-полнмеразы

В эукариотических клетках присутствует три различных РНК-полимеразы: РНК-полимеразы I-III.

РНК-полимераза I участвует в синтезе 18S, 28S, 5.8S pPIIK.

РНК-полимераза III синтезирует тРНК, 5S рРНК и 7S РНК.

РНК-полимераза II участвует в синтезе мРНК всех остальных генов. Эта РНК-полимераза характеризуется высокой чувствительностью к аманитину.

Кроме них в клетке функционирует митохондриальная РНК-полимераза. Недавно появились данные о присутствии в ядре четвертой РНК-полимеразы, гомологичной митохондриальной.

Все эукариотические РНК-полимеразы состоят примерно из 12 субъединиц и имеют молекулярную массу около 500 кДа. Около половины всех субъединиц являются общими для всех трех ферментов. Наиболее крупные субъединицы имеют гомологию с субъединицами бактериальной РНК-полимеразы и выполняют сходные функции. Гомолог бактериальной ß'-субъединицы - самая крупная субъединица L' (молекулярная масса около 200 кДа) участвует в связывании ДНК. У РНК-полимеразы II данная субъединица имеет С-концевой домен (CTD), состоящий из многократных повторов семи аминокислот. Число повторов варьирует от 26 у дрожжей до 52 у человека. Фосфорилирование CTD играет важную роль в активации транскрипции (Woychik and Hampsey 2002).

1.2 Промоторы РНК-полимеразы II

Для каждого типа РНК-полимераз характерна специфическая архитектура промотора. Для РНК-полимеразы II характерно два типа промоторов - содержащие последовательность TATA или содержащие DPE (Distal Promoter Element). Стартовая точка транскрипции определяется последовательностью InR (Initiator) с усредненной последовательностью РугСАРу5. Существуют также промоторы, не содержащие ни TATA, ни DPE.

TATA - А-Т-богатый регион, расположенный на расстоянии около 25 пн перед точкой инициации транскрипции. В отличие от него, DPE — пурин-богатая последовательность (обычно AGAC), расположен после точки инициации на расстоянии +28+32.

1.3 Сборка комплекса РНК-полимеразы II. Инициация транскрипции

Для инициации транскрипции РНК-полимеразе II требуется комплекс основных факторов транскрипции (TFIIx или GTF's). Основной и наиболее крупный фактор (800кДа) - TFIID участвует в связывании ТАТА-последовательности. TFIID состоит из белка ТВР (TATA-binding protein) и одиннадцати других субъединиц (TAF's - ТВР-associated factors). Данный комплекс является платформой для сборки преинициаторного комплекса, с ним связывается РНК-полимераза. Существуют аналоги TFIID и различные варианты альтернативной структуры этого комплекса. Например, у Drosophila ТВР могут замещать гомологичные белки TRF1, TRF2 (TBP-related factor), имеющие другую специфичность по отношению к промотору (Berk 2000). Многие полипептиды TAF взаимодействуют с регуляторными участками ДНК промоторов и с активаторами транскрипции.

Сборка преинициаторного комплекса начинается со связывания ТВР с ТАТА-последовательностью. Связывание ТВР приводит к сильному изгибу ДНК (около 80°). После этого присоединяются остальные компоненты TFIID. Затем последовательно присоединяются факторы TFIIA, TFIIB, TFIIF, они выполняют стабилизирующую функцию. Образовавшийся комплекс называется базальным аппаратом транскрипции. Сним связывается РНК-полимераза II. Далее происходит присоединение TFIIE, который способствует связыванию TFIIH, обладающих хеликазной активностью. TFIIH, кроме того, обладает киназной активностью и фосфорилирует CTD, что приводит к инициации транскрипции (Nikolov and Burley 1997; Cosma 2002).

2. Энхансеры

2.1 Открытие энхансеров

При изучении инициации транскрипции гена гистона Н2А морского ежа в ооцитах лягушки было выяснено, что ТАТА-Ьох определяет точное место инициации транскрипции. Его удаление нарушало специфичность инициации, но в целом уровень транскрипции не менялся. Оставалось неясным, какие последовательности влияют непосредственно на уровень экспрессии данных генов. При дальнейшем исследовании обнаружилась интересная особенность: делеция участка -490 - -184 от начала транскрипции приводила к значительному (в несколько десятков раз) понижению эффективности транскрипции гена. Авторы установили, что данный участок, который они назвали «модулятором», является АТ-богатым и содержит инвертированные повторы. Более того, неожиданно оказалось, что инверсия модулятора не только не ингибирует его активность, но даже приводит к 3-4-кратному повышению эффективности экспрессии мРНК, то есть данный активирующий элемент может работать в обоих направлениях (Grosschedl and Birnstiel 1980).

Позднее при изучении ранних генов вируса SV40 было показано, что удаление области -110-260 пн Т-антигена приводит к почти 100-кратному ослаблению его транскрипции. Обнаруженный участок состоял из двух последовательных 72 пн повторов, удаление одного из повторов, так же как его инверсия, перемещение никак не влияли на активность элемента. Авторы назвали открытый элемент эпхансером, позднее этот термин стал применяться ко всем подобным активаторам транскрипции (Banerji et al. 1981).

2.2 Общие свойства и разновидности энхансеров

Энхансеры - цис-элементы, in vivo они, как правило, функционируют только на той же молекуле ДНК, на которой находятся сами. По всей видимости, определяющее значение в данном случае играет физическая близость энхансера и промотора. В экспериментах показано, что энхансер и промотор могут взаимодействовать, если они расположены на разных плазмидах, которые как-либо связаны между собой, например, белковым или биотин-стрептавидиновым мостиком (Mueller-Storm et al. 1989).

Более сложные регуляторные области - локус-контролирующие регионы (LCR) состоят из нескольких энхансеров и действуют обычно на значительных расстояниях (до 100 т.п.н.). В состав LCR, помимо энхансер-подобных структур, часто входят репрессоры, а также барьерные элементы, инсуляторы. В связи с этим, локус-контролирующие регионы, в отличие от одиночных энхансеров, способны изолировать контролируемый участок от влияния окружающего хроматина (Fraser 2006).

Энхансеры - двунаправленные элементы, их активность не зависит от ориентации по отношению к промотору (Banerji et al. 1983). Энхансер может стимулировать экспрессию гена, находясь в интроне данного гена. Изменение последовательностей, расположенных между энханссром и промотором не оказывает существенного влияния на активность энхансера. Однако если в эту последовательность ввести ТАТА-Ьох, транскрипция будет преимущественно инициироваться на нем (Grosschedl and Birnstiel 1980). У дрожжей элементы, аналогичные энхансерам, получили название UAS (upstream activating sequence). В отличиче от энхансеров высших эукариот, они могут функционировать только если расположены перед промотором, а расстояние до промотора при этом составляет не более 1 т.п.н. (Dobi and Winston 2007).

Экспрессия некоторых генов контролируется несколькими энхансерами. Особенно это характерно для генов, контролирующих сегментацию и развитие осевых структур. Например, экспрессия even-skipped в эмбрионах Drosophila контролируется пятью различными энхансерами, два из которых находятся с 5'-стороны от промотора, три - с 3' (Levine and Tjian 2003).

Многие энхансеры работают на значительных расстояниях: энхансеры гена Igf-2-Н19 у позвоночных, wing margin энхансер гена cut у Drosophila находятся на расстоянии около 100 т.п.н. от точки начала транскрипции. Энхансер гена Decapentaplegic Drosophila находится на таком же расстоянии, но после промотора (Levine and Tjian 2003). Остается непонятным: каким образом осуществляются подобные дальние взаимодействия.

Энхансеры практически не обладают видовой специфичностью. Так, в первых же экспериментах с энхансерами гистоновых генов морского ежа их активность была обнаружена при введении соответствующей ДНК в ооциты лягушки. В то же время многие энхансеры проявляют тканевую специфичность. Так, гены р-глобинов экспрессируются только в клетках эритроидного ряда, (Dean 2003), гены иммуноглобулинов - в В-лимфоцитах (Genetta et al. 1994). Тканеспецифичность экспрессии генов часто обусловлена составом комплекса TFIID, тканеспецифичными являются некоторые TAFs (например, TAFn105 входит в состав TFIID в В-лимфоцитах и половых клетках). Именно с различными TAF обычно взаимодействуют активаторы (Hochheimer and Tjian 2003). Нередко энхансер содержит элементы, отвечающие за восприятие сигналов (например, HRJE — heat shock response element, или SRE — sterol response element), либо подобные элементы находятся между энхансером и промотором.

Часть энхансеров обладает специфичностью по отношению к промотору активируемого гена. Учитывая способность энхансеров действовать на значительных расстояниях, очевидно существование механизмов, обеспечивающих необходимую специфичность действия энхансеров. В определенном генетическом контексте и в определенном типе клеток энхансер должен обладать наибольшим сродством лишь к одному из близко расположенных промоторов. Данное явление получило название «конкуренция промоторов» (promoter competition). Например, экспрессия морфогена hunchback определяется наличием у гена одного энхансера и нескольких промоторов, которые активны на разных этапах раннего развития эмбриона и специфичны по отношению к концентрации других морфогенов. В Р-глобиновом локусе курицы единственный энхансер связывается с промотором одного из нескольких генов на определенных стадиях развития организма (Levine and Tjian 2003). Каким же образом достигается подобная избирательность?

В обеспечении необходимой специфичности действия энхансеров задействованы различные механизмы. Часто энхансеры имеют сродство к определенному типу промоторов - TATA или DPE-содержащему. Хорошо изученным примером являются энхансеры Abd-B и АЕ1, избирательно активирующие гены Abdominal-B и fushi tarazu (ftz), соотвественно. Показано, что их специфичность обусловлена наличием у активируемого промотора канонической ТАТА-последовательности. В отсутствие поблизости ТАТА-содержащего промотора данные энхансеры могут активировать DPE-содержащий ген. Так, в модельной системе эти энхансеры предпочтительно активируют ТАТА-содержащий промотор гена eve, в то время как нарушение этой последовательности приводит к активации соседнего DPE-содержащего промотора гена white (Ohtsuki et al. 1998; Butler and Kadonaga 2001; Cai et al. 2001). Подобную специфичность могут обеспечивать активаторы. Например, GAL4-VP16 (см. ниже), а также активатор гена ftz предпочтительнее связываются с TATA-lnr-содержащими промоторами, нежели с содержащими только Inr. Иначе действует активатор Spl, эффективнее активирующий Inr-промоторы. Активатор Dorsal с равной эффективностью работает и на TATA и на DPE-содержащих промоторах (Emami et al. 1995). Дополнительный уровень регуляции обеспечивается альтернативными структурами комплекса TFIID, включающими различные ТВР-подобные факторы (TRF1, TRF2), которые обладают иной специфичностью по отношению к промотору и могут иначе взаимодействовать с активаторами (Berk 2000; Smale 2001). Активность энхансеров может зависеть от определенных тканеспецифичных транскрипционных факторов. Область действия инсуляторов ограничивается инсуляторами - последовательностями ДНК, обладающими энхансер-блокирующей активностью (de Laat and Grosveld 2003; Levine and Tjian 2003). Все это, видимо, обеспечивает достаточный уровень избирательности действия энхансеров по отношению к промотору.

2.2.1 Структура энхансеров

Типичный энхансер позвоночных - последовательность около 500 пн, которая содержит до 10 сайтов связывания транскрипционных факторов. Как правило, энхансеры содержат сайты связывания для тканеспецифичных факторов, обеспечивающих активность энхансеров только в определенных типах клеток (Levine and Tjian 2003).

Каждый из 72 пн-повторов энхансера вируса SV40 содержит в своем составе несколько консервативных последовательностей, которые выявлены также в составе некоторых других вирусных энхансеров. Повреждение таких последовательностей в составе повтора приводит к сильному ослаблению активирующих свойств. В то же время синтетический участок ДНК, содержащий 8 таких последовательностей эквивалентен по эффективности 72 пн-повтору (Herr and Clarke 1986). В составе еще более сложного энхансера вируса цитомегаловируса (рис. 1) выявлено три протяженных повтора. Каждый из них содержит по два 51 пн-повтора, которые, в свою очередь, имеют в структуре несколько 18 пн-повторов. Сложность вирусных энхансеров, по всей видимости, обеспечивает их высокую эффективность: многократно повторенные сайты связывания активаторов повышают вероятность взаимодействия как самих активаторов с энхансером, так и активаторов с транскрипционным комплексом (1ЭогзсЬ-Ная1ег е1 а1. 1985).

HCMV~19bp ♦ ♦

HCMV"l8bp" » * -«.► -» » » immediate

181 bp----► -»--p. early RNA

I " I . I I "' I ' I I "I —

-800 -700 -600 -500 -400 -300 -200 -100 »1 »

Рис. 1. Структура энхансера цигомегаловируса (no Dorsch-Hasler et al., 1985).

Характерной особенностью большинства энхансеров является их гиперчувствительность к ДНКазе I. Этот фермент обычно вносит в ДНК одноцепочечные разрывы, но в районе регуляторных последовательностей при обработке ДНКазой часто, возникают двуцепочечные разрывы. Явление повышенной чувствительности к ДНКазе в целом объясняется тем, что свободная от нуклсосом ДНК не защищена от нуклеаз. Повышенной чувствительностью часто обладают активно транскрибирующиеся последовательности. В районе энхансеров ДНК декондепсирована и с ней связываются многочисленные регуляторные белки, которые защищают ДНК от ДНКазы. По-видимому, между связанными с ДНК белками остаются короткие участки незащищенной ДНК. По-всей видимости, такие участки атакуются ДНКазой в первую очередь, происходит накопление одноцепочечных разрывов в разных цепях, что в итоге приводит к возникновению двуцепочечных разрывов (Dean 2003).

2.2.2 Р-глобиновый локус Многие исследования, посвященные изучению механизма функционирования энхансеров, проводятся на регуляторных элементах р-глобинового локуса позвоночных (рис. 2.). У человека данный локус протяженностью около 100 т.п.н. расположен на 11-й хромосоме и состоит из 5 генов, расположенных в том порядке (5'-3'), в котором они экспрессируются в ходе онтогенеза - s, °у5 Ау, 5, р. Этот же локус у кур организован иначе - гены эмбриональных р-глобинов р и £ расположены в начале и конце кластера, а гены, экспрессирующиеся у взрослых (ри, рА), - в середине. Весь локус обладает повышенной чувствительностью к ДНКазе I, по краям локуса, а также перед генами глобинов находятся сайты гиперчувствительности (HS). В 5'-области локуса находится регуляторный элемент - LCR, активирующий экспрессию одного из генов локуса, он содержит четыре сайта HS. Расстояние от LCR до промоторов глобиновых генов составляет у человека 6-60 т.п.н. Сайты HS по краям локуса относятся к области инсуляторов (см. ниже), ограничивающих область действия контролирующего региона и выполняющих барьерную функцию, изолируя локус от воздействия гетерохроматина (Tolhuis et al. 2002; Dean 2003).

-ппобиновый локус человека рис 2 Структура р.глобшшВОГО 3 2 | s Gy Ay

§ ß локуса у позвоночных (Dean, 2003, с -^ Г—;-' -/---изменениями)

10 kb

-глобиновый локус мыши LCR

ПП^т ßmaj ßmin

-глобиновый локус курицы

5'HSs ENH

4 з г 1 на.

I 4- 4 I Р ß Plf т ' У Г

10 kb

10 kb

2.3 Механизмы действия энхансеров

С момента открытия встал вопрос о механизме действия энхансеров. Наиболее простой вариант энхансера - последовательности UAS у дрожжей. С ними связывается активатор, непосредственно активирующий инициацию транскрипции на небольших дистанциях, при этом происходит выпетливание ДНК. Однако у высших эукариот расстояние между энхансером и контролируемым промотором часто составляет несколько десятков тысяч пар нуклеотидов, при этом энхансер в разных условиях может очень специфично активировать определенный ген. Все это заставляет думать, что в процессах взаимодействия энхансеров и промоторов задействованы значительно более сложные механизмы. Предполагаемые модели функционирования энхансеров можно разделить на две группы:

1) Контактные модели, предполагающие существование контакта энхансера с промотором (с образованием петли, рис. ЗА).

2) Неконтактные модели (рис. 3, B-D), описывающие действие энхансера на расстоянии от промотора. В данном случае энхансер чаще всего рассматривается как участок сборки преинициаторного транскрипционного комплекса, либо как участок, с

Mueller-Storm et al. 1989) или белковым мостиком. Так, было продемонстрировано, что искусственно внедренные сайты связывания белка GAGA, который способен к агрегации, способствуют взаимодействию энхансера и промотора как in eis, так и in trans (Mahmoudi et al. 2002). Аналогично данному и наблюдаемое in vivo явление «трансвекции» -способности к функциональной комплементации аллелей генов, находящихся на гомологичных хромосомах, при том, что одна из аллелей содержит поврежденный ген, а другая — поврежденные регуляторные последовательности. Данное явление было открыто для гена Ubx у Drosophila еще в 1954 году, позднее показано и для других генов (Wu and Morris 1999).

В пользу модели выпетливания говорит также тот факт, что одним энхансером может активироваться один из группы генов, как, например, в ß-глобиновом локусе. Возможность инициации транскрипции любого из последовательно расположенных генов в целом плохо объясняется неконтактными гипотезами, ведь в таком случае транскрипция должна инициироваться на наиболее близком промоторе.

Однако данные, непосредственно подтверждающие физическую сближенность энхансера и промотора, были получены лишь в последнее время. Один из методов, позволяющих оценить пространственную структуру хроматина в интересующем нас участке, получил название ЗС (chromosome conformation capture). Первая стадия данного метода - фиксация взаимного положения цепей ДНК путем образования ДНК-белковых сшивок в результате обработки формальдегидом. После фиксации ДНК подвергается гидролизу эндонуклеазами рестрикции с последующим лигированием, лигироваться могут разные цепи, близко расположенные в пространстве. Продукты лигирования анализируют методом real-time PCR. Присутствие продуктов сшивок между участками, удаленными друг от друга в нуклеотидной последовательности, говорит о том, что эти участки сближены в пространстве за счет изгиба цепи ДНК (Dekker et al. 2002). Другой метод, получивший название RNA TRAP (tagging and recovery of associated proteins), заключается в мечении биотином белков, находящихся в непосредственной близости от новосинтезирующейся мРНК, также после фиксации формальдегидом. После разрушения белковых комплексов и стадии аффинной очистки, методом real-time PCR,анализируют ДНК, связанную с данными белками. Выявление последовательностей энхансеров говорит о том, что они располагались поблизости от транскрипционного комплекса (Carter et al. 2002). Двумя независимыми группами исследователей данные методы были применены для анализа пространственной структуры ß-глобинового локуса. Полученные данные однозначно свидетельствуют о том, что регионы LCR и транскрибирующегося глобинового гена сближены в пространстве (Carter et al. 2002; Tolhuis et al. 2002).

В передаче сигнала от активаторов к компонентам транскрипционного аппарата участвуют особые белковые комплексы - «Медиаторы». В клетках человека обнаружено два основных Медиатора - CRSP (500-700 кДа) и ARC (2 МДа, другие названия - TRAP, DRIP, NAT). Комплекс CRSP является основным в активации транскрипции, функции комплекса ARC до конца не выяснены, он участвует в репрессии транскрипции. У дрожжей выявлен только один комплекс, имеющий слабую гомологию с человеческим CRSP (рис.4.).

Первые данные о белках, входящих в состав Медиатора, получены в генетических экспериментах на дрожжах. Была идентифицирована группа генов-супрессоров укороченного С-концевого домена РНК-полимеразы II - SRBs (Suppressor of RNA polymerase В). В дальнейшем в результате скрининга белков по способности активировать транскрипцию in vitro были идентифицированы другие компоненты Медиатора - белки Med, Galll, Sin4, Rox3 и другие. В состав CRSP входит около 20 субъединиц. Морфологически в составе Медиатора выделяют головной, средний и хвостовой домен. Большинство субъединиц участвуют во взаимодействии с различными активаторами, которые связываются непосредственно с энхансерами и другими регуляторными последовательностями. Так, у дрожжей с «кислыми» активаторами GCN4, VP 16 взаимодействует белок хвостового домена Galll, с GAL4 - SRB4 головного домена. Эксисримен гальные данные свидетельствуют о том, что взаимодействие Медиатора с РНК-полимеразой II происходит после формирования преинициаторного комплекса. Активация транскрипции осуществляется за счет взаимодействия с С-концевым доменом РНК-полимеразы, а также за счет повышения эффективности реинициации транскрипции (Lewis and Reinberg 2003; Kornberg 2005; Kornberg 2007).

Помимо этого, активаторы взаимодействуют с комплексами, отвечающими за деконденсацию хроматина - гистонцацетилтрансферазами (GCN5), комплексами ремоделирования хроматина (SWI/SNF). Как правило, привлечение данных факторов предшествует сборке преинициаторного комплекса на промоторе. В первую очередь осуществляется ацетилирование гистонов, затем деконденсация хроматина.

Некоторые энхансеры, расположенные поблизости от npowozopa (проксимальные энхансеры), по всей видимости, функционируют через образование «энхансеосомы» -крупной многобелковой структуры, способной к активации инициации транскрипции. Наиболее изученный пример - энхансер гена интерферона-ß. Он содержит сайты для связывания транскрипционных факторов c-jun, NF-кВ, HMG-белков. Единичные нуклеотидные замены приводят к полной инактивации энхансера, что говорит о том, что сформированный на энхансере комплекс является транскрипционно активным, при определенных условиях наблюдалась инициация транскрипции на участке между энхансером и промотором. Для р-глобинового локуса человека и некоторых других генов идентифицированы дополнительные сайты инициации транскрипции, расположенные на значительном расстоянии от основного промотора (Plant et al. 2001). Внедрение терминатора транскрипции в области между энхансером и промотором в р-глобиновом локусе приводит к нейтрализации активности энхансера HS-2 (Ling et al. 2004). С другой стороны, многочисленные исследования показывают, что LCR и промотор этого локуса сближены в пространстве. Скорее всего, имеют место оба этих механизма - РНК-полимераза движется вдоль ДНК, оставаясь связанной с областью энхансера, в результате чего происходит выпетливание ДНК («facilitated-tracking»-rnnoTe3a, рис. 5). Недавно для энхансеров гена простата-специфичного ашшена и р-глобинового локуса были получены данные, подтверждающие эту гипотезу (Wang et al. 2005; Zhu et al. 2007). В обоих случаях авторы наблюдали инициацию транскрипции на участке энхансер-промотор, с помощью метода ЗС идентифицировано образование хроматиновых сшивок, демонстрирующих сближенность энхансера и участков ДНК между энхансером и промотором.

Учитывая то, что энхансеры часто расположены на значительном расстоянии от промотора, можно предположить, что процесс миграции РНК-полимеразы имеет место при первичной инициации транскрипции (поскольку миграция для каждой новой молекулы РНК потребовала бы очень много времени). В дальнейшем близость энхансера со связанными с ним активаторами и ко-акгиваторами способствует сильному повышению эффективности реинициации транскрипции (Szutorisz et al. 2005). Это подтверждается также тем, что Медиатор эффективно активирует процесс реинициации (Lewis and Reinberg 2003). Тем не менее, эта модель не являеюя универсальной, поскольку плохо согласуется с данными о том, что многие энхансеры сохраняют функциональность при их размещении после гена или на другой молекуле ДНК. Скорее всего, лишь некоторые энхансер-промоторные взаимодействия реализуются таким способом. Данные, полученные в экспериментах с инсуляторами, также не однозначны. Эффект нейтрализации инсуляторами друг друга не согласуется с фактом миграции РНК-полимеразы, как и любых других факторов, от энхансера к промотору. С другой стороны, показано, что введение инсулятора HS4 между энхансером HS2 и промоторами генов в Р-глобиновом локусе резко уменьшает уровень межгенной транскрипции и сближенность энхансера с этими участками ДНК, что указывает именно на блокирование инсулятором миграции РНК-полимеразы вдоль цепи ДНК (Zhu et al. 2007). дальнейшего поддержания структуры он, по-видимому, не нужен (Lin et al. 2004; Chen et al. 2005).

3.3.4. Дальние взаимодействия в геноме прокариот.

Большинство прокариотических репрессоров (LacI, Aral) фунцкионирует через образование петли между своими сайтами связывания, окружающими регулируемый ген. Расстояние между этими сайтами редко превышает 600 пн. При этом выпетливание обычно опосредовано взаимодействием двух димеров репрессора с образованием тетрамера. Однако есть примеры дальних взаимодействий (до 5000 пн), опосредованных образованием октамера. Это репрессор deoR (Dandanell et al. 1987) и репрессор cl фага X (Revet et al. 1999). В обоих случаях репрессия на расстояниях 2500-4600 пн достигает 8-3-кратной по сравнению с 25-100-кратной репрессией на расстояниях до 1000 пн. Сходный уровень активации наблюдался в дрожжевой модельной системе при активации, опосредованной взаимодействием между сайтами связывания GAGA-фактора (Petrascheck et al. 2005). Геном прокариот не организован в хроматиновые структуры. Упаковка ДНК в нуклеосомы потенциально может сокращать расстояние между участками ДНК и способствовать установлению дальних взаимодействий. Действительно, было показано (Rubtsov et al. 2006), что сборка хроматина на ДНК in vitro способствует стимуляции транскрипции бактериальным энхансером NtrC до 50 раз. В аналогичной системе in vitro было показано, что тетрамер Lac-penpeccopa способен эффективно обеспечивать взаимодействие участков ДНК (2-5-кратная степень респрессии), содержащих его сашы связывания, на расстоянии 2500 пн, при условии, что они находятся на одной плазмиде . (Bondarenko et al. 2003). Теграмерная форма репрессора в данном случае является достаточной для поддержания установившихся взаимодействий, но имеет существенное преимущество перед димсром репрессора. Энхансер NtrC также способен взаимодействовать с целевым промотором in vitro на расстоянии 2500 пн, при эюм активация достигает 50-кратного уровня (Liu et al. 2001). Эти феномены объясняются большей вероятностью взаимодействия элементов на суперскрученной плазмидной ДНК в процессе скольжения нитей ДНК относительно друг друга.

4. Инсуляторы

Поскольку многие энхансеры не обладают достаточно высокой специфичностью по отношению к активируемому промотору, должны существовать регуляторные элементы, ограничивающие функционирование энхансеров для предотвращения нежелательной активации генов. Такие структуры были впервые обнаружены на границах области генов толкования данных, получае!Мых в экспериментах с инсуляторами. Поэтому важно рассматривать эти явления в совокупности.

Предложены разные механизмы блокирования инсуляторами энхансер-промоторных взаимодействий:

1) Инсуляторы участвуют в формировании доменов, только внутри которых возможно взаимодействие энхансера с промотором (структурные модели).

2) Инсулятор может напрямую взаимодействовать с энхансером или промоюром, блокируя их активность (транскрипционные модели).

Предложено несколько структурных моделей. Согласно наиболее популярной (модель «инсуляторных телец»), инсуляторы образуют крупные белковые комплексы и взаимодействуют с белками ядерной оболочки или ядерного матрикса, следствием чего является выпетливание участка ДНК между инсуляторами, образующиеся учасхки генома оказываются пространственно и функционально разобщенными. Кроме того, показана ассоциация основного инсуляторного белка позвоночных CTCF с белками ядерного матрикса, в первую очередь, с нуклеофосмином. Нуклеофосмин принимает участие в транспорте рибосомных субъединиц и гисюнов из цитоплазмы в ядро. При эгом нуклеофосмин и CTCF преимущественно локализуются на ядерной оболочке (Yusufzai and Felsenfeld 2004). Сближение активно транскрибирующихся деконденсированных областей хроматина и оболочки ядра кажется функционально оправданным - таким образом облегчается экспорт новосинтезированной мРПК в цитоплазму. Однако связь функционирования инсуляторов со способностью формировать видимые компартменты в ядре так и не была продемонстрирована, что послужило основой для критики! данной модели (Golovnin et al. 2008). Кроме того, эга модель скорее предлагает неспецифическое взаимодействие между элементами (Gerasimova et al. 2007), в то время как инсуляторы взаимодействуют высокоспецифично (см.ниже). Согласно другой модели инсуляторы участвуют в образовании высокоуровневых структур хроматина. Эта модель была предложена на основе данных о том, что инсуляторы ses и ses' предпочтительно локализуются на границах дисков и пуфов политенных хромосом. Особая структура хроматина в данном случае образуется, вероятно, за счет взаимодейс!вия между инсуляторами (Gaszner et al. 1999). С данной моделью не согласуется способность инсулятора ses к блокированию взаимодействия энхансера и промотора, расположенных на разных кольцах катенанов (Krebs and Dunaway 1998). Впоследствии при более тщательном изучении было показано, что инсуляторы ses и ses ' не участвуют в образовании дисков и пуфов и, как правило, локализуются внутри дисков (Kuhn et al. 2004).

Возможно, инсуляторы участвуют в регуляции элонгации траскрипции, либо представляют собой криптические промоторы, так, многие из них способны привлекать РНК-полимеразные комплексы, которые скапливаются на инсуляторах в «остановленном» (stalled) состоянии. Есть данные, что такие комплексы сами по себе обладают энхансер-блокирующей активностью (Chopra et al. 2009). Показано, что инсуляторный белок млекопитающих CTCF напрямую взаимодействует с большой субъединицей РНК-полимеразы II (Chemukhin et al. 2007). Для проявления активности инсуляторов Fab7 и Fab8 необходимы негативные факторы элонгации транскрипции NELF и DSIF (Chopra et al. 2009). Эти факторы в геноме часто колокализаются с комплексами РНК-полимеразы II в состоянии паузы (Lee et al. 2008).

Известно, что блокирование энхансера возможно лишь в том случае, если инсулятор располагается между энхансером и промотором, при этом не происходит нарушения свойств энхансера, который сохраняет способность активировать другой промотор (Cai et al. 2001). Эти данные хорошо объясняются структурными моделями. Однако остается неясным, каким образом инсуляторы препятствуют взаимодействию регуляторных элементов соседних доменов. промотора в пространстве. Таким образом, еще раз подтверждается точка зрения о том, что энхансер и промотор (по крайней мере, в случае гена yellow) непосредственно взаимодействуют друг с другом.

Попарное взаимодействие инсуляторов приводит к усилению, либо нейтрализации их энхансер-блокирующей активности, в зависимости от взаимной ориентации. По всей видимости, взаимодействие происходит за счет ДНК-связывающих инсуляторных белков, поскольку оно очень специфично, такие универсальные компоненты как СР190 не смогли бы обеспечить наблюдаемый уровень избирательности (Muravyova et al. 2001; Kyrchanova et al. 2008).

По всей видимости, эти же модели применимы для объяснения второй функциональной активности инсуляторов - блокированию распространения хроматина. Активность Polycomb-зависимых сайленсеров (PRE) также во многом определяется пространственной структурой прилегающего хроматина, известно, что эти элементы также способны взаимодействовать друг с другом на больших дистанциях (Bantignies et al. 2011), и даже в случае, если они находятся на разных хромосомах (Schmitt et al. 2005).

4.1.Инсуляторы Drosophila melanogaster

Остановимся подробнее на структуре наиболее хорошо изученных инсуляторов Drosophila melanogaster.

4.1.1. Gypsy

Этот инсулятор был изначально обнаружен в ретротранспозоне gypsy Drosophila melanogaster. Он имеет длину в 350 п.н. и располагается в 5'-нетранслируемом районе gypsy перед началом открытой рамки считывания gag. Инсерции gypsy в некодирующие области генов часто приводят к появлению мутантного фенотипа из-за нарушения активирующего эффекта энхансеров этих генов. Инсулятор содержит 12 повторов 26-нуклеотидной последовательности, являющейся сайтом связывания белка Supressor of Hairy-Wing (далее Su(Hw)), необходимым для его работы. Сила эффекта зависит от количества сайтов связывания Su(Hw): одиночные сайты практически нефункциональны. В районе инсулятора локализуются сайты гиперчувствительности к ДНКазе1, что указывает на особенную структуру хроматина (Gerasimova and Corees 2001). Известны и эндогенные инсуляторы, активность которых связана с белком Su(Hw) (Parnell et al. 2003).

4.1.2.Scs/scs'

Scs/scs' — первые описанные инсуляторы Drosophila. Они расположены на границах домена генов теплового шока 87А7 локуса. Было установлено, что с последовательное 1ью 24 пн в составе ses связывается белок Zw5, изолированные сайты связывания также обладают энхансер-блокирующей активностью (Gaszner et al. 1999). С последовательностью ses' связывается белок BEAF-32 (Zhao et al. 1995). Сайты связывания BEAF-32 также были выявлены на многих границах «бэндов» на политенных хромосомах (Hart et al. 1997). Показано, что белки Zw5 и BEAF-32 взаимодействуют, что важно для изоляции локуса генов теплового шока (Blanton et al. 2003).

4.1.3. Инсуляторы регуляторной области гена Abdominal-B

Гены комплекса bithorax: Ultrabithorax, Abdominal-A, Abdominal-B экспрессируются парасегмент-специфично. Специфичность экспрессии обеспечивает протяженный регуляторный район (около 300 т.п.н.). Наиболее хорошо исследована регуляция экспрессии гена Abdominal-B. Его экспрессия контролируется парасегмент-специфичными энхансерами, расположенными последовательно: iab-8, iab-7, iab-6 и т.п. Каждый энхансер активируется только в соответствующем парасегменте на ранних стадиях эмбрионального развития. В последующем статус экспрессии поддерживается за счет белков Polycomb/Trithorax. Необходимую специфичность взаимодействия обеспечивают границы - инсуляторы, расположенные между энхансерами. Было описано несколько таких участков: Fab-8, Fab-7, Fab-6, Мер. Делеция этих инсуляторов приводит к нарушению избирательности функционирования энхансеров. Интересно, что обычно они располагаются в непосредственной близости от районов связывания белков группы Polycomb (PRE). Очевидно, что в контексте регуляторного района Abd-B активность этих инсуляторов подвержена регуляции: так, нижележащие инсуляторы не препятствуют работе вышележащих энхансеров. Позднее было выяснено, что данные граничные элементы сами по себе могут опосредовать энхансер-промоторную коммуникацию, связываясь с промоторной областью гена Abd-B (Kyrchanova et al. 2008). В активности инсуляторов регуляторной области Abd-B принимают участие различные белки. Так, для функционирования МСР и Fab8 необходим dCTCF (Mohan et al. 2007). Помимо него, в работе МСР и Fab-7 принимает участие GAGA-фактор (Busturia et al. 2001; Schweinsberg et al. 2004). По всей видимости, многие белковые компоненты, отвечающие за работу этих инсуляторов до сих пор не идентифицированы.

N-конце имеет ZAD-домеи (Zinc Finger Associated) с неясной функцией, возможно отвечающий за димеризацию, как и охарактеризованный ZAD-домен белка Grauzone (Jauch et al. 2003). Su(Hw) в С-концевом домене имеет несколько консервативных среди Drosophila участков, два из них, а также мотив «лейциновая молния» важны для взаимодействия с Mod(mdg4) и проявления энхансер-блокирующей активности (Harrison et al. 1993; Gdula and Corees 1997; Ghosh 2001). N-концевой домен не существенен для функционирования Su(Hw) (Harrison et al. 1993).

Важно, что dCTCF, Su(Hw) и Zw5 способны эффективно опосредовать взаимодействие на расстоянии 5000 пн между участками ДНК, содержащими мультиплицированные изолированные сайты связывания данных белков (Kyrchanova et al. 2008). При этом изолированные сайты связывания dCTCF и Zw5 не обладают инсуляторной активностью , в отличие от сайтов связывания Su(IIw), являющихся сильным инсулятором (Scott et al. 1999).

CTCF - консервативный у высших многоклеточных, единственный известный у млекопитающих инсуляторный белок (Bell et al. 1999; Moon et al. 2005). Доменная структура CTCF слабо изучена. Показано, что N- и С- концевые домены белка CTCF млекопитающих неструктурированы (Martinez and Miranda 2010). Для белка CTCF млекопитающих продемонстрированы вышеупомянутые способности взаимодействовать с белком ядерных РНП YB-1 посредством домена «цинковых пальцев», с большой субъединицей РНК-полимеразы II при помощи С-концевого домена (Chernukhin et al. 2000; Chernukhin et al. 2007), а также с ВТВ-содержащим транскрипционным фактором Kaiso (Defossez et al. 2005). Взаимодействие CTCF с Kaiso приводит к ослаблению энхансер-блокирующей активности. Известны многочисленные примеры участия CTCF млекопитающих в формировании контактов между удаленными участками хромосом (Phillips and Corees 2009). Молекулярный механизм данной активности остается неясным. Показано, что CTCF способен димеризоваться, имеются данные, что для этого важно взаимодействие С-концевого домена белка с доменом «цинковых пальцев» (Pant et al. 2004; Yusufzai and Felsenfeld 2004). CTCF Drosophila эффективно сближает свои сайты связывания, способствуя энхансер-промоторной коммуникации (Kyrchanova et al. 2008). Важную роль в установлении контактов между удаленными участками хромосом может играть взаимодействие с компонентами транскрипционного комплекса - TAF3 и РНК-полимеразой II (Chernukhin et al. 2007; Liu et al. 2011). Данное взаимодействие интересно с точки зрения различных гипотез функционирования инсуляторов. Гипотеза «ловушки энхансера» находит подтверждение в свете потенциальных взаимодействий CTCF с транскрипционными комплексами, которые привлекают активаторы, связывающиеся с знхансерами. По аналогии CTCF может взаимодействовать с транскрипционными комплексами, собирающимися на промоторах, что может объяснять сайленсерный эффект некоторых CTCF-содержащих элементов (Klochkov et al. 2006). С другой стороны, известно, что CTCF Drosophila не способен взаимодействовать с промоторами генов yellow и white, способствуя активации этих промоторов ОАЬ4-активатором (Erokhin et al. 2011). С точки зрения «ГасШ1а1ес1-1гаск

§»-модели установления дальних взаимодействий РНК-полимераза может являться «молекулярным мотором», обеспечивающим выпетливание протяженных участков ДНК. В пользу этого предположения говорит также интенсивная межгенная транскрипция, наблюдаемая в регуляторных областях генов, подверженных строгому тканеспецифичному контролю экспрессии на разных стадиях развития (Вае et al. 2002). Важную роль в поддержании петельных структур ДНК, очевидно, играет когезиновый комплекс, участвующий также в когезии сестринских хроматид. Недавно была продемонстрирована способность CTCF напрямую взаимодействовать с 8А2-субъединицей когезина, что важно для проявления инсуляторной активности CTCF (Xiao et al. 2011).

BEAF

BEAF-32 (Boundary element associated factor) был идентифицирован как ДНК-связывающий компонент инсулятора ses'. Сайты связывания BEAF-32 обладают энхансер-блокирующей активностью, но только в геномном контексте (Zhao et al. 1995). Для BEAF-32 характерна ассоциация с границами «бэндов» на политенных хромосомах (Blanton et al. 2003). В структуре BEAF-32 выявлен N-концевой ДНК-связывающий домен, который имеет сходство с «лейциновой молнией», С-концевой домен этого белка обеспечивает кооперативность связывания (Hart et al. 1997). BEAF-32 взаимодействует с белком Zw5, связывающим инсулятор ses, это взаимодействие необходимо для формирования изолированного хроматинового домена (Blanton et al. 2003). Сайты связывания BEAF-32 в геноме в большой степени перекрываются с сайтами связывания CP 190 (Bushey et al. 2009).

С ДНК-связывающим инсуляторным белком взаимодействуют другие белки, участвующие в функционировании инсуляторов. Так, белок Su(Hw) напрямую взаимодействует с белком Mod(mdg)4. Это взаимодействие критично для проявления инсуляторной активности (Ghosh 2001). Еще один компонент инсуляторных комплексов -цеитросомальный белок CP 190. Показано, что он соосаждается с белками CTCF, Zw5, между геномными элементами за счет специфических белок-белковых взаимодействий. Остановимся на нем подробнее.

GAGA-фактор Drosophila melanogaster

В проксимальной части промоторов некоторых генов Drosophila melanogaster (Ultrabithorax, Hsp70, fushi-tarazu, Hsp26, even-skipped и др.) находятся последовательности, обогащенные GAGA-участками. При помощи ДНК-аффинной хроматографии было показано, что с этими последовательностями связывается белок GAGA (Soeller et al. 1993). Было установлено, что GAGA-фактор кодирует ранее описанный ген trilhorax-like, мутации в котором вызывают снижение экспрессии гена Ultrabithorax и аномалии в развитии задних сегментов брюшка (Farkas et al. 1994). Показано, что связывание GAGA-фактора приводит к локальному АТФ-зависимому ремоделированию хроматина с образованием сайта гиперчувствительности к ДНКазе I (Tsukiyama et al. 1994). Впоследствии было установлено, что GAGA-фактор взаимодействует с фактором ремоделирования хроматина NURF301 (Xiao et al. 2001) и белковым комплексом FACT (FAcilitated Chromatin Transcription), необходимым для эффективной транскрипции ДНК, упакованной в хроматин (Shimojima 2003). Недавно получены данные о том, что GAGA-фактор необходим для быстрого ремоделирования хроматина в локусе Hsp70 при повышении температуры, в то же время удаление NURF301 и FACT слабо влияет на этот процесс (Petesch and Lis 2008). Очевидно, что GAGA-фактор участвует в регуляции элонгации транскрипции, так было показано, что он необходим для формирования «остановленного» (stalled) комплекса РНК-полимеразы II и часто совместно с NELF локализуется с такими комплексами в геноме (Lee et al. 1992; Lee et al. 2008).

GAGA-фактор специфично связывается с последовательностью GAGAG с помощью домена «цинковый палец» С2Н2-типа, фланкированного положительно заряженными участками, что обеспечивает высокую стабильность связывания (Pedone et al. 1996; Omichinski et al. 1997). Дополнительная специфичность связывания, возможно, обеспечивается способностью GAGA к мультимеризации, благодаря чему он более эффективно связывается с участками, содержащими многочисленные GAGAG-сайты (Espinas et al. 1999; Katsani et al. 1999).

На N-конце GAGA-факгора находится ВТВ-домен, основными функциями которого являются мультимеризация и белок-белковые взаимодействия. Показано, что GAGA-фактор in vitro и in vivo является мультимером, при этом производное, лишенное ВТВ-домена, в определенных условиях не способно к мультимеризации (Espinas et al. 1999; Katsani et al. 1999; Wilkins and Lis 1999). ВТВ-домен GAGA-фактора необходим для амилоидоподобные структуры (Agianian et al. 1999). Однако функциональная значимость этих функций остается неясной.

4.3 Мультимеризующие домены в структуре 1ранскрппционных факторов

Многие транскрипционные факторы, в том числе инсуляторные белки, наряду с ДНК-связывающим имеют домен, отвечающий за мультимеризацию и белок-белковые взаимодействия. Наиболее распространенные типы таких доменов - ВТВ, специфичные для позвоночных SCAN и KRAB, а также ZAD-домен, обнаруженный в структуре транскрипционных факторов беспозвоночных. При этом KRAB-домен является мономером и отвечает за взаимодействие с корепрессором КАР1 (Peng et al. 2000; Peng et al. 2007). Домены типа «цинковые пальцы» также могут участвовать в селективной димеризации (McCarty et al. 2003). Показано, что мультимеризующие домены в составе транскрипционных факторов необходимы для обеспечения кооперативности связывания (Payre et al. 1997; Katsani et al. 1999), помимо этого, возможно, избирательная мультимеризация может быть важна для поддержания дальних взаимодействий в геноме.

ВТВ-домен

ВТВ (Bric-a-brack, Tramtrack and Broad complex) - широко распространенный у эукариот домен белок-белкового взаимодействия. В геноме человека идентифицировано 183 ВТВ-содержащих белка, в геноме Drosophila - 85. ВТВ-содержащие белки можно разделить на 4 группы на основании присутствия других функциональных доменов и соответствующих структурных особенностей ВТВ-доменов. Первую группу составляют белки калиевых каналов (TI-Kv), для этих ВТВ-доменов характерно образование 'I етрамеров. Вторая группа представлена белками, контролирующими элонгацию транскрипции (семейство ElonginC), для ВТВ-доменов в составе этих белков характерно отсутствие последней а-спирали (см. ниже), они опосредуют взаимодействие других компонентов комплекса - ElonginB и Cull. Сходную функцию выполняют ВТВ-домены в составе белков семейства Skpl - они выполняют роль белкового мостика между Skpl и Си12 (ЕЗ-убиквитин лигазы). ВТВ-домены этих двух семейств опосредуют взаимодействие других белков между собой, но лишены способности к взаимодействию между собой. Последнюю, наиболее крупную группу белков составляют ВТВ-домены, имеющие дополнительную N-концевую а-спираль, способные к образованию мультимеров разного порядка. Большинство белков, содержащих ВТВ-домен такого типа

- транскрипционные факторы. Особое место среди них занимают транскрипционные факторы, связывающие ДНК с помощью «цинковых пальцев», у Drosophila выявлено 15 таких белков, у человека - 43. Кроме транскрипционных факторов ВТВ-домены сходной архитектуры представлены в белках BTB-Kelch, участвующих в разных внутриклеточных процессах, в основном связанных с передачей сигналов, а также межклеточные взаимодействия (Stogios et al. 2005; Perez-Torrado et al. 2006). Некоторые белки состоят только из одного ВТВ-домена такого типа, например, Batman у Drosophila (Faucheux et al. 2003). Именно ВТВ-домены последнего типа имеют многие белки, участвующие в регуляции транскрипции и энхансер-промоторных взаимодействиях, поэтому остановимся на них наиболее подробно.

Известно несколько кристаллических структур ВТВ-доменов в составе транскрипционных факторов - PLZF, LRF, BCL6, Mizl, Bachl (рис.9, (Ahmad et al. 1998; Ahmad et al. 2003; Stead et al. 2007; Stogios et al. 2007; Ito et al. 2009)). Все они демонстрируют большое сходство по структуре и образуют гомодимеры, которые кроме того могут взаимодействовать между собой в случае PLZF и Mizl. В димеризации ВТВ-доменов ключевую роль играет взаимодействие протяженных гидрофобных а-спиралей al, которое стабилизируется шпильками а2- аЗ. Кроме того, взаимодействуют N- и С-концевые ß-участки (ßl одной молекулы и ß5 другой), образуя антипараллсльные ß-слои. Это взаимодействие критично для димеризации некоторых ВТВ-доменов, например, Bachl (Ito et al. 2009). связывающего домена глутатион S-трансферазы. Белок, слитый с таким доменом, можно выделять на глутатион-сефарозе и использовать для GST pull-down. Также между GST и сайтом встраивания последовательности белка закодирована аминокислотная последовательность для разрезания тромбином.

Плазмида pMAL-c5X (производства New England Biolabs) позволяет экспрессировать в клетках Е. coli белки, слитые с мальтозасвязывающим белком (МВР). Это позволяет увеличить растворимость белка, что дает возможность выделить большее количество белка. Также МВР может способствовать более правильному сворачиванию белка. Между МВР и сайтом встраивания последовательности белка закодирована аминокислотная последовательность для разрезания протеиназой фактором Ха. В состав pMAL также входят ген устойчивости к ампициллину и промотор под контролем 1 ас-оператора.

Плазмида рАс5.1 (производства Invitrogen) использовалась для экспрессии белков в культуре S2 клеток D. melanogaster. Для этого в плазмиде имеется промотор гена-актина. Последовательность белка слита с FLAG-пептидом.

Плазмида pCasper2 содержит 5'- и 3' — концевые области Р-элемента Drosophilci:, melanogaster. Используется для получения трансгенных линий Drosophila. pGAD24 и pGBT9 (Clontech) использовались в дрожжевой двугибридной системе (см. ниже).

Ферменты

В работе использовали эндонуклеазы рестрикции, ДНК-лигазу бактериофага Т4, РНКазу A, Pfu ДНК-полимеразу, ДНКазу I, MuMLV обратную транскриптазу, Фрагмент Кленова ДНК-полимеразы I, щелочную фосфатазу (производства Fermentas), Taq-полимеразу (производства Силекс), биотинилированый тромбин (производства Novagen). Для работы с ферментами применяли стандартные буферы и протоколы.

Реактивы

Для работы применяли реактивы, произведенные компаниями Amresco, Sigma, Applichem, Amersham, Serva.

Олигонуклеотиды

В работе были использованы олигонуклеотиды производства компании Литех.

Олигонуклеотиды, использованные для ПЦР в реальном времени: tub 5'-GCTTTCCCAAGAAGCTCATACA-3', 5'-GGTTCAGTGCGGTATTATCCAG-3' rpl32 5'-GTTCGATCCGTAACCGATGT-3', 5 '-CC AGTCGGATCG AT ATGCT AA-3' буфера на 200-500 мл среды, в которой росли клетки, состав буфера см. ниже). Добавляли ингибиторы протеаз: ІмМ PMSF и 1:1000 Calbiochem Cocktail VII.

Клетки разрушали ультразвуком с постепенным увеличением мощности. Центрифугировали на 20000g 40 минут. Супернатант наносили на колонку.

Колонку перед использованием уравновешивали 10 объемами стартового буфера (объем колонки 1-2 мл). После нанесения промывали колонку 10 объемами стартового буфера. Белок с колонки смывали 5 объемами элюирующего буфера. После нанесения буфера ток через колонку перекрывали, выдерживали 5 минут и собирали 4-5 фракций по 0,75-1 мл.

Аффинная хроматография белков с 6xHIS-tag

Для белков, содержащих 6xHIS-tag, применяли Ni-NTA-сефарозу (Invitrogen) в качестве носителя. Стартовый буфер содержал 50 мМ Tris-HCl рН 8,0 либо 50мМ HEPES-КОН, рН 7,6, 500 мМ NaCI, 20 мМ имидазол рН 8,0, 1-5 мМ В-меркаптоэтанол, 1 мМ PMSF, 0,1 мМ ZnCI2. Элюцию проводили таким же буфером, но содержащим 300 мМ имидазол.

Аффинная хроматография белков с GST-lag

Носителем служит глутатион-ссфароза (Pierce). Стартовый буфер - PBS (1,7мМ КН2Р04, 5,2мМ Na2HP04, 150мМ NaCI) либо - 20 мМ HEPES-KOH, рН 7,6, 150 мМ NaCI, 5 мМ MgCl2, 100 мкМ ZnCl2, 10% глицерол, 0,1% NP-40, 1 мМ PMSF, 1 мМ DTT, 1:1000 Calbiochem Cocktail VII. с добавлением 0,1 мМ ZnCI2. Элюирующий буфер - 50 мМ Tris, 30 мМ глутатион рН 8,0. . '

Аффинная хроматография белков с MBP-tag

Носителем служит иммобилизованная амилоза (New England Biolabs). Стартовый буфер - 20 мМ HEPES-KOH, рН 7,6, 200 мМ NaCI, 5 мМ MgCl2, 100 мкМ ZnCl2, 10% глицерол, 0,1% NP-40, 1 мМ PMSF, 1 мМ DTT, 1:1000 Calbiochem Cocktail VII. Если белок связывает цинк, добавляли 0,1 мМ ZnCI2. Элюирующий буфер - 20 мМ HEPES-KOH, рН 7,6, 200 мМ NaCI, 0,1 мМ ZnCl2, 10 мМ мальтоза, 1-5 мМ В-меркаптоэтанол.

Отрезание эпитопа, использованного для аффинной очитки, при помощи тромбина.

Белок, иммобилизованный на аффинном носителе, уравновешивали в буфере 20 мМ HEPES-KOH, рН 7.7; 150 мМ NaCI, 20 мМ имидазол, 2.5 мМ СаС12, 1 мМ В-меркаптоэтанол. Добавляли биотинилированный тромбин (Novagen) до концентрации lU/мл и инкубировали в течение ночи при 20°С. Препарат очищали от тромбина путем инкубации со стрептавидин-агарозой (Pierce) в течение 10 минут.

Ренатурация белков из телец включения

Осадок, содержащий тельца включения, полученный после центрифугирования разрушенных ультразвуком клеток, ресуспендировали в буфере для растворения 50 мМ HEPES-KOH, рН 7,6, 6М гуанидин-гидрохлорид, 50 мМ DTT. Суспензию гомогенизировали с помощью ультразвука и выдерживали при 75 °С в течение 30 мин. Центрифугировали при 16000g 20 мин. Полученный супернатант при интенсивном помешивании медленно добавляли к 50-кратному объему буфера для ренатурации 50 мМ HEPES-KOH, рН 7,6, 200 мМ NaCl, 1М NDSB-201. Центрифугировали при 5000g 10 мин., супернатант инкубировали в течение ночи при +4°С. Центрифугировали при 5000g 10 мин., диализовали дважды по 2 часа против 20-кратного объема буфера 50 мМ HEPES-KOH, рН 7,6, 200 мМ NaCl, 1 мМ DTT, 10% глицерин. Центрифугировали при 20000g 30 мин. Использовали полученный препарат непосредственно в последующих экспериментах, либо дополнительно очищали при помощи гель-фильтрации и катионообменной хроматографии.

Гель-фильтрация

Раствор белка наносили на предварительно откалиброванную колонку с носителем Sephacryl S-200 или Sephacryl S-300 16/60 (производства GE Healthcare). Использовали 20 мМ Na-фосфатный буфер рН 7,4, содержащий 400 мМ NaCl и 5мМ р-меркаптоэтанол. Собирали исключенный объем - 50 мл и фракции по 2,5 мл.

Колонку калибровали с использованием следующих стандартов: 660 кДа (тироглобулин), 158 кДа (альдолаза), 75 кДа (овальбумин) и 43 кДа (кональбумин). Пики элюции этих белков приходятся, соответственно, на 2, 5, 8 и 10 фракции для колонки с Sephacryl S-200. Для колонки с Sephacryl S-300 пики элюции соответствуют 660 кДа - 4 фракция, 158 кДа- 10, 75 кДа- 13.

Концентрирование белков при помощи ТХУ

После гель-фильтрации белки концентрировали при помощи трихлоруксусной кислоты (ТХУ). Для этого 0,5 мл раствора белка из каждой фракции смешивали с равным объемом 50% ТХУ. Перемешивали, выдерживали при - 20°С в течение 20 минут и центрифугировали на 13200 об/мин 15 минут при 4°С. Супернатант тщательно удаляли фильтровальной бумагой. Осадок растворяли в 1х щелочном буфере для белкового электрофореза (0,2 М Tris, 2% SDS, 25 мМ р-меркаптоэтанол, 10% глицерин, 0,05% бромфеноловый синий).

Ионообменная хроматография

Препарат белка или клеточный лизат с концентрацией белка около 1 мг/мл наносили на предварительно уравновешенную колонку (10/20, GE HealthCare) с соответствующим носителем (Q-Sepharose, SP-Sepharose либо Heparin-Sepharose) при скорости потока 1 мл/мин в буфере 20 мМ IIEPES-KOH, рН 7,6, 150 мМ NaCl, 12,5 мМ MgCl2, 100 мкМ ZnCl2, 10% глицерол, 1 мМ PMSF, 1 мМ DTT. Промывали 10-кратным объемом буфера, элюировали градиентом концентрации NaCl от 0,15 до 1М, собирали фракции по 1 мл. Фракции исходного раствора и проскока концентрировали ТХУ.

Получение и очистка антител

Антитела к GAF (полноразмерный белок, изоформа 519), CTCF (фрагмент 610818), CP 190 (фрагмент 308-1096), CG7928 (фрагмент 1-254), Pita (фрагмент 554-683) были получены в крысах Ф.А. Бровко (филиал Учреждения Российской академии наук Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, г. Пущино). Антитела к Su(IIw) (фрагмент 1-233) и Mod(mdg4)67.2 (фрагмент 402611) были получены в кроликах А.К.Головниным (лаб. молекулярной генетики Drosophila, Институт биологии гена РАН). Фракция иммуноглобулинов была выделена из сыворотки после осаждения сульфатом аммония при помощи Pierce Melon Gel IgG Purification Kit по стандартной методике. Иммуноглобулины концентрировали с помощью ультрафильтрации на фильтрах Millipore Amicon, добавляли глицерин до 50% и хранили при -20°С. Антитела, полученные в кроликах, а также антитела к Pita были дополнительно аффинно очищены. Для эюго антиген иммобилизовали на CNBr-активированной сефарозе (GE HealthCare) согласно рекомендациям производителя, инкубировали с фракцией иммуноглобулинов сьівороіки, после отмывки при помощи PBS элюировали Глицин-HCl, рН 2.7, диализовали против PBS. Кроме эюго, в работе использованы мышиные антитела к РНК-полимеразе II (Abeam), МВР (New England Biolabs), 6xHis (GE Healthcare), CTCF (фрагмент 1-125, получены в лаб. R.Renkawitz, Гессен, Германия).

Трансформация S2 клеток D. melanogaster

Трансформацию S2 клеток D melanogaster проводили с помощью реагента Cellfectin II (производства Invitrogen) по стандартному протоколу.

Получение лизата S2 клеток D melanogaster

S2 клетки выращивали на среде SFX (НуСІопе). На сіадии монослоя клетки смывали с чашки, осаждали при 700 g в течение 3 минут, дважды промывали PBS-буфером.

Получение ядерного и цитоплазматического лизата S2 клеток D.melanogaster

Осадок клеток ресуспендировали в 2 мл IP-S (10 мМ Tris-HCl рН 8,0, 10 мМ NaCl, 10 мМ MgCl2, 1мМ EDTA, 1 мМ EGTA, 1 мМ DTT, 250 мМ сахароза, 1 мМ PMSF, 0,2% NP-40, Calbiochem Cocktail V) буфера. Инкубировали на льду 10 минут. Ресуспендировали с помощью гомогенизатора Dounce (поршень tight) 15-20 раз. Центрифугировали 3000 g при 4°С в течение 15 минут. Цитоплазматический лизат в супернатанте, фракция ядер в осадке.

К осадку ядер добавляли 0,5 мл IP-10+ (10 мМ Tris-HCl рН 8,0, 10 мМ NaCl, 10 мМ MgCl2, 1мМ EDTA, 1 мМ EGTA, 1 мМ DTT, 10% глицерол, 0,1% NP-40) буфера, ресуспендировали. Добавляли равный объем IP-850+ (10 мМ Tris-HCl рН 8,0, 850 мМ NaCl, 10 мМ MgCl2, 1мМ EDTA, ГмМ EGTA, 1 мМ DTT, 10% глицерол, 0,1% NP-40) буфера. В течение 10 минут на льду проводили солевой лизис ядер, разводили в 3 раза 1Р-0+ (10 мМ Tris-HCl рН 8,0, 10 мМ MgCl2, 1мМ EDTA, 1 мМ EGTA, 1 мМ DTT, 10% глицерол, 0,1% NP-40) буфером. После этого добавляли ДПКазу I, инкубировали 10 минут на ротаторе при комнатной температуре. Центрифугировали 16000 g 15 минут при 4°С. Полученный ядерный лизат использовали для дальнейшей работы.

Получение белкового экстракта D.melanogaster

Собирали по 20 мух каждой линии, хранили их' при -70°С. Для выделения растирали пестиком на льду, добавляли 200 мкл PBS, PMSF до 2 м'М и 1:1000 Calbiochem Cocktail V. Озвучивали 2 раза по 5 секунд с интервалом 30 сек. Добавляли 200 мкл буфер для белкового электрофореза с SDS, кипятили на водяной бане 5 минут. , Центрифугировали 13200 об/мин 5 минут. Супернатант отбирали и анализировали с помощью гель-электрофореза.

Биохимические методы исследования белков in vitro

Химическая сшивка белков

Сшивку белков проводили в буфере, не содержащем первичных аминогрупп. Для этого использовали PBS или HEPES-KOH. Если белок был растворен в Tris-HCl, то . предварительно проводили диализ против необходимого буфера. Белок разводили до концентрации 5-10 мкМ. К белкам добавляли глютаральдегид в концентрации от 0,005% до 0,1%. После добавления глютаральдегида пробы инкубировали при комнатной температуре 10 минут. Реакцию останавливали добавлением глицина до 50 мМ, инкубировали при комнатной температуре в течение 15 минут и добавляли буфер для SDS-электрофореза. Продукты сшивки анализировали при помощи полиакриламидного гель-электрофореза с градиентом концентрации акриламида 5-12% с последующей окраской серебром либо анализом посредством вестерн-блоттинга.

Ограниченный протеолиз

Образцы белка с концентрацией 0,5 мг/мл инкубировали с Трипсином (Sigma), либо Протеиназой К (Invitrogen) в концентрации 0,2-100 мкг/мл в течение 10 мин. После этого добавляли PMSF до концентрации 10 мМ и инкубировали в течение 10 мин, после чего добавляли денатурирующий буфер для нанесения на гель-электрофорез. После окраски Кумасси гель тщательно отмывали водой, вырезали фрагменты геля и анализировали при помощи MALDI-TOF масс-спектрометрии. Анализ проводился в ЦКП «Протеом человека» Института биомедицинской химии И.Ю. Торопыгиным.

Метод задержки в геле (EMSА)

Реакцию мечения рестриктных фрагментов ДНК проводили при помощи фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I по стандартному протоколу с использованием a32[P]-dATP вместо dATP. Белок инкубировали с меченой ДНК в буфере 25 мМ HEPES-KOH, рН 7.6, 100 мМ NaCl, 0.1 мМ ZnCl2, 0.05% NP40, 1 мМ DTT, 5% глицерин, и 50 нг/мкл poly[dI-dC] при 25°С, 30 мин и анализировали в 0.5хТВЕ в 1% агарозном геле с последующей радиоаві ографией.

GST/MBP pull-down

Для проведения GST pull-down экспрессировали белок, слитый с GST, в клетках Е. coli, как это описано выше. Клетки разрушали ультразвуком и центрифугировали при 15000 об/мин в течение 40 минут. Супернатант добавляли к 40 мкл предварительно уравновешенной суспензии глутатион-сефарозы и инкубировали 20 минут на ротаторе при комнатной температуре. После этого центрифугировали 30 секунд при 2000 об/мин и удаляли супернатант. Сефарозу трижды промывали pull-down буфером (20 мМ HEPES-KOH рН 7,6, 150 мМ NaCl, 5 мМ MgCl2, 100 мМ ZnCl2, 10% глицерол, 0,1% NP-40, 0,5 мМ PMSF, 1 мМ DTT, 1:1000 Calbiochem Cocktail VII) на ротаторе по 5 минут. После инкубации с 1% BSA в pull-down буфере, к сефарозе с имммобилизованным GST-белком добавляли препарат белка или ядерный лизат культуры S2 клеток D. melanogaster, инкубировали в течение 2 часов на ротаторе при комнатной температуре., Центрифугировали в течение 30 секунд при 2000 об/мин, затем осадок промывали, как описано выше, но с использованием буфера, содержащего 500 мМ NaCl и ЮмМ В-меркаптоэтанол. После этого к осадку добавляли буфер для элюции (50 мМ Tris, 30 мМ глугатион рН 8,0) и инкубировали на ротаторе в течение 20 минут, центрифугировали при 30 секунд при 2000 об/мин. Супернатант анализировали с помощью электрофореза. Для контроля неспецифического связывания одновременно проводили GST pull-down с отдельным белком GST. Для этого предварительно экспрессировали и очищали GST, диализовали препарат против PBS, добавляли глицерин с PBS до 50% и хранили при -20°С. Аналогично проводили МВР pull-down с использованием иммобилизованной амилозы.

Электрофорез белков в денатурирующих условиях

Использовали 30% водный раствор акриламида (29:1 акрилами д:метилен-бисакриламид). Разделяющий гель: 0,375 мМ Tris-HCl рН 8,8, 5-16% акриламида, 0,1%

SDS. Концентрирующий гель: 0,125 мМ Tris-IICl рН 6,8, 5% акриламида, 0,1% SDS. Для полимеризации геля добавляли PSA до 0,1% и TEMED до 0,01%. В качестве электрофорезного буфера использовали TGB (25 мМ Tris-HCl, 250 мМ глицин, 0,1% SDS). Пробы смешивали с 10х буфером для нанесения (0,4 М Tris-HCl рН 6,8, 10% SDS, 125 мМ Р-меркаптоэтанол, 50% глицерин, 0,25% бромфеноловый синий) и выдерживали на кипящей водяной бане в течение 2 минут. Электрофорез проводили при напряженности около 10 В/см в концентрирующем геле и 20 В/см в разделяющем геле.

Гель с градиентом концентрации акриламида заливали с помощью Hoefer SG 15 Gradient Maker.

Использовали белковые маркеры PageRuler™ Plus Prestained Protein Ladder и PageRuler™ Prestained Protein Ladder (Fermentas).

Электрофорез белков в нашивных условиях

Электрофорез белков в нативных условиях проводился так же, как и денатурирующий электрофорез, но в гель, электрофорезный буфер и буфер для нанесения не добавляли SDS. Пробы перед нанесением в течение часа инкубировали с 1% Р~ меркаптоэтанолом, но не нагревали на кипящей водяной бане.

Окрашивание Coomassie Blue R

0,025% Coomassie Blue R250 растворяли при нагревании и перемешивании в изопропиловом спирге. Разводили водой с добавлением 10% уксусной кислоты до концентрации спирта 30%. После растворения фильтровали через бумажный фильтр.

Гель помещали в раствор Coomassie и нагревали до кипения. Промывали 10% уксусной кислотой. Повторно добавляли 10% уксусную кислоту и доводили до кипения. Промывали дисшллированной водой и повторно доводили до кипения. Промывку водой повторяли несколько раз. Гель высушивали с помощью BioRad Gel Dryer.

Окрашивание серебром

Все процедуры проводили на качалке при комнатной температуре. Для всех растворов и промывок использовали деионизованную воду (p,Q). Формальдегид добавляли непосредственно перед применением.

Гель дважды инкубировали в фиксирующем растворе (25% этанол, 10% уксусная кислота), по 10 минут. Споласкивали водой. Дважды промывали водой в течение 20 минут. Сенсибилизировали 0,03% раствором тиосульфата натрия в течение 2 минут. Споласкивали водой. Дважды промывали водой в течение 10 минут. Инкубировали с 1% AgN03 с добавлением 0,04% формальдегида в темноте 30 минут. Отмывали водой три раза по 30 секунд. Проявляли раствором 4% ЫагСОз, 0,01% формальдегид, 0,0006% тиосульфат натрия. После появления первых полос сменяли проявляющий раствор. Отмывали водой и фиксировали 10% уксусной кислотой.

Western blot

Вырезали мембрану (Hybond-P, Amersham Biosciences) по размеру геля. Смачивали ее метанолом, промывали дистиллированной водой. Уравновешивали мембрану и гель в буфере для переноса TGB с метанолом (25 мМ Tris-HCl, 250 мМ глицин, 20% метанол) в течение 15 минут на качалке. Помещали мембрану и гель в кассету для мокрого переноса BioRad Mini Trans-Blot Cell. Проводили перенос в течение часа при охлаждении и силе тока 350 мА. После переноса мембрану помещали в 5% сухое нежирное молоко, разведенное в PBS-T (lxPBS, 0,1% Tween-20). Инкубировали 1 час на качалке при комнатной температуре. Мембрану помещали в раствор первичных антител с 3% молоком в PBS-T. Инкубировали в течение ночи на ротаторе в холодной комнате. Споласкивали PBS-T. Промывали PBS-T на качалке при комнатной температуре 20 »минут, затем еще два раза по 5 минут. Мембрану инкубировали с раствором вторичных антител с 3% молоком в PBS-T. Промывали PBS-T на качалке при комнатной температуре 20 минут, затем еще два раза по 5 минут. Проявляли, используя Amersham ECL Plus Western Blotting Detection System (GE Healthcare) или для обеспечения большей чувствительности SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate (Thermo Scientific), после чего получали изображение с помощью гель-документационной системы.

Отшпариванае мембран

Для перегибридизации с различными антителами мембрану отшпаривали в специальном буфере (50 мМ Tris-HCl pH 6,8, 2% SDS, 0,3%) ß-меркаптоэтанол). Инкубировали час при 55°С на качалке. После чего инкубировали мембрану с 5% молоком и проводили гибридизацию с антителами, как это описано выше.

Методы функционального анализа in vivo

Иммунопрег^ипитация хроматина (СЫР)

Для эксперимента использовали куколок на средней стадии развития. Образцы (500мг) измельчали в жидком азоте с помощью пестика и ступки, ресуспендировали в 10 мл буфера А (15 мМ HEPES-KOH, pH 7.6; 60 мМ KCl, 15 мМ NaCl, 13 мМ EDTA, 0.1 мМ EGT А, 0.15 мМ спермин, 0.5 мМ спермидин, 0.5% NP-40, 0.5 мМ DTT) с добавлением 0.5 мМ PMSF и Complete (EDTA-free) Protease Inhibitor Cocktail V (Calbiochem). Суспензию гомогенизировали в гомогенизаторе Даунса и фильтровали через Nylon Cell Strainer (BD Biosciences). Полученный гомогенат наслаивали поверх 3 мл буфера А, содержащего 10% сахарозы (AS), ядра осаждали центрифугированием при 4000 g 5 мин при 4°С. Осадок ресуспендировали в 5мл буфера А, повторно гомогенизировали с помощью гомогенизатора Даунса, наслаивали поверх 1,5 мл буфера AS, и центрифугировали. Осадок ядер ресуспендировали в промывочном буфере (15 мМ HEPES-KOH, pH 7.6; 60 мМ KCl, 15 мМ NaCl, 1 мМ EDTA, 0.1 мМ EGTA, 0.1% NP-40, ингибиторы протеаз) и добавляли формальдегид до 1%, инкубировали в течение 15 мин при комнатной температуре. Реакцию останавливали добавлением глицина до конечной концентрации 125 мМ. Ядра трижды промывали 10мл промывочного буфера и ресуспендировали в 1,5мл буфера для лизиса ядер (15 мМ HEPES, pH 7.6; 140 мМ NaCl, 1 мМ EDTA, 0.1 мМ EGTA, 1% Triton Х-100, 0.5 мМ DTT, 0.1% дезоксихолат натрия (SDC), 0.1% SDS, ингибиюры протеаз) и разрушали ультразвуком (Branson Sonifier 150) 5 раз по 20 с 1-минутными интервалами. Дебрис удаляли центрифугированием при 14 000 g, 4°, 10 мин. Хроматин очищали с помощью агарозы, конъюгированной с белком G (Pierce), блокированной BSA и ДНК спермы лосося. Аликвота этого препарата использовалась в качестве исходной (input). Препарат хроматина инкубировали с антителами против GAF (1:200) и неспецифическими иммуноглобулинами, очищенными из преимунной сыворотки крыс, при 4°С в течение ночи, комплексы антител с хромагином осаждали при помощи блокированной protein G agarose при 4°С в течение 5 ч. После нескольких промывок буфером для лизиса с добавлением 500 мМ NaCl, LiCl-буфером (20 мМ Tris-HCl, pH 8; 250 мМ LiCl, 1 мМ EDTA, 0.5% NP-40, 0.5% SDC, ингибиторы протеаз), и буфером ТЕ, хроматин олюировали буфером для элюции (50 мМ Tris-HCl, pH 8; 1 мМ EDTA, 1% SDS), доводили концентрацию NaCl до 200 мМ, подвергали расшивке формальдегидных сшивок в течение ночи при 65°С, обрабатывали Протеиназой К и РНКазой А, последовательно экстрагировали фенолом, смесью фенол/хлороформ/изоамиловый спирт (29/29/1) и смесью хлороформ/изоамиловый спирт (29/1), осаждали этанолом. Степень обогащения ДНК анализировали при помощи ПЦР в реальном времени на приборе Bio-Rad CFX96 Cl000 с помощью соответствующих праймеров.

Иммунопреципитация

Для экспериментов по иммунопреципитации использовали лизат ядер клеточной линии S2 как описано выше (см. Получение ядерного и цитоплазматического лизата S2 клеток D.melanogaster). Сефарозу с иммобилизованным белком G (Pierce) дважды промывали буфером IP (20 мМ HEPES-KOH pH 7,6, 150 мМ NaCl, 5 мМ iMgCl2, 100 мМ ZnCl2, 10% глицерол, 0,1% NP-40, 0,5 мМ PMSF, 1:1000 Calbiochem Cocktail V). После этого Сефарозу с иммобилизованным белком G инкубировали в течение часа со специфическими антителами либо неспецифическими иммуноглобулинами в буфере IP. Промывали один раз буфером IP, инкубировали в течение часа с 1% BS А в буфере IP.

Сефарозу с иммобилизованными моноклональными антителами к FLAG-эпитопу (Sigma) после двукратной отмывки в буфере IP также инкубировали с BSA. После центрифугирования к сефарозе с иммобилизованными антителами добавляли лизат ядер клеточной линии S2, инкубировали на ротаторе в течение ночи при +Ю°С. Отмывали четыре раза при помощи буфера IP с концентрацией NaCl 500мМ. Элюировали кипячением в буфере для SDS-электрофореза.

РТ-ПЦР

РНК выделяли при помощи TRI reagent (MRC), согласно рекомендациям производителя. РНК обрабатывали 2U Turbo DNase I (Ambion) 30 минут при 37°С, чтобы избавиться от примесей геномной ДНК. 2мкг РНК использовали для синтеза кДНК. кДНК синтезировали с помощью обратной транскриптазы Arrayscript (Ambion). Количество индивидуальных РНК анализировали при помощи ПЦР в реальном времени на приборе Bio-Rad CFX96 С1000 с помощью соответствующих праймеров. Уровень экспрессии генов оценивали путем нормализации полученных результатов на уровень экспрессии гр47, гр132 мРНК.

Дрожжевая двугибридная система

Дрожэ/севой штамм

В работе использовался штамм дрожжей Saccharomyces cerevisiae Pj69-4A: МАТа trpl-901 leu2-3,l 12 ura3-52 his3-200 gal4A gal80A LYS2::GAL1-HIS3 GAL2-ADE2 met2::GAL7-lacZ. Этот штамм в норме не способен синтезировать аденин и аминокислоты гистидин (His), триптофан (Тгр), лейцин (Leu). Транскрипционный фактор Gal4 также не экспрессируется.

В геном встроены гены ADE2, HIS3 под Gal4-активируемыми промоторами. Эти гены активируются в присутствии Gal4, после чего дрожжи могут синтезировать аденин, гистидин. Эти гены выступают в качестве репортерных, дрожжи при их активации могут расти на селективной среде, не содержащей аденина и гистидина.

•Плазмиды

Двугибридная система, использованная в данной работе, основана на плазмидах pGBT9 и pGAD. Обе плазмиды имеют ген устойчивости к ампициллину (ген Ыа) и бактериальный ориджин репликации для наращивания в E.coli. Плазмиды имеют в своем составе ориджин репликации в дрожжах (2ц). Гены транскрипционных факторов в обеих плазмидах находятся под контролем ADH1 промотора и ADH1 терминатора.

В плазмиде pGBT9 закодирован ДНК-связывающий домен транскрипционного фактора Gal4. В плазмиду можно клонировать необходимую последовательность белка. I If)H этом образующийся белок содержит на N-конце ДНК-связывающий домен Gal4, а на С-конце последовательность исследуемого белка. Плазмида содержит селективный маркер TRP1 (ген, участвующий в биосинтезе триптофана), который позволяет дрожжам Pj69-4A расти на селективной среде, не содержащей триптофана.

В плазмиде pGAD закодирован активационный домен Gal4. Синтезируемый белок будет содержать на N-конце активационный домен Gal4, а на С-конце- изучаемую последовательность . В плазмиде pGAD есть маркер LEU2 (ген синтеза лейцина), позволяющий дрожжам расти на среде без лейцина.

Внутри ДНК-связывающего домена содержатся сигналы ядерной локализации.

Дрожжи, ^трансформированные обеими плазмидами, растут на среде, не содержащей лейцина и триптофана (-2). При взаимодействии доменов будет происходить активация генов ADE2, HIS3, что позволяет штамму Pj69-4A расти на среде без аденина и гистидина (-3 или -4).

Выращивание дрожжей

Дрожжи Saccharomyces cerevisiae штамма Pj69-4A пересевали, в 15 мл пробирку в жидкую среду YPD (2% бактопетон, 1% дрожжевой экстракт, 2% глюкоза) с помощью стерильной петли. Наращивали в термостатированной качалке при температуре 30°С, скорость вращения 250-300 об/мин до поздней лог-фазы (оптическая плотность (Юбоо~1, определялась визуально).

Культуру разбавляли в 10 раз средой YPD и выращивали 3 часа при тех же условиях. 1,5 мл полученной суспензии клеток котрансформировали двумя плазмидами.

Трансформация дрожэ/сей

Клетки осаждали центрифугированием при 4000 g в течение 10 секунд, супернатант удаляли. К осадку добавляли 1 мл 0,1 М ацетата лития, инкубировали 10 минут на качалке при температуре 30°С, центрифугировали при 4000 g в течение 10 секунд. Надосадочную жидкость удаляли. После этого в пробирку с осажденными клетками добавляли последовательно 270 мкл 50% PEG 3380, растворенного в 0,1 М ацетате лития, 25 мкг денатурированной ДНК спермы лосося и 50 мкл смеси двух плазмид в 0,1 М ацетате лития (масса каждой плазмиды в смеси 400-800 нг).

Смесь ресуспендировали до гомогенного состояния. Пробирку помещали в качалку на 30°С на 30 минут. Затем инкубировали на 42°С в течение 2 минут. Пробирку ставили охлаждаться в лед на полминуты. Клетки осаждали на 4000 g в течение 20 секунд, надосадочную жидкость удаляли. К осадку добавляли 150 мкл деионизованной воды mQ). Содержимое пробирки аккуратно, но тщательно ресуспендировали и высевали на чашку с селективной средой, не содержащей аминокислот Leu и Тгр - среда -2. Состав среды -2: 0,67% дрожжевой среды без аминокислот, 1,5% агар, после автоклавирования добавляли глюкозу до 2% и раствор аминокислот (10х dropout -2: 0,03% L-изолейцин, 0,15% L-валин, 0,02% L-аргинин, 0,02% хлорид моногидрат L-гистидина, 0,03% хлорид L-лизина, 0,02% L-метионин, 0,05% L-фенилаланин, 0,2% L-треонина, 0,03% L-тирозина, 0,02% урацила, 0,02% сульфат аденина). Чашки помещали в термостат 30°С на трое суюк, до появления отдельных колоний.

Выросшие колонии пересевали истощающим штрихом на чашки с селективной средой, не содержащей аденина и аминокислот Leu, Тгр и His — среда -3, или на такие же чашки с добавлением 5 мМ 3-АТ (ингибитор продукта репортерного гена HIS3). Состав среды -3: 0,67% дрожжевой среды без аминокислот, 1,5% агар, после автоклавирования добавляли глюкозу до 2% и раствор аминокислот (10х dropout -3: 0,03% L-изолейцин, 0,15% L-валин, 0,02% L-аргинин, 0,03% L- хлорид лизина, 0,02% L-метионин, 0,05%) L-фенилаланин, 0,2% L-треонина, 0,03% L-тирозина, 0,02% урацила, 0,02% сульфат аденина). Выращивали дрожжи в термостате на 30°С в течение 1 недели. Уровень роста колоний на чашках оценивали визуально.

Работа с Drosophila melanogaster

Мух содержали при температуре 24°С на стандартном корме. Линии хранили при температуре 18°С.

Трансгенные линии были получены путем микроинъекций конструкции в составе Р-элемента совместно с плазмидой, экспрессирующей транспозазу Р-элемента, в пребластодерму эмбрионов мух линии y'w1. После получения мух, содержащих половые клетки со встроенным Р-элементом, было проведено скрещивание с линией мух y'w1 (желтое тело, белые глаза). Из потомства были отобраны мухи с пигмен і ированными глазами.

Линии Drosophila melanogaster, использованные в работе y'w"18 - лабораторная линия, несущая мутацию гена yellow с нарушенным инициаторным кодоном и мутацию гена white, представляющую собой делецию значительной его части. ylwllls; SM5, CyO/IF - лабораторная линия с балансерной хромосомой, несущая запиратель кроссинговера на второй хромосоме (доминантный маркер СуО — фенотип «загнутые крылья») и рецессивную леталь IF на гомологичной хромосоме. Использовалась для определения хромосомы, на которой произошло встраивание конструкции. у'\\'"18; ТМЗ/Р[шЬСАЬ4] - лабораторная линия с балансерной хромосомой, несущая запиратели кроссинговера по третьей хромосоме (доминантный маркер БЬ - фенотип «укороченные щетинки») и рецессивную деталь Р[шЪСАЬ4] на гомологичной хромосоме, экспрессирующую дрожжевой активатор транскрипции ОАЬ4 под контролем промотора гена тубулина. Использовалась для экспрессии ОАЬ4. у'м>1118; СуО, кзРЬР, ІБА/Бсо — лабораторная линия с балансерной хромосомой, несущая запиратель кроссинговера на второй хромосоме (доминантный маркер СуО — фенотип «загнутые крылья») и экспрессирующая рекомбиназу ИЬР под контролем промотора гена теплового шока Ьзр70. Использовалась для вырезания элементов, фланкированных сайтами РКТ. у'м>,П8; СуО, Р[м>+, Сге]/Бсо — лабораторная линия с балансерной хромосомой, несущая запиратель кроссинговера на второй хромосоме (доминантный маркер СуО -фенотип «загнутые крылья») и экспрессирующая рекомбиназу Сге. Использовалась для вырезания элементов, фланкированных сайтами ЬОХ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Функции мультимеризующих доменов инсуляторных белков Drosophila melanogaster»

Механизм того, каким образом происходит специфичное сближение промоторов и энхансеров на больших дистанциях (свыше 1000 пн) до сих пор остается неизвестным. Интересно, что многие известные инсуляторы обладают способностью специфично взаимодействовать друг с другом на больших дистанциях подобно взаимодействию энхансеров и промоторов, по всей видимости, используя сходные механизмы, и в определенных случаях даже участвуя в установлении энхансер-промоторных контактов. Аналогичной активностью обладают изолированные сайты связывания инсуляторных белков Drosophila (Su(Hw), Zw5 и CTCF) Очевидно, что для этого важны избирательные белок-белковые взаимодействия между транскрипционными факторами. На основании наблюдений, сделанных ранее при изучении белков-репрессоров транскрипции у прокариот (cl фага X, deoR), а также белков Zeste и GAGA Drosophila, было сделано предположение о необходимости формирования белковых мультимеров высокого порядка (по меньшей мере, октамеров) для осуществления взаимодействий между удаленными геномными элементами. Факторы, перечисленные выше, формируют мультимеры и способны сближать свои сайты связывания на значительных расстояниях. Применимость такого механизма к объяснению специфичных взаимодействий, осуществляемых инсуляторными белками, остается неясной.

Изучение механизмов работы инсуляторов, таким образом, может помочь пролить свет на фундаментальную проблему изучения механизма дальних взаимодействий в геноме.

Это и определяет актуальность данной работы, посвященной изучению доменов инсуляторных белков, выполняющих функции белок-белковых взаимодействий, и анализу их потенциальной роли в установлении и поддержании дальних геномных взаимодействий.

Результаты

1.1. ВТВ-домены GAGA-фактора и некоторых других транскрипционных факторов Drosophila способны формировать мультимеры в растворе.

Ранее было показано, что ВТВ-домен GAGA-фактора необходим для формирования комплексов с высокой молекулярной массой (Katsani et al. 1999). Делеционные производные белка, в которых отсутствовал ВТВ-домен, в растворе существовали в мономерной форме. Однако способность ВТВ-домена GAGA-фактора формировать мультимеры не была показана напрямую, в то же время глутамин-богатый домен этого белка способен мультимеризоваться при высоких концентрациях (Wilkins, Lis. 1999). Все хорошо изученные ВТВ-домены (Вс16, PLZF, FAZF и др.) являются димерами, в редких случаях - тетрамерами (Mizl). Таким образом, уникальная способность ВТВ-домена GAGA-фактора образовывать мультимеры высокого порядка нуждается в проверке. Помимо этого, большинство известных ВТВ-доменов способно взаимодействовать с другими, не содержащими ВТВ, белкамиизвестны лишь редкие случаи гетеродимеризации, в то время как для ВТВ-домена белка GAGA описаны взаимодействия непосредственно с ВТВ-доменами других белков (Tramtrack, Pipsqueak, Batman, Mod(mdg4)). Неясно, образуются ли при этом гетеродимеры, либо формируется сложный мультимер из нескольких димеров ВТВ-доменов. На рис.14 представлено множественное выравнивание различных ВТВ-доменов, из которого видно, что ВТВ-домен GAGA-фактора, ВТВ-домены белков, взаимодействующих с GAGA, а также некоторых других транскрипционных факторов образуют консервативную группу, которая была охарактеризована ранее как «ttk-group». формирование контактов между димерами ВТВ-доменов, опосредованное р1-участками, появление дополнительных гидрофобных аминокислот в этом районе могло привести к стабилизации образуемых мультимеров ВТВ -доменами "йк^гоир". Для изучения потенциальной роли последовательности РхЬКЛМЫ в способности ВТВ-доменов формировать мультимеры, мы сконструировали два ВТВ-домена с делецией данного участка: ОАБ <1[2-13] и Мос1(тс1§4) ё[1-17]. Анализ при помощи гель-электрофореза в нативных условиях (рис.18) показал, что данные делеции полностью подавляют способность ВТВ-доменов мультимеризоваться.

Следующим этапом нашей работы стал анализ взаимодействий ВТВ-доменов в дрожжевой двугибридной системе. Результаты представлены на рис.19. ВТВ-домен в АР с![2-13] не способен взаимодействовать сам с собой, однако эффективно взаимодействует с ВТВ-доменом дикого типа и с другими ВТВ-доменами практически с такой же специфичностью. Это говорит о том, что ВТВ-домен с делецией правильно сворачивается, но 1\1-копцевой консервативный участок вовлечен в стабилизацию димера, который, в свою очередь, может образовать мультимер, предположительно также за счет данного консервативного участка. Результат воспроизодится, если мутантный ВТВ домен, находится на И-конце относительно активационного домена ОАЬ4. Аналогичные эффекты наблюдаются в случае Мос1(тс^4) с![1-17], но в данном случае делеция, очевидно, затрагивает часть первой альфа-спирали, в результате данный белок дестабилизируется. Все это свидетельствует в пользу того, что взаимодействие между двумя ВТВ-доменами внутри «йк-цгоир», скорее всего, происходит по механизму гетеродимеризации.

Рис.19. Результаты анализа взаимодействий ВТВ-доменов в дрожжевой двугибридной сис1еме. Указана способное!ь дрожжей расти на среде без гистидина, оценивалась визуально. «+++» - способность роста на среде в присутствии 5мМ 3-АТ (конкурентного ингибитора реиор1ерного гена Н183).

СА1.4 ОЕШ ВТВ САР ТгаггПгаск М<х)(п^4) Рфзциеак ВаГтап СР190 Вс1б Й1-18 —. ингию рСАЭ САЯ Д2-13 йМЗАР йАР +++ +++ ++ +++ +++ +/- +/- +++ +4+

ТгаггНгаск +4+ +++ - +++ - - - + 44+

1УЫ(гг^4) +++ +++ - +++ - - + +/ +

Plpsqueak +++ - +++ +++ - - - 4

Ва1тап +++ +++ +++ +++ +++ - - - 444 444

СР130 - - - * +++ - .

Вс16 - - - - - +++ - -

Д1-18 - +4+ • - - - - -

6АР Д2-13 +++ +++ +++ +++ - - - +/присутствии 1% (3-меркаптоэтанола. Результаты представлены на рис.25в и рис.29д. Деления консервативной последовательности действительно приводит к значительному ослаблению связывания CTCF-CTD с «цинковыми пальцами». Наблюдаемое слабое связывание с делеционным вариантом CTCF-CTD, вероятно, является неспецифическим и пропадает при повышении концентрации NaCl в отмывочном буфере (рис.29д). Далее мы протестировали CTCF-CTD на связывание с «цинковыми пальцами» других транскрипционных факторов (Su(Hw) и Pita) in vitro. Во всех случаях было детектировано данное взаимодействие, при этом не было выявлено какой-либо специфичности связывания (рис.25г), что, по всей видимости, связано с достаточно высокими концентрациями белков в in vitro эксперименте либо отражает ситуацию, когда данный домен связывается с «цинковыми пальцами» той же молекулы CTCF непосредственно после трансляции и далее не диссоциирует. Таким образом, CTCF-CTD содержит аминокислотную последовательность, способную связывать домены типа «цинковый палец». Однако данное взаимодействие с большей вероятностью является внутримолекулярным, участвует в поддержании структуры целого белка и не связано с мультимеризацией белка CTCF.

Таким образом, ни один из известных инсуляторных белков Drosophila, способных поддерживать дальние взаимодействия между участками ДНК, не имеет в своей структуре доменов, обеспечивающих формирование мультимеров более высокого порядка, чем димер. С другой стороны, для белка Su(Hw) описано взаимодействие с белком Mod(mdg4), который имеет в своем составе ВТВ-домен, формирующий мультимеры, и дополнительный димеризующий домен. Для Zw5 описано взаимодействие с белком BEAF-32, две изоформы которого образуют тример.

1.4. Роль ВТВ-домена белка СР190 в функционировании инсулнторных белков.

Универсальным компонентом различных инсуляторных комплексов является центросомальный белок СР190, напрямую связывающийся с CTCF и Su(Hw) и соосаждающийся из клеточных лизатов с Zw5. Белок CP 190 не является, очевидно, ключевым компонентом в поддержании дальних взаимодействий, поскольку инсуляторы взаимодействуют друг с другом специфично и их общий компонент, таким образом, может участвовать лишь в первичном установлении геномных взаимодействий, либо в их регуляции. Белок CP 190 имеет в своей структуре ВТВ-домен, способный формировать димеры, помимо него в структуре CP 190 нет мультимеризующих доменов (данные не показаны). Известно также, что ВТВ-домен необходим для ассоциации СР190 с инсуляторами (Oliver et al. 2010). В экспериментах по связыванию in vitro мы установили, чю ВТВ-домен СР190 специфично взаимодействует с инсуляторными белками (Рис.26в,д). CTCF-CTD содержит участки, необходимые для взаимодействия с CP 190 (Рис.26а,б,г). Домен, отвечающий за взаимодействие с микротрубочками также способен связываться с CTCF in vitro, однако эффективность такого взаимодействия существенно ниже и, вероятно, является следствием электростатических взаимодействий между М-доменом, имеющим положительный заряд, и CTCF-CTD, содержащим кластеры отрицательно заряженных аминокислотных остатков (Рис.26в). Белок с делецией М-домена функционален и способен супрессировать нуль-мутации СР190 (Chodagam et al. 2005). Интересно, что CP 190 и CTCF не формируют стабильный комплекс in vivo, об этом говори! низкая эффективность коиммунопреципитации данных белков и возможность разделения белковых комплексов, содержащих CTCF и СР190, биохимически. СР190 из клеточного лизата не связывается с катионообменником SP-sepharose, а комплексы других инсуляторных белков эффективно задерживаются на данном носителе (рис.26е). Это может говорить о том, что в клетке инсуляторные белки либо связаны с белком, препятствующим взаимодействию с СР190, либо СР190 в клетке может быть посттрансляционно модифицирован таким образом, что оказывается неспособен к взаимодействию с инсуляторными белками. С другой стороны инсуляюрные белки CTCF и Su(Hw) эффективно связывают CP 190 из клеточного лизата, что исключает возможность тотальной посттрансляционной модификации данного белка. По всей видимости, связывание CP 190 с CTCF имеет регуляторную функцию, влияет на взаимодействие CTCF с другими факторами.

С целью более точного картирования участков связывания CP 190 и CTCF мы создали несколько делеционных производных CTCF-CTD. Из рис. 27а видно, что CP 190 а)

TRX6xHis-СР190 ВТВ из +

6 гН ЦЗ U.

U Iо

I-1/1 и + U

F и о +

U I— о и b и + о гН i£. UU

О b н-1/1 из + и (и исо о + гг» и I

U l-i-t/i о ш "О t-и из +

6) 610 +++ +++ +++ +++ +++ +++ anti-6xHis *■-*• mm — Шт т в) nput GST- pulldown nput GST-pulldown г) 00 4-І 00 N «Ч ¡£ 00 *—1 00 IN «Н JD

МВР + + + и 1- и U tU

М ВР-СТС FI7 21-818J + + + + + I- 1/1 13 1- (Л 13 ь- 1Л о

GST 4- + + MBP-CTCF[612-818] + + + +

GST-CTCF[610-723J + + + TRX-CP190 ВТВ +

TRX-CP190 ВТВ + + ♦ + anti-MBP —- е) SA.0.02* anti -МВР + *

6*His-CTCF[61M18) д)

TRX-CP190 ВТВ

0 0.02 0.1 0 0.02 0.1 0 0.02 0.1

6xHis-CTCF[610-818J

TRX-CP190 ВТВ

250 170 130 100 70 55

45

35 25 ни

4. j

Рис.27, а) Картирование участков CTCF-CTD, связывающих ВТВ-домен СР190 при помощи GST-pulldown, б) Сводная схема результатов картирования, в) ВТВ-домен СР190 опосредует взаимодействие между двумя различными фрагментами CTCF-CTD, который имеет, таким образом, но меньшей мере, два участка связывания с СР190 ВТВ. г) ВТВ-домен СР190 не способен опосредовать взаимодействие между двумя молекулами CTCF по результатам GST-pulldown, д) Результаты сшивки глугаральдегидом комплекса CTCF-CTD и ВТВ-домена СР190. Рекомбинантные белки смешаны в молярном соотношении CTCF-CTD:CPBTB = 1:2. е) CTCF-CTD и ВТВ-домена СР190 связываются в отношении 1:2. Результаты сшивки глутаральдегидом (GA). Обозначения: 1 - TRX-CP190 ВТВ, 2 - CTCF-CTD, 3 - димер TRX-CP190 ВТВ, 4 - комплекс 6xHIS-CTCF-CTD и двух молекул TRX-CP190 ВТВ, 5 - комплекс двух молекул CTCF-CTD и двух молекул TRX-CP190 ВТВ.

6xHis-CTCF[B10-818] /ТИХ-СР190 ВТВ

СР190, поскольку может блокировать лишь один из двух участков связывания ВТВ-домена. В то же время, наоборот, связывание СР190 с участком, необходимым для взаимодействия с РНК-полимеразой, препятствует последней взаимодействовать с СТСР. а)

FLAGтрансфекция: CTCF

Q. С

Z3 о. о. Q

Anti-RNAPII

Anti-FLAG б) трансфекция:

FLAG -CTCF-d[90-170] antiFLAG antiRNAPII antiCP190 о cn t-H QU

Рис.28 а) РНК-полимераза II соосаждается с полноразмерным CTCF, слитым с FLAG-jnHionoM, в эксперименте но коиммунопрсципитацни с антителами к FLAG, б) CTCF с делецией 90-170ак соосаждается с СР190 в эксперименте по коиммунопреципигацни с антителами к СР190, РНК-полимераза II не соосаждается.

75. Katsani, K. R., Hajibagheri, M. A. and Verrijzer, C. P. Co-operative DNA binding by GAGA transcription factor requires the conserved BTB/POZ domain and reorganizes promoter topology, 1999, EMBO J. 18(3): 698-708.

76. Klochkov, D., Rincon-Arano, H., Ioudinkova, E. S., Valadez-Graham, V., Gavrilov, A., Recillas-Targa, F. and Razin, S. V. A CTCF-dependent silencer located in the differentially methylated area may regulate expression of a housekeeping gene overlapping a tissue-specific gene domain, 2006, Mol Cell Biol, 26(5): 1589-1597.

77. Kobayashi, A., Yamagiwa, II., Iloshino, H., Muto, A., Sato, K., Morita, M., Hayashi, N., Yamamoto, M. and Igarashi, K. A combinatorial code for gene expression generated by transcription factor Bach2 and MAZR (MAZ-related factor) through the BTB/POZ domain. 2000, Mol. Cell Biol. 20(5): 1733-1746.

78. Kornberg, R. D. Mediator and the mechanism of transcriptional activation, 2005, Trends Biochem Sci, 30(5): 235-239.

79. Kornberg, R. D. The molecular basis of eukaryotic transcription, 2007, Proc Natl Acad Sci USA, 104(32): 12955-12961.

80. Kravchenko, E., Savitskaya, E., Kravchuk, O., Parshikov, A., Georgiev, P. and Savitsky, M. Pairing between gypsy insulators facilitates the enhancer action in trans throughout the Drosophila genome, 2005, Mol Cell Biol. 25(21): 9283-9291.

81. Krebs, J. E. and Dunaway, M. The scs and scs' insulator elements impart a cis requirement on enhancer-promoter interactions, 1998, Mol Cell, 1(2): 301-308.

82. Kuhn, E. J., Hart, C. M. and Geyer, P. K. Studies of the role of the Drosophila scs and scs' insulators in defining boundaries of a chromosome puff, 2004, Mol Cell Biol, 24(4): 1470-1480.

83. Kurshakova, M., Maksimenko, O., Golovnin, A., Pulina, M., Georgieva, S., Georgiev, P. and Krasnov, A. Evolutionarily conserved E(y)2/Susl protein is essential for the barrier activity of Su(Hw)-dependent insulators in Drosophila, 2007, Mol Cell, 27(2): 332-338.

84. Kutach, A. K. and Kadonaga, J. T. The downstream promoter element DPE appears to be as widely used as the TATA box in Drosophila core promoters, 2000, Mol Cell Biol, 20(13): 4754-4764.

85. Kyrchanova, O., Chetverina, D., Maksimenko, O., Kullyev, A. and Georgiev, P. Orientation-dependent interaction between Drosophila insulators is a property of this class of regulatory elements, 2008, Nucleic Acids Res. 36(22): 7019-7028.

86. Kyrchanova, O., Toshchakov, S., Parshikov, A. and Georgiev, P. Study of the functional interaction between Mcp insulators from the Drosophila bithorax complex: effects of insulator pairing on enhancer-promoter communication, 2007, Mol. Cell Biol., 27(8): 30353043.

87. Kyrchanova, O., Toshchakov, S., Podstreshnaya, Y., Parshikov, A. and Georgiev, P. Functional interaction between the Fab-7 and Fab-8 boundaries and the upstream promoter region in the Drosophila Abd-B gene, 2008, Mol Cell Biol, 28(12): 4188-4195.

88. Lee, C., Li, X., Hechmer, A., Eisen, M., Biggin, M. D., Venters, B. J., Jiang, C., Li, J., Pugh, B. F. and Gilmour, D. S. NELF and GAGA factor are linked to promoter-proximal pausing at many genes in Drosophila, 2008, Mol Cell Biol, 28(10): 3290-3300.

89. Lee, H., Kraus, K. W., Wolfner, M. F. and Lis, J. T. DNA sequence requirements for generating paused polymerase at the start of hsp70, 1992, Genes Dev, 6(2): 284-295.

90. Lespinet, O., Wolf, Y. I., Koonin, E. V. and Aravind, L. The role of lineage-specific gene family expansion in the evolution of eukaryotes, 2002, Genome Res, 12(7): 10481059.

91. Levine, M. and Tjian, R. Transcription regulation and animal diversity, 2003, Nature, 424(6945): 147-151.

92. Lewis, B. A. and Reinberg, D. The mediator coactivator complex: functional and physical roles in transcriptional regulation, 2003, J Cell Sci, 116(Pt 18): 3667-3675.

93. Li, X., Lopez-Guisa, J. M., Ninan, N., Weiner, E. J., Rauscher, F. J., 3rd and Marmorstein, R. Overexpression, purification, characterization, and crystallization of the BTB/POZ domain from the PLZF oncoprotein, 1997, J. Biol. Chem., 272(43): 27324-27329.

94. Lin, Q., Chen, Q., Lin, L. and Zhou, J. The Promoter Targeting Sequence mediates epigenetically heritable transcription memory, 2004, Genes Dev, 18(21): 2639-2651.

95. Ling, J., Ainol, L., Zhang, L., Yu, X., Pi, W. and Tuan, D. HS2 enhancer function is blocked by a transcriptional terminator inserted between the enhancer and the promoter, 2004, J Biol Chem, 279(49): 51704-51713.

96. Liu, Y., Bondarenko, V., Ninfa, A. and Studitsky, V. M. DNA supercoiling allows enhancer action over a large distance, 2001, Proc Natl Acad Sci USA. 98(26): 14883-14888.

97. Liu, Z., Scannell, D. R., Eisen, M. B. and Tjian, R. Control of Embryonic Stem Cell Lineage Commitment by Core Promoter Factor, TAF3, 2011, Cell, 146(5): 720-731.

98. Mahmoudi, T., Katsani, K. R. and Verrijzer, C. P. GAGA can mediate enhancer function in trans by linking two separate DNA molecules, 2002, EMBO J. 21(7): 1775-1781.

99. Mahmoudi, T., Zuijderduijn, L. M., Mohd-Sarip, A. and Verrijzer, C. P. GAGA facilitates binding of Pleiohomeotic to a chromatinized Polycomb response element, 2003, Nucleic Acids Res, 31(14): 4147-4156.

100. Martinez-Balbas, M. A., Dey, A., Rabindran, S. K., Ozato, K. and Wu, C. Displacement of sequence-specific transcription factors from mitotic chromatin, 1995, Cell, 83(1): 29-38.

101. Martinez, S. R. and Miranda, J. L. CTCF terminal segments are unstructured, 2010, Protein Sci, 19(5): 1110-1116.

102. McCarty, A. S., Kleiger, G., Eisenberg, D. and Smale, S. T. Selective dimerization of a C2H2 zinc finger subfamily, 2003, Mol Cell 11(2): 459-470.

103. Melnick, A., Carlile, G., Ahmad, K. F., Kiang, C. L., Corcoran, C., Bardwell, V., Prive, G. G. and Licht, J. D. Critical residues within the BTB domain of PLZF and Bcl-6 modulate interaction with corepressors, 2002, Mol. Cell Biol., 22(6): 1804-1818.

104. Melnikova, L., Juge, F., Gruzdeva, N., Mazur, A., Cavalli, G. and Georgiev, P. Interaction between the GAGA factor and Mod(mdg4) proteins promotes insulator bypass in Drosophila, 2004, Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A., 101(41): 14806-14811.

105. Mislira, K., Chopra, V. S., Srinivasan, A. and Mishra, R. K. Trl-GAGA directly interacts with lola like and both are part of the repressive complex of Polycomb group of genes, 2003, Mech. Dev. 120(6): 681-689.

106. Mohan, M., Bartkuhn, M., Herold, M., Philippen, A., Heinl, N., Bardenhagen, I., Leers, J., White, R. A., Renkawitz-Pohl, R., Saumweber, H. and Renkawitz, R. The Drosophila insulator proteins CTCF and CP 190 link enhancer blocking to body patterning, 2007, Embo J, 26(19): 4203-4214.

107. Mongelard, F., Labrador, M., Baxter, E. M., Gerasimova, T. I. and Corces, V. G. Trans-splicing as a novel mechanism to explain interallelic complementation in Drosophila, 2002, Genetics. 160(4): 1481-1487.

108. Moon, H., Filippova, G., Loukinov, D., Pugacheva, E., Chen, Q., Smith, S. T., Munhall, A., Grewe, B., Bartkuhn, M., Arnold, R., Burke, L. J., Renkawitz-Pohl, R., Ohlsson, R., Zhou, J., Renkawitz, R. and Lobanenkov, V. CTCF is conserved from Drosophila to humans and confcrs enhancer blocking of the Fab-8 insulator, 2005, EMBO Rep, 6(2): 165-170.

109. Morcillo, P., Rosen, C., Baylies, M. K. and Dorsett, D. Chip, a widely expressed chromosomal protein required for segmentation and activity of a remote wing margin enhancer in Drosophila, 1997, Genes Dev. 11(20): 2729-2740.

110. Mueller-Storm, II. P., Sogo, J. M. and Schaffner, W. An enhancer stimulates transcription in trans when attached to the promoter via a protein bridge, 1989, Cell, 58(4): 767777.

111. Muravyova, E., Golovnin, A., Gracheva, E., Parshikov, A., Belenkaya, T., Pirrotta, V. and Georgiev, P. Loss of insulator activity by paired Su(Hw) chromatin insulators, 2001, Science, 291(5503): 495-498.

112. Nikolov, D. B. and Burley, S. K. RNA polymerase II transcription initiation: a structural view, 1997, Proc Natl Acad Sci USA. 94(1): 15-22.

113. Oegema, K., Whitfield, W. G. and Alberts, B. The cell cycle-dependent localization of the CP190 centrosomal protein is determined by the coordinate action of two separable domains, 1995, J Cell Biol, 131(5): 1261-1273.

114. Ohtsuki, S. and Levine, M. GAGA mediates the enhancer blocking activity of the eve promoter in the Drosophila embryo, 1998, Genes Dev. 12(21): 3325-3330.

115. Ohtsuki, S., Levine, M. and Cai, H. N. Different core promoters possess distinct regulatory activities in the Drosophila embryo, 1998, Genes Dev, 12(4): 547-556.

116. Oliver, D., Sheehan, B., South, H., Akbari, O. and Pai, C. Y. The chromosomal association/dissociation of the chromatin insulator protein Cpl90 of Drosophila melanogaster is mediated by the BTB/POZ domain and two acidic regions, 2010, BMC Cell Biol 11:101.

117. Omichinski, J. G., Pedone, P. V., Felsenfeld, G., Gronenborn, A. M. and Clore, G. M: The solution structure of a specific GAGA factor-DNA complex reveals a modular binding mode, 1997, Nat Struct Biol. 4(2): 122-132.

118. Pagans, S., Ortiz-Lombardia, M., Espinas, M. L., Bernues, J. and Azorin, F. The Drosophila transcription factor tramtrack (TTK.) interacts with Trithorax-like (GAGA) and represses GAGA-mediated activation, 2002, Nucleic Acids Res., 30(20): 4406-4413.

119. Pai, C. Y., Lei, E. P., Ghosh, D. and Corces, V. G. The centrosomal protein CP 190 is a component of the gypsy chromatin insulator, 2004, Mol. Cell, 16(5): 737-748.

120. Pant, V., Kurukuti, S., Pugacheva, E., Shamsuddin, S., Mariano, P., Renkawitz, R., Klenova, E., Lobanenkov, V. and Ohlsson, R. Mutation of a single CTCF target site within the HI 9 imprinting control region leads to loss of Igf2 imprinting and complex patterns of de novo methylation upon maternal inheritance, 2004, Mol Cell Biol, 24(8): 3497-3504.

121. Parnell, T. J. and Geyer, P. K. Differences in insulator properties revealed by enhancer blocking assays on episomes, 2000, EMBO J, 19(21): 5864-5874.

122. Parnell, T. J., Viering, M. M„ Skjesol, A., Helou, C., Kuhn, E. J. and Geyer, P. K. An endogenous suppressor of hairy-wing insulator separates regulatory domains in Drosophila, 2003. Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A., 100(23): 13436-13441.

123. Payre, F., Buono, P., Vanzo, N. and Vincent, A. Two types of zinc fingers are required for dimerization of the serendipity delta transcriptional activator, 1997, Mol Cell Biol, 17(6): 3137-3145.

98 ! 1

124. Payre, F., Crozatier, M. and Vincent, A. Direct control of transcription of the Drosophila morphogen bicoid by the serendipity delta zinc finger protein, as revealed by in vivo analysis of a finger swap, 1994, Genes Dev, 8(22): 2718-2728.

125. Pedone, P. V., Ghirlando, R., Clore, G. M., Gronenborn, A. M„ Felsenfeld, G. and Omichinski, J. G. The single Cys2-His2 zinc finger domain of the GAGA protein flanked by basic residues is sufficient for high-affinity specific DNA binding, 1996, Proc Natl Acad Sci U S A, 93(7): 2822-2826.

126. Peng, H., Begg, G. E., Harper, S. L., Friedman, J. R., Speicher, D. W. and Rauscher, F. J., 3rd Biochemical analysis of the Kruppel-associated box (KRAB) transcriptional repression domain. 2000. J Biol Chem. 275(24): 18000-18010.

127. Peng, H., Gibson, L. C., Capili, A. D., Borden, K. L., Osborne, M. J., Harper, S. L., Speicher, D. W., Zhao, K. Marmorstein, R., Rock, T. A. and Rauscher, F. J., 3rd The structurally disordered KRAB repression domain is incorporated into a protease resistant corc upon binding to KAP-1-RBCC domain, 2007, J Mol Biol. 370(2): 269-289.

128. Perez-Torrado, R., Yamada, D. and Defossez, P. A. Born to bind: the BTB protein-protein interaction domain, 2006, Bioessays, 28(12): 1194-1202.

129. Petesch, S. J. and Lis, J. T. Rapid, transcription-independent loss of nucleosomes over a large chromatin domain at Hsp70 loci, 2008, Cell, 134(1): 74-84.

130. Petrascheck, M., Eschcr, D., Mahmoudi, T., Verrijzer, C. P., Schaffner, W. and Barberis, A. DNA looping induced by a transcriptional enhancer in vivo, 2005, Nucleic Acids Res. 33(12): 3743-3750.

131. Phillips, J. E. and Corces, V. G. CTCF: Master Weaver of the Genome, 2009, Cell. 137(7): 1194-1211.

132. Plant, K. E., Routledge, S. J. and Proudfoot, N. J. Intergenic transcription in the human beta-globin gene cluster, 2001. Mol Cell Biol, 21(19): 6507-6514.

133. Pointud, J. C., Larsson, J., Dastugue, B. and Couderc, J. L. The BTB/POZ domain of the regulatory proteins Brie a brae 1 (BAB1) and Brie a brae 2 (BAB2) interacts with the novel Drosophila TAF(II) factor BIP2/dTAF(II)155, 2001. Dev. Biol. 237(2): 368-380.

134. Ptashne, M. Gene regulation by proteins acting nearby and at a distance, 1986, Nature. 322(6081): 697-701.

135. Recillas-Targa, F., Pikaart, M. J., Burgess-Beusse, B., Bell, A. C., Litt, M. D., West, A. G., Gaszner, M. and Felsenfeld, G. Position-effect protection and enhancer blocking by the chicken beta-globin insulator are separable activities, 2002, Proc Natl Acad Sci USA, 99(10): 6883-6888.

136. Revet, B., von Wilcken-Bergmann, B., Bessert, H., Barker, A. and Muller-Hill, B. Four dimers of lambda repressor bound to two suitably spaced pairs of lambda operators form octamers and DNA loops over large distances, 1999, Curr Biol, 9(3): 151-154.

137. Rollins, R. A., Morcillo, P. and Dorsett, D. Nipped-B, a Drosophila homologue of chromosomal adherins, participates in activation by remote enhancers in the cut and Ultrabithorax genes, 1999, Genetics, 152(2): 577-593.

138. Rubtsov, M. A., Polikanov, Y. S., Bondarenko, V. A., Wang, Y. H. and Studitsky, V. M. Chromatin structure can strongly facilitate enhancer action over a distance, 2006, Proc Natl Acad Sci USA, 103(47): 17690-17695.

139. Salvaing, J., Lopez, A., Boivin, A., Deutsch, J. S. and Peronnet, F. The Drosophila Corto protein interacts with Polycomb-group proteins and the GAGA factor, 2003, Nucleic Acids Res, 31(11): 2873-2882.

140. Schmitt, S., Prestel, M. and Paro, R. Intergenic transcription through a polycomb group response element counteracts silencing, 2005, Genes Dev, 19(6): 697-708.

141. Schumacher, C., Wang, H., Iloner, C., Ding, W., Koehn, J., Lawrence, Q., Coulis, C. M., Wang, L. L., Ballinger, D., Bowen, B. R. and Wagner, S. The SCAN domain mediates -selective oligomerization, 2000, J Biol Chem, 275(22): 17173-17179.

142. Schupbach, T. and Wieschaus, E. Female sterile mutations on the second chromosome of Drosophila melanogaster. I. Maternal effect mutations, 1989, Genetics, 121(1): 101-117.

143. Schweinsberg, S., Hagstrom, K., Gohl, D., Schedl, P., Kumar, R. P., Mishra, R. and Karch, F. The enhancer-blocking activity of the Fab-7 boundary from the Drosophila bithorax complex requires GAGA-factor-binding sites, 2004, Genetics, 168(3): 1371-1384.

144. Schwendemann, A. and Lehmann, M. Pipsqueak and GAGA factor act in concert as partners at homeotic and many other loci, 2002, Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A., 99(20): 1288312888.

145. Scott, K. C., Taubman, A. D. and Gcyer, P. K. Enhanccr blocking by the Drosophila gypsy insulator depends upon insulator anatomy and enhancer strength, 1999, Genetics, 153(2): 787-798.

146. Seipel, K., Georgiev, O. and Schaffner, W. Different activation domains stimulate transcription from remote ('enhancer') and proximal ('promoter') positions, 1992, Embo J, 11(13): 4961-4968.

147. Shimojima, T. Drosophila FACT contributes to Hox gene expression through physical and functional interactions with GAGA factor, 2003, Genes & Development, 17(13): 1605-1616.

148. Smale, S. T. Core promoters: active contributors to combinatorial gene regulation, 2001, Genes Dev. 15(19): 2503-2508.

149. Soeller, W. C., Oh, C. E. and Kornberg, T. B. Isolation of cDNAs encoding the Drosophila GAGA transcription factor, 1993, Mol Cell Biol, 13(12): 7961-7970.

150. Splinter, E., Heath, H., Kooren, J., Palstra, R. J., Klous, P., Grosveld, F., Galjart, N. and de Laat, W. CTCF mediates long-range chromatin looping and local histone modification in the beta-globin locus, 2006, Genes Dev, 20(17): 2349-2354.

151. Stead, M. A., Trinh, C. H., Garnelt, J. A., Carr, S. B., Baron, A. J., Edwards, T. A. and Wright, S. C. A beta-sheet interaction interface directs the tetramerisation of the Miz-1 POZ domain, 2007, J. Mol. Biol., 373(4): 820-826.

152. Stogios, P. J., Chen, L. and Prive, G. G. Crystal structure of the BTB domain from the LRF/ZBTB7 transcriptional regulator, 2007, Protein ScL, 16(2): 336-342.

153. Stogios, P. J., Downs, G. S., Jauhal, J. J., Nandra, S. K. and Prive, G. G. Sequence and structural analysis of BTB domain proteins, 2005, Genome Biol., 6(10): R82.

154. Stone, J. R., Maki, J. L., Blacklow, S. C. and Collins, T. The SCAN domain of ZNF174 is a dimer, 2002, J Biol Chem, 277(7): 5448-5452.

155. Szutorisz, H., Dillon, N. and Tora, L. The role of enhancers as centres for general transcription factor recruitment, 2005, Trends Biochem Sci, 30(11): 593-599.

156. Tolhuis, B., Palstra, R. J., Splinter, E., Grosveld, F. and de Laat, W. Looping and interaction between hypersensitive sites in the active beta-globin locus, 2002, Mol Cell, 10(6): 1453-1465.

157. Torigoi, E., Bennani-Baiti, I. M., Rosen, C., Gonzalez, K., Morcillo, P., Ptashne, M. and Dorsett, D. Chip interacts with diverse homeodomain proteins and potentiates bicoid activity in vivo, 2000, Proc Natl Acad Sci USA, 97(6): 2686-2691.

158. Travcn, A., Jelicic, B. and Sopta, M. Yeast Gal4: a transcriptional paradigm revisited, 2006, EMBO Rep, 7(5): 496-499.

159. Tsukiyama, T., Becker, P. B. and Wu, C. ATP-dependent nucleosome disruption at a heat-shock promoter mediated by binding of GAGA transcription factor, 1994, Nature, 367(6463): 525-532.

160. Vazquez, J. and Schedl, P. Sequences required for enhancer blocking activity of scs are located within two nuclease-hypersensitive regions, 1994, EMBO J, 13(24): 5984-5993.

161. Wang, Q., Carroll, J. S. and Brown, M. Spatial and temporal recruitment of androgen receptor and its coactivators involves chromosomal looping and polymerase tracking, 2005, Mol Cell, 19(5): 631-642.

162. Wilkins, R. С. and Lis, J. T. DNA distortion and multimerization: novel functions of the glutamine-rich domain of GAGA factor, 1999, J. Мої. Biol., 285(2): 515-525.

163. Williams, A. J., Blacklow, S. C. and Collins, T. The zinc finger-associated SCAN box is a conserved oligomerization domain, 1999, Мої Cell Biol, 19(12): 8526-8535.

164. Woychik, N. A. and Hampsey, M. The RNA polymerase II machinery: structure illuminates function, 2002, Cell, 108(4): 453-463.

165. Wu, С. T. and Morris, J. R. Transvection and other homology effects, 1999, Curr Opin Genet Dev, 9(2): 237-246.

166. Xiao, H., Sandaltzopoulos, R., Wang, H. M., Hamiche, A., Ranallo, R., Lee, K. M., Fu, D. and Wu, C. Dual functions of largest NURF subunit NURF301 in nucleosome sliding and transcription factor interactions, 2001, Мої Cell, 8(3): 531-543.

167. Xiao, Т., Wallace, J. and Felsenfeld, G. Specific sites in the С terminus of CTCF interact with the SA2 subunit of the cohcsin complex and are required for cohesin-dcpendent insulation activity, 2011, Мої Cell Biol, 31 (11): 2174-2183.

168. Yusufzai, Т. M. and Felsenfeld, G. The 5-HS4 chicken beta-globin insulator is a CTCF-dependent nuclear matrix-associated clement, 2004, Proc Natl Acad Sci U S A, 101(23): 8620-8624.

169. Zhao, K., Hart, С. M. and Lacmmli, U. K. Visualization of chromosomal domains with boundary element-associated factor BEAF-32, 1995, СеИ, 81(6): 879-889.

170. Zhu, X., Ling, J., Zhang, L., Pi, W., Wu, M. and Tuan, D. A facilitated tracking and transcription mechanism of long-range enhancer function, 2007, Nucleic Acids Res, 35(16): 5532-5544.

171. Костюченко, M. В., Савицкая, E.E., Георгиев, П.Г. Изучение регуляторного района гена white Drosophila mclanogaster., 2005, ДАН, 405: 128-132.

172. Максименко, О. Г., Четверина, Д.А., Георгиев, П. Г. Свойства, механизмы действия инсуляторов высших эукариот и их роль в регуляции транскрипции. , 2006, Генетика. 42: 1029- 1044.

Благодарности

Автор выражает огромную признательность Георгиеву Павлу Георгиевичу и Максименко Оксане Геннадьевне за грамотное руководство, плодотворные дискуссии, критические замечания и ценные советы. Автор благодарит Кырчанову Ольгу Викторовну, Ивлиеву Татьяну Александровну, Стахова Вячеслава Леонтьевича, Золотарева Николая Александровича, Тощакова Степана Владимировича за создание и поддержание дружеской и творческой атмосферы внутри коллектива. Автор признателен всем сотрудникам Лаборатории Регуляции генетических процессов за всестороннюю поддержку в процессе выполнения работы. Кроме этого автор приносит благодарности сотрудникам Лаборатории Регуляции экспрессии генов и сотрудникам лаборатории физики белка Института белка РАН за помощь в проведении экспериментов.

Автор благодарит дирекцию Института биологии гена за предоставление возможности проведения научных исследований.