Генодиагностика рака: оптимизация методов выявления мутантных аллелей в ДНК тканей и биологических жидкостей организма тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.01.12, кандидат наук Кондратова, Валентина Николаевна

• Кондратова, Валентина Николаевна
• кандидат наук
• 2015

Оглавление диссертации кандидат наук Кондратова, Валентина Николаевна

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Циркулирующие ДНК и РНК: биологическая роль

1.1.1. Горизонтальный перенос информации

1.1.2. Внеклеточные ДНК и РНК как продукты распада

1.2. Циркулирующие ДНК и РНК: маркеры опухоли

1.2.1. Концентрация ДНК

1.2.2. Размеры фрагментов

1.2.3. Генные мутации

1.2.4. Аберрантное метилирование

1.2.5. Потеря гетерозиготности

1.2.6. Вирусные нуклеиновые кислоты

1.2.7. Циркулирующие РНК

1.3. Жидкостная биопсия: проблемы

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Выделение нуклеиновых кислот

2.2. Полимеразная цепная реакция

2.3. Секвенирование

2.4. Электрофорез ДНК

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1. Изотахофорез нуклеиновых кислот 30 .

3.1.1. Теоретическое обоснование метода

3.1.2. Практическая реализация метода

3.1.3. Количественная экстракция нуклеиновых кислот

3.1.4. Выводы 39 .

3.2. Количественная денситометрия ДНК

3.2.1. Материалы и методы

3.2.2. Результаты

3.2.3. Выводы

3.3. Сопоставление методов выявления мутаций

3.3.1. Материалы и методы

3.3.2. Результаты

3.3.3. Выводы

3.4. Опухоли полости рта: циркулирующие вирусные ДНК

3.4.1. Материалы и методы

3.4.2. Результаты

3.4.3. Выводы

3.5. Сателлитные РНК как маркеры опухолевого роста

3.5.1. Материалы и методы

3.5.2. Результаты

3.5.3. Выводы

4. ОБСУЖДЕНИЕ

ВЫВОДЫ

ПУБЛИКАЦИИ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ:

БФС - бромфенол синий

ВЭБ - вирус Эпштейна-Барр

ГИТЦ - гуанидинизотиоцианат

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ДОПР - другие опухоли полости рта

кДа - килодальтон

кДНК - комплементарная ДНК

КЦ - ксиленцианол

ЛЦР - лигазная цепная реакция

микроРНК - малые некодирующие молекулы РНК

мкг - микрограмм

мкл - микролитр

МКИ - межквартильный интервал

мРНК - матричная РНК

мтДНК - митохондриальная ДНК

нг - нанограмм

ОТ-ПЦР - обратная транскрипция-полимеразная цепная реакция

ОТ-ПЦР-РВ - обратная транскрипция-полимеразная цепная реакция в

реальном времени

ПААГ - полиакриламидный гель

п.о. - пара оснований

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ПЦР-РВ - ПЦР в реальном времени

РНГ - рак носоглотки

РНК - рибонуклеиновая кислота

рРНК - рибосомная РНК

т.п.о. — тысячи пар оснований

тРНК - транспортная РНК

ультразвуковое исследование ультрафиолетовый цвет циркулирующая ДНК Encyclopedia of DNA Elements

threshold cycle (пороговый цикл в ПЦР в реальном времени)

deoxyribonucleotide triphosphates (дезоксирибонуклео-зидтрифосфаты)

High Resolution Melting Analysis (анализ плавления ДНК в режиме высокого разрешения) Loss of Heterozygocity (потеря гетерозиготности) mutant allele specific amplification (специфическая амплификация мутантного аллеля) молекулярный вес

Restriction-endonuclease-mediated selective PCR (ПЦР с применением рестриктазной обработки) restriction fragment length polymorphism (полиморфизм длин рестрикционных фрагментов) peptide nucleic acids (пептидные нуклеиновые кислоты) relative fluorescence units (относительные единицы флуоресценции)

пик плавления (отрицательная первая производная зависимости флуоресценции от температуры) serum amyloid Р component (белок сыворотки крови) -sodium dodecyl sulphate (додецилсульфат натрия) single strand conformation polymorphism термостабильная ДНК-полимераза, выделенная из бактерии Thermus aquaticus

Terminal Deoxynucleotidyl Transferase (терминальная де-зоксинуклеотидилтрансфераза)

10 мМ Трис, 0,1 мМ EDTA температура плавления ДНК Uracil-DNA Glycosylase (урацил ДНК гликозилаза) wild type (дикий тип)

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Генодиагностика рака: оптимизация методов выявления мутантных аллелей в ДНК тканей и биологических жидкостей организма»

ВВЕДЕНИЕ

Циркулирующие в кровотоке внеклеточные нуклеиновые кислоты, обнаруженные впервые в 1948 г. и остававшиеся вне поля зрения исследователей на протяжении почти 50 лет, стали в последние годы объектом пристального внимания клиницистов и экспериментаторов в качестве перспективных опухолевых маркеров [1]. В крови онкологических больных были обнаружены происходящие из опухолевых клеток фрагменты ДНК с характерными аберрациями (мутантный онкоген К-RAS, измененные микросателлитные последовательности, метилированные CpG-островки в промоторах генов-супрессоров) [2-7], а затем было показано присутствие в ней «опухолевых» мРНК [8,9] и микроРНК [10,11].

Тестирование плазмы крови онкологических больных на предмет присутствия в ней нуклеиновых кислот, ассоциированных с опухолевым ростом, служит нескольким целям. Во-первых, такая «жидкостная биопсия» (liquid biopsy [12]) становится необходимой в тех нередких, особенно на ранней стадии процесса, случаях, когда присутствующий в биоптате клон мутантных клеток, ответственных за лекарственную устойчивость опухоли, количественно незначителен [12,13] (кроме того, одиночный биоптат обычно не дает полного представления о клональной гетерогенности и мутационном «профиле» всей опухоли [14]). Во-вторых, жидкостная биопсия, будучи малоинвазивным диагностическим подходом, может выполняться многократно и до и после удаления опухоли, что позволяет следить за ходом заболевания и оценивать эффективность лечения.

Вместе с тем, этот многообещающий подход технически довольно труден, поскольку нуклеиновые кислоты присутствуют в крови в очень низких концентрациях, сильно фрагментированы и, кроме того, искомые «опухолевые» последовательности обычно разведены большим избытком последовательностей дикого типа. Эти обстоятельства предъявляют высокие требования к методам их выделения и анализа.

Цель работы: разработка новых и усовершенствование ряда существующих методов выделения и анализа циркулирующих в крови нуклеиновых кислот - маркеров опухолевого роста.

Задачи работы:

1. Разработать метод количественного выделения нуклеиновых кислот из биологических жидкостей организма.

2. Разработать способ количественной денситометрии ДНК.

3. Сопоставить эффективность существующих методов определения мутаций.

4. Оценить эффективность жидкостной биопсии рака носоглотки посредством определения в плазме крови ДНК ВЭБ.

5. Оценить диагностическую значимость феномена аберрантной экспрессии в раковых клетках сателлитных ДНК.

Научная новизна. Впервые показано присутствие в плазме крови человека гетерогенной популяции некодирущих РНК, транскрибируемых на сателлитных последовательностях НБАТП и ОБАТП. Проведенное в пилотном исследовании сопоставление плазмы крови здоровых доноров и онкологических больных (рак толстой кишки) обнаружило статистически значимые различия в соотношении транскриптов НБАТИ/ОЗАТИ.

Практическое значение:

1. Разработан метод изотахофореза для количественного выделения нуклеиновых кислот из биологических жидкостей организма.

2. Разработан денситометрический метод определения концентрации ДНК.

3. Проведено сопоставление числа копий ДНК ВЭБ в плазме крови больных раком носоглотки и другими опухолями полости рта (этот показатель характеризует активность процесса). Плавление вирусных ампликонов обнаруживает в ряде случаев их возможный полиморфизм.

4. Впервые получены данные о возможной диагностической значимости присутствующих в крови сателлитных РНК.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Движущей силой канцерогенеза является многоступенчатый процесс накопления в клетке дефектов генов, ответственных за деление, репарацию ДНК, апоптоз, межклеточные взаимодействия и др. Фундаментальные открытия последнего времени, обусловленные применением методов массового параллельного секвенирования и реализацией проекта ENCODE (Encyclopedia of DNA Elements), открывают новые практические возможности: идентифицируют новые, способные служить диагностическим целям опухолевые маркеры. Действительно, обнаружение в самой опухолевой ткани или в биологических жидкостях организма опухоль-специфических (или опухоль-ассоциированных) молекул (мРНК, микроРНК, вирусных ДНК) или молекулярных дефектов (мутаций или аберрантно метилированных последовательностей) дает важную информацию об онкологическом процессе (сигнализирует о его начале или прогрессировании, о прогнозе заболевания, о чувствительности опухоли к разным видам терапии). При этом значимость того или иного показателя как маркера определяется не только его функциональными свойствами, но и такими факторами, как степень ассоциации с онкологической патологией (насколько часто встречается при разных опухолях), простота и надежность выявления.

Главная задача экспериментальной онкологии, - выявление фундаментальных различий нормальной и раковой клеток, - решается посредством секвенирования их геномов, экзомов и эпигеномов (большая «глубина прочтения» позволяет оценить клональную гетерогенность опухоли и проследить за эволюцией отдельных клонов) [15]. Мутации, наиболее часто обнаруживаемые в таких исследованиях (driver mutations), подвергаются затем углубленному экспериментальному анализу и становятся, в ряде случаев, объектом клинического тестирования. В отличие от широкомасштабных экспериментов, направленных на выявление всех мутаций в опухоли и выяснение их роли в канцерогенезе, верифицирующие и диагностические исследования имеют дело с ограниченным набором отобранных «мишеней» [16].

При идентификации генетических опухолевых маркеров возникает ряд проблем, обусловленных чрезвычайной сложностью и разнообразием патогенеза опухолевого роста. Так, во-первых, число генетических маркеров чрезвычайно велико и они не ассоциированы жестко с конкретным видом опухоли, поскольку трансформация клетки может осуществляться разными способами (опухолевый фенотип может быть детерминирован разными генотипами). Выявлено -140 генов, «принадлежащих» 12 сигнальным путям, мутации которых (драйвер-мутации, driver mutations) способны трансформировать клетку [17]. Поскольку для возникновения опухоли достаточно в среднем 2-8 драйвер-мутаций (из множества возможных), то существует, очевидно, обилие вариантов достижения одного и того же результата. Таким образом, многообразие комбинаций генетических дефектов, лежащих в основе канцерогенеза, обусловливает «индивидуальность» молекулярного профиля конкретной опухоли. В результате, близкие по гистогенезу опухоли могут иметь разные маркеры, а далекие по происхождению опухоли, напротив, могут иметь общие маркеры.

Во-вторых, вследствие так называемой «ветвящейся» (branched) эволюции [18] опухоли становятся клонально гетерогенными и одиночный биоптат не дает, как правило, адекватного представления о ней. Об этом свидетельствуют проведенные недавно исследования. Так, в одном из них из четырех опухолей рака почек и их метастазов получили 30 биоптатов, в которых определяли экзомные мутации, хромосомные аберрации, плоидность. Результаты сопоставления оказались следующими: а) две трети мутаций были не универсальны (обнаружены лишь в индивидуальных биоптатах); б) разные участки одной опухоли имели диаметрально противоположные прогностические показатели; в) инактивирующие мутации генов-супрессоров SETD2, PTEN, KDM5C различались в разных участках одной опухоли, что свидетельствует о конвергентной фенотипической эволюции (т.е., о том, что разные клетки приобретают эти мутации независимо одна от другой); г) большинство (26 из 30) биоптатов имели различный аллельный дисбаланс; д) внутриопухолевая гетерогенность эволюционирует, как оказалось, по ходу заболевания.

Полученные данные ставят под сомнение саму возможность индивидуализированной терапии рака [19] - главной задачи современной онкологии, непременным условием которой является определение молекулярного «профиля» конкретной опухоли. Дело в том, что одиночные биоптаты недостаточно, как правило, репрезентативны, а исчерпывающе исследовать всю массу опухоли вряд ли возможно технически.

Возможным решением проблемы становится жидкостная биопсия, основанная на анализе нуклеиновых кислот плазмы крови [12,20] и мочи [21-24]. Поскольку присутствующие в этих биологических жидкостях нуклеиновые кислоты происходят, по всей вероятности, из всех обновляющихся тканей организма [25], можно предполагать их высокую репрезентативность. Выделение и последующий анализ этих «циркулирующих» молекул может способствовать эффективной диагностике онкологического заболевания, определению прогноза его течения и чувствительности к определенному виду терапии, обеспечению постоянного мониторинга опухолевого роста для предсказания рецидива или метастаза и оценки эффективности предпринятых мер.

В нижеследующих разделах обзора литературы рассматриваются фундаментальные и прикладные аспекты исследования внеклеточных, циркулирующих в организме нуклеиновых кислот.

1.1. Циркулирующие ДНК и РНК: биологическая роль

Циркулирующие в кровотоке внеклеточные нуклеиновые кислоты еще относительно недавно рассматривали как генетический «мусор», возникающий вследствие клеточного распада, на пути к его удалению из организма. Новые методические возможности (в частности, высокопроизводительное полногеномное секвенирование) значительно расширили и во многом изменили наши представления о природе, возможных функциях и диагностическом потенциале этих молекул. Присутствие в кровеносном русле как здоровых лиц, так и онкологических больных «свободных» ДНК и РНК обусловлено, по-видимому, разными процессами: клеточным распадом и клеточной секрецией [2 6,27]. Приходит понимание того, что тогда как одна часть этих молекул - следствие клеточной гибели и распада, то другая опосредует горизонтальный перенос генетической информации, представляя собой особый вид гуморальной регуляции. В свободном состоянии или в составе специализированных органелл (экзосом) эти молекулы в нормальных условиях играют важную роль в межклеточной кооперации, а в организме онкологического больного - во взаимодействии и взаимовлиянии опухолевых и нормальных клеток [28-31].

1.1.1. Горизонтальный перенос информации

Уже в первых работах, посвященных внеклеточным ДНК [32], высказывалось предположение об их активной клеточной секреции [33,34], встреченное в то время весьма скептически как нечто экзотическое и маловероятное. Начиная с идентификации «опухолевых» ДНК в плазме крови онкологических больных [3,4,35] и далее, в последующей за ними лавине работ (см. [1,3 6-38]), главенствующим было представление о клеточном распаде (апоптотическом или некротическом) как единственно возможном механизме их появления. Этот взгляд не предполагал у этих молекул каких-либо биологических функций. Однако, с течением времени появились свидетельства участия содержащихся в апоптотических

тельцах фрагментов ДНК в «горизонтальном» переносе генетической информации, способном трансформировать нормальные клетки [39,40].

В организме существуют разные способы кооперации клеток -межклеточные контакты, нервная и эндокринная системы. В последние годы стало очевидно, что есть еще одна система, осуществляющая транспорт (трафик) биологически активных соединений. Внеклеточные везикулы (экзосомы, эктосомы, апоптотические тельца), - окруженные двуслойной липидной мембраной пузырьки нанометрового масштаба, - доставляют свой «груз» (молекулы белков, ДНК, мРНК, микроРНК) в клетки-реципиенты (Нобелевская премия по медицине и физиологии 2013 г.). Биогенез везикул разного типа различен и, по-видимому, имеет специфические особенности в зависимости от типа клеток, из которых они происходят [29]. Общим для них, однако, является клеточно-специфичный и неслучайный набор белков и нуклеиновых кислот. Следует отметить, что спектр мРНК в экзосомах отличен от такового в клетках-донорах [31].

Получившие применительно к раковым клеткам название «онкосом», эти структуры осуществляют «горизонтальный» транспорт мутантных белков и нуклеиновых кислот в соседние и отдаленные клетки, стимулируя тем самым ангиогенез, воспаление, метастазирование. Эти, по образному выражению, «записки в бутылке» мигрируют между клетками опухоли и ее окружения, опосредуя их взаимные влияния [2 8]. Взаимоотношения опухоли и ее окружения носят двунаправленный характер [41]. Так, экзосомы, происходящие из клеток стромы рака молочной железы, стимулируют миграцию и инвазивность раковых клеток, причем опосредован этот эффект сигнальным путем \Vnt-PCP [42]. При исследовании экзосом клеток меланомы обнаружен феномен «обучения» ими (опосредовано через рецепторную тирозинкиназу МЕТ) клеток костного мозга, способствующих формированию метастазов [4 3].

В развитие ранних представлений о секретируемой клетками ДНК [33,34] выдвигается еще одна концепция так называемой «метаболической» ДНК,

возникающей посредством эндорепликации и существующей в составе липопротеидных комплексов («виртосом»). Именно таково, по мнению авторов, происхождение основной массы циркулирующих ДНК (цДНК), и именно так происходит передача жизненно важной генетической информации от клетки к клетке [4 4]. При исследовании больных раком толстой кишки установлено, что спустя 2 года после хирургического удаления опухоли плазма их крови сохраняет способность трансформировать клетки №Н-ЗТЗ (последние способны вызывать опухоли у бестимусных мышей). Обнаружение в этих мышиных клетках последовательностей ДНК человека (в частности, онкогена К-Л45) однозначно свидетельствует в пользу горизонтального переноса ДНК как фактора раковой трансформации [4 5].

Экзосомы, циркулирующие в биологических жидкостях организма и транспортирующие биологически активные молекулы, представляют большой интерес и как источник важной информации о самой опухоли, и как возможная мишень таргетной терапии [30].

1.1.2. Внеклеточные ДНК и РНК как продукты распада

Давно известно, что в крови человека и животных присутствуют в свободной форме внеклеточные нуклеиновые кислоты разных типов, и что их содержание повышается при патологических процессах, сопряженных с усиленным клеточным распадом (воспаление, травма, онкологическое заболевание). Последнее обстоятельство дает основания для предположения о практическом использовании этих молекул в качестве маркеров опухолевого роста. Очевидно, что реализация такой возможности во многом определяется метаболизмом, структурными и функциональными особенностями циркулирующих нуклеиновых кислот (имеются в виду механизмы возникновения, ассоциированные структуры, подверженность нуклеазной атаке, размеры образующихся фрагментов, скорость клиренса, пути экскреции).

Так, установлено, что апоптоз и некроз (часто и сильно выраженный в опухолевой ткани из-за гипоксии) ведут к разрушению клеток, высвобождению со-

держимого, фрагментации молекул и их фагоцитозу макрофагами [4 6,47]. Несмотря на высокую эффективность фагоцитоза, значительная часть нуклеиновых кислот оказывается в кровотоке в свободном состоянии. В зависимости от механизма клеточной гибели (апоптоз, некроз) и молекулярной структуры они в разной степени подвержены воздействию агрессивной по отношению к ним внеклеточной среды (имеется в виду нуклеазная фрагментация): двунитевые и находящиеся в комплексе с нуклеосомами ДНК защищены значительно лучше, чем од-нонитевые мРНК, а наиболее устойчивы в силу своих малых размеров (22-24 основания) микроРНК. Происходящие из апоптотических клеток цДНК состоят в основном из малых мононуклеосомных фрагментов (~150 п.о.), тогда как фргмен-ты ДНК некротических клеток имеют крупные размеры (до десятков тысяч пар оснований) [4 6]. Циркулирующие в крови раковые клетки, а также отдаленные метастазы опухоли, могут вносить вклад в пул внеклеточных молекул [48,4 9].

Применение полногеномного секвенирования позволило установить, что в крови и моче человека присутствует множество последовательностей (и транс-криптов) генома исследуемого организма [50-53] (хотя при этом отмечены также некоторые различия в составе свободной и геномной ДНК [53,54]). Более того, и в крови беременных женщин присутствуют последовательности генома вынашиваемого эмбриона, что свидетельствует о способности внеклеточных молекул преодолевать плацентарный барьер [51,55-57]. Все эти наблюдения согласуются с представлением о цДНК как продуктах неизбирательного клеточного распада.

Существует несколько предположений относительно комплексов, в составе которых ДНК циркулирует в кровотоке, и которые защищают ее от действия нук-леаз. Вполне вероятно, что таковыми являются нуклеосомы, поскольку они обнаружены в сыворотке крови [58], а электрофорез ДНК плазмы выявляет характерную нуклеосомную «лесенку» [59]. Кроме того, транспортной формой ДНК и РНК могут быть ускользнувшие от фагоцитоза апоптотические тельца: в одних содержатся ДНК, в других - РНК [60]. В пользу существования крупных субклеточных структур, содержащих нуклеиновые кислоты, свидетельствуют опыты

разделения ДНК и РНК плазмы методами фильтрации, которые обнаруживают «нефильтруемые» фракции [61,62].

Упорядоченную утилизацию клеточных «отходов» обеспечивает, кроме того, белок плазмы крови SAP (serum amyloid Р component), который при физиологических условиях связывается с хроматином, солюбилизирует его (замещая гис-тон HI) и защищает от нуклеаз. Физиологическая роль этого белка состоит, видимо, в регуляции распада хроматина и предотвращении аутоиммунных реакций [63,64].

В серии работ последнего времени показано, что циркулирующие ДНК существуют в двух формах: в свободном состоянии (именно к нему, видимо, применимы перечисленные выше наблюдения) и в ассоциации с клеточной поверхностью. Эти альтернативные формы характерны, соответственно, для опухолевых и нормальных клеток, что представляет большой интерес как с фундаментальной, так и практической точек зрения [65-68]. Внеклеточные ДНК, ассоциированные с клеточной поверхностью, характерны именно для раковых, но не нормальных, клеток поджелудочной железы. В экспериментах прижизненного биолюминисцентного видеоизображения ксенографтов человеческих клеток мышам показано, что внеклеточные ДНК играют роль стимулятора воспаления, инвазии и метастазирования (предварительная обработка клеток ДНКазой I устраняла эти эффекты). Установлена положительная обратная связь между присутствием на клеточной поверхности ДНК и секрецией воспалительного хемокина CXCL8 [69]. Механизм и физиологический смысл переходов внеклеточной ДНК из свободного в ассоциированное с клеточной поверхностью состояние требуют дальнейших исследований.

1.2. Циркулирующие ДНК и РНК: маркеры опухоли

В контексте исследований рака особенно важен и интересен факт обнаружения в крови онкологических больных нуклеиновых кислот «опухолевого» происхождения (мутантных онкогенов и генов-супрессоров, измененных микроса-теллитных последовательностей, аберрантно метилированных CpG-островков в

промоторах генов-супрессоров, мРНК и микроРНК). Первоначально эта возможность по ряду причин казалась крайне маловероятной. Вследствие постоянного обновления тканей в организме взрослого человека ежесуточно погибает (претерпевает апоптоз) ~10п клеток [70]. Это обстоятельство делает превышение нормальных аллелей над мутантными в плазме крови столь значительным, что выявление последних кажется практически недостижимым (следует учесть также относительно небольшую, сравнительно с организмом, массу опухоли; присутствие в ней нормальных клеток стромы и крови; клональную гетерогенность опухоли, в силу которой тот или иной маркер может присутствовать не у всех, а лишь у некоторых опухолевых клеток). Кроме того, цДНК, «разбавленная» большим объемом крови, присутствует в ней в очень низкой концентрации. Ситуацию еще более осложняет факт реутилизации тканями организма основной массы внеклеточной ДНК, что было ранее установлено в экспериментах на животных [71,72]. И, наконец, в крови и моче присутствуют нуклеазы [22, 7 3,7 4], вызывающие фрагментацию свободных молекул [70,75,7 б].

Вопреки ожиданиям «опухолевые» нуклеиновые кислоты выявлены у онкологических больных как в крови [25, 36, 7 7-79], так и в моче («трансреналь-ные» ДНК) [71,75,80-85]. Более того, выявление феномена потери гетерозигот-ности (Loss Of Heterozygocity, LOH) в цДНК больных опухолями головы, шеи и легких [3,4] показало, что доля «опухолевой» фракции в ДНК крови в ряде случаев может быть значительной (иначе невозможно было бы обнаружить отсутствие одного из двух аллелей в малой субпопуляции мутантных молекул на фоне большого избытка молекул дикого типа - с обоими аллелями). Действительно, при оценке разными способами «опухолевой» фракции цДНК установлено, что она часто вполне ощутима, варьирует в широких пределах и источником ее являются нормальные и опухолевые, апоптотические и некротические клетки [4 6,8 6,87].

Доля «опухолевых» молекул может варьировать в широких пределах (от незначительной до преобладающей) в зависимости от стадии онкологического процесса (и, соответственно, от размера опухоли) [4 6,87]). Их концентрация в крови

определяется балансом двух противоположных процессов: поступления в кровоток (в силу клеточной секреции и клеточному распаду, апоптотическому и/или некротическому [4 6]) и выведения из кровотока (из-за нуклеазного распада, реутилизации, поглощения клетками печени и выведения почками [82]). В результате клиренс цДНК, судя по данным экспериментов на животных и по клиническим наблюдениям, обычно очень эффективен (время ее полу-жизни составляет ~15 мин [71]), хотя в некоторых случаях, при снижении функциональных способностей организма, может составлять несколько часов [8 8].

В клинике исследование циркулирующих в крови молекул проводят с целью диагностики и мониторинга опухолевого роста, используя все нуклеиновые кислоты безотносительно к их происхождению и биологической роли. Существующие методы не позволяют подразделить эту чрезвычайно гетерогенную и сложную в функциональном и структурном отношении популяцию на отдельные субфракции. Выделение циркулирующих молекул сводится обычно к осаждению клеток (и иногда митохондрий) низкоскоростным центрифугированиием, депро-теинизации супернатанта и сорбции нуклеиновых кислот на гранулах кремния («glass milk») в среде хаотропных агентов.

Соответственно генетическим нарушениям, которые обусловливают раковую трансформацию клетки, диагностически значимые маркеры, обнаруживаемые в циркулирующей ДНК, подразделяются на несколько типов: а) мутации онкогенов и генов-супрессоров, б) потеря гетерозиготности, в) аберрантное метилирование CpG-островков, г) изменения микросателлитных локусов. Кроме того, важным показателем некротического клеточного распада (присущего опухолям из-за перманентной гипоксии) может служить увеличение размеров (целостности) циркулирующей в крови ДНК.

1.2.1. Концентрация ДНК

Есть свидетельства диагностической значимости повышенного в плазме крови уровня ДНК, который, возможно, отражает растущую массу опухоли [8 992]. Ряд работ, однако, оспаривают это мнение [93,94]. Проблема в том, что

стандартные методы выделения циркулирующей ДНК не количественны, а принятый в большинстве работ способ измерений, основанный на ПЦР-РВ, не учитывает сильной ее фрагментации и неспособности многих мелких фрагментов участвовать в реакции амплификации [92].

В числе первых попыток использования цДНК в качестве опухолевого маркера было определение ее количественного содержания в крови и сопоставление этого показателя у здоровых лиц и онкологических больных. Эти исследования несколько обесценены применением принципиально разных методов анализа (спектрофотометрия, флуорометрия, количественная ПЦР). В последнем случае, в частности, не всегда учитывалось то обстоятельство, что размер получаемого ам-пликона может существенно влиять на эффективность реакции при использовании в качестве матрицы сильно фрагментированной ДНК.

В последующем усилиями ряда исследователей было установлено, что интервал значений цДНК в крови онкологических больных составляет 0-1000 нг/мл (в среднем 180 нг/мл) [95-97], тогда как у здоровых лиц этот показатель значительно ниже (0-100 нг/мл, в среднем 30 нг/мл). Отмечено снижение уровня цДНК в крови больного после удаления опухолевого очага [98]. Хотя в этих и ряде других работ была обнаружена связь повышенного уровня ДНК с онкологическим процессом [87,99,100], большая вариабельность этого показателя внутри каждой из исследованных групп, и, кроме того, значительное перекрывание интервалов его значений между группами, обесценивали до некоторой степени его диагностическую значимость. С учетом этих обстоятельств кажется оправданным использовать содержание ДНК в крови больного как вспомогательный показатель и непременно в комплексе с другими, более специфическими маркерами.

1.2.2. Размеры фрагментов

Циркулирующие в крови ДНК имеют размер, характерный для апоптотиче-ского распада (в основном мононуклеосомного, —140 п.н., - и кратного ему), и существуют либо в свободной форме, либо ассоциированы с поверхностью клеток крови. В кровоток попадают, видимо, те фрагменты, которые не были включены в

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Кондратова, Валентина Николаевна, 2015 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Schwarzenbach, H. Cell-free nucleic acids as biomarkers in cancer patients /

H.Schwarzenbach, D.S. Hoon, K. Pantel // Nat Rev Cancer. - 2011. - Vol. 11.-P. 426-437.

2. Sorenson, G.D. Soluble normal and mutated DNA sequences from single-copy

genes in human blood / G.D. Sorenson, D.M. Pribish, F.H. Valone et al. // Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. - 1994. - Vol. 3. - P. 67-71.

3. Chen, X.Q. Microsatellite alterations in plasma DNA of small cell lung cancer

patients / X.Q. Chen, M. Stroun, J.L. Magnenat et al. //Nat. Med. - 1996. - Vol. 2.-P. 1033-1035.

4. Nawroz, H. Microsatellite alterations in serum DNA of head and neck cancer

patients / H. Nawroz, W. Koch, P. Anker et al. // Nat. Med. - 1996. - Vol. 2. - P. 1035-1037.

5. Wong, I.H. Frequent pi5 promoter methylation in tumor and peripheral blood

from hepatocellular carcinoma patients / I.H. Wong, Y.M. Lo, W. Yeo et al. // Clin. Cancer Res. - 2000. - Vol. 6. - P. 3516-3521.

6. An, Q. Detection of pl6 hypermethylation in circulating plasma DNA of non-

small cell lung cancer patients / Q. An, Y. Liu, Y. Gao et al. // Cancer Lett. -2002. - Vol. 188. - P. 109-114.

7. Ellinger, J. CpG island hypermethylation in cell-free serum DNA identifies

patients with localized prostate cancer / J. Ellinger, K. Haan, L.C. Heukamp et al. // Prostate. - 2008. - Vol. 68. - P. 42-49.

8. Miura, N. Clinical usefulness of serum telomerase reverse transcriptase (hTERT)

mRNA and epidermal growth factor receptor (EGFR) mRNA as a novel tumor marker for lung cancer / N. Miura, H. Nakamura, R. Sato et al. // Cancer Sei. -2006. - Vol.97. - P. 1366-1373.

9. Garcia, V. Free circulating mRNA in plasma from breast cancer patients and

clinical outcome / V. Garcia, J.M. Garcia, C. Pena et al. // Cancer Lett. - 2008. -Vol. 263.-P. 312-320.

10. Lawrie, C.H. Detection of elevated levels of tumour-associated microRNAs in

serum of patients with diffuse large B-cell lymphoma / C.H. Lawrie, S. Gal, H.M. Dunlop et al. // Br. J. Haematol. - 2008. - Vol. 141. - P. 672-675. ~

11. Mitchell, P.S. Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer

detection /P.S. Mitchell, R.K. Parkin, E.M. Kroh et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. - 2008. - Vol. 105. - P. 10513-10518.

12. Diaz Jr, L.A. The molecular evolution of acquired resistance to targeted EGFR

blockade in colorectal cancers / L.A. Diaz Jr, R.T. Williams, J. Wu et al. // Nature. - 2012. - Vol. 486. - P. 537-540.

13. Misale, S. Emergence of KRAS mutations and acquired resistance to anti-EGFR

therapy in colorectal cancer / S. Misale, R. Yaeger, S. Hobor et al. // Nature. -2012.-Vol. 486.-P. 532-536.

14. Gerlinger, M. Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by

multiregion sequencing / M. Gerlinger, A.J. Rowan, S. Horswell et al. // N. Engl. J Med. - 2012. - Vol. 366. - P. 883-892.

15. Lawrence, M.S. Discovery and saturation analysis of cancer genes across 21

tumour types / M.S. Lawrence, P. Stojanov, C.H. Mermel et al. // Nature. -2014. - Vol. 505, № 7484. - C. 495-501.

16. Weidlich, S. Pyrosequencing-based methods reveal marked inter-individual

differences in oncogene mutation burden in human colorectal tumours / S. Weidlich, K. Walsh, D. Crowther et al. // Br J Cancer. - 2011. - Vol. 105, № 2. -P. 246-254.

17. Vogelstein, B. Cancer genome landscapes / B. Vogelstein, N. Papadopoulos,

V.E. Velculescu et al. // Science.- 2013. - Vol. 339. - P. 1546-1558.

18. Swanton, C. Intratumor heterogeneity: evolution through space and time / C.

Swanton // Cancer Res. - 2012. - Vol. 72. - P. 4875-4882.

19. Kaiser. J. The downside of diversity / J. Kaiser // Science. - 2013. - Vol. 339. - P.

1543-1545.

20. Narayan, A. Ultrasensitive measurement of hotspot mutations in tumor DNA in

blood using error-suppressed multiplexed deep sequencing / A. Narayan, N.J. Carriero, S.N. Gettinger et al. // Cancer Res. - 2012. - Vol. 72. - P. 3492-3498.

21. Bryzgunova, O.E. Methylation-specific sequencing of GSTP1 gene promoter in

circulating/extracellular DNA from blood and urine of healthy donors and prostate cancer patients / O.E. Bryzgunova, E.S. Morozkin, S.V. Yarmoschuk et al. // Ann. N. Y. Acad. Sci. - 2008. - Vol. 1137. - P. 222-225.

22. Tamkovich, S.N. Deoxyribonuclease activity in biological fluids of healthy

donors and cancer patients / S.N. Tamkovich, A.V. Cherepanova, O.E. Bryzgunova et al. // Bull. Exp. Biol Med.- 2008. - Vol. 146. - P. 89-91.

23. Bordelon, H. A magnetic bead-based method for concentrating DNA from human

urine for downstream detection / H. Bordelon, P.K. Russ, D.W. Wright et al. // PLoS ONE. - 2013. - Vol. 8, № 7. - P. e68369.

24. Tsui, N.B.Y. High resolution size analysis of fetal DNA in the urine of pregnant

women by paired-end massively parallel sequencing / N.B.Y. Tsui, P. Jiang, K.C.K. Chow et al. // PLoS ONE. - 2012. - Vol. 7, № 10. - P. e48319.

25. Leary, R.J. Detection of chromosomal alterations in the circulation of cancer

patients with whole-genome sequencing / R.J. Leary, M. Sausen, I. Kinde et al. // Science Translational Medicine. - 2012. - Vol. 4, № 162- P. 162ral54.

26. Gahan, P.B. Circulating nucleic acids in plasma and serum. Recent developments

/ P.B. Gahan, R. Swaminathan // Ann. N. Y. Acad. Sci. - 2008. - Vol. 1137. - P. 1-6.

27. Stroun, M. The origin and mechanism of circulating DNA / M. StroUn, P.

Maurice, V. Vasioukhin et al. // Ann. N. Y. Acad. Sci. - 2000. - Vol. 906. - P. 161-168.

28. Kharaziha, P. Tumor cell-derived exosomes: A message in a bottle / P.

Kharaziha, S. Ceder, Q. Li et al. // Biochim. Biophys. Acta. - 2012. - Vol. 1826. -P. 103-111.

29. Mathivanan, S. Exosomes: extracellular organelles important in intercellular

communication / S. Mathivanan, H. Ji, R.J. Simpson // J Proteomics. - 2010. -Vol. 73. - P. 1907-1920.

30. Rak, J. Extracellular vesicles - biomarkers and effectors of the cellular

interactome in cancer / J. Rak // Frontiers in Pharmacology. - 2013. - Vol. 4.

31. Eldh, M. Exosomes communicate protective messages during oxidative stress;

possible role of exosomal shuttle RNA / M. Eldh, K. Ekstrôm, H.Valadi et al. // PLoS ONE. - 2010. - Vol. 5, № 12. - P. el5353.

32. Mandel, P. Les acides nucléiques du plasma sanguin chez l'homme. / P. Mandel,

P. Metais // C. R. Acad. Sci. Paris. - 1948. - Vol. 142. - P. 241-243.

33. Stroun, M.P. Neoplastic characteristics of the DNA found in the plasma of cancer

patients / M. Stroun, P. Anker, P. Maurice et al. // Oncology. - 1989. - Vol. 46. -P. 318-322.

34. Anker, P. Transformation of NIH/3T3 cells and SW 480 cells displaying K-ras

mutation / P. Anker, J. Lyautey, F. Lefort et al. // C. R. Acad. Sci. Ill - 1994. -Vol. 317.-P. 869-874.

35. Vasioukhin, V. Point mutations of the N-ras gene in the blood plasma DNA of

patients with myelodysplastic syndrome or acute myelogenous leukaemia / V. Vasioukhin, P. Anker, P. Maurice et al. // Br. J. Haematol. - 1994. - Vol. 86. - P. 774-779.

36. Sidransky, D. Emerging molecular markers of cancer / D. Sidransky // Nat. Rev.

Cancer. - 2002. - Vol. 2. - P. 210-219.

37. Ransohoff, D.F. Cancer: developing molecular biomarkers for cancer / D.F.

Ransohoff// Science. - 2003. - Vol. 299. - P. 1679-1680.

38. Fleischhacker, M. Cell-free DNA resuscitated for tumor testing / M.

Fleischhacker, B. Schmidt // Nat Med. - 2008. - Vol. 14. - P. 914-915.

39. Holcik, M. Deadly revenge: uptake of oncogenes from apoptotic bodies / M.

Holcik // Trends Genet. - 2001. - Vol. 17. - P. 491-

40. Holmgren, L. Horizontal transfer of DNA by the uptake of apoptotic bodies / L.

Holmgren, A. Szeles, E. Rajnavolgyi et al. // Blood. - 1999. - Vol. 93. - P. 39563963.

41. Goldenring, J.R. A central role for vesicle trafficking in epithelial neoplasia:

intracellular highways to carcinogenesis / J.R. Goldenring // Nat Rev Cancer. -2013. - Vol. 13. - P. 813-820.

42. Luga, V. Exosomes mediate stromal mobilization of autocrine Wnt-PCP

signaling in breast cancer cell migration / V. Luga, L. Zhang, A.M. Viloria-Petit et al. // Cell. - 2012. - Vol. 151. - P. 1542-1556.

43. Peinado, H. Melanoma exosomes educate bone marrow progenitor cells toward a

pro-metastatic phenotype through MET / H. Peinado, M. Aleckovic, S. Lavotshkin et al. //Nat Med. - 2012. - Vol. 18. - P. 883-891.

44. Peters, D.L. Continuous adaptation through genetic communication - a putative

role for cell-free DNA / D.L. Peters, P.J. Pretorius // Expert. Opin. Biol. Ther. -2012. - Vol. 12, Suppl 1. - P. S127-S132.

45. Garcia-Olmo, D. Oncogenic transformation induced by cell-free nucleic acids

circulating in plasma (genometastasis) remains after the surgical resection of the primary tumor: a pilot study / D. Garcia-Olmo, D.C. Garcia-Olmo, C. Dominguez-Berzosa et al. // Expert. Opin. Biol. Ther. - 2012. - Vol. 12, Suppl 1. -P. S61-S68.

46. Jahr, S. DNA fragments in the blood plasma of cancer patients: quantitations and

evidence for their origin from apoptotic and necrotic cells / S. Jahr, H. Hentze, S. Englisch et al. // Cancer Res. - 2001. - Vol. 61. - P. 1659-1665.

47. Choi, J.J. The role of macrophages in the in vitro generation of extracellular DNA

from apoptotic and necrotic cells / J.J. Choi, C.F.Reich III, D.S. Pisetsky // Immunology. - 2005. - Vol. 115, №. 1. - P. 55-62.

48. Schwarzenbach, H. Cell-free tumor DNA in blood plasma as a marker for

circulating tumor cells in prostate cancer / H. Schwarzenbach, C. Alix-Panabieres, I. Muller et al. // Clin. Cancer Res. - 2009. - Vol. 15. - P. 1032-1038.

49. Schwarzenbach, H. Detection of tumor-specific DNA in blood and bone marrow

plasma from patients with prostate cancer / H. Schwarzenbach, F.K. Chun, I. Lange et al. // Int. J. Cancer. - 2007. - Vol. 120. - P. 1465-1471.

50. Suzuki, N. Characterization of circulating DNA in healthy human plasma / N.

Suzuki, A. Kamataki, J. Yamaki et al. // Clin. Chim. Acta. - 2008. - Vol. 387. -P. 55-58.

51. Lo, Y.M.D. Maternal plasma DNA sequencing reveals the genome-wide genetic

and mutational profile of the fetus / Y.M.D. Lo, K.C.A. Chan, H. Sun et al. // Science Translational Medicine. - 2010. - Vol. 2. - P. 61ra91.

52. Semenov, D.V. Unbiased approach to profile the variety of small non-coding

RNA of human blood plasma with massively parallel sequencing technology / D.V. Semenov, D.N. Baryakin, E.V. Brenner et al. // Expert. Opin. Biol. Ther. -2012. - Vol. 12, Suppl 1. - P. S43-S51.

53. Beck, J. Profile of the circulating DNA in apparently healthy individuals / J.

Beck, H.B. Urnovitz, J. Riggert et al. // Clin Chem. - 2009. - Vol. 55. - P. 730738.

54. Morozkin, E.S. A comparative study of cell-free apoptotic and genomic DNA

using FISH and massive parallel sequencing / E.S. Morozkin, E.M. Loseva, I.V. Morozov et al. // Expert. Opin. Biol. Ther. - 2012. - Vol. 12, Suppl 1. - P. Sll-S17.

55. Fan, H.C. Analysis of the size distributions of fetal and maternal cell-free DNA

by paired-end sequencing / H.C. Fan, Y.J. Blumenfeld, U. Chitkara et al. // Clin Chem. - 2010. - Vol. 56. - P. 1279-1286.

56. Fan, H.C. Sensitivity of noninvasive prenatal detection of fetal aneuploidy from

maternal plasma using shotgun sequencing is limited only by counting statistics / H.C. Fan, S.R. Quake // PLoS ONE. - 2010. - Vol. 5, № 5. - P. el0439.

57. Kitzman, J.O. Noninvasive whole-genome sequencing of a human fetus / J.O.

Kitzman, M.W. Snyder, M. Ventura et al. // Science Translational Medicine. -2012. - Vol. 4.-P. 137ra76.

58. Holdenrieder, S. Nucleosomes in serum of patients with benign and malignant

diseases / S. Holdenrieder, P. Stieber, H. Bodenmuller et al. // Int. J Cancer. -2001.-Vol. 95.-P. 114-120.

59. Giacona, M.B. Cell-free DNA in human blood plasma: length measurements in

patients with pancreatic cancer and healthy controls / M.B. Giacona, G.C. Ruben, K.A. Iczkowski et al. // Pancreas. - 1998. - Vol. 17. - P. 89-97.

60. Halicka, H.D. Segregation of RNA and separate packaging of DNA and RNA in

apoptotic bodies during apoptosis / H.D. Halicka, E. Bedner, Z. Darzynkiewicz // Exp. Cell Res. - 2000. - Vol. 260. - P. 248-256.

61. Chiu, R.W. Effects of blood-processing protocols on fetal and total DNA

quantification in maternal plasma / R.W. Chiu, L.L. Poon, T.K. Lau et al. // Clin. Chem. - 2001. - Vol. 47. - P. 1607-1613.

62. Ng, E.K. Presence of filterable and nonfilterable mRNA in the plasma of cancer

patients and healthy individuals / E.K. Ng, N.B. Tsui, N.Y. Lam et al. // Clin Chem. - 2002. - Vol. 48. - P. 1212-1217.

63. Bickerstaff, M.C. Serum amyloid P component controls chromatin degradation

and prevents antinuclear autoimmunity / M.C. Bickerstaff, M. Botto, W.L. Hutchinson et al. //Nat Med. - 1999. - Vol. 5. - P. 694-697.

64. Butler, P.J. Pentraxin-chromatin interactions: serum amyloid P component

specifically displaces HI-type histones and solubilizes native long chromatin / P.J. Butler, G.A. Tennent, M.B. Pepys // J Exp. Med. - 1990. - Vol. 172. - P. 1318.

65. Cherepanova, A.V. Ku protein as the main cellular target of cell-surface-bound

circulating DNA / A.V. Cherepanova, A.V. Bushuev, T.G. Duzhak et al. // Expert. Opin. Biol. Ther. - 2012. - Vol. 12, Suppl 1. - P. S35-S41.

66. Laktionov, P.P. Cell-surface-bound nucleic acids: free and cell-surface-bound

nucleic acids in blood of healthy donors and breast cancer patients / P.P. Laktionov, S.N. Tamkovich, E.Y. Rykova et al. // Ann. N. Y. Acad. Sci. - 2004. -Vol. 1022.-P. 221-227.

67. Rykova, E.Y. Extracellular DNA in breast cancer: Cell-surface-bound, tumor-

derived extracellular DNA in blood of patients with breast cancer and nonmalignant tumors / E.Y. Rykova, P.P. Laktionov, T.E. Skvortsova et al. // Ann. N. Y. Acad. Sci. - 2004. - Vol. 1022. - P. 217-220.

68. .Skvortsova, T.E. Cell-free and cell-bound circulating DNA in breast tumours:

DNA quantification and analysis of tumour-related gene methylation / T.E. Skvortsova, E.Y. Rykova, S.N. Tamkovich et al. // Br. J. Cancer. - 2006. - Vol. 94. - P. 1492-1495.

69. Wen, F. Extracellular DNA in pancreatic cancer promotes cell invasion and

metastasis / F. Wen, A. Shen, A. Choi et al. // Cancer Res. - 2013. - Vol. 73. - P. 4256-4266.

70. Lichtenstein, A.V. Novel applications of polymerase chain reaction to urinary

nucleic acid analysis / A.V. Lichtenstein, H.S. Melkonyan, L.D. Tomei et al. // Methods Mol. Biol. - 2006. - Vol. 336. - P. 145-154.

71. Botezatu, I. Genetic analysis of DNA excreted in urine: a new approach for

detecting specific genomic DNA sequences from cells dying in an organism /1. Botezatu, O. Serdyuk, G. Potapova et al. // Clin. Chem. - 2000. - Vol. 46. - P. 1078-1084.

72. Tsumita, T. Fate of Injected Deoxyribonucleic Acid in Mice / T. Tsumita, M.

Iwanaga//Nature. - 1963. - Vol. 198. - P. 70-71.

73. Cherepanova, A.V. Blood deoxyribonuclease activity in health and diseases /

A.V. Cherepanova, S.N. Tamkovich, V.V. Vlasov et al. // Biomed. Khim. -2007. - Vol. 53, № 5. - P. 488-496.

74. Cherepanova, A.V. Deoxyribonuclease activity and circulating DNA

concentration in blood plasma of patients with prostate tumors / A.V. Cherepanova, S.N. Tamkovich, O.E. Bryzgunova et al. // Ann. N. Y. Acad. Sci. -2008.-Vol. 1137.-P. 218-221.

75. Bryzgunova, O.E. Isolation and comparative study of cell-free nucleic acids from

human urine / O.E. Bryzgunova, T.E. Skvortsova, E.V. Kolesnikova et al. // Ann. N. Y. Acad. Sci. - 2006. - Vol. 1075. - P. 334-340.

76. Koide, K. Fragmentation of cell-free fetal DNA in plasma and urine of pregnant

women / K. Koide, A. Sekizawa, M. Iwasaki et al. // Prenat. Diagn. - 2005. -Vol. 25. - P. 604-607.

77. Bidard, F.C. Going with the flow: from circulating tumor cells to DNA / F.C.

Bidard, B. Weigelt, J.S. Reis-Filho // Science Translational Medicine. - 2013. -Vol. 5, № 207. - P. 207psl4.

78. Forshew, T. Noninvasive identification and monitoring of cancer mutations by

targeted deep sequencing of plasma DNA / T. Forshew, M. Murtaza, C. Parkinson et al. // Science Translational Medicine. - 2012. - Vol. 4, № 136 - P. 136ra68.

79. Leary, R.J. Development of personalized tumor biomarkers using massively

parallel sequencing / R.J. Leary, I. Kinde, F. Diehl et al. // Science Translational Medicine. - 2010. - Vol. 2, № 20. - P. 20ral4.

80. Chan, A.K. Cell-free nucleic acids in plasma, serum and urine: a new tool in

molecular diagnosis / A.K. Chan, R.W. Chiu, Y.M. Lo // Ann. Clin. Biochem. -2003.-Vol.40.-P. 122-130.

81. Chan, K.C. Quantitative analysis of the transrenal excretion of circulating EBV

DNA in nasopharyngeal carcinoma patients /K.C. Chan, S.F. Leung, S.W. Yeung et al. // Clin Cancer Res. - 2008. - Vol. 14. - P. 4809-4813.

82. Lichtenstein, A.V. Circulating nucleic acids and apoptosis / A.V. Lichtenstein,

H.S. Melkonyan, L.D. Tomei et al. // Ann. N. Y. Acad. Sci. - 2001. - Vol. 945. -P. 239-249.

83. Serdyuk, O.I. Detection of mutant k-ras sequences in the urine of cancer patients

/ O.I. Serdyuk, I.V. Botezatu, V.P. Shelepov et al. // Bull. Exp. Biol. Med. -2001.-Vol. 131.-P. 283-284.

84. Shekhtman, E.M. Optimization of transrenal DNA analysis: detection of fetal

DNA in maternal urine / E.M. Shekhtman, K. Anne, H.S. Melkonyan et al. // Clin. Chem. - 2009. - Vol. 55. - P. 723-729.

85. Umansky, S.R. From transrenal DNA to stem cell differentiation: an unexpected

twist / S.R. Umansky // Clin. Chem. - 2009. - Vol. 55. - P. 602-604.

86. Mouliere, F. The importance of examining the proportion of circulating DNA

originating from tumor, microenvironment and normal cells in colorectal cancer patients / F. Mouliere, A.R. Thierry // Expert. Opin. Biol. Ther. - 2012. - Vol. 12, Suppl l.-P. S209-S215.

87. Thierry, A.R. Clinical validation of the detection of KRAS and BRAF mutations

from circulating tumor DNA / A.R. Thierry, F. Mouliere, S.E1 Messaoudi et al. // Nat Med. - 2014. - Vol. 20. - P. 430-435.

88. Fleischhacker, M. Circulating nucleic acids (CNAs) and cancer - a survey / M.

Fleischhacker, B. Schmidt // Biochim. Biophys. Acta. - 2007. - Vol. 1775. - P. 181-232.

89. Sozzi, G. Quantification of free circulating DNA as a diagnostic marker in lung

cancer / G. Sozzi, D. Conte, M. Leon et al. // J. Clin. Oncol. - 2003. - Vol. 21. -P. 3902-3908.

90. Taback, B. Quantification of circulating DNA in the plasma and serum of cancer

patients / B. Taback, S.J. O'Day, D.S. Hoon // Ann. N. Y. Acad. Sci. - 2004. -Vol. 1022. - P. 17-24.

91. Kamat, A.A. Quantification of total plasma cell-free DNA in ovarian cancer

using real-time PCR / A.A. Kamat, A.K. Sood, D. Dang et al. // Ann. N. Y. Acad. Sci. - 2006. - Vol. 1075. - P. 230-234.

92. Mouliere, F. High fragmentation characterizes tumour-derived circulating DNA /

F. Mouliere, B. Robert, E. Arnau Peyrotte et al. // PLoS ONE. - 2011. - Vol. 6. -P. e23418.

93. Herrera, L.J. Quantitative analysis of circulating plasma DNA as a tumor marker

in thoracic malignancies / L.J. Herrera, S. Raja, W.E. Gooding et al. // Clin Chem. - 2005. - Vol. 51. - P. 113-118.

94. Schmidt, B. Improved method for isolating cell-free DNA / B. Schmidt, S.

Weickmann, C. Witt et al. // Clin. Chem. - 2005. - Vol. 51. - P. 1561-1563.

95. Allen, D. Role of cell-free plasma DNA as a diagnostic marker for prostate

cancer / D. Allen, A. Butt, D. Cahill et al. // Ann. N. Y. Acad. Sci. - 2004. -Vol. 1022. - P. 76-80.

96. Schwarzenbach, H. Detection and monitoring of cell-free DNA in blood of

patients with colorectal cancer / H. Schwarzenbach, J. Stoehlmacher, K. Pantel et al. // Ann. N. Y. Acad. Sci. - 2008. - Vol. 1137. - P. 190-196.

97. Sunami, E. Quantification of LINE1 in circulating DNA as a molecular

biomarker of breast cancer / E. Sunami, A.T. Vu, S.L. Nguyen et al. // Ann. N. Y. Acad. Sci. - 2008. - Vol. 1137. - P. 171-174.

98. Catarino, R. Quantification of free circulating tumor DNA as a diagnostic marker

for breast cancer / R. Catarino, M.M. Ferreira, H. Rodrigues et al. // DNA Cell Biol. - 2008. - Vol. 27. - P. 415-421.

99. Kamat, A.A. Plasma cell-free DNA in ovarian cancer: an independent prognostic

biomarker / A.A. Kamat, M. Baldwin, D. Urbauer et al. // Cancer. - 2010. - Vol. 116. -P. 1918-1925.

100. Wimberger, P. Impact of platinum-based chemotherapy on circulating nucleic

acid levels, protease activities in blood and disseminated tumor cells in bone marrow of ovarian cancer patients / P. Wimberger, C. Roth, K. Pantel et al. // Int. J. Cancer. - 2011. - Vol. 128. - P. 2572-2580.

101. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome / The

ENCODE Project Consortium //Nature.- 2012. - Vol. 489. - P. 57-74.

102. Fedoroff, N.V. Transposable elements, epigenetics, and genome evolution /N.V.

Fedoroff// Science. - 2012. - Vol. 338. - P. 758-767.

103. Jiang, N. The role of macrophages in generation of circulation blood nucleosomes

from dead and dying cells / N. Jiang, C.F. Reich, D.S. Pisetsky // Blood. - 2003. -P. 2002-2010.

104. Umetani, N. Prediction of breast tumor progression by integrity of free circulating

DNA in serum / N. Umetani, A.E. Giuliano, S.H. Hiramatsu et al. // J. Clin. Oncol. - 2006. - Vol. 24. - P. 4270-4276.

105. Umetani, N. Increased integrity of free circulating DNA in sera of patients with

colorectal or periampullary cancer: direct quantitative PCR for ALU repeats / N. Umetani, J. Kim, S. Hiramatsu et al. // Clin. Chem. - 2006. - Vol. 52. - P. 1062-1069.

106. Diehl, F. Detection and quantification of mutations in the plasma of patients with

colorectal tumors / F. Diehl, M. Li, D. Dressman et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.- 2005. - Vol. 102. - P. 16368-16373.

107. Trevisiol, C. Prognostic value of circulating KRAS2 gene mutations in colorectal

cancer with distant metastases / C. Trevisiol, F.F. Di, R. Nascimbeni et al. // Int. J. Biol. Markers. - 2006. - Vol. 21. - P. 223-228.

108. Gautschi, O. Origin and prognostic value of circulating KRAS mutations in lung

cancer patients / O. Gautschi, B. Huegli, A. Ziegler et al. // Cancer Lett. - 2007. -Vol. 254. - P. 265-273.

109. Shinozaki, M. Utility of circulating B-RAF DNA mutation in serum for

monitoring melanoma patients receiving biochemotherapy / M. Shinozaki, S.J. O'Day, M. Kitago et al. // Clin. Cancer Res. - 2007. - Vol. 13. - P. 2068-2074.

110. Kimura, H. EGFR mutation status in tumour-derived DNA from pleural effusion

fluid is a practical basis for predicting the response to gefitinib / H. Kimura, Y. Fujiwara, T. Sone et al. // Br. J. Cancer. - 2006. - Vol. 95. - P. 1390-1395.

111. Schtibeler, D. Epigenetic islands in a genetic ocean / D.Schiibeler // Science. -2012.-Vol. 338.-P. 756-757.

112. Jones, P.A. Functions of DNA methylation: islands, start sites, gene bodies and

beyond / P.A. Jones // Nat Rev Genet. - 2012. - Vol. 13. - P. 484-492.

113. Bock, C. Analysing and interpreting DNA methylation data / C. Bock // Nat Rev

Genet. - 2012. - Vol. 13. - P. 705-719.

114. Boddy, J.L. Prospective study of quantitation of plasma DNA levels in the

diagnosis of malignant versus benign prostate disease / J.L. Boddy, S. Gal, P.R. Malone et al. // Clin. Cancer Res. - 2005. - Vol. 11. - P. 1394-1399.

115. Bruhn, N. Detection of microsatellite alterations in the DNA isolated from tumor

cells and from plasma DNA of patients with lung cancer / N. Bruhn, T. Beinert, C. Oehm et al. // Ann. N. Y. Acad. Sci. - 2000. - Vol. 906. - P. 72-82.

116. Schwarzenbach, H. Comparative evaluation of cell-free tumor DNA in blood and

disseminated tumor cells in bone marrow of patients with primary breast cancer

/ H. Schwarzenbach, K. Pantel, B. Kemper et al. 11 Breast Cancer Res. - 2009. -Vol. 11.-P.R71.

117. Silva, J.M. Tumor DNA in plasma at diagnosis of breast cancer patients is a

valuable predictor of disease-free survival / J.M. Silva, J. Silva, A. Sanchez et al. // Clin. Cancer Res. - 2002. - Vol. 8. - P. 3761-3766.

118. Sozzi, G. Analysis of circulating tumor DNA in plasma at diagnosis and during

follow-up of lung cancer patients / G. Sozzi, D. Conte, L. Mariani et al. // Cancer Res. - 2001. - Vol. 61. - P. 4675-4678.

119. Sunami, E. Multimarker circulating DNA assay for assessing blood of prostate

cancer patients / E. Sunami, M. Shinozaki, C.S. Higano et al. // Clin. Chem. -2009. - Vol. 55. - P. 559-567.

120. Taback, B. Detection of tumor-specific genetic alterations in bone marrow from

early-stage breast cancer patients / B. Taback, A.E. Giuliano, N.M. Hansen et al. // Cancer Res. - 2003. - Vol. 63. - P. 1884-1887.

121. Coulet, F. Detection of plasma tumor DNA in head and neck squamous cell

carcinoma by microsatellite typing and p53 mutation analysis / F. Coulet, H. Blons, A. Cabelguenne et al. // Cancer Res. - 2000. - Vol. 60. - P. 707-711.

122. Hibi, K. Molecular detection of genetic alterations in the serum of colorectal

cancer patients / K. Hibi, C.R. Robinson, S. Booker et al. // Cancer Res. - 1998. -Vol. 58. - P. 1405-1407.

123. Kopreski, M.S. Detection of mutant K-ras DNA in plasma or serum of patients

with colorectal cancer / M.S. Kopreski, F.A. Benko, C. Kwee et al..// Br. J. Cancer. - 1997. - Vol. 76. - P. 1293-1299.

124. Chan, K.C. Persistent aberrations in circulating DNA integrity after radiotherapy

are associated with poor prognosis in nasopharyngeal carcinoma patients / K.C. Chan, S.F. Leung, S.W. Yeung et al. // Clin. Cancer Res. - 2008. - Vol. 14. - P. 4141-4145.

125. Leung, S.F. Plasma Epstein-Barr viral deoxyribonucleic acid quantitation

complements tumor-node-metastasis staging prognostication in nasopharyngeal

carcinoma / S.F. Leung, B. Zee, B.B. Ma et al. // J. Clin. Oncol. - 2006. - Vol. 24. - P. 5414-5418.

126. Lo, Y.M. Quantitative analysis of cell-free Epstein-Barr virus DNA in plasma of

patients with nasopharyngeal carcinoma / Y.M. Lo, L.Y. Chan, K.W. Lo et al. // Cancer Res. - 1999. - Vol. 59. - P. 1188-1191.

127. Lo, Y.M. Molecular prognostication of nasopharyngeal carcinoma by quantitative

analysis of circulating Epstein-Barr virus DNA / Y.M. Lo, A.T. Chan, L.Y. Chan et al. // Cancer Res. - 2000. - Vol. 60. - P. 6878-6881.

128. Lo, Y.M. Plasma cell-free Epstein-Barr virus DNA quantitation in patients with

nasopharyngeal carcinoma. Correlation with clinical staging / Y.M. Lo, S.F. Leung, L.Y. Chan et al. // Ann. N. Y. Acad. Sci. - 2000. - Vol. 906. - P. 99-101.

129. Kim, B.K. Persistent hepatitis В viral replication affects recurrence of

hepatocellular carcinoma after curative resection / B.K. Kim, J.Y. Park, d.Y. Kim et al. // Liver Int. - 2008. - Vol. 28. - P. 393-401.

130. Wong, B.C. Reduced plasma RNA integrity in nasopharyngeal carcinoma

patients / B.C. Wong, K.C. Chan, A.T. Chan et al. // Clin. Cancer Res. - 2006. -Vol. 12. - P. 2512-2516.

131. Шапот, B.C. Нуклеазы / В.С.Шапот // Издательство "Медицина". - 1967. -

Vol. 20. - P. 22-26.

132. Cocucci, E. Shedding micro vesicles: artefacts no more / E. Cocucci, G.

Racchetti, J. Meldolesi // Trends Cell Biol. - 2009. - Vol. 19. - P. 43-51.

133. Orozco, A.F. Flow cytometric analysis of circulating microparticles in plasma /

A.F. Orozco, D.E. Lewis // Cytometry A. - 2010. - Vol. 77. - P. 502-514.

134. O'Driscoll, L. Feasibility and relevance of global expression profiling of gene

transcripts in serum from breast cancer patients using whole genome microarrays and quantitative RT-PCR / L. O'Driscoll, E. Kenny, J.P. Mehta et al. // Cancer Genomics Proteomics. - 2008. - Vol. 5. - P. 94-104.

135. Ghildiyal, M. Small silencing RNAs: an expanding universe / M. Ghildiyal, P.D.

Zamore // Nat Rev Genet. - 2009. - Vol. 10. - P. 94-108.

136. Calin, G.A. MicroRNA signatures in human cancers / G.A. Calin, C.M. Croce //

Nat Rev Cancer. - 2006. - Vol. 6. - P. 857-866.

137. Tricoli, J.V. MicroRNA: Potential for cancer detection, diagnosis, and prognosis

/ J.V. Tricoli, J.W. Jacobson // Cancer Research. - 2007. - Vol. 67. - P. 45534555.

138. Рязанский, C.C . Короткие РНК и канцерогенез. / С.С. Рязанский, В.А.

Гвоздев // Биохимия - 2008. - Vol. 73, № 5. - Р. 640-655.

139. Cortez, М.А. MicroRNA identification in plasma and serum: a new tool to

diagnose and monitor diseases / M.A. Cortez, G.A. Calin // Expert. Opin. Biol. Ther. - 2009. - Vol. 9. - P. 703-711.

140. Cortez, M.A. MicroRNAs in body fluids-the mix of hormones and biomarkers /

M.A. Cortez, C. Bueso-Ramos, J. Ferdin et al. // Nat. Rev. Clin. Oncol. - 2011. -Vol. 8. - P. 467-477.

141. Melkonyan, H.S. Transrenal nucleic acids: from proof of principle to clinical tests

/ H.S. Melkonyan, W.J. Feaver, E. Meyer et al. // Ann. N. Y. Acad. Sci. - 2008. -Vol. 1137. - P. 73-81.

142. Chen, X. Characterization of microRNAs in serum: a novel class of biomarkers

for diagnosis of cancer and other diseases / X. Chen, Y. Ba, L. Ma et al. // Cell Res. - 2008. - Vol. 18. - P. 997-1006.

143. Chen, C. Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR / C.

Chen, D.A. Ridzon, A.J. Broomer et al. // Nucleic Acids Res. - 2005. - Vol. 33, №20. - P. el79.

144. Sambrook, J. Molecular cloning. / J. Sambrook, E.F. Fritsch, T. Maniatis // A

laboratory manual (Second Edition) - 1989. - Vol. 3.

145. Bettegowda, C. Detection of circulating tumor DNA in early- and late-stage

human malignancies / C. Bettegowda, M. Sausen, R.J. Leary et al. // Sci. Transl. Med. - 2014. - Vol. 6, № 224. - P. 224ra24.

146. Diehl, F. Circulating mutant DNA to assess tumor dynamics / F. Diehl, K.

Schmidt, M.A. Choti et al. // Nat Med. - 2008. - Vol. 14. - P. 985-990.

147. Garcia, V. Levels of VEGF-A mRNA in plasma from patients with colorectal

carcinoma as possible surrogate marker of angiogenesis / V. Garcia, J. Garcia, J. Silva et al. // Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. - 2008. -Vol. 134. - P. 1165-1171.

148. Wong, B.C. Cell-free DNA and RNA in plasma as new tools for molecular

diagnostics / B.C. Wong, Y.M. Lo // Expert. Rev. Mol. Diagn. - 2003. - Vol. 3. - P. 785-797.

149. van der Vaart, M.. Is the role of circulating DNA as a biomarker of cancer being

prematurely overrated? / M.van der Vaart, P.J.Pretorius // Clin. Biochem. -2010.-Vol. 43.-P. 26-36.

150. Kondratova, V.N. Concentration and isolation of DNA from biological fluids by

agarose gel isotachophoresis / V.N. Kondratova, O.I. Serd'uk, V.P. Shelepov et al. // BioTechniques. - 2005. - Vol. 39. - P. 695-699.

151. Kondratova, V.N. Isotachophoresis of nucleic acids in agarose gel rods / V.N.

Kondratova, I.V. Botezatu, V.P. Shelepov et al. // Biochemistry (Mosc. ). -2009. - Vol. 74. - P. 1285-1288.

152. Abelev, G.I. Counterflow immunoisotachophoresis on cellulose acetate

membranes / G.I. Abelev, E.R. Karamova // Anal. Biochem. - 1984. - Vol. 142. . p. 437-444.

153. Abelev, G.I. Automation on membranes: countercurrent isotachophoresis and

immunoelectrochromatography / G.I. Abelev, E.R. Karamova // Biokhimiia. -1996.-Vol. 61.-P. 1984-1994.

154. Ma, H. An efficient method for purification of PCR products for sequencing / H.

Ma, S. Difazio // BioTechniques. - 2008. - Vol. 44. - P. 921-923.

155. Janne, P.A. A rapid and sensitive enzymatic method for epidermal growth factor

receptor mutation screening / P.A. Janne, A.M. Borras, Y. Kuang et al. // Clin Cancer Res.- 2006. - Vol. 12. - P. 751-758.

156. Yeung, A.T. Enzymatic mutation detection technologies / A.T. Yeung, D.

Hattangadi, L. Blakesley et al. // BioTechniques. - 2005. - Vol. 38. - P. 749-758.

157. Lewis, L.K. Interference with spectrophotometric analysis of nucleic acids and

proteins by leaching of chemicals from plastic tubes / L.K. Lewis, M.H. Robson, Y. Vecherkina et al. // BioTechniques. - 2010. - Vol. 48. - P. 297-302.

158. Lee, H.Y. A modified mini-primer set for analyzing mitochondrial DNA control

region sequences from highly degraded forensic samples / H.Y. Lee, N.Y. Kim, M.J. Park et al. // BioTechniques. - 2008. - Vol. 44, № 4. - P. 555-558.

159. Taylor, G.R. Enzymatic methods for mutation scanning / G.R. Taylor, J. Deeble

//Genet. Anal. - 1999.-Vol. 14.-P. 181-186.

160. Taylor, G.R. Enzymatic and chemical cleavage methods / G.R. Taylor //

Electrophoresis. - 1999. - Vol. 20. - P. 1125-1130.

161. Andrulis, I.L. Comparison of DNA- and RNA-based methods for detection of

truncating BRCA1 mutations / I.L. Andrulis, H. Anton-Culver, J. Beck et al. // Hum. Mutat. - 2002. - Vol. 20. - P. 65-73.

162. Kahn, S.M. Rapid and sensitive nonradioactive detection of mutant K-ras genes

via 'enriched' PCR amplification / S.M. Kahn, W. Jiang, T.A. Culbertson et al. // Oncogene. - 1991. - Vol. 6. - P. 1079-1083.

163. Orita, M. Detection of polymorphisms of human DNA by gel electrophoresis as

single-strand conformation polymorphisms / M. Orita, H. Iwahana, H. Kanazawa et al. // Proc. Natl. Acad Sci U. S. A. - 1989. - Vol. 86. - P. 27662770.

164. Fujita, T. Identification of DNA polymorphism by asymmetric-PCR SSCP / T.

Fujita, M. Kiyama // BioTechniques. - 1995. - Vol. 19. - P. 532-534.

165. Goldrick, M.M. NIRCA: a rapid robust method for screening for unknown point

mutations / M.M. Goldrick, G.R. Kimball, Q. Liu et al. // BioTechniques. -1996.-Vol. 21.-P. 106-112.

166. Erali, M. High resolution melting analysis for gene scanning / M. Erali, C.T.

Wittwer // Methods. - 2010. - Vol. 50. - P. 250-261.

167. Botezatu, I.V. DNA melting analysis: application of the "open tube" format for

detection of mutant KRAS / I.V. Botezatu, V.N. Kondratova, V.P. Shelepov et al. // Anal. Biochem. - 2011. - Vol. 419. - P. 302-308.

168. Huang, Q. Multiplex fluorescence melting curve analysis for mutation detection

with dual-labeled, self-quenched probes / Q. Huang, Z. Liu, Y. Liao et al. // PLoS ONE. - 2011. - Vol. 6. - P. el9206.

169. Hildesheim, A. Etiology of nasopharyngeal carcinoma: a review / A. Hildesheim,

P.H. Levine // Epidemiol. Rev. - 1993. - Vol. 15. - P. 466-485.

170. Feng, B.J. Genome-wide scan for familial nasopharyngeal carcinoma reveals

evidence of linkage to chromosome 4 /B.J. Feng, W. Huang, Y.Y. Shugart et al. //Nat Genet. - 2002. - Vol. 31. - P. 395-399.

171. Zeng, Y. Follow-up studies on Epstein-Barr virus IgA/VCA antibody-positive

persons in Zangwu County, China / Y. Zeng, J.M. Zhong, L.Y. Li et al. // Intervirology. - 1983. - Vol. 20. - P. 190-194.

172. Ng, M.H. Serological diagnosis of nasopharyngeal carcinoma by enzyme linked

immunosorbent assay: optimization, standardization and diagnostic criteria / M.H. Ng, H.L. Chen, R.X. Luo et al. // Chin Med J (Engl.). - 1998. - Vol. 111. -P. 531-536.

173. Shotelersuk, K. Epstein-Barr virus DNA in serum/plasma as a tumor marker for

nasopharyngeal cancer / K. Shotelersuk, C. Khorprasert, S. Sakdikul et al. // Clin Cancer Res. - 2000. - Vol. 6. - P. 1046-1051.

174. Shao, J.Y. Comparison of plasma Epstein-Barr virus (EBV) DNA levels and

serum EBV immunoglobulin A/virus capsid antigen antibody titers in patients with nasopharyngeal carcinoma / J.Y. Shao, Y.H. Li, H.Y. Gao et al. // Cancer. - 2004. - Vol. 100. - P. 1162-1170.

175. Twu, C.W. Comparison of the prognostic impact of serum anti-EBV antibody

and plasma EBV DNA assays in nasopharyngeal carcinoma / C.W. Twu, W.Y. Wang, W.M. Liang et al. // Int. J Radiat. Oncol. Biol Phys. - 2007. - Vol. 67. - P. 130-137.

176. Kondratova, V.N. Tube gel isotachophoresis: A method for quantitative isolation

of nucleic acids from diluted solutions / V.N. Kondratova, I.V. Botezatu, V.P. Shelepov et al. // Anal. Biochem. - 2011. - Vol. 408. - P. 304-308.

177. Гурцевич, В.Э. Гуморальный иммунный ответ к вирусу Эпштейна-Барр в

диагностике рака носоглотки (Обзор литературы и 30-летний опыт собственных исследований) / В.Э. Гурцевич, В.Н. Степина, Н.Б. Сенюта и др. // Вестник РОНЦ им Н.Н. Блохина. - 2011. - Т. 22, № 2. - С. 20-29.

178. Lawrence, J.B. Sensitive, high-resolution chromatin and chromosome mapping in

situ: presence and orientation of two closely integrated copies of EBV in a lymphoma line / J.B. Lawrence, C.A. Villnave, R.H. Singer // Cell. - 1988. -Vol. 52. - P. 51-61.

179. Vossen, R.H. High-resolution melting analysis (HRMA): more than just sequence

variant screening / R.H. Vossen, E. Aten, A. Roos et al. // Hum. Mutat. - 2009. -Vol. 30. - P. 860-866.

180. Britten, R.J. Gene regulation for higher cells: a theory / R.J. Britten, E.H.

Davidson // Science. - 1969. - Vol. 165. - P. 349-357.

181. Pasquinelli, A.E. MicroRNAs and their targets: recognition, regulation and an

emerging reciprocal relationship / A.E. Pasquinelli // Nat Rev Genet. - 2012. -Vol. 13. - P. 271-282.

182. Baer, C. Genome-wide epigenetic regulation of miRNAs in cancer / C. Baer, R.

Claus, C. Plass // Cancer Research. - 2013. -Vol. 73. P. 473-477.

183. .Castel, S.E. RNA interference in the nucleus: roles for small RNAs in

transcription, epigenetics and beyond / S.E. Castel, R.A. Martienssen // Nat Rev Genet. - 2013. - Vol. 14. - P. 100-112.

184. Pennisi, E. Long noncoding RNAs may alter chromosome's 3D structure / E.

Pennisi // Science. - 2013. - Vol. 340. - P. 910-910.

185. Fatica, A. Long non-coding RNAs: new players in cell differentiation and

development / A. Fatica, I. Bozzoni // Nat Rev Genet. - 2014. - Vol. 15. - P. 721.

186. Gvozdev, V.A. Regulatory small RNAs / V.A. Gvozdev // Biochemistry (Mosc.).

-2013.-Vol. 78, №6.-P. 561.

187. Huang, Y. Non-coding RNAs and diseases / Y. Huang, J.P. Wang, X.L. Yu et al.

// Mol Biol. (Mosk). -2013. - Vol. 47. - P. 531-543.

188. Andreasen, D. Improved microRNA quantification in total RNA from clinical

samples / D. Andreasen, J.U. Fog, W. Biggs et al. // Methods. - 2010. - Vol. 50. - P. S6-S9.

189. Brunner, A. Transcriptional profiling of IncRNAs and novel transcribed regions

across a diverse panel of archived human cancers / A. Brunner, A. Beck, B. Edris et al. // Genome Biology. - 2012. - Vol. 13. - P. R75.

190. Chang, S. Tumor suppressor BRCA1 epigenetically controls oncogenic

microRNA-155 / S. Chang, R.H. Wang, K. Akagi et al. // Nat Med. - 2011. -Vol. 17. - P. 1275-1282.

191. Gibb, E.A. Human cancer long non-coding RNA transcriptomes / E.A. Gibb,

E.A. Vucic, K.S.S. Enfield et al. // PLoS ONE. - 2011. - Vol. 6, № 10. - P. e25915.

192. Burgess, D.J. Chromosome instability: tumorigenesis via satellite link / D.J.

Burgess //Nat Rev Cancer. - 2011. - Vol. 11. - P. 158-159.

193. Ting, D.T. Aberrant overexpression of satellite repeats in pancreatic and other

epithelial cancers / D.T. Ting, D. Lipson, S. Paul et al. // Science. - 2011. - Vol. 331. - P. 593-596.

194. Sheinerman, K.S. Analysis of organ-enriched microRNAs in plasma as an

approach to development of Universal Screening Test: feasibility study / K.S. Sheinerman, V.G. Tsivinsky, S.R. Umansky // J Transl. Med. - 2013. - Vol. 11.-P. 304.

195. Nikitina, I.G. The role of exosomes and microvesicules in carcinogenesis / I.G.

Nikitina, E.Yu. Sabirova, V.L. Karpov et al. // Mol Biol. (Mosk). - 2013. - Vol. 47. - P. 767-773.

196. Gusachenko, O.N. Nucleic acids in exosomes: disease markers and intercellular

communication molecules / O.N. Gusachenko, M.A. Zenkova, V.V. Vlassov // Biochemistry (Mosc.). - 2013. - Vol. 78. - P. 1-7.

197. Fisher, R. Cancer heterogeneity: implications for targeted therapeutics / R.

Fisher, L. Pusztai, C. Swanton // Br J Cancer. - 2013. - Vol. 108. - P. 479-485.

198. Takeshita, N. Serum microRNA expression profile: miR-1246 as a novel

diagnostic and prognostic biomarker for oesophageal squamous cell carcinoma / N. Takeshita, I. Hoshino, M. Mori et al. // Br J Cancer. - 2013. - Vol. 108. - P. 644-652.

199. Zen, K. Circulating microRNAs: a novel class of biomarkers to diagnose and

monitor human cancers / K. Zen, C.Y. Zhang // Med. Res. Rev. - 2012. - Vol. 32. - P. 326-348.