Генетическая трансформация эмбриональных клеток кур с использованием ретровирусных векторов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.02.07, кандидат биологических наук Тулякова, Анастасия Олеговна

• Тулякова, Анастасия Олеговна
• кандидат биологических наук
• 2010

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Тулякова, Анастасия Олеговна

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Особенности эмбрионального развития кур.

1.2. Методы трансгенеза в птицеводстве.

1.2.1. Микроинъекция ДНК в цитоплазму зиготы.

1.2.2. Использование вирусных векторов для переноса экзогенной ДНК в эмбриональные клетки и органы птицы.

1.2.3. Использование эмбриональных стволовых клеток.

1.2.4. Использование примордиальных зародышевых клеток (ПЗК) для получения трансгенной птицы.

1.2.5. Осеменение самок трансформированными спермиями.

1.3. Ретровирусные векторы как эффективная система переноса чужеродных генов в клетки эукариот.

1.3.1 Биологические особенности ретровирусов.

1.3.2 Создание ретровирусных векторов.

1.3.3 Пакующие линии клеток.

1.3.4 Свойства ретровирусных векторных систем и их использование для генетической модификации сельскохозяйственной птицы.

1.4 Применение трансгенных кур.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

2.1 Материалы.

2.1.1 Реактивы и оборудование.

2.2. Генные конструкции.

2.3 Работа с культурой клеток.

2.3.1 Культивирование клеток.

2.3.2 Получение первичной культуры клеток эмбриона курицы.

2.3.3 Трансформация эмбриональных клеток кур in vitro ретровирусными векторами.

2.3.4 Введение ретровирусных векторов в в эмбрионы кур in vivo.

2.4. Анализ на наличие генной конструкции.

2.5 Анализ экспрессии рекомбинантных белков.

2.5.1 Имму ногистохимия.

2.5.2 Оценка экспрессии экзогенной [3-галактозидазы.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

3.1. Результативность генетической трансформации эмбриональных клеток кур ретровирусными векторами в культуре in vitro.

3.2. Изучение факторов, влияющих на результативность получения трансгенных кур.

3.2.1. Способ и стадия введения генных конструкций в эмбрионы

3.2.2. Способ подготовки генных конструкций для инъекции и их концентрация.

3.3. Эффективность использования ретровирусных векторов, содержащих целевые гены человека, для генетической трансформации эмбрионов кур in vivo.

3.3.1. Введение в эмбрионы кур генной конструкции рХ-RSVhgh.

3.3.2. Введение в эмбрионы кур генной конструкцииpX-ins.

3.3.3. Анализ эффективности интеграции генных конструкций в органах и тканях опытных кур.

3.3.4. Анализ экспрессии рекомбинантных белков в органах и тканях опытных кур.

4. ОБСУЖДЕНИЕ.

5. ВЫВОДЫ.

6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Генетическая трансформация эмбриональных клеток кур с использованием ретровирусных векторов»

Создание генетически модифицированной птицы рассматривается в последние годы в качестве альтернативной технологии получения рекомбинатных белков человека, характеризующейся по сравнению с другими методами синтеза рекомбинатных белков (прокариотические и эукариотические клеточные системы, трансгенные животные биореакторы) относительно низкими материальными и временными затратами [Mizuarai S. et al., 2001; Harvey A. et ah, 2002; Mozdziak P. et ah, 2003; Kamihira M et a]., 2005; Kawabe Y. et al., 2006, Сураева H.M., 2008]. К важным преимуществам данной технологии производства рекомбинатных протеинов по сравнению с созданием животных-биореакторов следует отнести короткий генерационный интервал сельскохозяйственной птицы, позволяющий получать стадо продуцентов уже через полгода после получения родоначальников (для сравнения, получение стада продуцентов крупных сельскохозяйственных животных — коров, коз, свиней - требует до 3-5 лет), высокую белоксинтезирующую способность птицы, а также отсутствие патогенной микрофлоры в белке яйца. Вышеназванные преимущества обуславливают относительно невысокую стоимость получаемых рекомбинантных протеинов: затраты на производство 1 грамма рекомбинантного белка составляют около 10-25 центов, в то время как при использовании для этих целей молочной железы трансгенных животных стоимость возрастает до 100 долларов [Das R.C., 2001].

Однако традиционный метод получения трансгенных животных — микроинъекция ДНК в пронуклеус зиготы - является малоэффективным для получения трансгенной птицы, что связано, прежде всего, с особенностями ее воспроизводства и развития, а именно с трудностью в точности определения овуляции, большим количеством желтка в яйцеклетке, сильным уплотнением цитоплазмы около пронуклеусов. Все это требует поиска и разработки альтернативных методов переноса экзогенной ДНК, одним из которых является использование векторных систем на основе ретровирусов.

Цель и задачи исследований

Исходя из вышеизложенного, целью диссертационной работы являлось изучение факторов, влияющих на результативность генетической трансформации эмбриональных клеток кур с использованием ретровирусных векторов.

Для достижения указанной цели были поставлены и решены следующие задачи:

1. Изучить компетентность эмбриональных клеток кур к рекомбинантным ретровирусным векторам in vitro.

2. Определить факторы, влияющие на результативность введения рекомбинантных ретровирусов в эмбриональные клетки кур (способ и период введения, концентрация и тип используемого препарата).

3. Изучить результативность генетической трансформации модифицированными ретровирусами эмбрионов кур in vivo.

4. Оценить влияние генно-инженерных манипуляций на развитие эмбрионов кур.

5. Провести анализ интеграции и экспрессии рекомбинантной ДНК в органах и тканях трансгенных кур.

Научная новизна

Впервые исследованы механизмы доставки рекомбинантной ДНК в эмбриональные клетки кур посредством использования ретровирусных векторов, изучено влияние проводимых генно-инженерных манипуляций на эмбриогенез кур. Выявлены факторы, влияющие на эффективность генетической модификации эмбрионов кур in vivo. Дана характеристика паттернов интеграции и экспрессии рекомбинантных генов (lacZ, инсулин и гормон роста) в различных органах и тканях полученной трансгенной птицы.

Практическая значимость

Усовершенствован метод получения трансгенных кур, основанный на использовании ретровирусных векторов. Предложен усовершенствованный способ введения ретровирусных векторов в эмбрионы кур in vivo. Оптимизированы отдельные этапы технологической цепочки создания трансгенной птицы, позволяющей получать трансгенных кур с интеграцией и экспрессией генов инсулина и гормона роста в ряде внутренних органов: сердце, печени, кишечнике, желудке, яйцеводе и репродуктивных органах, а также в мышечной ткани.

Основные положения, выносимые на защиту

• Опосредованный ретровирусами перенос генов как результативный способ генетической трансформации эмбриональных клеток кур in vitro и in vivo.

• Способ подготовки, состав инъекционного препарата, стадия введения ретровирусных векторов в эмбрионы кур in vivo как факторы, влияющие на результативность получения трансгенной птицы.

• Характер интеграции и экспрессии рекомбинантной ДНК в органах и тканях трансгенных кур.

Апробация работы

Материалы диссертации были представлены на международных конференциях: «Современные достижения и проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных», Дубровицы, 2006, 2008гг.; «Актуальные проблемы биологии в животноводстве», Боровск, 2006 г.

Структура и объем работы

Диссертация изложена на 109 страницах, содержит 9 таблиц, 24 рисунка, 9 графиков, 1 схему. Библиографический список содержит 110 источников, в том числе 90 на иностранных языках.

Заключение диссертации по теме «Генетика», Тулякова, Анастасия Олеговна

5. ВЫВОДЫ

1. Установлена компетентность эмбриональных клеток кур in vitro к рекомбинантным ретровирусам, полученным на основе векторов pBMN и рХ. Частота генетической трансформации клеток-мишеней варьировала от 8,6*10"4 до 5,9*10"3 в зависимости генной конструкции и метода трансфекции.

2. Выявлены факторы, влияющие на результативность генетической модификации эмбрионов кур in vivo рекомбинантными ретровирусами. С использованием генной конструкции pBMN-lacZ получены трансгенные цыплята с частотой интеграции экзогеннойй ДНК от 28,6 до 66,7% в зависимости от метода и стадии генно-инженерных манипуляций, а так же способа подготовки и концентрации генных конструкций.

3. Установлена высокая по сравнению с контролем эмбриональная смертность в опытных группах кур после проведения генно-инженерных манипуляций с эмбрионами. Максимальный процент гибели эмбрионов выявлен в первую неделю инкубации - от 10,0 до 50,0% при аналогичном показателе в контрольной группе 1,3%.

4. Усовершенствован метод введения ретровирусных генных конструкций в эмбриональные клетки кур, позволяющий получать трансгенную птицу с эффективностью до 8,8%. Максимальная результативность трансгенеза выявлена при введении клеток-упаковщиц в дорсальную аорту 2,5-дневных эмбрионов кур в концентрации 1000 клеток/эмбрион.

ДНК генных конструкций выявлены, преимущественно, в клетках сердца, печени, желудка, кишечника, репродуктивных органов, а также мышечной ткани. При введении генных конструкций в дорсальную аорту 2,5-дневных эмбрионов установлена трансформация репродуктивных органов у 25,042,9% полученных трансгенных цыплят в зависимости от концентрации вводимых генных конструкций.

6. Показана эффективность использования ретровирусных векторов, содержащих гены инсулина и гормона роста человека, для генетической трансформации эмбрионов кур in vivo. Интеграция генных конструкций выявлена у 53,5-61,8%) развившихся эмбрионов при общей эффективности получения трансгенных цыплят 7,0-8,0%). Экспрессия рекомбинантных белков установлена, преимущественно, в клетках кишечника, печени, яйцевода, репродуктивных органов, а так же мышечной ткани.

6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Лабораториям, занимающимся генной и клеточной инженерией животных, рекомендуем для эффективной трансформации органов и тканей кур in vitro и in vivo использовать генные конструкции на основе рекомбинантных ретровирусов.

Для получения трансгенных цыплят с эффективностью 7,0-8,0% рекомендуем осуществлять введение генных конструкций на основе рекомбинантных ретровирусов в дорсальную аорту 2,5-дневных эмбрионов в виде суспензии клеток-упаковщиц.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Тулякова, Анастасия Олеговна, 2010 год

1. Абдрахманов И. К. Характеристика линий клеток, упаковывающих рекомбинантные ретровирусные векторы, в переносе экзогенной ДНК в клетки млекопитающих: автореф. диссер. канд. биол. наук.- Дубровицы. 2001. С. 22.

2. Бессарабов Б. Ф. Инкубация яиц с основами эмбриологии сельскохозяйственной птицы / М.:КолосС. 2006. С.248.

3. Брем Г., Зиновьева Н.А., Эрнст JI.K. Генные фермы новый путь производства биологически активных протеинов трансгенными животными // Сельскохозяйственная биология. 1993. №6. С.3-27.

4. Брем Г., Кройслих X., Штранцингер Г. Экспериментальная генетика в животноводстве /М.-РАСХН. 1995. С.326.

5. Волкова JI.A. Эффективность генетической трансформации соматических и эмбриональных клеток животных с использованием различных типов клеток «упаковщиц»: автореф. дисс. канд. биол. наук.-Дубровицы. 2005. С. 25.

6. Вракин В. Ф., Сидорова М. В., Панов В. П. Морфология сельскохозяйственных животных. Анатомия и гистология с основами цитологии и эмбриологии / М.:Гринлайт. 2008. С. 510-516.

7. Гистология / Под ред. Ю.И. Афанасьева, Н.А. Юрина М.: Медицина, 2002. - 695с.

8. Зиновьева Н. А., Эрнст JI. К., Брем Г. Трансгенные животные и возможности их использования: молекулярно-генетические аспекты трансгенеза в животноводстве // Дубровицы: ВИЖ. 2001.С. 128.

9. Зиновьева Н. А., Эрнст JI.K. Проблемы биотехнологии и селекции сельскохозяйственных животных // Дубровицы: ВИЖ. 2004. С. 316.

10. Микроскопическая техника: Руководство / под ред. Д.С. Саркизова, Ю.П. Перова. М.: Медицина, 1996. - 544 с.

11. Новое в клонировании ДНК. Методы. / Под ред. Д. Гловера. М.: Мир, 1989. -368с.

12. Ромейс, Б. Микроскопическая техника / Б. Ромейс. Пер. с нем. В .Я. Александрова, З.И. Кроковой М.: Изд.-во иностр. лит.-ры, 1953. - 718с.

13. Сураева Н. М., Самойлов А. В. Получение фармацевтических белков с помощью трансгенной птицы// Вестник РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН. 2009. Т. 20, №4. С. 19-23.

14. Сюрин В. Н. Вирусные болезни животных./ М.: ВНИТИБП, 1998. 363-460 с.

15. Прасолов B.C. Ретровирусные векторы эффективная система переноса и экспрессии чужеродных генов в клетках млекопитающих// Молекулярная биология. 1989. Т. 23, вып. 2. С. 8-12.

16. Титова В. А., Зиновьева Н. А., Волкова Н. А. Использование ретровирусных векторов для переноса генов в органы-мишени у сельскохозяйственных животных// Международная конференция. 2001. С. 90.

17. Эрнст JT. К., Зиновьева Н. А., Брем Г. Современное состояние и перспективы использования трансгенных технологий в животноводстве. М.: РАСХН, 2002. 341с.

18. Эрнст JI. К., Прокофьев М. И. Биотехнология сельскохозяйственных животных. М.: Колос, 1995. 192с.

19. Chapman, Hu W., Ivarie R. Rapid and improved method for windowing eggs accessing the stage x chicken embryo// Mol. Reprod. 2005. Dev. 69:31-34.

20. Barnard R., Elleder D., Young J. Avian sarcoma and leukosis virusvreceptor interactions: from classical genetics to novel insights into virus-cell membrane fusion// Virology. 2004. P. 25-29.

21. Reconstitution of a chicken breed by inter se mating of germline chimeric birds/ M. Bednarczyk et al. Poult. Sci, 2002. 81, 1347-1353.

22. Bednarczyk M., Lakota P., Siwek M. Improvement of hotchability of chicken eggs injected by biastodermal cells// Poult Sci. 2000. 79, 1823-1828.

23. Borwornpinyo S., Brake J., Mozdziak P., Petitte J. Culture of chicken embryos in surrogate eggshells// Poult. Sci. 2005. 84, 1477-1482.

24. Bosselman R., Hsu R., Boggs T, Hu S. Germline transmission of exogenous genes in the chicken // Science. 1989. 243, 533-535.

25. Brinster R., Avarbock M. Germ line transmission of donor haplotype following spermatogonial transplantation// PNAS. 1994. 91, 11303-11307.

26. Brasolot C., Chen H., Trumbauer M., Senear A., Warren R., Palmiter R. Somatic expression of herpes thymidine kinase in mice following injection of a fusion gene into eggs// Cell. 1991. 27, 223-231.

27. Carsience R., Clark M., Verrinder Gibbins A., Etches R. Germline chimeric chickens from dispersed donor blastodermal cells and compromised recipient embryos // Development. 1993. 117, 669-675.

28. Chang I., Jeong D., Hong Y., Park T. Production of germline chimeric chickens by transfer of cultured primordial germ cells// Cell Biol. Int. 1997. 21, 495-499.

29. Clark A. J. Pharmaceuticals from transgenic livestock// Trends Biotechnol. 1997. 5, 20-24.

30. Coffin J. Structure and classification of retroviruses// Plenum Press, NY. 1992. P. 19-49.

31. DCosta S., Pardue S., Petitte J. Comparative development of avian primordial germ cells and production of germ line chimeras// Avian Poult Biol Rev. 2001. 12, 151-168.

32. Das R. Production of therapeutic proteins from transgenic animals// Bio Business. 2001. P. 60-62.

33. Ebara F., Fujihara N. Reproductive characteristics of transgenic (TG) chickens carrying an exogenous gene // Asian J Androl. 1999. Vol. 1. P. 139-144

34. The receptor for the subgroup С avian sarcoma and leukosis viruses, Tvc, is related to mammalian butyrophilins, members of the immunoglobulin superfamily/ Elleder D. et al. Journal of Virology, 2005. 79, 10408-10419.

35. Emery D, Friedemann Т., Yee J. Pseudotype formation of murine leukemia virus with the G protein of vesicular stomatitis virus// Journal of Virology. 1998. 65, 1202-1207.

36. Fulton J., Delany M. Genetics. Poultry genetiresources—Operation rescue needed// Science. 2003. 300, 1667-1668.

37. Gordon J., Scongos G., Plotkin D., Sorbose J. Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA// Proc Natl Acad Sci USA. 1996. 77, 7380-7384.

38. Harvey A., Ivarie R. Validating the hen as a bioreactor for the production of exogenous proteins in egg white// Poult Sci. 2003. 82, 927-930.

39. Harvey A., Speksnijder G., Bough L., Morris J. Consistent production of transgenic chickens using replication-deficient retroviral vectors and high throughput screening procedures // Poult Sci. 2002a. 81, 202-212.

40. Harvey A., Speksnijder G., Bough L., Morris J. Expression of exogenous protein in the egg white of transgenic chickens// Nat Biotechnol. 2002b. 20, 396-399.

41. Hajkova P., El-Maarri O., Engemann S., Oswald J. DNA-methylation analysis by the bisulfite-assisted genomic sequencing method // Methods in Molecular Biology. 2002. 200, 143-154.

42. Han J., Park Т., Hong Y., Jeong D. Production of germline chimeras by transfer of chicken gonadal primordial germ cells maintained in vitro for an extended period//Theriogenology. 2002. 58, 1531-1539.

43. Hejnar J., Ha'jkova P., Plachy J., Elleder D. CpG island protects Rous sarcoma virus-derived vectors integrated into nonpermissive cells from DNA methylation and transcriptional suppression // PNAS. 2001. 98, 565-569.

44. Ivarie R. Avian transgenesis: progress towards the promise // Trends Biotechnol. 2003. 21, 14-19.

45. The developmental origin of primordial germ cells and the transmission of the donor-derived gametes in mixed-sex germline chimeras to the offspring in the chicken / Kagami H. et al. Mol. Reprod. Dev, 1997. 48, 501510.

46. Kanatsu-Shinohara M., Ogonuki N., Inoue K., Miki H. Long-term proliferation in culture and germ line transmission of mouse male germline stem cells // Biology of Reproduction. 2003. 69, 612-616.

47. Kanatsu-Shinohara M., Toyokuni S., Shinohara T. Transgenic mice produced by retroviral transduction of male germ line stem cells in vivo // Biology of Reproduction. 2004. 71, 1202-1207.

48. Karagenc L. Origin of primordial germ cells in the prestreak chick embryo//Dev. Genet. 1996. 19, 290-301.

49. Kawabe Y. Production of scFv-Fc Fusion Protein Using Genetically manipulated Quails //Biosciens and Bioengineering. 2006. Vol. 102. P. 297-303.

50. Kalina J., S~enigl F., MicVkova' A., Mucksova' J., Blaz'kova'J., Yan H., Popls^tein M., Hejnar J., Trefil P. Retrovirus-mediated in vitro gene transfer into chicken male germ line cells // Reproduction. 2007. Vol. 134. P. 445453.

51. Kamihira, Pain S., Leibo M., Cochran M. Production of chicken chimeras from injection of frozen-thawed blastodermal cells // Poult. Sci. 2005. 76, 753-760.

52. Kawabe, Coltey M., Le Douarin N. Postnatal development of a demyelinating disease in avian spinal cord chimeras // Cell. 2006. 45, 307-314.

53. Retrovirus-mediated gene transfer and expression of EGFP in chicken/ B. Koo et al. Molecular Reproduction and Development, 2004. 68, 429-434.

54. Kubota H., Avarbock M., Brinster R. Growth factors essential for selfrenewal and expansion of mouse spermatogonial stem cells // PNAS. 2004. 101, 16489-16494.

55. Koo В., Koo В., Choi В., Lee H. Development of transgenic chickens expressing enhanced green fluorescent protein// Biochemical and Biophysical Research Communications. 2006. 320, 442-448.

56. Efficient production by sperm-mediated gene transfer of human decay accelerating factor (hDAF) transgenic pigs for xenotransplantation // M. Lavitrano et al. Proc Natl Acad Sci USA, 2002. 99, 14230-14235.

57. Lavitrano M., Forni M., Bacci M., Di Stefano C. Sperm mediated gene transfer in pig: selection of donor boars and optimiza tion of DNA uptake // Mol Reprod Dev. 2003. 64, 284-291.

58. Van de Lavoir M., Diamond J., Leighton P., Mather-Love C. Germline transmission of genetically modified primordial germ cells // Nature 2006. Vol. 44. P. 766-769.

59. Li С., Song Y„ Sha J., Wang N. Production of duck-chicken chimeras by transferring early biastodermal cells // Poult Sci. 1995. 81, 1360-1364.

60. Lois C., Hong E., Pease S., Brown E. Germline transmission and tissue-specific expression of trans-genes delivered by lentiviral vectors // Science. 2002. 295, 868-895.

61. Love J., Gribbin C., Mather C., Sang H. Transgenic birds by DNA microinjection//Biotechnology. 1994. 12, 60-63.

62. McGrew M., Sherman A., Ellard F., Lillico S. Efficient production of germline transgenic chickens using lentiviral vectors // EMBO Reports. 2004. 5, 728-733.

63. McGrew M., Sherman A., Ellard F., Lillico S. Efficient production of transgenic chickens using lentiviral vectors // Transgenic Animal Research Conference IV. University of California-Davis. 2003. P. 10-14.

64. Meloun M., Militky J., Forina M. Retrovirusmediated gene delivery into male germ line stem cells // FEBS Letters. 2000. P. 7-10.

65. Mikawa Т., Fischman D., Dougherty J., Brown A. In vivo analysis of a new lacZ retrovirus vector suitable for cell lineage marking in avian and other species/ / Exp Cell Res. 1991. 195, 516-523.

66. Mizuarai S., Ono K., Yamaguchi K., Nishijima M. Production of transgenic quails with high frequency of germ-line transmission using VSV-G pseudotyped retroviral vector // Biochem Biophys Res Commun. 2001. 286, 456463.

67. Mozdziak P., Borwornpinyo S., McCoy DW., Petitte J. Development of transgenic chickens expressing bacterial beta-galactosidase // Dev Dyn. 2003. 226, 439-445.

68. Mozdziak P., Angerman-Stewart J., Rushton В., Pardue S. Isolation of chicken primordial germ cells using fluorescence-activated cell sorting // Poult. Sci. 2005. 84, 594-600.

69. Nagano M., Brinster C., Orwig K., Ryu B. Transgenic mouse produced by retroviral transduction of malegermline stem cells // PNAS. 2001. Vol. 99. P. 131-135.

70. Nagano M., Ryu В., Brinster C., Avarbock M. Maintenance of mouse male germ line stem cells in vitro // Biology of Reproduction. 2003. 68, 22072214.

71. Naito M., Nirasawa K., Oishi T. Development in culture of the chick embryo from fertilized ovum to hatching // J. Exp. Zool.1994. 254,322-326.

72. Naldini, Perry M. Development in culture of the chick embryo from cleavage to hatch // Br. Poult. Sci. 1996. 30, 251-256.

73. Naito M., Tajima A., Tagami Т., Yasuda Y. Preservation of chick primordial germ cells in liquid nitrogen and subsequent production of viable offspring// J. Reprod. Fertil. 1994a. 102, 321-325.

74. Naito M., Tajima A., Tagami Т., Yasuda Y. Production of germline chimeric chickens, with high transmission rate of donor-derived gametes, produced by transfer of primordial germ cells // Mol. Reprod. Dev. 1994b. 39, 153-161.

75. Опо Т., Machida Y. Immunomagnetic purification of viable primordial germ cells of japanese quail (Coturnix japonica) Сотр. Biochem. Physiol. Part A Mol. // Integr. Physiol. 1999. 122, 255-259.

76. Опо Т., Wakasugi N. Mineral content of quail embryos cultured in mineral-rich and mineral-free conditions // Poult. Sci. 1994. 63,159-166.

77. Pain В., Clark M., Shen M., Nakazawa H. Long-term in vitro culture and characterization of avian embryonic stem cells with multiple morphogenetic potentialities//Development. 1996. 122, 2339-2348.

78. Park Т., Jeong D., Kim J., Song G. Improved germline transmission in chicken chimeras produced by transplantation of gonadal primordial germ cells into recipient embryos // Biol. Reprod. 2003. 68, 1657-1662.

79. Pittoggi C., Beraldi R., complete culture system for the chick embryo //Nature. 2006. Vol. 331. P. 70-72.

80. Petitte J., Liu G., Yang Z. Avian pluripotent stem cells // Mechanisms of Development. 2004. 121, 1159-1168.

81. Petitte J., Clark M., Liu G., Etches R. Production of somatic and germline chimeras in the chicken by transfer of early blastodermal cells // Development. 1990. Vol. 108. P. 185-189.

82. Petitte J., Mozdziak P. Production of transgenic poultry. In: Pinkert С A. editor. Transgenic technology: a laboratory handbook second edition // New York: Elsevier Science. 2002. P. 279-306.

83. Reynaud G. The transfer of turkey primordial germ cells to chick embryos by intravascular injection // J. Embryol. Exp. Morphol. 1989. Vol. 21. P. 485-507.

84. Sang H. Prospects for transgenesis in the chick // Mechanisms of Development. 2004. 121, 1179-1186.

85. Salter, Carsience R., Etches R., Verrinder Gibbins A. The fate of female donor blastodennal cells in male chimeric chickens // Biochem. Cell. Biol. 1992. Vol. 70. P. 121-122.

86. Simkiss K., Rowlett K., Bumstead N., Freeman B. Transfer of primordial germ cell DNA between embryos // Protoplasma. 1999. 151,164-166.

87. Song Y., D'Costa S., Pardue S., Petitte J. Production of germline chimeric chickens following the administration of a busulfan emulsion // Mol. Reprod. Dev. 2005. Vol. 70. P. 438-444.

88. Speksnijder G., Ivarie R. A modified method of shell windowing for producing somatic or germline chimeras in fertilized chicken eggs // Poult. Sci. 2000. 79, 1430-1433.

89. Swift C. Origin and early history of primordial germ cells in the chick//Am. J. Physiol. 1994. Vol. 15. P.483-516.

90. Thoraval P., Lasserre F., Coudert F., Dam brine G.Somatic and germline chicken chimeras obtained from brown and white leghorns by transfer of early blastodermal cells //Poult. Sci. 1995. Vol. 73. P. 189-191.

91. Thurston R., Korn N. Spermiogenesis in comercial poultry species: anatomy and control // Poultry Science. 2000. 79, 1650-1668.

92. Trefil P., Polak J., Poplstein M., Mikus M. Preparation of fowl tetstes as recipient organs to germ-line chimeras by means of g-radiation // British Poultry Science. 2003. Vol. 44. P. 643-650.

93. Vick L., Luke G., Simkiss K. 1993. Germ-line chimaeras can produce both strains of fowl with high efficiency after partial sterilization // J. Reprod. Fertil. 1993. Vol. 98. P. 637-641.

94. Wei Q., Croy В., Etches R. Selection of genetically modified chicken blastodermal cells by magnetic-activated cell sorting // Poult. Sci. 2001. Vol. 80. P.161-168.

95. Wentworth A., Tsai H., Hallett J., Gonzales D. Manipulation of avian primordial germ cells and gonadal differentiation // Poult. Sci. 1989. Vol. 68. P. 999-1010.

96. Wentworth A., Wentworth B. The avian primordial germ cell.An enigma of germline evolution, development and immortality // Avian Poult. Biol. Rev. 2000. Vol. 11. P. 173-282.

97. Yasuda Y., Tajima A., Fujimoto Т., Kuwana T. A method to obtain avian germ-line chimaeras using isolated primordial germ cells // J. Reprod. Fertil. 2001. Vol. 96. P. 521-528.

98. Zhao D., Kuwana T. Purification of avian circulating primordial germ cells by nycodenz density gradient centrifugation // Br. Poult. Sci. 2003. Vol. 44. P. 30-35.

99. Zhu L., van de Lavoir M., Albanese J., Beenhouwer P. 2005. Production of human monoclonal antibody in eggs of chimeric chickens // Nat. Biotechnol. 2005. Vol. 23. P. 115-119.