Функциональное состояние клеток при действии ультразвуковых волн: биохимические и физиологические аспекты тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.04, кандидат наук Олешкевич, Анна Анатольевна

• Олешкевич, Анна Анатольевна
• кандидат наук
• 2017

Оглавление диссертации кандидат наук Олешкевич, Анна Анатольевна

Введение..................................................................................................................................................5

I. Обзор литературы.............................................................................................................................14

1. Действие физических факторов на клетки и активность ферментов крови............................14

§ 1.1. Факторы неакустической природы...................................................................................14

§ 1.2. Примеры разнонаправленного действия ультразвука in vivo.........................................20

2. Ультразвук и механизмы его действия........................................................................................22

§ 2.1. Применение ультразвука в диагностике и терапии.........................................................22

§ 2.2. Биологическое действие непрерывного, импульсного и амплитудно-модулированного

ультразвука..................................................................................................................................23

§ 2.3. Биохимические эффекты ультразвука на примере изменения ферментативной активности...................................................................................................................................33

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ....................................................................................................35

II. Методология и материалы исследования......................................................................................35

3. Объекты работы.............................................................................................................................35

§ 3.1. Культуры бактерий и архей...............................................................................................35

§ 3.2. Выделение лейкоцитов и получение интерферона..........................................................36

§ 3.3. Отделение эритроцитов......................................................................................................37

§ 3.4. Использование биосенсоров..............................................................................................37

§ 3.5. Домашние и лабораторные животные..............................................................................38

4. Способы ультразвукового воздействия на объекты исследования...........................................42

§ 4.1. Методика обработки суспензий клеток............................................................................42

§ 4.2. Методика обработки цельной крови и сыворотки...........................................................43

§ 4.3. Методика воздействия на лабораторных животных in vivo............................................44

5. Методы анализов...........................................................................................................................45

§ 5.1. Визуальные методы (микробиологические и гематологические)..................................45

§ 5.2. Цитохимические методы....................................................................................................46

§ 5.3. Биохимические методы......................................................................................................47

§ 5.4. Физические методы.............................................................................................................51

§ 5.5. Методы математического анализа нелинейной динамики.............................................54

III. Результаты собственных исследований.......................................................................................64

6. Действие непрерывного и модулированного ультразвука на модельные объекты................64

§ 6.1. Выбор модельных объектов...............................................................................................64

§ 6.2. Рост и эмиссия люминесцирующих бактерий Aliivibriofischeri в разных условиях ... 66 § 6.3. Действие модулированного ультразвука на рост культуры Halobacterium halobium .. 72

7. Действие ультразвука на безъядерные клетки крови животных in vitro..................................74

§ 7.1. Особенности воздействия ультразвука на тромбоциты..................................................74

§ 7.2. Особенности воздействия ультразвука на эритроциты...................................................77

8. Действие непрерывного и импульсного ультразвука на лейкоциты........................................82

§ 8.1. Жизнеспособность лейкоцитов..........................................................................................82

§ 8.2. Модели изменения жизнеспособности лейкоцитов........................................................83

§ 8.3. Влияние непрерывного ультразвука на изменение лейкограммы.................................84

§ 8.4. Действие ультразвука минимальной терапевтической интенсивности на лейкоциты

здоровых и больных животных.................................................................................................88

§ 8.5. Направления действия непрерывного ультразвука низких интенсивностей на

лейкоциты в зависимости от возраста животных....................................................................91

§ 8.6. Морфологические изменения клеток крови в непрерывном ультразвуковом поле.....95

§ 8.7. Действие импульсного ультразвука на клетки крови лошадей......................................98

9. Изучение действия амплитудно-модулированного ультразвука низких интенсивностей на клетки крови домашних животных..............................................................................................101

§ 9.1. Действие модулированного ультразвука на клетки крови здоровых мелких домашних

животных...................................................................................................................................101

§ 9.2. Результаты изучения действия амплитудно-модулированного ультразвука на клетки

крови лошадей...........................................................................................................................109

§ 9.3. Действие модулированного ультразвука на клетки крови инвазированных животных

....................................................................................................................................................118

§ 9.4. Сравнительный анализ выявляемых изменений клеток крови в поле бегущей непрерывной, импульсной и амплитудно-модулированной ультразвуковой волны.........127

10. Анализ изменений клеток крови под воздействием физических факторов.........................132

§ 10.1. Возможность использования в лабораторных исследованиях программного пакета

HarFA.........................................................................................................................................132

§ 10.2. Определение с помощью пакета HarFA сочетанного действия нескольких физических

факторов на кровь животных...................................................................................................135

§ 10.3. Самостоятельное действие температуры на клетки крови животных.......................139

§ 10.4. Статическое электрическое поле...................................................................................140

11. Изучение изменения ферментативной активности................................................................150

§ 11.1. Направления изменения активности ферментов гомеостаза в результате непрерывного

ультразвукового воздействия..................................................................................................150

§ 11.2. Изучение активности ферментов крови после действия амплитудно-модулированного ультразвука................................................................................................................................151

12. Биосинтез интерферона. Использование ультразвука в процессе биосинтеза лейкинферона .........................................................................................................................................................157

§ 12.1. Идентификация биохимическими методами полученного с использованием модулированного ультразвука интерферона..........................................................................158

13. Изучение действия ультразвука на ткани лабораторных животных in vivo........................160

§ 13.1. Результаты воздействия модулированного ультразвука на сперматозоиды мышей

in vivo.........................................................................................................................................160

§ 13.2. Действие ультразвука на лейкоциты кролика in vivo..................................................160

§ 13.3. Действие ультразвука на живого возбудителя Dirofilaria repens...............................161

IV. Обсуждение результатов.............................................................................................................162

14. Действие непрерывного и модулированного ультразвука на культуры микроорганизмов 162 § 14.1. Действие пероксида водорода, температуры, pH и белков на интенсивность

люминесценции Aliivibrio fischeri...........................................................................................163

§ 14.2. Действие непрерывного и модулированного ультразвука на бактерии Aliivibrio fischeri

....................................................................................................................................................164

§ 14.3. Действие модулированного ультразвука на культуру археи Halobacterium halobium

....................................................................................................................................................166

§ 14.4. Люминесцирующие бактерии как тест-система для оценки лекарственных препаратов

....................................................................................................................................................168

§ 14.5. Основные математические модели пролиферативной активности культуры клеток почки телёнка MDBK, интенсивности свечения Aliivibrio fischeri, динамики роста культуры Halobacterium halobium и изменения жизнеспособности лейкоцитов после ультразвукового воздействия................................................................................................................................168

15. Изменение физиологического состояния клеток крови в ультразвуковом поле.................175

§ 15.1. Особенности воздействия непрерывного ультразвука терапевтической интенсивности

на лейкоциты мелких домашних животных..........................................................................175

§ 15.2. Возрастные особенности направления действия непрерывного ультразвука низких

интенсивностей на лейкоциты мелких домашних животных..............................................184

§ 15.3. Анализ изменения состояния грануло- и агранулоцитов in vitro под действием

непрерывного и модулированного ультразвука низких интенсивностей...........................189

§ 15.4. Изменение жизнеспособности лейкоцитов..................................................................199

16. Разнонаправленное действие на клетки крови различных видов животных непрерывного и модулированного ультразвука in vitro......................................................................................203

§ 16.1. Направленное действие непрерывного ультразвука на клетки крови представителей

семейства кошачьих.................................................................................................................204

§ 16.2. Влияние амплитудно-модулированного ультразвука на физиологическое состояние

клеток крови животных семейства кошачьих........................................................................205

§ 16.3. Действие ультразвука на клетки-мишени крови собак...............................................211

§ 16.4. Действие ультразвука на клетки-мишени крови лошадей..........................................220

§ 16.5. Возможность однонаправленного изменения физиологического состояния

лейкоцитов разных видов животных с помощью модулированного ультразвука.............225

§ 16.6. Сводный анализ основных выявленных особенностей воздействия ультразвука на

клетки крови домашних животных.........................................................................................229

§ 16.7. Интегральный диагностический индекс степени влияния физического фактора на состояние клеток крови как результат фрактального анализа программным пакетом HarFA ....................................................................................................................................................248

17. Изменение активности ферментов...........................................................................................250

§ 17.1. Изменение активности аланинаминотрансферазы, аспартатаминотрансферазы,

креатинкиназы, щелочной фосфатазы и лактатдегидрогеназы после обработки крови

животных непрерывным ультразвуком..................................................................................250

§ 17.2. Изменение активности аланинаминотрансферазы, аспартатаминотрансферазы

и креатинкиназы после обработки модулированным ультразвуком крови кошачьих......252

§ 17.3. Действие модулированного ультразвука на активность ферментов крови

представителей семейства собачьих.......................................................................................253

§ 17.4. Действие модулированного ультразвука на активность ферментов крови лошадей 257

18. Получение интерферона после применения амплитудно-модулированного ультразвука. 261

§ 18.1. Влияние модулированного ультразвука на синтез интерферона...............................261

§ 18.2. Оценка интерферона. Реакция люминесцирующих бактерий на интерферон различной

концентрации (активности).....................................................................................................262

19. Действие ультразвука на ткани лабораторных животных in vivo.........................................264

§ 19.1. Количественный анализ действия модулированного ультразвука на сперматозоиды

мышей in vivo ............................................................................................................................ 264

§ 19.2. Действие ультразвука на клетки крови кролика in vivo..............................................266

Заключение.........................................................................................................................................268

Список сокращений и условных обозначений................................................................................275

Словарь терминов...............................................................................................................................276

Список литературы............................................................................................................................277

Список иллюстративного материала................................................................................................311

Приложения........................................................................................................................................317

Приложение А. Схема эксперимента.............................................................................................318

Приложение Б. Документы.............................................................................................................321

Б1. Патенты и авторские свидетельства...................................................................................321

Б2. Прочие документы................................................................................................................323

ВВЕДЕНИЕ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Функциональное состояние клеток при действии ультразвуковых волн: биохимические и физиологические аспекты»

Актуальность темы исследования

В настоящее время ультразвуковые методы являются неотъемлемой частью комплексного диагностического обследования животных и человека, что определяет актуальность изучения их физиологического воздействия на биологические объекты.

Известно, что ультразвук (УЗ) с используемыми в физиотерапии частотами 45 кГц, 1 и 3 МГц стимулирует внутриклеточные и молекулярные процессы, задействованные в реакциях воспаления и ранозаживления [254, 256, 301, 318, 323, 392]. Существуют практические руководства и рекомендации по частоте, интенсивности УЗ, времени обработки или количеству процедур при лечении целого ряда заболеваний. Однако отсутствуют, особенно в ветеринарной медицине, физиологические и биохимические основы безопасной физиотерапии, исключающей деструктивные побочные эффекты данного фактора воздействия, что определило направление наших исследований. Актуальность исследования состоит также в том, что до сих пор в физиотерапии в ветеринарной практике также не определены спектры действия (зависимость величины и знака биологического эффекта от частоты модулирующего сигнала при равноэнергетическом воздействии на биологические системы) активных частот для разных тканей домашних животных при использовании модулированного УЗ. Необходимо не только достоверно знать эффективность, но и определить биохимические и физиологические механизмы изменения состояния организма в целом, тканей и отдельных клеток.

Для различных физических факторов воздействия (электромагнитных и акустических) рядом авторов было отмечено, что модулированные волны могут оказывать более сильное воздействие, чем непрерывные волны. Применение биологически активных частот позволит получать эффекты для одной, заранее заданной, конкретной системы, не затрагивая другие. Модуляционное, по сравнению с непрерывным, воздействие на биологические системы разного уровня организации может вызывать ожидаемые ответы при уровнях энергии намного меньших. Амплитудно-модулированный УЗ может позволить получать результаты, когда непрерывное воздействие является (под)пороговым, или инициировать более сильные стимулирующие или тормозящие эффекты. Поэтому возможно будет достичь существенного снижения уровня отрицательного воздействия, а также резко уменьшить тепловое и кавитационное действие УЗ на органы и ткани при проведении исследования и терапии животного, тем самым увеличивая эффективность.

При УЗ терапии и диагностике всегда основным объектом воздействия являются клетки крови. Экспериментальные данные могут показать динамику изменения физиологического состояния клеток крови в поле непрерывной бегущей и амплитудно-модулированной УЗ волны

для определения интенсивностей, временных интервалов и диапазонов частот ингибирования или активирования внутриклеточных процессов. Установленные физиологические и биохимические изменения клеток помогают выявлять безопасные для организма диапазоны.

Проведение исследований по определению физиологических и биохимических аспектов непрерывного, импульсно- и амплитудно-модулированного акустического воздействия позволит разработать комплексную стратегию клинического использования терапевтического ультразвука (УЗ) различной частоты в диагностике и терапии.

Степень разработанности темы

Для решения поставленной научной цели нами проведено изучение и анализ публикаций материалов экспериментальных и теоретических исследований на глубину более пятидесяти лет. Проработано 227 отечественных источников и 183 зарубежных. В предыдущие годы установлена возможность разнонаправленного действия УЗ. Было показано, что в ультразвуковом поле могут возникать градиенты скорости, а объекты облучения подвергаться действию сдвиговых напряжений. Методом гемолиза эритроцитов в суспензии in vitro [208] было доказано, что высокие сдвиговые напряжения в акустических течениях становятся причиной повреждений биологических тканей. Повреждения эндотелия, наблюдаемые в кровеносных сосудах эмбрионов цыплят и в кровеносных сосудах матки мышей, обусловлены частично сдвиговыми напряжениями, возникающими из-за акустических течений, потому что именно в месте контакта жидкости с оболочкой и нарушается целостность кровеносного сосуда.

В зависимости от интенсивности и времени воздействия могут наблюдаться как активация, так и подавление функционального состояния клеток, вплоть до их повреждения [74, 76, 140, 333], что сопровождается изменением электрокинетических потенциалов клеток, систем активного и пассивного транспорта ионов через клеточные мембраны и их структурными перестройками, а также изменением биохимического состава крови [237, 275, 329, 346, 354]. Биологические эффекты УЗ многофакторны, а клеточный отклик на воздействие зависит от концентрации клеток [240]. Проявление механизма биологического действия зависит от интенсивности УЗ и времени воздействия [9, 111, 156, 200]. При воздействии акустических волн на живую клетку происходит изменение её функционального состояния, что проявляется изменением поверхностного заряда вследствие последовательного сжатия и разрежения цитоплазматических мембран (ЦПМ). Это как уменьшает, так и увеличивает количество активных каналов за счёт латеральной диффузии молекул липидного бислоя и может значительно изменить физиологическое состояние клетки [9, 154]. Указанные механизмы определяют интерес по выяснению процессов, проходящих на уровне клеток, после УЗ воздействия in vitro и in vivo. Однако в литературных источниках данные о взаимодействии

непрерывного и модулированного УЗ с подвижной тканью организма животного — кровью — или отсутствуют вовсе или представлены недостаточно. Также не указаны спектры опасных и безопасных частот модуляции при работе с УЗ терапевтических интенсивностей.

Таким образом, недостаточная научная разработанность означенной проблемы и то существенное значение, которое она приобретает для ветеринарной медицины, определяют актуальность темы, цель и задачи диссертационного исследования.

Цели и задачи

Целью исследования стало изучить физиологические и биохимические эффекты воздействия ультразвука на клетки и организм животных для характеристики разнонаправленных изменений указанных систем.

Для реализации указанной цели были поставлены задачи:

1) изучить влияние непрерывного и модулированного УЗ на клетки бактерий;

2) изучить влияние непрерывного и модулированного УЗ на клетки археи;

3) исследовать влияние in vitro непрерывного и модулированного УЗ на клетки крови здоровых животных в зависимости от вида клеток и вида животных;

4) провести исследования по изучению особенностей влияния in vitro непрерывного и модулированного УЗ на клетки крови больных и инвазированных животных;

5) изучить действие модулированного УЗ на продукцию интерферона (ИФН) лейкоцитами;

6) изучить влияние непрерывного и модулированного УЗ на активность ферментов крови разных видов животных;

7) провести испытания влияния in vivo модулированного УЗ на целый организм.

Научная новизна работы

Состоит в следующем:

1. Впервые в качестве воздействующего фактора на клетки крови различных животных применён амплитудно-модулированный УЗ и изучено его влияние. Впервые из акустического спектра действия экспериментально найдены частоты модуляции ультразвуковых волн для активного облучения (инсонации) конкретных биологических систем, позволяющие при равноэнергетическом воздействии получать биологические эффекты разного знака и амплитуд для разных частот модуляции.

2. Установлено, что воздействие модулированных УЗ волн терапевтического диапазона интенсивностей с частотой модуляции от 0.10 до 1000 Гц и временем экспозиции от 10 с до 5 мин может оказывать стимулирующее, тормозящее или разрушающее воздействие на клетки. Определены УЗ диапазоны, оказывающие эти эффекты. Впервые выявлена особая

чувствительность эритроцитов и нейтрофилов, содержащих внутриклеточных паразитов (бабезии), к воздействию модулированного УЗ.

3. Впервые показано однонаправленное стимулирующее действие непрерывного и амплитудно-модулированного УЗ на клетки люминесцирующих бактерий, архей, лейкоциты, сперматогенные клетки и выявлены оптимальные режимы воздействия: интенсивность, время и диапазоны активных частот модуляции.

3.1. Стойкий стимулирующий эффект эмиссионной активности фотобактерий вызывает трёхминутное облучение непрерывным УЗ интенсивностью 0.2-0.4 Вт/см2, амплитудно-модулированным — из диапазона активных частот 85-100 Гц при интенсивности 0.2 Вт/см2, а также 10-12 Гц при интенсивности 0.4 Вт/см2.

3.2. Стимулирующее воздействие на клетки архей оказывает УЗ интенсивностью 0.4 Вт/см2 частотой 0.25-0.7 Гц.

3.3. Стимулирующее действие на лейкомассу оказывает УЗ интенсивностью 0.05 Вт/см2, частотой модуляции 800 Гц в течение 30 с — 1 мин, на сперматогенные клетки — интенсивностью 1.0 Вт/см2, частотой модуляции 250 Гц в течение 5 мин.

4. Впервые на клетках крови, культурах микробных клеток: бактерий Aliivibrio fischeri, архей Halobacterium halobium 1001 (H. salinarum; Natrinema pallidum) — показано тормозящее, супрессорное и разрушающее действие амплитудно-модулированного УЗ как самостоятельного фактора.

5. Впервые показаны физиологические изменения in vitro грануло — и агранулоцитов в поле бегущей непрерывной и амплитудно-модулированной УЗ волны, а также особенности её влияния на ЦПМ, цитоплазму (ЦП) и ядра клеток крови различных видов животных. Выявлена видовая чувствительность к амплитудно-модулированному УЗ. Выполнены расчётно-экспериментальные исследования динамики изменения лейкограмм разных видов животных после воздействия непрерывного и модулированного УЗ.

6. Впервые выявлены особенности действия модулированного УЗ на форменные элементы крови животных с моно- и смешанными инвазиями.

7. Впервые выявлены особенности поведения клеток крови в электростатическом поле (СЭП, статическое электрическое поле) и установлена аналогия с процессами, происходящими в акустическом поле.

8. Благодаря увеличению проницаемости мембран клеток модулированный УЗ интенсифицировал процессы метаболизма, выход эндогенных (ИФН) веществ через клеточную стенку. Биохимическими методами подтверждена полноценность, отсутствие токсичности полученного ИФН.

9. Впервые показана возможность одномоментного воздействия амплитудно-модулированного УЗ из экспериментально выявленного диапазона активных частот на ряд ферментов крови (аланинаминотрансферазу [АлАТ], аспартатаминотрансферазу [АсАТ], креатинкиназу [КК], лактатдегидрогеназу [ЛДГ] и щелочную фосфатазу [ЩФ]) животного определённого вида, направленно уменьшающее активность одних, увеличивающее активность других, не затрагивая при этом активность остальных.

10. Впервые показана возможность термального воздействия на клетки крови in vitro амплитудно-модулированного УЗ терапевтического диапазона интенсивностей с частотой генерации 0.88 МГц, начиная с минимальной интенсивности 0.05 Вт/см2, и найден минимальный порог биологического действия.

11. Установлены математические модели с расчётными коэффициентами, адекватно описывающие изменение оптической плотности клеточных суспензий культур, жизнеспособности лейкоцитов и эмиссионной активности в зависимости от интенсивности непрерывного УЗ и от частоты модуляции при действии модулированного УЗ.

Теоретическая и практическая значимость работы

Результаты экспериментальных биохимических, физиологических и биофизических исследований, проведённых автором, позволили расширить представления о механизме УЗ воздействия. Созданы и верифицированы методы УЗ обработки клеток с целью активации/супрессии их физиологических процессов.

Экспериментальные данные по характеристике и особенностям влияния на клетку амплитудно-модулированного УЗ терапевтических интенсивностей в широком диапазоне частот модуляции могут быть использованы при составлении рекомендаций по подбору частотных характеристик диагностических и терапевтических приборов, а также позволят обосновать и сформулировать основные подходы к защите человека, работающего с модулированными полями.

Экспериментальные и расчётные данные по динамике клеточного отклика на акустическое воздействие могут быть использованы для обоснования возможности направленного и избирательного влияния на клетки-мишени.

Для новых биологических объектов определены активные частоты, вызывающие направленные биологические эффекты модулированного УЗ. Выявлены спектры активных частот и диапазоны интенсивностей, стимулирующих получение практически важных метаболитов (ИФН, бактериородопсин).

Разработаны: способ диагностики наличия заболевания у животных по изменению лейкограммы после ультразвукового воздействия; способ окраски тромбоцитов после

воздействия непрерывным и модулированным УЗ (рисунки 115-119 в Приложении Б1 на страницах 321-322) [149-151].

Установлено, что ведущей (основной) причиной цитоморфологических изменений под действием непрерывного УЗ является дозовая зависимость, а в случае модуляционного воздействия — диапазон активных частот и интенсивность УЗ.

Практическая значимость исследований состоит в определении диапазонов воздействия УЗ — от стимулирующего до разрушающего; в возможности применения результатов при разработке новых, более эффективных и направленных воздействий ультразвука при лечении различных патологий животных и создании новых методов в физиотерапии. Также исследования являются основой для разработки УЗ аппаратов нового поколения с программируемыми режимами физиотерапии и заданием эффективных частот модуляции при избирательном лечении ряда патологий. Научные положения, выводы и рекомендации диссертационной работы используются при чтении лекций, проведении лабораторно-практических занятий и при выполнении научно-исследовательских работ на кафедрах Радиобиологии и вирусологии имени академиков А. Д. Белова и В. Н. Сюрина, Физиологии, фармакологии и токсикологии имени А.Н. Голикова и И. Е. Мозгова, а также Информационных технологий, математики и физики ФГБОУ ВО МГАВМиБ — МВА имени К. И. Скрябина.

Методология и методы исследования

Методология проведённых исследований базировалась на теоретических, численных и эмпирических подходах. При проведении работы использовали общенаучные и специальные методы, традиционные для области ветеринарной биохимии, физиологии и биофизики: общебиологические, биохимические, биофизические, микробиологические и цитохимические, а также методы статистического анализа и биометрической обработки данных.

Объекты исследования:

1. В работе использованы: лабораторные животные (кролики, мыши), домашние животные (лошади и мелкие домашние животные [МДЖ]: собаки, кошки; другие кошачьи и собачьи). Подбор животных в группы осуществляли с учётом аналогов фоновых физиологических, клинических, биохимических и гематологических показателей, а также состояния здоровья, пола, возраста, лейкограмм, ферментного профиля сыворотки крови и пр. В группы животных входило от 8 до 18 особей.

2. Кровь животных, лейкоцитарная масса клеток, люминесцирующие бактерии ЛИшЪпо fischeri, клетки культуры археи На!оЪа^епит Иа1оЫиш, семенники лабораторных мышей.

Основные положения, выносимые на защиту

- Эффекты, возникающие при использовании непрерывного и модулированного УЗ на клетки различной природы — стимулирующие, супрессорные и разрушающие.

- Видовые и индивидуальные особенности действия непрерывного и модулированного УЗ на клетки крови и активность ферментов плазмы и сыворотки крови.

- Эффекты УЗ воздействия на организм.

Степень достоверности и апробация результатов

Достоверность и обоснованность полученных результатов и выводов подтверждена:

- проведением методически правильно организованных исследований с использованием значительного и достаточного количества экспериментальных животных и клеточных культур; результатами корреляционного и фрактального анализов, методами математической статистики;

- путём проведения сопоставления расчётных и экспериментальных данных, полученных автором, с аналитическими решениями и данными физиологических, биохимических и биофизических исследований других авторов;

- получением 3 патентов на изобретения;

- результатами работ, опубликованных в ведущих научных журналах и в трудах отечественных и международных конференций.

Основные результаты работы докладывались на Международных конференциях: «Актуальные проблемы ветеринарной медицины, зоотехнии и биотехнологии» Москва: ФГБОУ ВПО МГАВМиБ, 2014; XI International scientific and practical conference, "Modern European science". Biological science: Science and education, Англия, Шеффилд, 2014. А также на:

российской научно-практической конференции «Оценка современного состояния микробиологических исследований в Восточно-Сибирском регионе» — Иркутск, 2002;

республиканской научной конференции «Проблемы современной микробиологии и биотехнологии». — Ташкент, 2009;

VII Международной конференции «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии» — Минск, 31 мая — 4 июня 2010 г.;

Международных школах-семинарах «Физика в системе высшего и среднего образования России» — Москва, 2014 и 2015 гг.;

Международных научно-практических конференциях «Наука и образование в XXI веке» и «Научная дискуссия: вопросы математики, физики, химии, биологии» (2014); «Теоретические и прикладные вопросы науки и образования» (М., 2015);

Всероссийском симпозиуме с международным участием «Современные проблемы физиологии, экологии и биотехнологии микроорганизмов» — Москва, 2014; V Съезде биофизиков России — Ростов-на-Дону, 2015;

Международном симпозиуме "Microorganisms and the biosphere" — Uzbekistan, Tashkent,

2015;

VII Международной научно-практической конференции Дулатовские чтения — Костанай,

2016;

XI Международной научно-технической конференции «Актуальные вопросы биологической физики и химии. БФФХ — 2016» — Севастополь, 2016;

IV Международной конференции "Radiation and applications in various fields of research. RAD Conference — 2016" — Сербия, 2016.

Личный вклад автора

Диссертационная работа содержит расчётные, экспериментальные и прикладные результаты исследований, выполненные автором в МГАВМиБ — МВА имени К. И. Скрябина 2002-2016 годах. В материалах, представленных в настоящей диссертационной работе, автору принадлежит выбор направлений исследований, определение цели, постановка задач, выполнение расчётов, моделирование и интерпретация полученных результатов, обоснование и формулирование выводов. Результаты теоретических и экспериментальных исследований получены автором лично или при его определяющем участии, что нашло отражение в совместных публикациях с академиком РАН Ф. И. Василевичем, д.б.н. Т. Н. Пашовкиным, д.б.н. А. М. Носовским и другими.

Лично автором и при его непосредственном участии:

- разработана схема УЗ обработки суспензии клеток;

- проведён анализ литературных данных и на их основе отобраны начальные диапазоны частот модуляции для исследования биологических эффектов;

- получены все экспериментальные данные;

- осуществлялась обработка и анализ экспериментальных данных, полученных в период проведения исследований;

- осуществлялось научно-техническое руководство проведением всех биохимических и биофизических экспериментов по верификации авторских методов;

- созданы экспериментальные математические модели поведения клеток различной этиологии в акустическом поле;

- проведён анализ эффективности применения амплитудно-модулированного УЗ как тормозящего, стимулирующего и разрушающего фактора.

По теме диссертации опубликовано 51 научная работа в российских и зарубежных журналах, в трудах международных и всероссийских конференций, учебных изданиях, в тезисах докладов и препринтах. Из них 19 работ опубликовано в центральных рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК, 8 — в зарубежных рецензируемых журналах, цитируемых в AGRIS и Chemical Abstracts, 3 патента РФ на изобретения. Научные выводы и практические рекомендации использованы при написании 6 учебных и учебно-методических пособий.

Диссертационная работа изложена на 324 страницах текста, включая 123 рисунка, 54 таблицы, состоит из введения, четырёх разделов, состоящих из 19 глав; заключения, списка сокращений и условных обозначений, словаря терминов, списка литературы из 410 наименований, списков иллюстративного материала и двух Приложений.

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1. Действие физических факторов на клетки и активность

ферментов крови

§ 1.1. Факторы неакустической природы

Оценке влияния физических факторов акустической и электромагнитной природы на человека и животных посвящено значительное число работ [19, 21, 43, 47, 50, 54-56, 60, 62, 64, 79, 82, 84, 93, 100, 101, 109, 116, 120, 145, 158, 161, 164, 170, 171, 175-177, 180, 203, 209-211, 301, 302, 347].

Взаимодействие физических полей с биологическими тканями и клетками вследствие разной глубины проникновения может происходить как интегрально — на низких частотах, так и локально — на частотах электромагнитного излучения (ЭМИ) миллиметрового диапазона, когда во взаимодействие с полями включаются только клетки, входящие в структуры кожи и клетки крови, находящиеся в микрокапиллярах. Поэтому на сверхвысоких частотах (миллиметровый диапазон волн) биологические эффекты на уровне целого организма будут опосредованными, например, через выделение гистамина тучными клетками. Так как биологические макро — и микросистемы являются динамическими, разные клетки могут находиться на разных стадиях функционирования, а, следовательно, каждая из них может иметь разную чувствительность к фактору воздействия. Например, для ультразвуковых волн воздействие на осциллирующие эритроциты в различные фазы процесса осцилляции может приводить к разным эффектам: либо к увеличению числа осцилляций в несколько раз при сохранении уровня выброса калия из клеток, либо к сохранению числа осцилляций при существенном увеличении выброса ионов калия. [209, 210]. Поэтому максимальные эффекты физических факторов воздействия возможны при исследовании их влияния на клетки в синхронизированных культурах. Разные авторы отмечают наибольшую чувствительность к физическим факторам воздействия иммунокомпетентных клеток и клеток головного и спинного мозга.

Одной из первых мишеней воздействия физических полей на клетки является ЦПМ, имеющая поверхностный заряд, поры, каналы и мембраносвязанные ферменты. ЭМИ взаимодействует с заряженными частицами на поверхности мембраны. В системе возникают вынужденные колебания с частотой внешнего электрического поля. Ток через поверхность мембраны может иметь не непрерывный, а импульсный характер, а транспорт ионов хлора и натрия — происходить поочерёдно [53]. Концентрация электромагнитных волн в порах мембран локально повышает температуру, которая существенно превышает общий разогрев. Возникает возможность денатурации пептидных каналообразующих молекул, стрикция мембран,

приводящая к генерации акустических волн, которые, в свою очередь, могут являться фактором воздействия и служить сигналом для других клеток. Локальные разогревы в мембранных порах, стрикционные сжатия и расширения мембран могут увеличивать или уменьшать открытое состояние каналов. При импульсных ЭМИ реализуется термоэластическое возбуждение акустических волн с частотой, зависящей от частоты импульсации или модуляции. Поэтому при действии ЭМИ крайне высокой частоты (30-300 ГГц) в импульсном режиме возможно глубинное воздействие на органы человека и животных за счёт воздействия генерируемых в результате поглощения ЭМИ [ 192]. Для сверхвысокочастотных непрерывных ЭМИ показана возможность возбуждения тороидальных вихрей в воде, существующих длительное время с колоссальными скоростями перемешивания молекул, пульсирующими в сверхнизкочастотных диапазонах [302].

При воздействии акустических волн за счёт сжатия в волне клеточных мембран и реализации пьезоэффекта возможно изменение поверхностного заряда и изменение функционального состояния мембран. Таким образом, мембрана может быть мишенью, на уровне которой реализуются цепи одинаковых в дальнейшем эффектов как для акустических, так и для электромагнитных волн. Клетки, находящиеся в акустической волне, являются точечными по сравнению с длиной волны и могут испытывать сжатия и расширения объёма, достигающие 20%, при действии волн с амплитудой до 100 кПа. Это может уменьшить количество активных каналов за счёт латеральной диффузии молекул липидного бислоя и изменить функциональное состояние клетки.

Важную роль в функционировании клеток играет состояние воды, особенно вблизи заряженных поверхностей. Поэтому влияние магнитных, электромагнитных, акустических полей на воду и водные растворы, приводящее к структуризации диполей воды, может инициировать и существенное изменение функционального состояния клеток в сторону ухудшения из-за существенного уменьшения коэффициентов проницаемости различного вида ионов через неперемешиваемые слои.

Влияние переменных магнитных полей в последнее время изучается в многочисленных химических и биохимических экспериментах [198, 199]. Теория, объясняющая механизмы биологического действия магнитных полей на биологические системы, основана на факте существования биологических эффектов комбинированных (постоянного и переменного) магнитных полей при определённых, теоретически предсказуемых, значениях частот переменной компоненты поля, формально соответствующим циклотронным частотам ряда ионов (кальция, калия, магния). В основе расчёта частот воздействия лежит Ларморова прецессия как результат влияния магнитного поля на электронную орбиту с появлением дополнительного орбитального электронного тока и индуцированного магнитного момента электрона [116].

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Олешкевич, Анна Анатольевна, 2017 год

использовании

выдана для представления в Совет по

защите докторских и

кандидатских диссертаций о том, что научные положения. выводы „

рекомендации днееергаш.и докторанта ФГКОУ ВО «Московская

государственная академия ветеринарной медицины и био,ехнологии - - МВА

имени К.И. Скрябина» Олешкевич Анны Анатольевны но теме:

«Функциональное состояние клеток при действии ультразвуковых волн

(биохимические и физиологические аспекты)» на соискание учёной степени

доктора биологических наук но специальностям 03.01,04 - биохимия и

03.03.01 - физиология используется при чтении лекций, проведении

лабораторпо-практичееких занятий „ „ри выполнении научи,ь

исследовательских работ на кафедре радиобиологии и вирусологии имени

академиков А.Д. Белом и В Н. Сюрниаи и кафедре фармаколога* и

токсикологии им, А.Н. Голикова и И.Е. Мозгова.

Заведующая кафедрой фармакологии

и токсикологии им. А Н. Голикова и И.Е. Мтюа^//

доктор биологических наук, профессор _ _а%_{Ипполитоьа Т.В.)

Заведующий кафедрой

радиобиологии и вирусологии,

доктор биологических наук, профессор (щ _(Лыеенко Н.П.1

УТВЕРЖДАЮ

ФЙ^ЦЗО «Московская государственная lH^af|ioii медицины и биотехнологии УДя^Й^^^И- Скрябина», академик РАН, "рофсссор Василсвич ФЛ.

^ЗЖЫЙВКА

учебном процессе и диагностических исследованиях результат научно-исследоиагельской работы «скшранта Ф1 ВОУ ВО «Московская государе, веиная академия ветеринарной медицины и биотехнологии _ МВА имени К.И. Скрябина» Олешкевич Ан,гы Анатольевны „а тему: «Функциональное состояние «леток при действии ультразвуковых волн (биохимические и физиологические аспекты)».

Результаты исследований Олешкевич A.A. содержат данные „о взаимодействию непрерывного и ампливдио-модулироваиного ультразвука с клетками различной миологии. 13 результатах работ впервые подробно описаны изменения физиолог™ клеток крови в цате бегущей ультразвуковой волны в зависимости от вида, возраста и состояния здоровья животных, а также показаны направления изменения активности сывороточных ферментов. Материалы, рекомендации и выводы работы Олешкевич A.A. но теме: «Функциональное соооягше клеток при действии ультразвуковых волн (биохимические и физиологические аспекты)» используются „р„ чтении лекций и проведении лабораторно-практическнх занятий и при выполнении научных исследований и. кафедре физиолога,,, и ка,|,едре паразитологии и

вегерннарпо-санигарппн экспертизы.

Выдала для представления в Совет кандидатских диссертаций.

но защи ,е докторских и

Заведующая кафедрой физиологии, фармакологии и токсикологии им. А.Н. Голикова и И.Е. Мозгона

У/

(Ипполитона Т.Н.)

Рисунок 122. Справки об использовании в учебном процессе

Рисунок 123. Сертификаты об участии.