Генетическое разнообразие хантавирусов в популяциях грызунов и насекомоядных азиатской части России тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.03, доктор биологических наук Яшина, Людмила Николаевна

• Яшина, Людмила Николаевна
• доктор биологических наук
• 2012

Оглавление диссертации доктор биологических наук Яшина, Людмила Николаевна

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. ХАНТАВИРУСЫ.

1.1. История открытия.

1.2. Экология и эпидемиология.

1.3. Структура генома хантавирусов.

1.4. Эволюция хантавирусов.

1.5. Характеристика известных хантавирусов.

1.5.1. Вирус Hantaan (HTNV) и HTNV-подобные вирусы.

1.5.2. Вирус Seoul (SEOV) и SEOV-подобные вирусы.

1.5.3. Вирус Dobrava/Belgrad (DOBV).

1.5.4. Вирус Thailand (THAI).

1.5.5. Puumala (PUUV) и PUUV-подобные хантавирусы.

1.5.6. Вирус Tula (TULV).

1.5.7. Вирусы Khabarovsk (KHAV), Vladivostok (VLAV) и Topografov (TOPV).

1.5.8. Хантавирусы насекомоядных.

1.6. Хантавирусы Нового Света.

1.7. Распространение хантавирусов в Старом Свете.

1.8. Хантавирусы азиатской части России.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Материалы.

2.2. Методы.

2.2.1. Непрямой метод флуоресцирующих антител (НМФА).

2.2.2. Выделение нуклеиновых кислот.

2.2.3. Обратная транскрипция - двухраундовая полимеразная цепная реакция (ОТ-ПЦР) и секвенирование.

2.2.4. Праймеры.

2.2.5. Филогенетический анализ.

ГЛАВА 3. ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ХАНТАВИРУСОВ -ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ГЛПС НА ДАЛЬНЕМ ВОСТОКЕ РОССИИ.

3.1. Состав генетических типов хантавирусов - возбудителей ГЛПС в Хабаровском и Приморском краях в 1996-1997 гг.

3.2. Применение тест-системы на основе ПЦР для диагностики ГЛПС и генотипирования вирусов - возбудителей.

ГЛАВА 4. ПРИРОДНЫЕ НОСИТЕЛИ ПАТОГЕННЫХ ХАНТАВИРУСОВ.

4.1. Природный резурвуар нового вируса Амур (AMRV).

4.1.1. Генетическая идентификация хантавируса, циркулирующего в популяциях восточно-азиатской мыши (A. peninsulae).

4.1.2. Филогеография вируса Амур и оценка вариабельности генома.

4.2. Природный носитель вируса Hantaan (HTNV).

4.3. Молекулярная эпидемиология вируса Seoul (SEOV) на Дальнем Востоке

России.

ГЛАВА 5. РАСПРОСТРАНЕНИЕ ХАНТАВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ У МЕЛКИХ МЛЕКОПИТАЮЩИХ НА ТЕРРИТОРИИ СИБИРИ И ДАЛЬНЕГО ВОСТОКА.

5.1. Выявление новых очагов циркуляции хантавирусов на территории Сибири, оценка инфицированности видов и установление видов животных -носителей вируса.

5.2. Эпизоотологические исследования на территории Дальнего Востока.

ГЛАВА 6. ХАНТАВИРУСЫ HOKKAIDO (HOKV) И PUUMALA (PUUV).

6.1. Новый генетический вариант вируса HOKV в Приморье и его природный носитель, красно-серая полевка (Myodes rufocanus).

6.2. Распространение вируса HOKV на территории азиатской части России и его природные носители, красно-серая полевка (М rufocanus) и красная полевка (М rutilus).

6.2.1. Анализ генетической вариабельности вируса HOKV, циркулирующего в популяциях М. rufocanus на территории Дальнего Востока.

6.2.2. Генетическая идентификация хантавируса, циркулирующего среди М. rufocanus на территории Прибайкалья.

6.2.3. Генетическая идентификация хантавируса, циркулирующего в популяциях М. rufocanus и М. rutilus на территории Западной Сибири.

6.3. Изоляты вируса PUUV из Тюменской области.

ГЛАВА 7. ХАНТАВИРУСЫ KHABAROVSK (KHAV) И VLADIVOSTOK (VLAV) И ИХ ПРИРОДНЫЕ НОСИТЕЛИ Microtus maximowiczii и Microtus fortis.

7.1. Генетическая идентификация хантавируса, циркулирующего среди дальневосточных полевок М. fortis.

7.2. Хантавирусы, циркулирующие в популяциях полевок М. fortis и М. maximowiczii.

ГЛАВА 8. ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИДЕНТИФИКАЦИЯ ХАНТАВИРУСОВ, ЦИРКУЛИРУЮЩИХ СРЕДИ НАСЕКОМОЯДНЫХ НА ТЕРРИТОРИИ СИБИРИ.

8.1. Вирус Seewis (SWSV) и его природные носители на территории Сибири.

8.2. Новые генетические типы хантавирусов, циркулирующих среди насекомоядных - Алтай (ALTV) и Lena (LNAV).

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Генетическое разнообразие хантавирусов в популяциях грызунов и насекомоядных азиатской части России»

Актуальность темы

Хантавирусы, принадлежащие к роду Hantavirus семейства Bunyaviridae, широко распространены во многих регионах мира и являются возбудителями двух клинически различных форм заболевания человека: геморрагической лихорадки с почечным синдромом (ГЛПС) в Евразии и хантавирусного легочного синдрома (XJIC) в Северной и Южной Америке (Schmaljohn & Hjelle, 1997). Первый хантавирус - вирус Hantaan - был открыт в 1976 году, когда антиген вируса - возбудителя ГЛПС был обнаружен в легочной ткани полевой мыши {Apodemus agrarius) в Корее (Lee et al., 1978). Вирусы Hantaan (HTNV), Puumala (PUUV), Dobrava-Belgrade (DOBV) и Seoul (SEOV) вызывают ежегодно до 110 ООО случаев ГЛПС различной тяжести в Евразии (LeDuc, 1989; Lee et al., 1990; Clement et al., 1997; Zhang et al., 2010). Вирусы Sin Nombre (SNV), Andes (ANDV) и еще 11 хантавирусов являются возбудителями ХЛС на американском континенте (Vahery et al., 2008).

ГЛПС занимает одно из первых мест среди всех природно-очаговых заболеваний человека в Российской Федерации с регистрацией в отдельные годы от 4 605 до 20 921 случаев (Информация Госкомстатэпиднадзора, 19972007). При этом в России отсутствуют разрешенные к применению вакцины для профилактики ГЛПС (Ткаченко и др., 2009). Инактивированные вакцины против ГЛПС выпускают и успешно используют только в двух странах - Китае и Корее (Li et al., 2010; Schmaljohn, 2009). Для лабораторного подтверждения диагноза ГЛПС в России используют тест-систему выявления специфических антител на основе НМФА.

Природным резервуаром хантавирусов являются грызуны отряда Rodentia (Plyusnin & Morzunov, 2001; Vapalahti et al., 2003). Каждый хантавирус ассоциирован с одним или несколькими близкородственными видами грызунов (Lee, 1982; Khaiboullina et al., 2005). Так, вирус HTNV циркулирует в популяциях полевой мыши (Lee et al., 1978), вирус DOBV и DOBV-подобные вирусы - желтогорлой мыши (Apodemus flavicollis) (Avsic-Zupanc et al., 1992; Gligic et al., 1992), кавказской лесной мыши (A. ponticus) (Ткаченко и др., 2005; Klempa et al., 2008) и полевой мыши (A. agrarius) (Plyusnin et al., 1999; Klempa et al., 2004; Sironen et al., 2005), вирус SEOV - серой крысы (Rattus norvegicus) (Lee et al., 1982), вирус PUUV - рыжей полевки {Myodes glareolus) (Brummer-Korvenkontio et al., 1980), вирус SNV - оленьего хомяка {Peromyscus maniculatus) (Nerurcar et al., 1993, 1994; Nichol et al., 1993), вирус ANDV -длиннохвостой рисовой крысы {Oligoryzomys longicaudatus) (Levis et al., 1998).

До недавнего времени единственным исключением из ассоциаций хантавирус - грызун был вирус Thottapalayam (TPMV), изолированный не от грызуна, а от представителя насекомоядных - азиатской гигантской белозубки (Suncus murinus), отловленной в Индии (Carey et al. 1971). В течение пяти последних лет были получены доказательства того, что природными носителями хантавирусов являются не только грызуны, но и насекомоядные отряда Soricimorpha, среди которых выявлено 10 новых хантавирусов, включая вирус Seewis (SWSV) в обыкновенной бурозубке {Sorex araneus) из Швейцарии и вирус Nova (NVAV) в европейском обыкновенном кроте {Talpa europea) из Венгрии (Song et al., 2007; Kang et al., 2009). Распространение хантавирусов, имеющих природными резервуарами насекомоядных носителей, и возможность инфицирования этими вирусами человека остаются важными нерешенными задачами.

Хантавирусы имеют одноцепочечный сегментированный РНК геном отрицательной полярности, состоящий из большого, среднего и малого сегментов, кодирующих РНК-зависимую РНК-полимеразу, предшественник двух оболочечных гликопротеинов и нуклеокапсидный белок, соответственно. Одним из критериев дифференциации видов хантавирусов является уровень различия в последовательностях среднего и малого сегментов генома: свыше 21% нуклеотидных и 7% аминокислотных различий (Nichol et al., 2005).

В настоящее время в международном комитете по таксономии вирусов зарегистрированы 23 серологически и генетически отличающихся друг от друга вида хантавирусов и их число продолжает увеличиваться (Nichol et al., 2005; Vaheri, 2008; Plyusnin, 2010). Для видовой дифференциации хантавирусов, помимо значительных генетических различий, требуется доказательство ассоциации с определенным видом (или подвидом) природного носителя, установление иммунологических различий в опытах перекрестной нейтрализации вирусов и отсутствие реассортации между геномами разных видов вирусов в природе (Elliott et al., 2000). Трудности изоляции штаммов хантавирусов привели к тому, что ряд новых генетически значительно отличающихся хантавирусов, включая все новые вирусы от насекомоядных, был идентифицирован на основании анализа фрагментов их геномов (Klempa et al., 2007; Song et al., 2007b, 2007c, 2009). Хотя для всех видов хантавирусов установлено соответствие данных генетического анализа с данными реакции нейтрализации, в литературе до выделения штаммов и их иммунологического анализа генетически отличающиеся хантавирусы называют генетическими типами, а отличающиеся группы внутри каждого генетического типа -генетическими вариантами (Gu et al., 2011; Kang et al., 2009; Mir, 2010).

Показано, что основным возбудителем ГЛПС на территории Европейской части России является вирус PUUV, циркулирующий в популяциях рыжих полевок, и 3% случаев ГЛПС ассоциированы с вирусом DOBV, носителями которого являются два вида мышей рода Apodemus: A. agrarius и A. ponticus (Ткаченко и др., 2005; Klempa et al., 2008; Tkachenko et al., 1999). В популяциях полевок рода Microtus (М arvalis и М. rossiaemeridionalis) обнаружена циркуляция вируса Tula (TULV), значение которого в этиологии ГЛПС окончательно не установлено (Mertens et al., 2011; Plyusnin et al., 1994b). Выявление и изучение распространенности различных видов хантавирусов в России продолжается, и к началу нашего исследования наименее изученным регионом была азиатская часть, на территории которой сведения о составе хантавирусов, их распространении и многообразии их естественных хозяев были ограничены.

На Дальнем Востоке России заболевание ГЛПС характеризуется значительной тяжестью по сравнению с заболеваемостью на европейской территории, тяжелые и среднетяжелые клинические формы в регионе составляют более 80% (Слонова и др., 2006). На основе иммунологического анализа вирусных штаммов в Приморском и Хабаровском краях у больных ГЛПС были выявлены серотипы HTNV и SEOV (Астахова и др., 1990; Иванов и др., 1990; Слонова и др., 1990b). К началу выполнения наших исследований установлено, что носителями хантавирусов в Дальневосточном регионе являются не менее 17 видов мелких млекопитающих (Иванов и др., 1989; Слонова и др., 1990а; Ткаченко и др., 1987). Генетический анализ циркулирующих в регионе типов хантавирусов был ограничен одним видом носителей - дальневосточной полевкой (Microtus fortis), в популяциях которой были обнаружены два новых хантавируса с неустановленной патогенностью для человека - Khabarovsk (KHAV) и Vladivostok (VLAV) (Horling et al., 1996; Kariwa et al., 1999). Данные о генетическом составе и характеристике хантавирусов - возбудителей ГЛПС, также как генетические характеристики хантавирусов, циркулирующих в популяциях других носителей вируса отсутствовали.

Ранее в 8 административных регионах Сибири при отсутствии или единичных регистрируемых клинических случаев ГЛПС были обнаружены специфические антитела к хантавирусам у 0,3-9,1% здорового населения, а также выявлено присутствие антигена вируса у различных видов мелких млекопитающих (Жуков и Сильвестров, 1999; Малкин и др., 1996; Мясников и др., 1984, 1987, 1992; Ткаченко и др. 1987; Чапоргина и др., 2002). Данные о циркулирующих типах хантавирусов были получены для ограниченной части территории: зоне тундры, Омской и Тюменской областей. Вирус PUUV, вызывающий на территории Европы преимущественно легкие формы ГЛПС, был выявлен в популяциях М. glareolus в Омской и Тюменской областях (Якименко и др., 2008; Dekonenko et al., 2003). На территории Омской области среди A. agrarius циркулирует патогенный хантавирус DOBV (Якименко и др.,

2008). Эти же авторы установили циркуляцию вируса ТЦЬУ в популяциях узкочерепной полевки (МгсгоШ ^ге^аИъ) и степной пеструшки {Lagurus \agurus). В арктической зоне у сибирских леммингов (Ьеттш хй/Угсщ) и полевок Миддендорфа {МюгоШб т1с1с1епс1ог//И) обнаружен вирус ТОРУ -потенциальный возбудитель ГЛПС, для которого, однако, достоверных случаев инфицирования человека не установлено (Якименко и др., 2008; Уара1аМ ег а1., 1999).

Состав генетических типов хантавирусов, циркулирующих в популяциях грызунов и насекомоядных на обширной территории Сибири и Дальнего Востока России, был изучен совершенно недостаточно. Вместе с тем, данные о типовом составе хантавирусов, циркулирующих на определенной территории, и их природных резервуарах имеют важное значение при разработке научно обоснованной стратегии борьбы с хантавирусной инфекцией.

Цели, задачи и методы исследования

Целью настоящей работы было комплексное молекулярно-генетическое исследование хантавирусов, циркулирующих на территории азиатской части России. Для достижения этой цели необходимо было решить следующие задачи.

1. Установить типы хантавирусов - возбудителей ГЛПС в очагах Дальнего Востока России и выявить виды носителей - природных источников ГЛПС.

2. Определить географическое распространение и видовой состав зараженных хантавирусами мелких грызунов на территории 12 административных регионов азиатской части России.

3. На основании генетической идентификации вируссодержащих образцов от мышевидных грызунов определить состав циркулирующих хантавирусов.

4. Исследовать циркуляцию хантавирусов среди новых видов природных носителей - насекомоядных.

Для выявления и идентификации хантавирусов, циркулирующих на территории азиатской части России, использовали набор молекулярно-генетических методов анализа. Выбранный подход включал выделение и генотипирование новых РНК изолятов, изучение вариабельности генома выявленных генетических типов, определение видов мелких млекопитающих -носителей хантавирусов и поиск новых очагов хантавирусной инфекции. В очагах Дальнего Востока России исследованы типы патогенных хантавирусов, обусловивших заболеваемость людей ГЛПС. Данные о составе генетических типов хантавирусов, распространенных в Сибири и на Дальнем Востоке России, были получены на основании анализа первичных вируссодержащих образцов крови больных ГЛПС и тканей легких животных. Этот подход значительно расширил возможности выявления новых хантавирусов, циркулирующих среди грызунов и насекомоядных, без их адаптации к росту в культуре клеток Vero Е6, требующей значительного времени и не увенчавшейся успехом для большинства вирусов насекомоядных.

Для решения поставленных задач нами был разработан новый вариант анализа вирусного генома методом многолокусного ОТ-ПЦР, позволяющий выявить и идентифицировать как ранее известные виды хантавирусов, так и новые генетические типы. Образцы крови больных ГЛПС и тканей легких мелких млекопитающих - природных носителей вируса были предварительно протестированы на присутствие антител к хантавирусам и/или вирусного антигена и использованы для последующего анализа методом обратной транскрипции и двухраундовой полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР). Обнаружение специфических антител в сыворотках крови больных ГЛПС и мелких млекопитающих осуществляли с помощью непрямого метода флуоресцирующих антител (НМФА), для выявления антигена в тканях легких грызунов применяли метод иммуноферментного анализа (ИФА). Генетическая идентификация хантавирусов и их природных носителей была основана на определении и анализе нуклеотидных последовательностей фрагментов трех сегментов вирусных геномов и фрагментов митохондриальной ДНК носителей, и их последующем сравнении с ранее опубликованными последовательностями геномов хантавирусов и мтДНК мелких млекопитающих из базы данных ОепВапк.

При выполнении исследований были использованы образцы (п=10681) тканей легких и крови мелких млекопитающих, собранные в ходе 23 экспедиций на территории Дальнего Востока России и Сибири, образцы крови больных ГЛПС (п=194) из очагов Дальнего Востока и Республики Башкортостан, а также образцы (п=211) от инфицированных грызунов из коллекций Хабаровской противочумной станции, НИИ эпидемиологии и микробиологии СО РАМН г. Владивостока и г. Иркутска.

Научная новизна и практическая ценность

Впервые с помощью молекулярно-генетических методов исследования образцов от больных ГЛПС и мелких млекопитающих - носителей хантавирусов получены новые данные о природных резервуарах и составе генетических типов хантавирусов, распространенных в различных ландшафтных зонах 12 административных районов азиатской части России, включая Кемеровскую, Новосибирскую, Тюменскую, Томскую, Иркутскую области, Республику Алтай, Алтайский, Красноярский,' Приморский и Хабаровский края, Амурскую и Еврейскую автономную области, о которых до наших исследований имелись фрагментарные сведения.

Впервые среди мелких млекопитающих на территории азиатской части России установлено распространение 9 генетических типов хантавирусов, носителями которых в очагах Сибири являются не только мышевидные грызуны, но насекомоядные. Выявлены ранее неизвестные природные очаги хантавирусов на территории Новосибирской, Кемеровской, Томской областей, Красноярского и Алтайского краев, Республики Алтай.

Генетическое разнообразие хантавирусов, циркулирующих на территории Сибири и Дальнего Востока, представлено новыми генетическими типами Амур (АМЯУ) и Алтай (АЪТУ), получившими свое название по месту их выделения, новыми вариантами известных широко распространенных хантавирусов HTNV, SEOV, PUUV, KHAV, VLAV и недавно выявленных хантавирусов HOKV и SWSV. Впервые получены доказательства, что природным хозяином генетического типа Амур является восточноазиатская мышь {Apodemus peninsulae), для выявленного в Сибири генетического типа Алтай - обыкновенная бурозубка (Sorex araneus).

Впервые, на основании анализа геномов РНК изолятов хантавирусов от больных ГЛПС, показано, что популяция патогенных хантавирусов на Дальнем Востоке России представлена новым для рода Hantavirus генетическим типом Амур (AMRV) и новыми генетическими вариантами вирусов HTNV (FE) и SEOV (VDV).

Для вирусов с пока неустановленной патогенностью для человека на территории азиатской части России показана циркуляция вируса HOKV, ранее обнаруженного в Японии. Природным носителем вируса HOKV на Дальнем Востоке России является красно-серая полевка (Myodes rufocanus). Впервые установлено, что в Сибири резервуарами вируса являются два вида полевок рода Myodes: Myodes rutilus и Myodes rufocanus.

На территории Сибири впервые установлена циркуляция вируса SWSV, ранее обнаруженного в обыкновенной землеройке {Sorex araneus) в Швейцарии. Впервые показано, что резервуарами вируса являются три близкородственных вида землероек рода Sores: S. araneus, S. tundrensis и S. daphaenodon.

Выявлено 11 новых очагов циркуляции хантавирусов среди полевок М. glareolus, М. rutilus, М. rufocanus, М. oeconomus, М. agrestis, М. gregalis, степных пеструшек Lagurus lagurus, мышей A. agrarius и A. peninsulae на территории Новосибирской, Кемеровской, Томской областей, Красноярского и Алтайского краев и Республики Алтай.

Фундаментальные данные о разнообразии генетических типов хантавирусов, обнаруженных в очагах Сибири и Дальнего Востока, будут использованы при уточнении классификации и таксономии хантавирусов.

Установленные нуклеотидные последовательности новых хантавирусов депонированы в базу данных GenBank.

Полученные новые знания являются основой дальнейших исследований роли новых генетических типов в патологии человека и необходимости их использования при разработке вакцин против ГЛПС и создании новых диагностических препаратов.

На основе полученных данных в ГНЦ ВБ «Вектор» совместно с ЗАО «Вектор-Бест» была разработана первая в России тест-система «Векто Ханта-РНК-ампли», использующая метод ОТ-ПЦР для выявления вирусной РНК в образцах крови больных ГЛПС и органах грызунов - носителей патогенных вирусов. Тест-система предназначена для научных исследований и использовалась для ранней диагностики и оценки эффективности противовирусной терапии, оценки эпизоотической активности природных очагов ГЛПС и исследования путей передачи вируса между природными носителями (Кушнарева и др., 2005а, 2005в, 2006; Кушнарева и Слонова, 2008; Образцов и др., 2008).

Положения, выносимые на защиту

Используя технологию выявления и идентификации хантавирусов у больных ГЛПС и мелких млекопитающих, получен ряд новых результатов, которые обосновывают следующие положения.

На исследованной территории Азиатской части России циркулирует 9 генетических типов хантавирусов; Популяция патогенных хантавирусов на Дальнем Востоке России представлена новым для рода Hantavirus генетическим типом Амур (AMRV) и новыми генетическими вариантами вирусов HTNV и SEOV. Носителем нового генетического типа Амур является восточно-азиатская лесная мышь (Apodemus peninsulae);

Для вирусов с пока неустановленной патогенностью для человека на территории азиатской части России в красно-серых полевках (Myodes rufocanus) показана циркуляция вируса HOKV, на территории Сибири резервуаром вируса HOKV являются два вида полевок рода My odes: Myodes rutilus и Myodes rufocanus;

В очагах Дальнего Востока циркулируют вирусы KHAV и VLAV, причем каждый из вирусов ассоциирован со своим носителем, полевками Microtus maximowiczii и Microtus fortis, соответственно;

Носителями хантавирусов на территории Сибири являются не только грызуны, но и насекомоядные. В обыкновенной бурозубке (Sorex araneus) выявлен ранее неизвестный генетический тип Алтай (ALTV), а в средней бурозубке (S. caecutiens) циркулирует новый генетический вариант вируса Lena (LENV), открытого в том же виде бурозубок в Республике Саха. Кроме того, в географически удаленных точках Сибири в трех близкородственных видах бурозубок S. araneus, S. tundrensis и S. daphaenodon циркулирует вирус SWSV;

Структура и объем работы

Диссертация построена по монографическому типу и состоит из введения, обзора литературы, материалов, шести глав экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы (508 ссылок). Работа изложена на 293 страницах, включая 43 рисунка и 50 таблиц.

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Яшина, Людмила Николаевна

ВЫВОДЫ

1. Впервые на основании молекулярно-генетического исследования материала от больных ГЛПС и мелких млекопитающих - носителей вирусов на территории регионов азиатской части России (Приморского и Хабаровского краев, Амурской и Еврейской автономной областей, Кемеровской, Новосибирской, Иркутской областей, Республик Алтай и Бурятии, Алтайского и Красноярского краев) установлена циркуляция 9 генетических типов хантавирусов.

2. Представлены доказательства, что возбудителями ГЛПС в очагах Дальнего Востока России являются новые генетические варианты известных вирусов HTNV (вариант FE) и SEOV (вариант VDV) и новый для рода Hantavirus генетический тип Амур (AMRV). Показано, что уровень отличия нуклеотидных и кодируемых аминокислотных последовательностей фрагмента среднего сегмента генома генетического типа Амур от HTNV (FE) составлял 15,9-21,2% и 6,3-8,9%, Амур от SEOV (VDV) - 20,2-24,8% и 16,7-17,9%, соответственно.

3. На основании сходства фрагментов генома РНК изолятов от больных ГЛПС и грызунов - носителей вируса установлено, что резервуарами генетического типа Амур и вируса HTNV (FE) являются восточно-азиатская {Apodemus peninsulae) и полевая (Apodemus agrarius) мыши, соответственно.

Впервые установлено, что в популяциях A. peninsulae на территории Приморского и Хабаровского краев циркулируют четыре филогенетически различающихся варианта генетического типа Амур (Приморье, Приморье 1-Китай, Хабаровск, Солнечный), которые группируются по географическому признаку.

В популяциях A. agrarius на территории Приморского и Хабаровского краев, Еврейской автономной и Амурской областей циркулирует генетический вариант HTNV (FE), отличающийся от вариантов вируса HTNV из Китая и Кореи в пределах 17,7% для нуклеотидных и 6,2% для аминокислотных последовательностей фрагментов всех сегментов генома.

4. Установлено, что генетический вариант вируса SEOV (VDV), циркулирующий в популяциях серой крысы {R. norvegicus) в городе Владивостоке, имеет общее происхождение с генетическим вариантом вируса из стран юго-восточной Азии (Камбоджи и Сингапура). Изолят вируса SEOV, выявленный на основе Сахалин, близок варианту вируса из Кореи, что подтверждено на основании анализа фрагмента среднего сегмента генома.

5. Выявлено 11 новых очагов хантавирусной инфекции среди полевок Myodes glareolus, М. rutilus, М. rufocanus, Microtus oeconomus, M. agrestis, M. gregalis; степных пеструшек Lagurus lagurus; мышей A. agrarius и A. peninsulae на территории Новосибирской, Кемеровской, Томской областей, Красноярского и Алтайского краев и Республики Алтай.

6. В популяциях красно-серых полевок (М rufocanus) азиатской части России впервые обнаружен вирус HOKV, который представлен пятью генетическими вариантами на территории Западной Сибири (вариант Сибирь), Восточной Сибири (варианты Байкал и Сибирь), Дальнего Востока России (варианты Шкотово-Китай и Солнечный), острова Сахалин (вариант Сахалин-Япония). Уровень различия между вариантами на основании анализа фрагментов трех сегментов вирусного генома превышал 16,8% для нуклеотидных и 2,6% для аминокислотных последовательностей. Вирус HOKV впервые выявлен и в популяциях красных полевок (М rutilus).

8. Показано что, вирус PUUV, выявленный в популяциях рыжих полевок (М glareolus) на территории Тюменской области, генетически близок вирусу PUUV, циркулирующему на территории Омской области, уровень их различия для фрагментов малого и среднего сегментов генома не превышал 3,8% и 5,0%.

9. Вирусы Khabarovsk (KHAV) и Vladivostok (VLAV) имеют самостоятельных природных хозяев: дальневосточную полевку (М. fortis) - для вируса VLAV и полевку Максимовича (М maximowiczii) - для вируса KHAV, что установлено на основании анализа последовательностей гена цитохрома b мтДНК носителей вируса. Впервые показано, что на территории Амурской области, Еврейской АО и Хабаровского края в популяциях М. maximowiczii циркулирует вирус KHAV, на территории Приморского края и Амурской области в популяциях М. fortis циркулирует вирус VLAV.

10. Впервые на территории Сибири генетически доказана циркуляция хантавирусов среди насекомоядных. Бурозубки рода Sorex являются носителями трех генетических типов хантавирусов.

Новый для рода Hantavirus генетический тип Алтай (ALTV), отличающийся от известных хантавирусов из других регионов мира более чем на 35,7% по нуклеотидным и на 30,6% по аминокислотным последовательностям фрагмента большого сегмента вирусного генома обнаружен у обыкновенной бурозубки (S. araneus) в Республике Алтай.

В Красноярском крае в популяции средней бурозубки (S'. caecutiens) выявлен генетический вариант вируса Lena (LNAV) также имеющего значительные отличия от известных хантавирусов: более 35,6% нуклеотидных и 32,1% аминокислотных различий в последовательностях фрагментов малого и большого сегментов генома.

Впервые в популяциях трех близкородственных видов бурозубок (S. araneus, S. tundrensis и S. daphaenodon) в Республике Алтай, Красноярском крае, Кемеровской и Новосибирской областях, окрестностях городов Новосибирск и Иркутск установлена циркуляция нового генетического варианта вируса Seewis (SWSV). Различия с РНК изолятом SWSV из Швейцарии составили более 16,3% по нуклеотидным и 1,4% по аминокислотным последовательностям фрагментов малого и большого сегментов вирусного генома.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящей работе впервые проведено комплексное молекулярно-генетическое изучение хантавирусов, циркулирующих на территории 12 административных регионов азиатской части России. Впервые представлены данные по генетическому разнообразию хантавирусов на обширной территории России за пределами Урала, что позволило не только подтвердить полученные ранее данные о существовании очагов хантавирусной инфекции в Сибири, но значительно расширить ареал распространения хантавирусов, состав циркулирующих генетических типов и их природных носителей на территории азиатской части России.

При анализе генетического разнообразия хантавирусов из очагов Приморского и Хабаровского краев было установлено, что возбудителями ГЛПС в этих регионах являются три генетических типа хантавирусов. Наряду с генетическими вариантами известных видов хантавирусов HTNV (вариант FE) и SEOV (вариант VDV), был выявлен новый для рода Hantavirus генетический тип, названный Амур (AMRV) по месту его выделения.

РНК изоляты генетического типа AMRV были выделены от больных с тяжелой и средней тяжести клинической формой ГЛПС в тех же очагах, где одновременно циркулировал HTNV (генетический вариант FE). Различие нуклеотидных последовательностей фрагментов М-сегмента генома двух вирусов составляло 15,9-21,2%, различие аминокислотных последовательностей - 5,1-10,3%, что соответствовало критерию различия двух видов. На основании сравнения нуклеотидных последовательностей фрагментов РНК, изолированных из крови больных ГЛПС и органов инфицированных грызунов, природным резервуаром вируса Амур установлена восточно-азиатская мышь (A. peninsulae).

Проведенные исследования по выявлению нового патогенного вируса на территории Дальнего Востока России привлекли значительный интерес зарубежных и российских исследователей. В последующих работах было установлено широкое распространение вируса Амур на территории Китая и Кореи (Baek et al., 2006; Lokugamage et al., 2002, 2004a; Wang et al., 2000). Кроме того, было показано, что новый генетический тип является и новым серотипом. Отличие генетического типа Амур от HTNV было подтверждено при исследовании штаммов, выделенных от больных и грызунов в реакции нейтрализации (Lokugamage et al., 2004; Baek et al., 2006) и при исследовании иммунных сывороток от грызунов и сывороток крови больных ГЛПС в реакции торможения гемагглютинации (Кушнарева и др., 2005с). Совокупность полученных нами и другими исследователями данных подтвердила принадлежность генетического типа AMRV к новому виду рода Hantavirus — вирусу Амур (AMRV). В дальнейшем было установлено, что доля вируса Амур в структуре заболеваемости ГЛПС в Приморском крае России в отдельные годы составляла 56% (Слонова и др., 2006).

Важно отметить, что при анализе РНК изолятов от A. peninsulae, отловленных на территории Приморского и Хабаровского краев, выявлена циркуляция четырех филогенетически различающихся вариантов вируса AMRV (Приморье, Хабаровск, Амурск и Приморье 1-Китай), что не исключает возможности отражения филогенетического разнообразия вируса AMRV в клинических проявлениях ГЛПС. В последовательностях фрагментов оболочечного белка G2, нуклеокапсидного белка и РНК-полимеразы установлены ключевые аминокислотные остатки, которые могут быть использованы для различения генетического типа AMRV от других хантавирусов.

Анализ РНК изолятов патогенного для человека хантавируса, циркулирующего в популяциях полевой мыши {A. agrarius) показал, что природным резервуаром дальневосточного варианта FE вируса HTNV является полевая мышь A. agrarius. Этот вывод согласуется с результатами, полученными при исследовании образцов от A. agrarius, обитающей на территории Кореи и Китая (Wang et al., 2000; Zou et al., 2008b). Сравнительный анализ изолятов от A. agrarius из трех стран продемонстрировал отличие генетического варианта HTNV (FE) от ранее известных вариантов вируса HTNV, циркулирующих в сопредельных странах.

При анализе материала от серых крыс - носителей вируса SEOV материковой (Владивосток) и островной (Сахалин) популяций нами установлено различие в происхождении циркулирующих в них вирусов. Выявленный у больных ГЛПС и серых крыс генетический вариант VDV имел общее происхождение с вариантом вируса, циркулирующего в серых крысах (R. norvégiens) в странах юго-восточной Азии (Камбодже и Сингапуре), в то время как РНК изолят вируса SEOV, выявленный на острове Сахалин, был близок варианту вируса из Кореи. Необходимо отметить, что случаи ГЛПС, обусловленные вариантом VDV вируса SEOV на территории города Владивостока регистрируются ежегодно и нередко отмечается средне-тяжелая и тяжелая формы заболевания, в то время как о подобных случаях в Камбодже и Сингапуре сообщений нет (Слонова и др. 2006; Reynes et al., 2003).

Изучено генетическое многообразие хантавирусов, циркулирующих в других видах мелких млекопитающих Дальнего Востока и Сибири, для которых не установлена связь с заболеваниями человека. Долгое время считалось, что источником генетически различающихся вирусов KHAV и VLAV, циркулирующих на территории Дальнего Востока, является дальневосточная полевка (Microtus fortis) (Horling et al., 1996; Kariwa et al., 1999), однако это не согласовывалось с большинством опубликованных данных, свидетельствующих о циркуляции каждого вируса в своем природном носителе (Plyusnin & Morzunov, 2001). Сравнительный анализ РНК изолятов вирусов, циркулирующих в популяциях полевок рода Microtus, и митохондриальной ДНК носителей вируса показал, что у вирусов имеются разные природные резервуары: M. fortis для вируса VLAV и M. maximowiczii для вируса KHAV. Эти данные были подтверждены результатами исследований вирусов на территории Китая и Внутренней Монголии (Zou et al., 2008а, 2008b). Важно, что в настоящей работе на основании анализа митохондриальной ДНК носителей, показано различие видов полевок, обеспечивающих циркуляцию разных генетических типов хантавирусов. Так циркуляцию KHAV и VLAV на территории Амурской области, Еврейской АО и Хабаровского края поддерживают М. maximowiczii и М. fortis, соответственно. В Приморском крае носителем вируса VLAV является М. fortis, хантавирус KHAV в этом регионе не обнаружен.

На территории азиатской части континента носителями PUUV-подобного вируса являются красно-серые и красные полевки (Иванов и др., 1990; Мясников и др., 1992; Ткаченко и др., 1987; Zhang et al., 2007). Было показано, что в красно-серых полевках на острове Хоккайдо в Японии циркулирует вирус HOKV (Kariwa et al., 1999). Тип хантавируса, циркулирующего в популяциях красных полевок (М. rutilus), не был определен. В нашем исследовании впервые получено молекулярное доказательство циркуляции вируса HOKV среди М. rufocanus на Дальнем Востоке России и в Сибири. Выявлено пять генетических вариантов вируса HOKV, циркулирующих на территории Западной Сибири (вариант Сибирь), Восточной Сибири (варианты Байкал и Сибирь), Дальнего Востока России (варианты Шкотово-Китай и Солнечный), острова Сахалин (вариант Сахалин-Япония). При сравнительном анализе РНК изолятов из разных географических регионов установлены маркерные аминокислотные остатки вируса HOKV. В дополнение к традиционному носителю вируса, красно-серой полевке (М rufocanus), на территории Сибири вирус HOKV выявлен и в красных полевках (М rutilus).

Полученные нами данные свидетельствуют о широком распространении вируса HOKV на территории Азиатской части России и его циркуляции в двух видах полевок, красно-серой полевке (М. rufocanus) и красной полевке (М. rutilus). Подобно вирусу PUUV, представленному многочисленными генетическими вариантами, циркулирующими в популяциях рыжих полевок (М. glareolus) на территории Европы и Западной Сибири (Омская и Тюменская области), вирус HOKV также представлен пятью генетическими вариантами, каждый из которых циркулирует в различных географических регионах азиатской части континента.

На территории Сибири до настоящего времени отсутствуют прямые доказательства хантавирусной инфекции у человека, то есть выявление РНК изолятов хантавирусов от больных ГЛПС и их генетическая идентификация. Выявление и идентификация вируса РЦЦУ в рыжих полевках (М. glareolus), выполненное нами в Тюменской области, а также ранее опубликованные данные о циркуляции РЦЦУ среди рыжих полевок в Тюменской и Омской областях (Якименко и др., 2008; Бекопепко е1 а1., 2003), свидетельствуют о возможной связи заболевания людей ГЛПС в этих областях с вирусом РЦЦУ. Вторым потенциальным возбудителем ГЛПС в регионе может быть вирус БОВУ-Аа, обнаруженный в полевых мышах (А. agrarius) из Омской области (Якименко и др., 2008). В России оба вируса являются возбудителями ГЛПС в европейских очагах с более легким, чем в дальневосточных очагах, клиническим течением.

До сих пор не решен вопрос о значении в патологии человека РЦЦУ-подобного вируса НОКУ. Среди исследованных образцов от больных ГЛПС из очагов Дальнего Востока нам не удалось выявить случаев, ассоциированных с вирусом НОКУ. Значительно отличающиеся от дальневосточных варианты вируса НОКУ выявлены в Сибири и на Сахалине, однако в этих регионах отсутствуют не только генетические, но и серологические данные о типах потенциальных возбудителей ГЛПС. Опубликованные данные по выявлению специфических антител у здорового населения регионов основаны на использовании комплекса антигенов хантавирусов, не позволяющего провести дифференциацию вирусов (Малкин и др., 1996). Возможность инфицирования человека вирусом НОКУ, либо каким-либо из его генетических вариантов остается предметом дальнейших исследований.

Выполненное нами исследование подтвердило широкое географическое распространение хантавирусов среди мелких млекопитающих. Выявлено 11 новых очагов циркуляции хантавирусов на территории Республики Алтай, Алтайского и Красноярского краев, Кемеровской, Томской, Омской, Тюменской, Новосибирской и Иркутской областей. Были идентифицированы вирус HOKV в M. rufocanus и M. rutilus, a также вирус PUUV в M. glareolus. Инфицированными оказались также узкочерепная полевка Microtus gregalis и степная пеструшка Lagurus lagurus, обитающие на территории Новосибирской области. В настоящем исследовании идентификация хантавирусов от этих видов не проводилась, однако ассоциация видов с хантавирусом TULV была установлена ранее в соседнёй Омской области (Якименко и др., 2008).

Впервые получены данные о зараженности хантавирусом полевых мышей (A. agrarius) на территории Восточной Сибири. Инфицированные A. agrarius были отловлены в Красноярском крае, однако проведенный анализ не позволил идентифицировать вирус, так как образцы оказались отрицательными при тестировании методом ОТ-ПЦР. Наиболее вероятна ассоциация полевых мышей с патогенным вирусом DOBV-Aa, как это было установлено ранее на территории европейской части России и в Омской области (Ткаченко и др., 2008; Якименко и др., 2008), однако нельзя исключить циркуляции в Красноярском крае вируса HTNV, носителем которого на Дальнем Востоке также являются полевые мыши. Более обоснованные предположения о типе циркулирующего вируса могут дать данные анализа мтДНК полевых мышей и их отнесение к европейскому либо дальневосточному подвидам A. agrarius. В литературе такие данные отсутствуют и для выяснения этого вопроса необходимы дальнейшие исследования. Присутствие антител к хантавирусам выявлено и у восточно-азиатской мыши (A. peninsulae) на территории Республики Алтай и Красноярского края. Попытки идентификации хантавируса в A. peninsulae оказались безуспешными. Поскольку на Дальнем Востоке с этим видом связан патогенный вирус Амур — возбудитель тяжелых и среднетяжелых форм ГЛПС, а в Сибири тяжелые формы ГЛПС не зарегистрированы, генетическая идентификация вируса и его особенностей в сравнении с дальневосточным вирусом Амур остается важной, пока нерешенной проблемой.

В последние годы значительное внимание уделялось выявлению новых видов - носителей хантавирусов среди мелких млекопитающих, в частности, насекомоядных. Нами впервые получено генетическое доказательство циркуляции хантавирусов в насекомоядных в Сибири. В Республике Алтай в обыкновенной бурозубке (Saraneus) был открыт новый ранее неизвестный генетический тип, названный Алтай (ALTV). В Красноярском крае был выявлен РНК изолят нового генетического типа Lena (LNAV), пока не опубликованного, но открытого немного ранее нашего РНК изолята на территории Республики Саха (персональное сообщение д-ра Янагихары, университет Гавайи, США). РНК изоляты генетического типа LNAV были найдены в тканях легких средней бурозубки (S. caecutiens). Установлен значительный уровень отличия нуклеотидных и аминокислотных последовательностей новых и ранее известных хантавирусов, превышающий 35,7% н.о. и 30,6% а.о. для генетического типа Алтай и 35,6% н.о. и 35,6% а.о. для генетического типа LNAV для исследованных фрагментов вирусного генома.

Кроме того, на территории Сибири установлено широкое распространение генетического типа SWSV, открытого в 2007 г. в Швейцарии. Впервые показано, что вирус SWSV встречается у нескольких близкородственных видов бурозубок S. araneus, S. tundrensis и S. daphaenodon. Очаги циркуляции вируса SWSV выявлены в Республике Алтай, Красноярском крае, Кемеровской, Новосибирской областях и в окрестностях городов Новосибирск и Иркутск.

Важнейшим нерешенным вопросом остается вопрос о патогенности хантавирусов, циркулирующих среди насекомоядных, для человека. Получено лишь косвенное доказательство инфицирования человека вирусом TPMV, основанное на выявлении антител к вирусу TPMV у людей (Okumura et al., 2007). Прямое генетическое доказательство ассоциации хантавирусов, выявленных от бурозубок и кротов, с заболеванием человека в настоящее время отсутствует. Установленная нами циркуляция вируса SWSV в окрестностях двух больших городов (Новосибирска и Иркутска), выявление двух типов вирусов SWSV и Алтай в центре туризма в окрестностях озера Телецкое

Республика Алтай) дает веские основания для исследования роли выявленных вирусов в патологии человека.

В результате проведения молекулярно-генетических исследований нами представлены генетические доказательства существования на обширной территории азиатской части России - Сибири и Дальнем Востоке - очагов хантавирусной инфекции. На основании анализа вирусных геномов РНК изолятов от больных ГЛПС и мелких млекопитающих методом многолокусного ОТ-ПЦР получены данные о генетическом разнообразии хантавирусов, циркулирующих в 12 административных регионах Сибири и Дальнего Востока, выделены новые генетические типы и генетические варианты известных видов хантавирусов, установлен круг животных — носителей обозначенных генотипов и показано значение трех генетически различных хантавирусов в заболеваемости ГЛПС в очагах Дальнего Востока.

Эти данные, совместно с полученными ранее данными по изучению природных очагов хантавирусной инфекции на территориях европейской части России, Западной Сибири и Дальнего Востока, позволили не только ответить на многолетний вопрос о наличии очагов хантавирусной инфекции на территориях от Урала до Дальнего Востока, но и показать генетическое многообразие популяций хантавирусов, связанное с различиями их природных хозяев.

Полученные данные о составе генетических типов хантавирусов найдут практическое применение при создании диагностических препаратов, при решении задачи о значении выявленных в очагах Сибири новых вирусов в патологии человека и необходимости их использования при разработке вакцин против ГЛПС.

261

Список литературы диссертационного исследования доктор биологических наук Яшина, Людмила Николаевна, 2012 год

1. Агапова E.H., Мултых Е.В., Цинкаловский И.В. Заболевания геморрагической лихорадки с почечным синдромом в одном из районов Краснодарского края // Вопросы микробиологии, эпидемиологии и клиники инфекционных болезней. Краснодар, 1968. -С. 243-249.

2. Ашмарин И.П., Воробьев A.A. Статистические методы в микробиологических исследованиях. JL: Изд-во Медгиз, 1962. - 181 с.

3. Башкирцев В.Н., Ткаченко Е.А., Дзагурова Т.К., Рыльцева Е.В. Выделение штаммов вируса геморрагической лихорадки с почечным синдромом // Вопр. вирусол. 1984. - № 4.-С. 497-502.

4. Гаранина С.Б., Шипулин Г.А., Малинин О.В., Афсари Ж.В., Журавлев В.И., Платонов А.Е. Молекулярно-генетические подходы к изучению вспышки ГЛПС в Удмуртии // Генодиагностика инфекционных болезней. Новосибирск, 2005. - С. 103-107.

5. Гаранина С.Б., Шипулин Г.А., Журавлев В.И., Платонов А.Е. Определение вирусной нагрузки у больных геморрагической лихорадкой с почечным синдромом (ГЛПС) с использованием ПЦР в реальном времени // Микробиол. эпидемиол. иммунобиол. 2007. -Т.З.-С. 66-69.

6. Горькова Т.И., Шамак Д.Р. Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом // Клин, медицина. 1973. - Т. 51. - С. 137-138.

7. Гранитов В.М. Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом в Алтайском крае // Всероссийская конференция инфекционистов. Москва-Волгоград, 1996. - С. 45.

8. Громов И.М., Ербаева М.А. Млекопитающие фауны России и сопредельных территорий. Зайцеобразные и грызуны. СПб.: Изд-во Зоол. ин-та РАН, 1995. - 522 с.

9. Деконенко, А.Е., Ткаченко, Е.А., Липская, Г.Ю. ,- Дзагурова Т.К., Иванов А.П., Иванов Л.И., Слонова P.A., Маркешин С.А., Иванидзе Э.А., Шуткова Т.М., Якименко В.В.,16,17,18.19,2021,22,23,24,25,26,27,28,29,

10. Дранов И.Ю., Тинкер Ю.А., Ткаченко Е.А. И др. Обнаружение природных очагов ГЛПС в Краснодарском крае // Актуальные проблемы мед. вирусологии. М.: Медицина, 1985. - С. 138-139.

11. Журавлев В.И., Гаранина С.Б., Кабин В.В., Шипулин Г.А., Платонов А.Е. Выявление нового природного очага вируса Добрава в Астраханской области // Вопр. вирусол. -2008.-Т. 53 (2).-С. 37-40.

12. Информация ФЦГЭ. Сведения об инфекционных и паразитарных заболеваниях // Эпидемиол. и вакцинопрофил. 2010. - № 1. - С. 74-77.

13. Кучерук B.B. Структура, топология и районирование очагов болезней человека. Из книги: Итоги развития учения о природной очаговости болезней человека и дальнейшие задачи. -М., 1972.-С. 180-312.

14. Кушнарева Т.В., Максема И.Г., Образцов Ю.Г., Иванис В.А. Детекция РНК хантавирусов у больных ГЛПС и оценка эффективности этиотропной терапии с помощью метода ПЦР // Журн. микробиол. 2006. - № 3. - С. 99-101.

15. Кушнарева Т.В., Слонова P.A. Роль прямого пути передачи хантавирусов возбудителей геморрагической лихорадки с почечным синдромом среди мышей рода Apodemus // Тихоокеанский медицинский журнал. - 2008. - № 2. - С. 57-60.

16. Малкин А. Е., Мясников Ю. А., Рыльцева Е. В., Ткаченко Е.А. Ландшафтное районирование природных очагов ГЛПС в России // Медицинская паразитол. и паразитар. болезни. 1996. - № 2. - С. 27-32.

17. Марунич H.A., Фигурнов В.А., Дзюба О.В., Гаврилов A.B. Итоги изучения ГЛПС в Верхнем Приамурье // Дальневост. мед. журн. 2002. - Т 1. - С. 35.

18. Морозов В.Г., Ткаченко Е.А., Рощупкин В.И., и др. // Мед. вирусол. 2006. - Т. 23. - С. 230-236.

19. Морозов В.Г., Морзунов С.П., Хайбуллина С.Ф., Генетическая идентификция хантавирусов в крови борльных геморрагической лихорадкой с почечным синдромом // Эпидемиол. и инфекц. бол. 2004. - № 2. - С. 43-47.

20. Мясников Ю. А., Ткаченко Е.А., Иванов А. П., Резапкин Г.П., Рыльцева Е.В., Лебедев Е. П. Природные очаги геморрагической лихорадки с почечным синдромом на территории Омской области // Природно-очаговые инфекции и инвазии. Омск, 1984. - С. 134-140.

21. Мясников Ю.А., Апекина Н.С., Зуевский А.П., Хитрин A.B., Бернштейн А.Д. Размещение природных очагов геморрагической лихорадки с почечным синдромом в различных ландшафтных зонах Тюменской области // Вопр. вирусол. 1992. - Т. 37(3). - С. 161-165.

22. Образцов Ю.Г., Попов А.Ф., Иванис В.А., Кушнарева Т.В. Этиотропная терапия геморрагической лихорадки с почечным синдромом // Тихоокеанский медицинский журнал. 2008. -№ 2. - С. 69-71.

23. Платонов А.Е., Карань Л.С., Гаранина С.Б., Шопенская Т.А., Колясникова Н.М.,46.