Генотипирование вируса африканской чумы лошадей различных серотипов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.02.02, кандидат биологических наук Титов, Илья Андреевич

• Титов, Илья Андреевич
• кандидат биологических наук
• 2013

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Титов, Илья Андреевич

СОДЕРЖАНИЕ

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

1 ВВЕДЕНИЕ

1.1 Актуальность темы

1.2 Степень разработанности проблемы

1.3 Цель и задачи исследования

1.4 Научная новизна результатов исследований

1.5 Теоретическая и практическая значимость работы

1.6 Степень достоверности и апробация результатов работы

1.7 Публикации научных исследований

1.8 Основные положения, выносимые на защиту

1.9 Объём и структура работы

1.10 Личный вклад соискателя

2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1 Характеристика вируса АЧЛ

2.1.1 Морфология вириона АЧЛ

2.1.2 Компоненты вириона АЧЛ

2.1.3 Механизм вирусной репликации

2.1.4 Структурная организация генома и полипептидный состав вируса

2.1.5 Устойчивость к физико-химическим воздействиям

2.1.6 Антигенные свойства вируса АЧЛ

2.2 Восприимчивые к АЧЛ животные

2.3 Природные очаги и роль переносчиков при вспышках АЧЛ

2.4 Клиническая картина АЧЛ

2.5 Эпизоотическая ситуация по АЧЛ в мире

2.6 Диагностика АЧЛ

2.6.1 Выделение вируса из проб патологического материала

2.6.2 Индикация вируса при помощи реакции связывания комплимента

2.6.3 Индикация вируса АЧЛ при помощи реакции диффузной преципитации

2.6.4 Типизация вируса. Реакция нейтрализации

2.6.5 Реакция задержки гемагглютинации

2.7 Применение ПЦР в индикации вируса АЧЛ

2.8 Филогенетический анализ вируса АЧЛ молекулярно-генетическими методами

2.9 Заключение по обзору литературы

3 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1 Материалы

3.1.1 Вирусы

3.1.2 Культуры клеток

3.1.3 Образцы патологического материала

3.1.4 Животные

3.1.5 Плазмиды и бактериальные штаммы

3.1.6 Реактивы

3.1.7 Лабораторное оборудование

3.2 МЕТОДЫ

3.2.1 Подбор праймеров и зондов

3.2.2 Выделение нуклеиновых кислот

3.2.3 Проведение ОТ-ПЦР с детекцией продуктов амплификации методом электрофореза

3.2.4 Анализ ПЦР-продуктов

3.2.5 Проведение ОТ-ПЦР в режиме реального времени

3.2.6 Нуклеотидное секвенирование

3.2.7 Компьютерный анализ и сравнение нуклеотидных последовательностей фрагментов генома вируса АЧЛ, построение филогенетических дендрограмм

3.2.8 Молекулярное клонирование продуктов ПЦР

3.2.9 Заражение культур клеток, мышей, чувствительных животных

3.3 Статистическая обработка результатов диссертации

4 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

4.1 Разработка ОТ-ПЦР в режиме реального времени

4.1.1 Дизайн специфических праймеров и зонда, использованных в тест-системе

4.1.2 Оптимизация условий постановки ОТ-ПЦР в режиме реального времени

4.1.3 Определение чувствительности и специфичности ОТ-ПЦР в режиме реального времени

4.2 Экспериментальное воспроизведение АЧЛ

4.2.1 Клинические признаки болезни

4.2.2 Молекулярно-генетические исследования

4.3 Филогенетический анализ различных штаммов вируса АЧЛ и

определение их серотиповой принадлежности

4.3.1 Филогенетический анализ 7 и 10 сегментов генома вируса АЧЛ

4.3.2 Филогенетический анализ 2 сегмента генома вируса АЧЛ

5 ОБСУЖДЕНИЕ

6 ВЫВОДЫ

7 ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

8 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

9 ПРИЛОЖЕНИЯ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

а.к. - аминокислота

A4JI - Африканская чума лошадей

БСА - бычий сывороточный альбумин

ГТЦ -гуанидинтиоционат

ДНК- дезоксирибонуклеиновая кислота

дНТФ - дезоксинуклеотид трифосфаты

дцРНК - двухцепочечная РНК

кДа - килодальтон

кДНК - комплементарная ДНК

KJIO - катаральная лихорадка овец

мкл - микролитр

н.о. - нуклеотидное основание

НТО - нетранслируемая область

ОТ - обратная транскрипция

ОТ-ПЦР - обратно - транскриптазная ПЦР

оцДНК - одноцепочечная ДНК

п.о. - пар оснований

ПААГ - полиакриламидный гель

пикоМ - пикомоль

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ПЦР-РВ - полимеразная цепная реакция в реальном времени

РНК- рибонуклеиновая кислота

тыс.п.о. - тысяч пар оснований

ТЕ - трис-ЭДТА буфер

Трис - трис (гидроксиметил) аминометан

ЭГБО - эпизоотическая геморрагическая болезнь оленей

ЭДТА - этилендиаминотетроацетат

С. -Culcoides

HRM - High Resolution Melting Point

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Генотипирование вируса африканской чумы лошадей различных серотипов»

1 Введение

1.1 Актуальность темы. Африканская чума лошадей (африканская чума однокопытных) (A4JI) - вирусная болезнь, протекающая остро и подостро, характеризуется лихорадкой, отеками подкожной клетчатки и кровоизлияниями во внутренних органах. Болезнь относится к группе трансмиссивных инфекций, передается кровососущими насекомыми, носит сезонный характер, проявляясь в теплое, влажное время года (Сюрин В.Н. и др.1991). Экономический ущерб от этой инфекции слагается из падежа животных и затрат, связанных с проведением противоэпизоотических мероприятий (Сюрин В. Н. и др. 1991).

По современной классификации возбудитель африканской чумы лошадей принадлежит к роду Orbivirus семейства Reoviridae. Наличие сегментированного генома предопределяет появление реассортантов, что, в свою очередь, может привести к возникновению вариантов вируса с новыми биологическими свойствами. На данный момент известно о 9 серотипах A4JI.

В настоящее время в мире сохраняется неблагоприятная эпизоотическая ситуация по A4J1. В период с 1999 г. до 2011 г. в странах Африки (ЮАР, Нигерия, Намибия, Свазиленд, Лесото, Зимбабве) ежегодно регистрировались вспышки A4J1. Вспышки A4JI были зарегистрированы в Испании и Португалии в 1989 году, в Алжире и Марокко (1989-1991 гг.), в Эфиопии (2003 г.), в Сенегале (2007 г.) и в Южной Африке (2008-2009 гг.). Вспышка АЧЛ, произошедшая в Сенегале в 2007 г., была вызвана 2, 7 и 9 серотипами вируса. Она длилась 4 месяца, нанеся ущерб в 1,4 миллиона евро (Akakpo A.J., Diouf N.et al. 2007). Последняя вспышка была зарегистрирована в ЮАР в мае 2013 года. В настоящее время в странах Африки циркулируют 2, 3, 7 и 9 серотипы АЧЛ (www.oie.int.).

По данным Росстата за 2009 год в нашей стране насчитывается 1354 тысячи лошадей, из которых сельскохозяйственным предприятиям принадлежит 417 тысяч голов, что составляет 30,8% от общей численности: фермерским хозяйствам - 177 тысяч (13,1%) и частным владельцам - 760 тысяч

(56,1%). Из данных статистики видно, что наибольшее число лошадей принадлежит частным лицам, что связано с увеличением популярности конного спорта среди населения. В последние годы возрастает импорт лошадей из неблагополучных по A4J1 регионов, таких, как страны Аравийского полуострова и Африки, что актуализирует проблему контроля данной болезни и требует совершенствования средств и методов экспресс-диагностики A4JI.

1.2 Степень разработанности проблемы.

Для диагностики A4J1 широко применяют серологические методы:метод флюоресцирующих антител, реакцию диффузной преципитации, реакцию нейтрализации, реакцию связывания комплемента, реакцию задержки гемагглютинации (Сюрин В.Н. и др. 1991). В 90-е годы был разработан ряд тест-систем, основанных на методе ПЦР с электрофорезной детекцией (Zientara S.,Sailleau C.et al. 1995). В последние годы для детекции генома вируса АЧЛ испанскими и французскими учёными (Agüero М., Gomez-Tejedor C.et al. 2008), (Rodriguez-Sanches В., Fernandez-PineiroJ.et al. 2008) были разработаны OT-ПЦР в режиме реального времени с праймерами, комплементарными различным сегментам генома. Для определения серотиповой принадлежности вируса АЧЛ в 2000 году была разработана двухраундная серотипоспецифическая ПЦР с электрофорезной детекцией продуктов амплификации (Sailleau С., Hamblin С., et. al. 2000). В настоящее время испанскими учёными AgueroM., Tena К. разработаны 3 серотипоспецифические тест - системы на основе ПЦР режиме реального времени, позволяющие в ходе одной реакции выявлять 2,4,9; 3,5,7 и 1,6,8 серотипы.

Отечественными учеными были предложены серологические методы выявления антигена вируса АЧЛ (Сюрин В.Н. и др. 1991). В 2004 г., Д.В. Колбасовым, И.М. Калабековым были разработаны наборы препаратов на основе ПЦР с электрофорезной детекцией.

В настоящее время в Российской Федерации отсутствуют средства быстрого определения серотиповой принадлежности изолятов и штаммоввируса АЧЛ.

Заключение диссертации по теме «Вирусология», Титов, Илья Андреевич

6 Выводы

1. Разработана тест-система для выявления генома вируса африканской чумы лошадей методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени, позволяющая выявлять до 1,0 ^ ТЦД50/см РНК вируса АЧЛ.

2. При экспериментальном заражении лошади вирусом АЧЛ (штамм 9 серотипа "Уттар-Прадеш") регистрировали острую форму течения болезни, о чём свидетельствует наблюдаемая клиническая и патологическая картины, а также выявление генома вируса АЧЛ с помощью ОТ-ПЦР в режиме реального времени.

3. Доказана возможность использования разработанных тест-систем для лабораторной диагностики вируса африканской чумы лошадей у экспериментально-зараженной лошади и в вируссодержащих образцах. Геном вируса АЧЛ был выявлен в образцах крови, селезёнки, печени, сердца, почек и других внутренних органов.

4. Установлена первичная структура участков 2, 7 и 10 сегментов генома вируса АЧЛ для создания банка нуклеотидных последовательностей штаммов, хранящихся в коллекции микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии. Нуклеотидные последовательности участков 7,10 сегментов вируса АЧЛ штамма "Уттар-Прадеш" депонированы в международную базу данных ОепВапк (УР7-КС904541;К83-КС904542).

5. На основании филогенетического анализа последовательностей 2,7 и 10 сегментов вирусной РНК изолятов вируса АЧЛ ("А-501", "ОБ", "114", "Кагеп","№452"," 18/60-100", "Уттар-Прадеш") установлена их гомология с аналогичными последовательностями штаммов, имеющихся в ОепЬапк (1ЧСВ1) соответствующих серотипов, на основании чего сделан вывод о их принадлежности к данным серотипам.

7 Практические предложения

Методические рекомендации по выявлению РНК вируса африканской чумы лошадей методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени», утвержденные академиком-секретарём Отделения ветеринарной медицины РАСХН Смирновым A.M. 15.08.2013г., предлагаются для использования в научно-исследовательских лабораториях, занимающихся генодиагностикой.

В схему лабораторной диагностики вируса A4JI рекомендуется включить тест-систему «АЧЛ/ОТ-ПЦР РВ/5»,для выявления генома вируса A4J1 методом ОТ-ПЦР отбирать пробы крови, селезёнки, лёгких, печени и сердца.

Для паспортизации штаммов вируса A4JT предлагается средство генотипирования изолятов на основе ПЦР и нуклеотидного секвёнирования амплифицированных фрагментов кДНК.

Полученные нуклеотидные последовательности 2, 7 и 10 сегментов генома использованы для характеристики штаммов вируса A4JI, депонированных в музее вирусных штаммов ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Титов, Илья Андреевич, 2013 год

8 Список цитируемой литературы

1. Бурдов, А. Н. Инфекционные и инвазионные болезни лошадей/ А. Н. Бурдов М.: Колос-1976. -С.52-61.

2. Зотов, А.П. Вирусные болезни животных/ А.П.Зотов М.: Издательство сельскохозяйственной литературы, журналов и плакатов, 1963. -С.411-422.

3. Лукашов, В. В. Молекулярная эволюция и филогенетический анализ.-М. :Бином,2009.-С.90.

4. Ребриков, Д.В. ПЦР в реальном времени/ Д.В. Ребриков// М.: Бином -2009. -С.10-19.

5. Сюрин, В.Н. Ветеринарная вирусология.-2-e изд., перераб. и доп./ В.Н. Сюрин, Р.В.Белоусова, Н.В. Фомина.//-М.: Агропромиздат, 1991. -С.431.

6.Эпизоотология с микробиологией - М.: Агропромиздат, 1987. -С. 338-341.

7. Юров, К. П. Инфекционные болезни лошадей/ К. П. Юров М.: Росагропромиздат, 1991. -С.78-80.

8.A comparison of the nucleotide sequences of cognate NS2 genes of three different orbiviruses/ V.Van Staden, J. Theron, B. J. Greyling, H. Huismans, L. H. Nel // Virology -1991. -Vol.185. -P.500-504.

9.A first full outer capsid protein sequence data-set in the Orbivirus genus (family Reoviridae): cloning, sequencing, expression and analysis of a complete set of full-length outer capsid VP2 genes of the nine African horsesickness virus serotypes -2003/ A.C. Potgieter, M. Cloete, P.J. Pretorius, A.A. Dijk // J. Gen. Virol. -2003,-Vol.84. -P.1317-1326.

10.A simpleandrapidmethod for detection of African horse sickness virus serogroup in cell cultures using RT-PCR /I.E. Aradaib, M.E.H. Mohemmed, J.A. Sarh, S.H. Idris, N.O.M. Ali, A.A. Majid, A.E. Karrar // Veterinary research communications. -2006. Vol.30.-P.319-324.

11.African horse sickness in Senegal: serotype identification and nucleotide sequence determination of segment S10 by RT-PCR. / C. Sailleau, J. Seignot, B. Davoust, E. Cardinale, B. Fall, C. Hamblin, S.Zientara // Vet. Record - 2000. - Vol. 146. -P.107-108.

12. Epidemiology of African horse-sickness in Senegal: importance of the epizootic of 2007./ Akakpo A. J., Diouf N., Ndiaye O., WombouToukam C.,Ly C., Mankor A., Etter E.// EU Workshop on Laboratory Diagnosis of Bluetongue virus and African Horse Sickness 2010, Madrid.

13.Alexander, R.A. Studies on the neurotropic virus of horse sickness/ R.A. Alexander// Onderstepoort J. -1936, -Vol.17. -P.l 1-16.

14.Alexander, R. A. Horse sickness. Immunization of Horses and mules in the field during the seasons 1934-1936 with a discription of the technique of oreparation of polyvalent mouse neurotropic vaccine/R. A. Alexander, W. Neitz, R. Toil // Ondersteport J. -1936. -Vol.7. -P.l.

15.An outbreak of African horse sickness in dogs/L.B.J. VanRensburg, J. De Clerk, H.B. Groenewald, W.S. Botha // J. S. Afr. Vet. Assoc. -1981. -Vol.52. -P.323-325.

16.Application of the polymerase chain reaction to the detection of African horse sickness viruses -1995/ S. Zientara, C. Sailleau, S. Moulay, A.Wade-Evans, C.Cruciere // J. Virol. Meth. - 1995. -Vol. 53. -P. 47-54.

17.Basak, A.K. Crystal-structure of the top domain of African horse sickness virus VP7 - comparisons with bluetongue virus VP7/ A.K. Basak, P. Gouet, J. Grimes // J. Virol. - 1996. -Vol.70.- P.3797-3806.

18.Basic Local Alignment Search Tool/NCBI[3neKTpoHHbrapecypc]. -PeacHMflocTyna: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/.- National center of biotechnology information.

19.Bluetongue virus detection by two real-time RT-qPCRs targeting two different genomic segments/ J.F. Toussaint, C. Sailleau, E. Breard, S. Zientara, K. De Clercq// J. Virol. Meth.-2007.-Vol. 140. -P.l 15-123.

20.Bouayoune, H. The Culicoides vectors of African horse sickness virus in Morocco: distribution and epidemiological implications/H.Bouayoune, J.Touti // Arch. Virol. Suppl. -1998.-Vol.l4.-P.l 13-125.

21.Bourdin, P. Ecology of African horse sickness/ P. Bourdin // Proceedings Third international conference on equine infectious diseases, 1972, Paris, France. -P. 1230.

22.Braverman,Y. Repellency of synthetic and plant-derived preparations for Culicoides imicolaiY. Braverman, A.Chizov-Ginsburg // Med. Vet. Entomol. -1997. -Vol.11.-P. 355-360.

23.Bremer, C. W. A gel electrophoretic study of the protein and nucleic acid components of African horse sickness virus/C. W. Bremer // Onderstepoort Journal of Veterinary Research -1976. -Vol.43. -P. 193-199.

24.Bremer, C. W. Characterization and cloning of the African horse sickness genome/C.W.Bremer, H.Huismans, A. A. Van-Dijk // Journal of General Virology -1990.- Vol.71. -P.793-799.

25.Cetre-Sossah,C. Development and evaluation of a real-time quantitative PCR assay for Culicoides imicola, one of the main vectors of bluetongue (BT) and African

horse sickness (AHS) in Africa and Europe/C.Cetre-Sossah [et al.] // Res.Vet.Sci. -2008.-Vol. 85,№2. -P.372-382.

26.Chomczynski, P. Single step method for RNA isolation by acid guanidiniumthiocyanate-phenol-chloroform extraction 1987/ P. Chomczynski, N. Sacchi// Anal. Biochem. - 1987. - Vol.162. -P. 156-159.

27.Clarke, D.H. Techniques for hemagglutination and hemagglutination-inhibition with arthropod-borne viruses / D.H.Clarke, , J.Casals // Am. J. Trop. Med. Hyg. -1958. Vol. 7 №5.p.561-573.

28.Cytology of monkey kidney cells infected with African horsesickness virus/Y.Ozawa, , I.G. Hopkins, A. Hazrati, A. Modjitabai, P. Kaveh// Nature (Lond.) -1965.-Vol.206-P. 1321-1323.

29.Davies, F. Elephants and Zebras as possible reservoir hosts for african horse sickness virus/F. Davies, S. Otieno//Vet.Res. -1977.-Vol.100.-P. 291-291.

30.Davies, F.G. The application of fluorescent antibody techniques to the virus of African horse sickness/F.G. Davies, L.J. Lund // Res. Vet. Sci. -1974.-Vol. 17.-P. 128-130.

31 .de Sa,R. Phylogenic analysis of segment 10 from African horsesickness virus and cognate genes from other orbiviruses/ R.de Sa, M. Zellner and M. J. Grubman// de Sa R, Zellner M. and Grubman M. J.Virus.Res.-1994.- Vol.33. -P.157-165.

32.Detection of African horse sickness virus by dot-blot hybridization using a digoxigenin-labeled probe/S. Moulay, S. Zientara, C. Sailleau, C. Cruciere // Molecular and Cellular Probes. -1995.- Vol.9. -P.233-237.

33.Detection of African horse sickness virus by reverse - transcription PCR/M. Stone-Marschat, A. Carville, A. Skowronek, W.W. Laegried // Journal of Clinical Microbiology -1994.- Vol.32.-P.697-700.

34.Detection of African Horsesickness Virus by Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (PT-PCR) using Primers for Segment 5 (NS1 Gene)/ N. Mizukoshi, K.Sakamoto, A.Iwata, S. Ueda, M. Kamada, A. Fukusho//J. Vet. Med. Sci. -1994. -Vol.56. -P.347-352.

35.Development and optimization of a duplex real-time reverse transcription quantitative PCR assay targeting the VP7 and NS2 genes of African horse sickness virus -2010/ M.Quan, C.W.Lourens, N.J.MacLachlan, I.A.Gardner, A.J.Guthrie // J. Virol. Meth. - 2010. - Vol.167. -P. 45-52.

36.Diagnosis of the African horse sickness virus serotype 4 by a one-tube, one manipulation RT-PCR reaction from infected organs/ S. Zientara, C. Sailleau, S. Moulay, C. Cruciere //J. Virol. Meth. - 1994. - Vol.46. -P. 179-188.

37.DuToit, R.M. The transmission of bluetongue and horse sickness by Culicoides/R. M. DuToit // Onderstepoort Journal of Veterinary Science and Animal Industry -1944. -Vol.19. -P.7-16.

38.Epidemiology of African horse sickness: duration of viraemia in zebra {Equus burchelli)/ B.J. Barnard, R. Bengis, D. Keet, E. H. Dekker // Onderstepoort J. Vet. Res. - 1994.- Vol.61. -P. 391-393.

39.Erasmus, B.J. The pathogenesis of African horse sickness/ B.J. Erasmus// In Proceedings of the 3rd international conference of equine infectious diseases. Edited by Bryans J.T., Gerber H. 1973, Paris, France. -P. 1-11.

40.Expression and characterization of the two outer capsid proteins of African horsesickness virus: the role of VP2 in virus neutralization/Martinez - Torrecuadrada, J. L., H. Iwata, A. Venteo, J. I. Casal, P. Roy. // Virology.-1994.-Vol.202. -P.348-359.

41.Germer, S. Single-tube genotyping without oligonucleotide probes/ S. Germer, Higuchi R. // Genome Res. -1999. Vol.9. -P.72-78.

42.Gillies,S. Viral RNA polymerases: electron microscopy of reovirus reaction cores -1971/ S. Gillies, S. Bullivant, A.R. Bellamy // Science. - 1971. - Vol. 174. P. 694696.

43.Groenink, S.R. Development of a protocol for the molecular serotyping of the African horse sickness virus/S.R. Groenink//Submitted in fulfilment of the academic requirements for the degree of Master of Science in Agriculture in the Department of Animal and Poultry Science School of Agricultural Sciences and Agribusiness Faculty of Science and Agriculture University of KwaZulu-Natal Pietermaritzburg December 2009.

44.Grubman, M. J. Identification and characterization of the structural and nonstructural proteins of African horse sickness virus and determination of the genome coding assignments/M. J. Grubman, S. A. Lewis // Virology -1992.- Vol.186. -P.444-451.

45.Hamblin, C. Antibodies in horses, mules and donkeys following monovalent vaccination against African horse sickness /C. Hamblin, P.S. Mellor, S.D. Graham // Epidemiol. Infect. -1991. -Vol.104.-P.365-371.

46.Hazrati, A. Proceedings of 3rd International Conference on equine infectious diseases held at Paris/A. Hazrati //Paris -P.69-80.

47.Henning, M.W. African horse sickness, perdesiekte, pestis equorum/ M.W. Henning// In Animal diseases of South Africa. Central News Agency Ltd, Pretoria, 1956.-P.789-808.

48.Hewat, E.A. 3-D reconstruction of bluetongue virus tubules using cryo-electron microscopy -1992 /E.A. Hewat [et al.] // J. Struct. Biol. - 1992.- Vol. 108. -P. 35-38.

49.High throughput detection of bluetongue virus by a new real-time fluorogenic reverse transcription-polymerase chain reaction: application on clinical samples from current Mediterranean outbreaks/ M.A. Jimenez-Clevero, M. Aguero, E. San Miguel, T. Mayoral, M.C. Lopez , M.J. Ruano, E. Romero, F. Monaco, A. Polci, G. Savini, C. Gomez-Tejedor//J. Vet. Diagn. Invest. -2006.-Vol.18. -P.7-17.

50.Howell, P.G. African horse sickness/ P.G. Howell // in Emerging diseases of animals, FAO, Rome, FAO Agricultural Studies -1963. -Vol.61. -P.71-108.

51 .Howell, P.G. The isolation and identification of further antigenic types of African horse sickness virus/ P.G. Howell // Onderstepoort J. Vet. Res. -1963. -Vol.29. -P139-149.

52.Hug, M.M. Gel-precipitin test for the diagnosis of South African horse sickness. MM. Hug, M.Y. Ansari// Bull. Off. Int. Epiz. -1962. Vol.58. -P.694-698.

53.Huismans H. Characterization of the tubules associated with the replication of three different orbiviruses/ H. Huismans// Virology. - 1979. - Vol. 92. -P. 397-406.

54.Huismans, H. Reovirus-coded polypeptides in infected cells: isolation of two native monomeric polypeptides with affinity for single-stranded and double-stranded RNA, respectively/ H. Huismans, W. K. Joklik// Virology -1976.-Vol.70. -P.411-424.

5 5.Identification and differentiation of the nine African horse sickness virus serotypes by RT-PCR amplification of the serotypespecific genome segment 2 / C. Sailleau, C. Hamblin, J. T. Paweska, S. Zientara // J. Gen. Virol. - 2000. - Vol. 81. -P. 831837.

56.1wata, H. Evolutionary relationships among the gnat-transmitted orbiviruses that cause African horse sickness, bluetongue, and epizootic hemorrhagic disease as evidenced by their capsid protein sequences/H. Iwata, M. Yamagawa, P. Roy // Virology -1992.- Vol.191. -P.251-261.

57.Koekemoer,J.J.O. African horsesickness virus serotyping and identification of multiple co-infecting serotypes with a single genome segment 2 RT-PCR amplification and reverse line blot hybridization -2004/ J. J. O. Koekemoer, A.A. Dijk // J. Virol. Meth. -2004.-Vol. 122.-P.49-56.

58.Koekemoer J.J. Development of probes for typing African horsesickness virus isolates using a complete set of cloned VP2-genes/J.J.O. Koekemoer // J.Vir.Meth. -2000. - Vol.88.-P.135-144.

59.Koekemoer, J.J.O. Serotype-specific detection of African horsesickness virus by

real-time PCR and the influence of genetic variations/JJ.O. Koekemoer // J.Virol. Meth. -2008. -Vol.154. -P. 104-110.

60.Koreanmedicallibraryengine/ КМЬЕ[Электронныйресурс]. - Режим доступа: www.kmle.co.kr. - Korean medical library engine.

61.Laviada, M. D. Characterization of African horsesickness virus serotype 4 -induced polypeptides in Vero cells and their reactivity in Western immunoblotting/M. D. Laviada, M. Arias, J. M. Sanchez - Vizcaino// J. Gen. Virol. -1993. -Vol.74.-P .81-87.

62.Lubroth,J. African horsesickness and the epizootic in Spain 1987 /J.Lubroth //Equine Pract. -1988.-Vol.l0.-P.26-33.

63.Martinez - Torrecuadrada, J.L. Identification of a linear neutralization domain in the protein VP2 of African horse sickness virus/J. Martinez - Torrecuadrada, J.L. Casal, J.I. Casal// Virology. -1995.-Vol.210.-P.391-399.

64.McIntosh, B.M. Immunological types of horsesickness virus and their significance in immunization/ B.M. Mcintosh// Onderstepoort J. Vet. Res. -1958. -Vol.35. -P.465-538.

65.Mellor,P.S. African horse sickness. Review article/ P.S. Mellor, C. Hamblin // Vet.Res. - 2004. -Vol.35. -P.445-466.

66.Mellor, P.S. The multiplication of African horse sickness virus in two species of Culicoides(Diptera: Ceratopogonidae)/ P.S.Mellor, J.Boorman, M.Jennings // Arch. Virol. -1975.- Vol.47. -P. 351-356.

67.Mellor, P.S. Replication of arboviruses in insect vectors/P.S.Mellor // J. Сотр. Pathol. -2000.- Vol.124 -P.231-247.

68.Mellor, P.S. Epizootiology and vectors of African horse sickness virus/P.S.Mellor // Сотр. Immunol. Microbiol. Infect. Dis. -1994.-Vol.17.-P. 287- 296.

69.Mellor, P.S. African horse sickness: transmission and epidemiology/P.S.Mellor // Vet. Res. -1993.-Vol.24.-P. 199-212.

70.Mellor, P.S. Isolations of African horse sickness virus from vector insects made during the 1988 epizootic in Spain/ P.S.Mellor [et al.] // Epidemiol. Infect. -1990. -Vol. 105.-P. 447-454.

71.Mellor, P.S. The multiplication of African horse sickness virus in two species of Culicoides (Diptera: Ceratopogonidae)/?.S.Mellor, J.Boorman, M.Jennings // Arch. Virol. -1975. -Vol. 47.-P. 351-356.

72.Mertens, P.P. Orbiviruses and coltiviruses - general features/P.P.Mertens // In: Webster R.G., Granoff A. (eds) Encyclopedia of virology, vol 2. Academic Press, London, -1994. -P. 941- 956.

73.Meyden, C. H. Encephalities and chorioretinitis associated with neurotropic African horse sickness virus infection in laboratory workers/ C. H. Meyden [et al.]// S. Afr. Med. J. -1992. -Vol. 81.-P. 451-454.

74.Molecular epidemiology of African horse sickness virus based on analyses and comparisons of genome segments 7 and 10/ S. Zientara, C. Sailleau, E. Plateau, S. Moulay, P.P.C.Mertens, C. Cruciere // Arch. Virol. -1998. -Vol.14. -P.221-234.

75.Molecular epidemiology of the African horse sickness virus S10 gene. -2008/ M. Quan, M. Vuuren, P. J. Howell, D. Groenewald, A. J. Guthrie // J. Gen. Virol. -2008.-Vol. 89. -P.1159-1168.

76.Moss, S. R. Comparison of the non-structural protein, NS2 of tick-borne orbiviruses/ S. R. Moss, L. D. Jones, P. A Nuttall// Virology -1992.-Vol.187. -P.841-844.

77.Neutralizing epitopes of African horsesickness virus serotype 4 are located on VP2/T.G.Burrage, R. Trevejo, M. Stone-Marschat, W.W. Laegreid.// Virology.-1993.-Vol.196.-P.799-803.

78.Newsholme,O.A. Morphological study of the lesions of African horse sickness -1983/ O.Newsholme, G.Bedford, R.DuToit // Onderstepoort J. Vet. Res. - 1983.-Vol.50. -P. 7-24.

79.Novel gel-based and real-time PCR assays for the improved detection of African horse sickness virus. -2008/ B. Rodriguez-Sanchez, J.Fernandez-Pinero, C. Saileau, S. Zientara, S. Belak, M. Arias, J. M. Sanchez-Vizcaino // J. Vir. Meth.- 2008,-Vol.151. -P. 87-94.

80.0ellermann, R. A.Characterization of African horse sickness virus/R. A. Oellermann, H. J. Els, B. J. Erasmus // Archiv fur die gesamte Virusforschung -1970.- Vol.29. -P.163-174.

81.0zawa, Y. Studies on the replication of African horse sickness virus in two different cell cultures/Y.Ozawa // Arch. Ges. Virusforsch.-1967.-Vol.21. -P.155-169.

82.Parvi ,K.M. Isolation of vaccine strains of African horse sickness virus from brains of two horses given polyvalent vaccine/ K.M. Parvi , C.R. Anderson // Indian J. Vet. Sci. Anim. Husb. -1963. Vol.33. -P. 215-219.

83.Phylogenetic analysis of African horse sickness virus segment 10: sequence variation, virulence characteristics and cell exit -1998/ L. A. Martin, A.J. Meyer, R.S. O'Hara, H. Fu, P.S. Mellor, N. J. Knowles, P. P. C. Mertens // Arch. Virol. - 1998. -Vol. 14. -P.281-293.

84.Purification and properties of virus perticles, infectious sub-viral particles, cores and VP7 crystals of African horsesickness virus serotype 9/ J. N. Burroughs, R. S.

CTHara, C. J. Smale, C. Hamblin, A. Walton, R. Armstrong, P. P. C. Mertens//J.Gen.Virol. -1994.- Vol.75. -P.1849-1857.

85.Rafyi, A. Horsesickness/ A. Rafyi // Bull. Off. Int. Epizoot. - 1961.- Vol.56. -P.216-250.

86.Real-time fluorogenic reverse transcription polymerase chain reaction assay for detection of African horse sickness virus/ C. Gomez-Tejedor, M. A. Cubillo, C. Rubio, E. Romero, M.A. Jimenez-Clavero // J. Vet. Diagn. - 2000. - Vol.20. -P.325-328.

87.Real-time fluorogenic reverse transcription polymerase chain reaction assay for detection of African horsesickness virus/ M. Aguero, C. Gomez-Tejedor, M. Angeles Cubillo, C. Rubio, E. Romero , A. Jimenez-Clavero// J. Vet. Diagn. Invest. -2008.-Vol.20. -P.325-328.

88.Real-time, multiplex PCR assays/ C.T. Wittwer, M.G. Herrmann, C.N. Gundry, K.S. Elenitoba-Johnson // Methods 2001.- Vol.25. -P.430-442.

89.Rodriguez, M. Current status of diagnosis and control of African horse sickness/M. Rodriguez, H. Hooghuis, M. Castano // Veterinary Research -1993.-Vol.24. -P.189-197.

90.Rodriguez, M. African horsesickness in Spain/ M. Rodriguez, H. Hooghuis, M.Castano// Vet. Microbiol. -1992.- Vol.33. -P. 129-142.

91.Roy.P. African horse sickness virus structure -1994/ P.Roy, P. P. C.Mertens, I.Casal // Comp. Immun. Microbiol. Infect. Dis. - 1994. - Vol. 17, №3/4. -P.243-273.

92.Roy P. Bluetongue virus genetics and genome structure. Review article/P. Roy// Virus Res. -1989.-Vol.13. -P. 179-206.

93.Sailleau, C. Identification and differentiation of the nine African horse sickness virus serotypes by RT-PCR amplification of the serotype specific genome segment 2/ C.Sailleau [et al.] // J. Gen. Virol. -2000. -Vol. 81.-P. 831-837. 94.Sailleau , C. Nucleotide sequence comparison of the segments S10 of the nine African horse sickness virus serotypes/ C.Sailleau, S. Moulay, S.Zientara // Arch. Virol. - 1997. - Vol. 142. -P. 965-978.

95.Sequence conservation among the cognate nonstructural NS3/3A protein genes of six bluetongue viruses/ G.Y.Hwang, Y.Y.Yang, J.F.Chiou, J. K.K.Less // Virus Res. -1992.- Vol.23. -P. 151-161.

96.Shah, K.V. Investigation of African horse-sickness in India, study of the natural disease and the virus /K. V. Shah// Ind. J. vet. Sci. -1964. Vol.3. -P. 1-14.

97.Stoltz,M.A. Subcellular localization of the nonstructural protein NS3 of African horse sickness virus/ M.A., Stoltz [et al.] // Onderstepoort J. Vet. Res. - 1996. -Vol.63.-P. 57-61.

98.Structural insight into African horse sickness infection/ V.Manole, P. Laurinmaki, W. Van Wyngaardt, C.A. Potgieter, I.M. Wright, G.J. Venter, A.A. Van Dijk, B.T. Sewell, S.J. Butcher//J.Virol. -2012. -Vol.86. -P.7858-7866.

99.Tessler,J. Detection of African Horsesickness Viral Antigens in Tissues by Immunofluorescence/ J.Tessler//Can. J. Comp. Med. -1972. Vol.36 №2 -P. 167-169.

100.Theiler, A. African horse sickness/ A. Theiler// South Afr. Dept. Ag. Sci. Bull. -1921.-Vol. 19.-P. 1-29.

101.Theiler, A. Transmission of horse sickness into dogs/ Theiler A. // Rep. Govt. Vet. Bact. -1906.-P. 160-162.

102.The complete nucleotide sequence of African horsesickness virus serotype 4 (vaccine strain) segment 4, which encodes the minor core protein VP4// N.Mizukoshi, K.Sakamoto, A.Iwata, T.Tsuchiya, S.Ueda, B. Apiwatnakorn, M.Kamada, A.Fukusho// Virus Res. -1993.-Vol.28. -P.299-306.

103 .The complete sequences of African horse sickness virus serotype 4 (vaccine strain) RNA segment 2 and 6 which encode outer capsid protein/K.Sakamoto, N.Mizukoshi, B.Apiwatnakorn, A.Iwata, T.Tsuchiya, S.Ueda, H.Imagawa, T.Sugiura, M.Kamada, A.Fukusho // Journal of Veterinary Medical Science -1994.- Vol.56. -P.321-327.

104.The complete sequence of African horse sickness virus serotype 4 (vaccine strain) RNA segment 5 and its predicted polypeptide compared with NS1 of bluetongue virus/N.Mizukoshi, K.Sakamoto, A.Iwata, T.Tsuchiya, S.Ueda, T.Watanabe, M.Kamada, A.Fukusho // Journal of General Virology -1992.- Vol.73. -P.2425-2428.

105.The complete sequence of the group-specific antigen, VP7, of African horsesickness disease virus serotype 4 reveals a close relationship to bluetongue virus/ P.Roy, T.Hirasawa, M.Fernandez, V. M.Blinov, J. M.Sanchez-Vizcaino // J. Gen. Virol. -1991. -Vol.72. -P.1237-1241.

106.Thecw//coz'c/esvectors of African horse sickness virus in Morocco: distribution and epidemiological implications/ H. Bouayoune, J. Touti, H. el Hasnaoui, M. Bailys, P.S. Mellor// Arch. Virol. Suppl. -1998. -Vol.14. -P.l 13-125.

107.The growth of African horse sickness virus in embryonated hen eggs and the transmission of virus by Culicoides variipennis {Diptera:

Ceratopogonidae)/].Boorman, P.S.Mellor, M.Penn, M.Jennings // Arch. Virol. -1975.-Vol.47. -P.343-349.

108.The role played by Hyalomma dromedarii in the transmission of African horse sickness in Egypt/F.I.Awad, M.M.Amin, S.A.Salama, S.Khide // Bull. Anim. Health Prod. Afr. -1981.- Vol.29. -P.337-340.

109.The use of African horse sicknes virus NS3 protein, expressed in bacteria, as a marker to differentiate infected from vaccinated horses/M. D. Laviada, P. Roy, J. M. Sanchez - Vizcaino, J. I. Casal// Virus Res. -1995.-.Vol.38. -P.205-218.

110.Thompson, G. M. A review of African horse sickness and its implications for Ireland -2012/ G. M. Thompson; S.Jess; A.K.Murchie // Irish Veterinary Journal -2012.- Vol.65.-9p.

102.Tyagi, S. Molecular beacons: probes that fluoresce upon hybridization/S.Tyagi, F.RKramer//Nat. Biotechnol. -1996. -Vol.14.-P. 303-308.

Ill .vanStaden, V. A comparison of the genes which encode non-structural protein NS3 of different orbiviruses/V.vanStaden, H.Huismans // Journal of General Virology -1991.- Vol.72.-P. 1073-1079.

112.Variation in the NS3 gene and protein in South African isolates of bluetongue and equine encephalosis viruses. / M .Van Niekerk, Freeman M., Paweska J.T., Howell P.G., Guthrie A.J., Polgieter A.C., Van Staden V., Huismans, H. // J.Gen.Virol. - 2003. Vol. 84. - P. 581-590.

113.Venter, G.J. A comparison of the vector competence of the biting midges, Culicoides (Avaritia) bolitinos and imicola, for the Bryanston serotype of equine encephalosis virus/G.J.Venter, D.Groenewald, E.Venter // Med. Vet. Entomol. -2002. -Vol. 16.-P. 372-377.

114.Venter, G.J. African horse sickness epidemiology: vector competence of South African Culicoides species for virus serotypes 3, 5 and 8/G.J.Venter, S.D.Graham, C.Hamblin // Med. Vet. Entomol. -2000. -Vol. 14. -P. 245-250.

115.Verwoerd, D.W. Orbiviruses/D.W.Verwoerd, H.Huismans, B.J. Erasmus // In Comprehensive Virology, vol. 14, pp. 285-345. Edited by H. Fraenkel-Conrat& R. R. Wagner. New York: Plenum Press. Virus in tissue culture. Bull. Off. Int. Epiz., -1979.- Vol. 62. -P.923-928.

116.Verwoerd, D. W. On the relationship between bluetongue, African horsesickness and reovirus: hybridization studies/ D. W. Verwoerd, H. Huismans// Onderstepoor J. Vet Res. -1969.-Vol.36.-P. 175-180

117. Veterinary Research - A Journal on Animal Infection/ Veterinary Research^eKTpoHHbiii ресурс].-Режим доступа: http://www.vetres.org/. -

Veterinary Research.

118.Vreede, F.T. Sequence analysis of the RNA polymerase gene of African horse sickness virus/ F.T. Vreede, H. Huismans// Arch. Virol. -1998.- Vol.143. -P.413-419.

119.WAHIDInterface/ OIE [электронный ресурс].- Режимдоступа www.oie.int. -WAHID Interface.

120.WesternKentuckyUniversity/ WKU[электронный ресурс]. - Режим доступа: bioweb.wku.edu - bioweb.wku.edu./courses/biol350/ProtStruct22/Review.html.

121.Whiley, D.M. Melting curve analysis using hybridization probes: limitations in microbial molecular diagnostic/ D.M. Whiley, T.P. Sloots// Pathology - 2005.-Vol.37. -P.254-256.

122.Zientara,S. Diagnosis of the African horse sickness virus serotype 4 by a one-tube, one manipulation RT-PCR reaction from infected organs / S. Zientara, C. Sailleau, S. Moulay // Journal of Virological Methods. - 1994. - Vol. 46. -P. 179188.