Идентификация молекулярных маркеров прогрессии гепатокарцином тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.00.14, кандидат биологических наук Флейшман, Дарья Игоревна

• Флейшман, Дарья Игоревна
• кандидат биологических наук
• 2008

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Флейшман, Дарья Игоревна

Список сокращений

Введение

Цели и задачи исследования б

Научная новизна и практическая ценность работы

1. Обзор литературы

1.1. Структура и функции печени

1.2. Канцерогенез 1 з

1.2.1. Гепатоканцерогенез

1.2.2. Другие злокачественные заболевания печени

1.3. Ткане-специфические транскрипционные факторы

1.3.1. Семейство HNF1, , '

1.3.2. Семейство HNF

1.3.3. Семейство HNF

1.3.4. Семейство С/ЕВР

1.3.5. Семейство HNF

1.4. ГЯФ при патологиях

1.4.1. Диабет

1.4.2. ГЯФ при канцерогенезе

1.5. Другие транскрипционные регуляторы развития печени

1.5.1. FTF

1.5.2. Семейство GATA

1.6. Эпителиально-мезенхимальный переход

1.7. Апоптоз

1.8. Модель одноступенчатой прогрессии

1.9. Другие гены, изменение экспрессии которых ассоциировано с 57 гепатоканцерогенезом '

1.9.1. Остеопонтин

1.9.2. Циклин01 60 1.9.3 SLPI

1.9.4. Цитохезины

1.9.5. GILZ

1.9.6. Кавеолин

1.9.7. TGEF

1.9.8. РКА

1.9.9. Белки семейства TGFP

2. Материалы и методы

2.1. Коллекция мышиных гепатокарцином

2.2. Забор и хранение опухолей

2.3. Гистологические препараты

2.4. Выделение РНК

2.5. Реакция обратной транскрипции

2.6. Праймеры

2.7. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

2.8. Культуры клеток

2.9. бактериальные штаммы и плазмидные векторы

2.10. Трансформация клеток Е. Coli

2.11. Выделение плазмид

2.12. Трансфекция эукариотических клеток

2.13. Измерение активности гена люциферазы

2.14. Список использованных растворов и сред

3. Результаты исследования и их обсуждение

3.1. Сравнительная характеристика панели гепатокарцином мыши 82 незавтисимого происхождения и разной степени дифференцировки

3.1.1. Гистологический анализ

3.1.2. Сравнительный анализ экспрессии генов в гепатокарциномах мыши

3.1.2.1. Анализ экспрессии печень-специфических генов

3.1.2.2. Анализ экспрессии генов, продукты которых вовлечены в ЭМП

3.1.2.3. Анализ экспрессии генов, продукты которых задействованы в 100 регуляции апогггоза

3.1.2.4. Анализ экспрессии протоонкогенов, активация которых описана 103 для ГК

3.1.2.5. Анализ экспрессии возможных маркеров гепатоканцерогенеза и 103 генов, определяющих опухолевую прогрессию

3.1.2.6. Анализ экспрессии генов семейства TGF

3.2. Сравнительный анализ экспрессии генов в опухолях печени человека

3.2.1. Анализ экспрессии генов в гепатокарциномах человека

3.2.2. Анализ экспрессии генов в других опухолях печени человека

3.3. Изучение регуляторного района гена HNF4al 129 Заключение 137 Выводы 140 Список Литературы

Список сокращений

АФП - альфа-фетопротеин а.о. - аминокислотный остаток

6ГК - быстрорастущая гепатокарцинома

ВКМ - внеклеточный матрикс

ГК - гепатокарцинома

ГЯФ (HNF) - гепатоцитарный ядерный фактор мГК - медленнорастущая гепатокарцинома

ОТ — реакция обратной транскрипции п.н. - пара нуклеотидов

ПЦР - полимеразная цепная реакция т.п.н. - тысяча пар нуклеотидов

ХЦР - холангиокарцинома

ЭМП - Эпителиально-мезенхимальный переход аЗ-int — аЗ субъединица интегрина

ASNS - аспарагинсинтетаза

BrDU - бромдезоксиуридин

СЕАСАМ — канцероэмбриональный антиген-ассоциированная адгезионная молекула 1 (гликопротеин желчи)

С/ЕВРа - СААТ/энхансер связывающий белок а С/ЕВРр - СААТ/энхансер связывающий белок Р СК - щггокератин

COUP-TF1 - транскрипционный фактор 1 промотора овальбумина цыпленка COUP-TF2 - транскрипционный фактор 2 промотора овальбумина цыпленка Сх32 - коннексин

DcoH - б-пировоил-тетрагидропротеинсинтаза /кофактор димеризации HNFla

FTF - транскрипционный фактор альфа-фетопротеина

FasL - лиганд рецептора смерта Fas

GAPDH - глицеральдещц 3-фосфат дегидрогеназа

Gilz-S - Малая изоформа Глюкокортикоид-индуцируемого- bZip- белка

Gilz-L - Большая изоформа Глюкокортикоид-индуцируемого- bZip- белка

НВ V - вирус гепатита В

HCV - вирус гепатита С

HGF/scatter - фактор роста гепатоцитов/фактор рассеивания

HNFla - гепатоцитарный ядерный фактор la

HNFlp - гепатоцитарный ядерный фактор 1р

HNF4a - гепатоцитарный ядерный фактор 4а

HNF4al - al изоформа гепатоцитарного ядерного фактора

HNF4a7 - a7 изоформа гепатоцитарного ядерного фактора

HNF3a - гепатоцитарный ядерный фактор За

HNF3 р - гепатоцитарный ядерный фактор 3 р

HNF3y - гепатоцитарный ядерный фактор Зу

HNF6 - гепатоцитарный ядерный фактор б

HPRT - гипоксантин фосфорибозилтрансфераза

MODY - диабет молодых (Maturity Onset Diabetes of the Young)

OC2 - представитель семейства белков с доменом one cut р21 - белок 21 кДа р53 - белок 53 кДа

RI/PKA-I - регуляторная субъединица первого типа цАМФ-зависимой протеинкиназы А SLPI - Секреторный лейкоцитарный ингибитор протеаз Tbi-68 - TGFp -индуцируемый белок 68 kDa

TGFa - фактор роста опухолей a TGFpl — фактор роста опухолей pi TGFp2 - фактор роста опухолей Р

TGFp-RI — рецептор фактора роста опухолей первого типа TGFP-RII - рецептор фактора роста опухолей второго типа TGIF - 5'TG3' взаимодействующий фактор TSC-22 - TGFp-стимулируемый клон

ZOl (TJP1) - белок из zona occludens 1 (белок плотных контактов 1)

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Идентификация молекулярных маркеров прогрессии гепатокарцином»

Гепатокарциномы (ГК) - опухоли, возникающие из зрелых гепатоцитов. Их возникновение ассоциировано с хроническими инфекциями вирусами гепатита В (HBV) или С (HCV), алкоголизмом, циррозом печени, а также связано с действием на организм химических канцерогенов и гепатоканцерогенов, таких как микотоксин или афлатоксин В1 [Rocken и McGrath, 2001].

Прогрессия гепатокарцином представляет собой многостадийный процесс, который приводит к приобретению опухолью злокачественного фенотипа. При этом развитие опухоли сопровождается снижением уровня дифференцировки, увеличением скорости пролиферации клеток, утратой эпителиальной морфологии и приобретением способности к метастазированию. Опухолевая прогрессия ассоциирована с изменением паттерна экспрессируемых генов, в том числе последовательностей, кодирующих опухолевые супрессоры, факторы роста, компоненты межклеточных и адгезионных контактов, а также -ткане-специфические белки. Определяющую роль в регуляции экспрессии функциональных генов печени играет несколько семейств регуляторных белков, получивших общее название гепатоцитарных ядерных факторов (ГЯФ; Hepatocyte nuclear factors - HNF): HNF1, С/ЕВР (СААТ/энхаксер связывающий белок a), HNF3, HNF4 и HNF6. Роль этих факторов в развитии и дифференцировке гепатоцитов активно изучается, однако их роль в гепатоканцерогенезе до сих пор исследована недостаточно полно.

Для решения этой проблемы ранее в лаборатории была использована экспериментальная система одноступенчатой прогрессии, в которой из медленнорастущей высокодифференцированной ГК мыши одномоментно выщепился злокачественный быстрорастущий ннзкодифференцированный вариант. Было показано, что дедифференцировка медленнорастущей гепатокарциномы сопровождалась подавлением активности большинства гепатоцитарных ядерных факторов, а также снижением уровня экспрессии генов, определяющих эпителиальный фенотип гепатоцитов. Восстановление экспрессии гепатоцитарного ядерного фактора HNF4a в культуре клеток быстрорастущей гепатокарциномы привело к частичной реверсии злокачественного фенотипа. Было выдвинуто предположение, что скоординированная работа гепатоцитарных ядерных факторов шрает ключевую роль в поддержании дифференцировки гепатоцитов, причем HNF4a является ключевым регулятором этого' процесса;

Для дальнейшего' поиска генов; вовлеченных в прогрессию гепатокарцином, спектры экспрессии генов в гепатокарциномах мыши были исследованы с помощью гибридизации с кДНК микрочипами. Было выявлено более 20 потенциальных опухолевых маркеров, экспрессия которых была более чем в 5 раз повышена во всех исследованных гепатокарциномах по сравнению с нормальной печенью, и около 30 генов со значительным уровнем гиперэкспрессии в дедифференцированной гепатокарциноме.

В настоящей работе мы выяснили, :какиё из закономерностей, выявленных на модели одноступенчатой прогрессии гепатокарциномы,' имеют наиболее общий характер, а также определили частоту встречаемости изменения уровней транскрипции факторов;, выявленных при кДНК гибридизации, при прогрессии гепатокарцином.

В работе была использована серия химически индуцированных мышиных гепатокарцином из коллекции, полученной ранее в НИИ Канцерогенеза РОНЦ РАМН, а также образцы опухолей печени человека, полученные при резекции опухолей у пациентов РОНЦ РАМН. Мы провели сравнительный анализ исследуемых опухолей и выявили гены, изменение экспрессии которых наиболее четко отражает - развитие злокачественного фенотипа. Мы предполагаем, что ключевую роль в поддержании дифференцировочного статуса гепатоцитов играет фактор HNF4a, а подавление' .транскрипции его изоформы HNF4al, совместно с активацией экспрессии его эмбриональной сплайс-формы HNF4a7 служит маркером гепатоканцерогенеза. Налай был проведен -анализ регуляторного района гена HNF4al и выявлен участок, который, по нашему мнению, . содержит сайт связывания для репрессора, . ответственного за инактивацию гена HNF4a в ходе опухолевой прогрессии.

ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ . Целью настоящей работы стало выявление и .функциональная характеристика, молекулярных маркеров прогрессни гепатокарцином мышии: человека./ В связи с заданной целью мы выдвинули следующие задачи:. / !. Создание и гистологическая характеристика коллекции мышиных гепатокарцином независимого происхождения с различным уровнем дифференцировки, а. также • ■ коллекцгш гепатокарцином. человека. • . ■ . • • б

2. Анализ экспрессии гепато-специфических генов, а также генов, экспрессия ■ которых значительно изменилась при одноступенчатой прогрессии,- в панели химически индуцированных гепатокарциноммыши с различной скоростью роста и уровнем дифферещщровки.

3. Изучение закономерностей экспрессии гепато-специфических генов, а также потенциальных маркеров:;. гепато канцерогенеза, .выявленных на предыдущих стадиях исследования,, в опухолях печени, человека, полученных при резекции, гепатокарцином у пациентов РОНЦ.

4. Поиск возможных механизмов возникновения событий, маркирующих опухолевую прогрессию (исследование механизма инактивации гена HNF4al).

НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ОТАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РАБОТЫ

На протяжении длительного времени изучение генетических изменений, лежащих ' в основе гепатоканцерогенеза,, ограничивались исследованиями нетканеспецифических. факторов, нарушение в активности которых является общим явлением для опухолей разного типа. Работы, посвященные роли ткане-специфических регуляторов транскрипции в прогрессии отдельных типов эпителиальных опухолей, и, в частности, гепатокарцином; . чаще всего затрагивали лишь один или несколько из упомянутых транскрипционных факторов, причем о нарушении работы последних судили по результатам анализа модельных систем in vitro.

В представленной работе были проанализированы спектры экспрессии большинства печень-специфических транскрипционных факторов на панели из ГК мыши •i независимого происхождения, различшощихся по уровню дифференцировки и скорости • ^:.роста, что .позволило. определить спектр генов, уровни экспрессии которых наиболее ■'- четко, связаны с этими признаками. Кроме того, следует отметить, что в большинстве работ, посвященных изучению роли ГЯФ в гепатоканцерогенезе, изучаются общие свойства семейств, в то время как в представленном исследовании мы постарались отдельно рассмотреть роль каждого из представителей и его изоформ. Это позволило впервые описать гиперэкспрессию эмбриональной формы HNF4a7 в ,. образцах •дифференцированных гепатокарцином мыши и человека.

На модели ГК мыши независимого происхождения и разного уровня дифференцировки нам удалось показать четкую зависимость между степенью дедифференцировки ГК и профилем зкспрессируемых в них ткане-специфических регуляторов транскрипции HNF4a, HNFlaj HNFlp, HNF3y, C/EBPa н FTF (транскрипционный фактор альфа-фетопротеина).

В работе впервые проведен анализ полного спектра экспрессии ГЯФ в образцах опухолей печени человека. Впервые охарактеризованы закономерности экспрессии ряда генов (остеопонтина, кавеолина, аспарагинсинтазы ASNS, секреторного лейкоцитарного ингибитора протеаз SLPI, киназы Ufo/Axl), транскрипция которых повышается в ходе гепатоканцерогенеза, в гепатокарциномах и холангиокарциномах человека.

Кроме того, мы впервые показали, что гепатоциты неопухолевой ткани печени пациентов с гепатокарциномами экспрессируют ряд генов, нехарактерных для взрослой печени (например, гены HNF4a7, HNFip, snail и виментин). Эти данные позволяют предположить о влиянии опухоли на генетическую программу клеток окружающей ткани. Не исключено, что под этим воздействием опухоли нормальные клетки вырабатывают факторы, способствующие изменению внеклеточного матрикса, что в свою очередь ускоряет инвазию опухоли.

Мы установили, что репрессия гена HNF4al в низкодифференцированных ПС происходит на транскрипционном! уровне. Исследования регуляторного района гена HNF4al показали, что участок—1.4 т.п.н./-363 п.н. ответственен за связывание репрессора, подавляющего транскрипцию гена. Кроме того, впервые показано, что ни один из других ГЯФ - HNFla и р, HNF6, GATA6 (энтодермальный транскрипционный фактор, содержащий ДНК-связывающий домен типа "цинковые пальцы", который взаимодействует с последовательностью WGATAR), HNF3a, Р и у, С/EBPa и HNF4a7 -сайты связывания которых находятся в исследованном регуляторном участке, не способен активировать экспрессию гена, контролируемого промотором HNF4al.

Изучение взаимосвязи паттерна экспрессируемых генов с прогрессионным статусом опухоли представляет интерес для фундаментальной науки. Выявление маркеров прогрессии ГК является важным этапом в исследованиях механизмов опухолевой прогрессии и представляет новые инструменты для диагностики и мишени для терапии ГК.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение диссертации по теме «Онкология», Флейшман, Дарья Игоревна

выводы

1. В гепатокариномах мыши и человека выявлена обратная зависимость между степенью опухолевой прогрессии и профилем экспрессируемых в них ткане-специфических регуляторов транскрипции HNF4a, HNFla, HNFip, HNF3y, C/EBPa и FTF. Подавление активности гена HNF4al представляется наиболее значимым событием прогрессии гепатокарцином.

2. Впервые описана гиперэкспрессия эмбриональной формы HNF4a7 в образцах дифференцированных гепатокарцином мыши и человека. На поздних этапах опухолевой прогрессии происходит подавление транскрипции HNF4a7.

3. При прогрессии в значительной части гепатокарцином впервые описана активация экспрессии гена TGF02 и TGFp-зависимых генов.

4. Из 46 проанализированных генов остеопонтин, тирозин-киназа Ufo/Axl и аспарагинсинтаза охарактеризованы как наиболее перспективные маркеры гепатоканцерогенеза.

5. Клетки ткани, окружающей гепатокарциному, экспрессируют не характерные для зрелых гепатоцитов гены HNF4a7 и HNFip, виментин, остеопонтин и snail.

6. Гепатокарциномы человека, ассоциированные с инфекцией вирусным гепатитом, развиваются по альтернативному механизму: в них не происходит репрессии гена HNF4gl

7. В регуляторном районе гена HNF4al выявлен участок -1.4 т.п.н./-363 п.н., определяющий транскрипционную репрессию этого гена в клетках дедифференцированной гепатокарциномы.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В представленной работе был впервые проведен комплексный анализ экспрессии ключевых регуляторов дифференцировки печени - ГЯФ в опухолях печени мыши и человека. Также для этих опухолей было проведено исследование закономерности экспрессии генов, предположительно вовлеченных в возникновение и прогрессию гепатокарцином.

Кроме того, был изучен регуляторный район гена HNF4al — фактора, который, по результатам проведенного исследования, является ключевым регулятором поддержания дифференцировочного статуса гепатоцитов, а подавление его активности может расцениваться, как маркер опухолевой прогрессии.

Ранее, на модели одноступенчатой прогрессии в нашей лаборатории был выведен ряд закономерностей изменения экспрессии генов в ходе гепатоканцерогенеза. На панели из 11 химически индуцированных гепатокарцином независимого происхождения и разного уровня дифференцировки мы подтвердили существование этих закономерностей. Мы установили, что уровень дифференцировки опухоли четко коррелирует с паттерном экспрессируемых в ней ткане-специфических транскрипционных факторов, причем наибольшая корреляция наблюдается с экспрессией гена HNF4a и его мишеней. Мьг показали, что высоко-дифференцированные опухоли, экспрессирующие основные ГЯФ, обладают меньшей скоростью роста, в них подавлена экспрессия генов, продукты которых вовлечены в эпителиально-мезенхимаьный переход, кроме того, судя по паттерну транскрибируемых в них генов, эти опухоли более чувствительны к проапоптотическим сигналам.

Целью данного исследования бы поиск и характеристика возможных маркеров прогрессии гепатокарцином. По итогам проведенной работы наиболее общим явлением гепатоканцерогенеза и для мыши, и для человека является снижение активности гена транскрипционного фактора HNF4al, а также гиперэкспрессия его эмбриональной сплайс-формы HNF4a7. HNF4a связывается с респонсивными элементами более, чем 12% всех генов, экспрессируемых в гепатоцитах человека, продукты которых вовлечены в самые разнообразные процессы клеточного метаболизма, дифференцировки и роста: это гены основных ферментов глюконеогенеза и обмена липидов, гены плотных и щелевых контактов, гены, кодирующие ингибиторы роста, а также большая часть генов других печень-специфических транскрипционных факторов. Эти данные указывают на то, что описываемый фактор лежит на пересечении множества сигнальных путей, нарушение которых способствует приобретению гепатоцитами злокачественного фенотипа.

Вероятно, именно поэтому нарушение его функции является одним из ключевых событий гепатоканцерогенеза. Мы полагаем, что появление транскриптов HNF4a7 является ранним маркером гепатоканцерогенеза. В то же время, мы показали,, что в дедифференцированных опухолях агрессивного фенотипа, происходит падение активности этого гена. Таким образом, можно предположить, что подавление гиперэкспрессии HNF4a7 служит маркером опухолевой прогрессии.

Активация генов TGFP-сигнального пути была также охарактеризована нами, как событие, маркирующее прогрессию гепатокарциномы: представители' семейства TGFp являются мощными регуляторами клеточного роста. В норме воздействие TGFP на эпителиальные клетки приводит к активации в них проапоптотической программы. В то же время, эпителиоциты, претерпевшие ЭМП, оказываются резистентными к действию TGFP: напротив, под влиянием этого фактора в таких клетках активируются пролиферационные антиапоптотические каскады. Мы показали, что дедифференцированные ГК самостоятельно транскрибируют TGFP, кроме того, мы регистрировали в этих опухолях гиперэкспрессию некоторых TGFP-зависимых генов (TSC-22, Tbi-68, Остеопонтин, р21). Логично предположить, что приобретение устойчивости к про-апоптотическому воздействию TGFP и последующая активация TGFp-респонсивных генов также являются маркерами опухолевой прогрессии.

Мы провели анализ спектра экспрессии 46 генов в опухолях печени мыши и человека. По результатам проведенной работы гены остеопонтина, Ufo/Axl и ASNS охарактеризованы нами как наиболее перспективные маркеры гепатоканцерогенез. Кроме того, мы впервые показали, что в гепатокарциномах повышена экспрессия генов SLPI, ASNS, кавеолина и цитохезина 3.

Немаловажным результатом работы стало наблюдение об активации некоторых генов, нехарактерных для нормальных гепатоцитов, в клетках ткани печени, окружающей опухоль. К ним относятся гены, кодирующие ГЯФ; в норме присутствующие лишь в эмбриональной печени: HNF4a7 и HNFip, ген эмбрионального белка АФП, а также гены, продукты которых вовлечены в изменение внеклеточного матрикса, различных клеточных контактов и перестройку клеточного цитоскелета в сторону подвижного фенотипа (остеопонтин, виментин, Snail). Мы предполагаем, что опухолевые клетки, способны секретировать в окружающую среду факторы, которые, в' свою очередь, активируют сигнальные каскады как в клетках опухоли, так и в клетках прилежащей к ней ткани. Таким образом, окружающие нормальные гепатоциты участвуют в моделировании внеклеточного матрикса, а значит, способствуют инвазии опухолевых клеток. Изучение этого явления представляется нам чрезвычайно важным направлением онкологии, и, несомненно, станет темой наших дальнейших исследований.

В работе также охарактеризован регуляторный район гена HNF4al. Выдвинуто предположение, что участок -1.4 т.п.н./-363 п.н. содержит сайт связывания для неизвестного пока регулятора транскрипции HNF4a. Удаление этого фрагмента из регуляторного района HNF4al позволяет активировать экспрессию гена-репортера в клетках дедифференцированной гепатомы НЗЗ, в норме не экспрессирующей HNF4a. Мы показали, что ни один из известных ГЯФ (HNFla и Р, HNF6, GATA6, HNF3a, Р и у, C/EBPa и HNF4a7), сайты связывания которых находятся в исследованном регуляторном участке, не способен активировать транскрипцию гена-репортера, находящегося под контролем полного регуляторного района HNF4al. Это позволило нам предположить, что репрессия гена HNF4a в клетках культуры НЗЗ вызвана именно наличием репрессора, сайт связывания для которого находится на участке -1.4 т.п.н./-363 п.н. регуляторного района. В дальнейшем мы планируем выявить и охарактеризовать этот репрессор. Не исключено, что именно за счет действия этого фактора осуществляется подавление активности гена HNF4al, что приводит к углублению опухолевой прогрессии.

Несмотря на то, что каждая опухоль уникальна по способу возникновения и развития, а спектр генетических поломок, последовательно направляющих клетку по пути канцерогенеза, сугубо индивидуален, нам представляется целесообразным продолжать поиски общих закономерностей опухолевой прогрессии. Изучение отдельных этапов этой прогрессии и способов перехода на следующую ступень озлокачествления представляет как неоспоримый интерес для фундаментальной науки, так и перспективное направление в лечении и диагностике опухолей.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Флейшман, Дарья Игоревна, 2008 год

1. Канцерогенез, п. ред. Заридзе, Д.Г., М.: Медицина, 2004.

2. Лазаревич, Н.Л., 2004. Молекулярные механизмы прогрессии опухолей печени. Успехи биохимии 44: 365-418.

3. Лазаревич, Н.Л. 2003. Изменения спектров экспрессии генов при гепатоканцерогенезе и прогрессии опухолей печени. Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук, Москва, МГУ.

4. Лазаревич, Н.Л., 2000. Молекулярные механизмы экспрессии гена альфа-фетопротеина. Биохимия, 65(1): 139-158.

5. Ченцов, Ю.С., 2004. Введение в клеточную биологию: учебник для вузов. М.: ИКЦ Академкнига, 495 с.

6. Abelev, G.I., Perova, S., Khramkova, N.I., Postnikova, Z.A., Irlin, I., 1963. Production of embryonic alpha-globulin by the transplantable mouse hepatomas. Transplant. Bull 1: 174-180.

7. Abelev, G.I., Lazarevich, N.L., 2006. Control of differentiation in progression of epithelial tumors. Adv. Cancer Res., 95: 61-113.

8. Bailly, A., Torres-Padilla, M.E., Tinel, A.P., Weiss, M.C., 2001. An enhancer elementi6kb upstream of the mouse HNF4al promoter is activated by glucocorticoids and liver-enriched transcription factors. Nucleic Acids Res. 29:'3495-3505.

9. Barbacci, E., Reber, M., Ott, M.O., Breillat, C., Huetz, F„ Cereghini, S., 1999. Variant hepatocyte nuclear factor 1 is required for visceral endoderm specification. Development 126: 4795-4805.

10. Bartoov-Shifman, R., Hertz, R., Wang, H., Wollheim, C.B., Bar-Tana, J., Walker, M.D., 2002. Activation of the Insulin Gene Promoter through a Direct Effect of Hepatocyte Nuclear Factor 4a. J. Biol. Chem. 277 (29): 25914-25919.

11. Bertolino, E., Reimund, В., Wildt-Perinic, D., Clerc, R.G., 1995. A novel Homeobox protein which recognizes a TGT core and functionally interferes with a Reyinoid-responsive motif. J. Biol. Chem. 270(52):31178-31188.

12. Boyer, В., Valles, A.M., Edme, N., 2000. Induction and regulation of epithelial-mesenchymal transitions. Bioch. Pharmacol. 60: 1091-1099.

13. Briancon, N., Weiss, M.C., 2006. In vivo role of the HNF4a AF-1 activation domain revealed by exon swapping. EMBO J. 25: 1253-1262.

14. Buendia, M.A., 2000. Genetics of hepatocellular carcinoma. Cancer Biol. 10: 185-200.

15. Cascio, S., Zaret, K.S., 1991. Hepatocyte differentiation initiates during endodermal-mesenchymal interactions prior to liver formation. Development 113: 217-225.

16. Cereghini, S., 1996. Liver-enriched transcription factors and hepatocyte differentiation. FASEB J. 10: 267-282.

17. Chao, D.T., Korsmeyer, S.J., 1998. BCL-2 family: regulators of cell death. Ann. Rev. Immunol. 16: 395-419.

18. Christensen, В., Kazanecki, C.C., Petersen, Т.Е., Rittling S.R., Denhardt, D.T., Sorensen, E.S., 2007. Cell-type specific podt-translational modifications of mouse osteopontin are associated with different adhesive properties. J Bio Chem, in press.

19. Clotman, F., Lannoy, V.J., Reber, M., Cereghini, S., Cassiman, D., Jacquemin, P., Roskams, Т., Rousseau, G.G., Lemaigre, F.P., 2002. The onecut transcription factor HNF6 is required for normal development of the biliary tract. Dev. 129(8): 1819-28.

20. Coffinier, С., Barra, J., Babinet, C., Yaniv, M., 1999. Expression of the vHNFl/HNFlbeta homeoprotein gene during mouse organogenesis. Mech. Dev. 89(1-2): 211213.

21. Coffinier, C„ Gresh, L., Fiette,-L., Tronche, F., Schutz, G., Babinet, C., Pontoglio, M., Yaniv, M. and Barra, J., 2002. Bile system morphogenesis defects and liver dysfunction upon targeted deletion of HNFip. Development 129: 1829 -1838.

22. Costa, R.H., Kalinichenko, V.V., Holterman, A.X., Wang, X., 2003. Transcription factors in liver development, differentiation , and regeneration. Hepatology 3: 1331-1347.

23. De Juan, C., Benito, M., A' lvarez, A.M., Fabregat, I., 1992. Differential proliferative response of cultured fetal and regenerating hepatocytes to growth factors and hormones. Exp. Cell Res. 202: 495-500.

24. Delfino, D.V., Agostini, M., Spinicelli, S., Vito, P., Riccardi, C., 2004. Decrease of Bcl-xL and augmentation of thymocyte apoptosis in'GILZ overexpressing transgenic mice. Blood 104(13): 4134-4141.

25. Denhardt, D.T., Guo, X., 1993. Osteopontin: a protein with diverse functions. FASEB J. 7(15): 1475-1482.

26. Devogdt, N., Gkassabeh, G.H., Zhang, J., Brys, L., De Baetselier, P., Revets, H., (2003). Secretory leukocyte protease inhibitor promotes the tumorigenic and metastatic potential of cancer cells. PNAS 100(10): 5778-5782.

27. Drewes, Т., Senkel, S., Holewa, В., Ryffel, G.U., 1996. Human hepatocyte nuclear factor 4 isoforms are encoded by distinct and differentially expressed genes. Mol. Cell Biol. 16(3): 925931.

28. Duncan, S.A., Nagy, A., Chan, W., 1997. Murine gastrulation requires HNF-4 regulated gene expression in the visceral endoderm: tetraploid rescue of Hnf-4(-/-) embryos. Development 124(2): 279-87.

29. Duncan, S.A., Navas, M.A., Dufort, D., Rossant, J., Stoffel M., 1998. Regulation of a transcription factor network required for differentiation and metabolism. Science 281(5377): 692-695.

30. Faubion, W.A. and G.J. Gores, Death receptors in liver biology and pathobiology. Hepatology, 1999. 29(1): p. 1-4.

31. Fausto, N., 2000. Liver regeneration. J. Hepatology, 31: 19-31.

32. Feitelson, M.A., Sun, В., Satiroglu, Tufan. N.L., Liu, J., Pan, J., Lian, Z., 2002. Genetic mechanisms of hepatocarcinogenesis. Oncogene 21: 2593-2604.

33. Frayling, T.M., Bulman, M.P., Ellard, S., Appleton, M., Drousfield, M. J., Mackie,

34. A.D.R., Baird, J.D., Kaisaki, P.J., Yamagata, K., Bell, G.I., Bain, S.C., Hattersley, A.T., 1997. Mutations in the hepatocite nuclear factor-1 gene are a common cause of maturity-onset diabetes of the young in the U.K. Diabetes 46(4): 720-725.

35. French-Constant, C., 1995. Alternative splicing of fibronectin many different proteins but few different functions. Exp. Cell Res. 221: 261-271.

36. Friedl, P., Wolf, K., 2003. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nature Rev. 3: 362-374.

37. Galarneau, L., Pare, J.F., Allard, D., Hamel, D., Levesque, L., Tugwood, J.D., Green, S., Belanger, L., 1996. The alpha 1-fetoprotein locus is activated by a nuclear receptor of the Drosophila FTZ-F1 family. Mol. Cell Biol. 16(7): 3853-3865.

38. Gery, S., Tanosaki, S., Bose, S., Bose, N., Vadgama, J., Koeffler, H.P. 2005. Down-regulation and growth inhibitory role of C/EBPalpha in breast cancer. Clin. Cancer Res. 11(9): 3184-3190.

39. Greenbaum, L.E., Li, W., Cressman, D.E., Peng, Y., Ciliberto, G., Poli, V., Taub, R. 1998. CCAAT enhancer- binding protein beta is required for normal hepatocyte proliferation in mice after partial hepatectomy. J. Clin. Invest. 102(5): 996-1007.

40. Hafher, M., Schmitz, A., Grune, I., Srivatsan, S.G., Paul, В., Kolanaus, W., Quast, Т., Kremmer, E., Bauer, I., Famulok, M., 2006. Inhibition of cytohesins by SecinH3 leads to hepatic insulin resistance. Nature 444(7121): 941-944.

41. Halmos, В., Basseres, D.S., Monti, S., D'Alo, F., Dayaram, Т., Ferenczi, K., Wouters,

42. B.J., Huettner, C.S., Golub, T.R., Tenen, D.G., 2004. A transcriptional profiling study of

43. CCAAT/enhancer binding protein targets identifies hepatocyte nuclear factor 3 beta as a novel tumor suppressor in lung cancer. Cancer Res. 64(12): 4137-4147.

44. Halmos, В., Huettner, C.S., Kocher, O., Ferenczi, K., Karp, D.D., Tenen, D.G., 2002. Down-regulation and antiproliferative role of C/EBPalpha in lung cancer. Cancer Res. 62(2): 528-534.

45. Hanahan, D., Weinberg, R.A., 2000. The hallmarks of cancer. Cell 100: 57-70.

46. Hatzis, P., Kyrmizi, I., Talianidis, I., 2006. Mitogen-activated protein kinase-mediated disruption of enhancer-promoter communiaton inhibits hepatocyte nuclear factor 4a expression. Mol. and Cell Biol. 26 (19): 7017-7029.

47. Hatzis, P., Talianidis, I., 2001. Regulatory mechanisms controlling human hepatocyte nuclear factor 4a gene expression. Mol. and Cell Biol. 21 (21): 7320-7330.

48. Hatzis, P., Talianidis, I., 2002. Dynamics of enhancer-promoter communication during differentiation-induced gene activation. Mol. Cell 10: 1467-1477.

49. Hayhurst, G.P., Lee, Y.-H., Lambert, G., Ward, J.M., Gonzalez, F.J., 2001. Hepatocyte Nuclear Factor 4a (Nuclear Receptor 2A1) Is Essential for Maintenance of Hepatic Gene Expression and Lipid Homeostasis. Mol. Cell Biol. 21(4): 1393-1403.

50. Hertz, R., Kalderon, В., Byk, Т., Berman, I., Za'tara, G., Mayer, R., Bar-Tana, J., 2005. Thioesterase Activity and Acyl-CoA/Fatty Acid Cross-talk of Hepatocyte Nuclear Factor-4a. J. Biol. Chem. 280(26): 24451-24461.

51. Hertz, R., Magenheim, J., Berman, I., Bar-Tana, J., 1998. Nature. 392: 512-516.

52. Hollander, C., Nystrom, M., Janciauskiene, S., Westin, U., (2003). Human mast cells decrease SLPI levels in type II like alveolar cell model, in vitro. Cancer Cell. Int. 3(14).

53. Hood, J.D., Cheresh, D.A., 2002. Role of integrins in cell invasion and migration. Nature Rev. Cancer 2: 91-100.

54. Jensen, M.R., Factor, V.M., Fantozzi, A., Heli, K., Huh, C.G., Thorgerrison, S.S., (2003) Reduced hepatic tumor incidence in cyclin Gl-deficient mice. Hepatology 37:862-870.

55. Johnoson, P., 2005. Molecular stop signs: regulation of cell-cycle arrest by C/EBP transcription factors. J. Cell Science 118: 2545-2555.

56. Kaestner, K.H., Knochel, W., Martinez, D.E., 2000. Unified nomenclature for the winged helix/forkhead transcription factors. Gen. Dev., 14 (2): 142-146.

57. Kaestner. K.H., Hiemisch. H., Schutz. G., 1998. Targeted disruption of the gene encoding hepatocyte nuclear factor 3gamma results in reduced transcription of hepatocyte-specific genes. Mol. Cell Biol. 18(7): 4245-4251.

58. Karam, J.A., Lotan, Y., Roehborn, C.G., Ashfaq, R., Karakiewicz, P.I., Shariat, .S.F., 2007. Caveolin-1 overexpression is associated with aggressive prostate cancer recurrence. Prostate 67: 614-622.

59. Koch, A., Denkhaus, D., Albrecht, S., Leuschner, I., von Schweinitz, D., Pietsch, Т., 1999. Childhood hepatoblastomas frequently carry a mutated degradation targeting box of the p-catenin gene. Cancer Res. 59: 269-273.

60. Maire, P., Wuarin, J., Schibler, U., 1989. The role of cis-acting promoter elements in tissue-specific albumin gene expression. Science 244: 343-346.

61. Manabe, R., Ohe, N., Maeda, Т., Fukuda, Т., Sekiguchi, K., 1997. Modulation of cell-adhesive activity of fibrinectin by the alternatively spliced EDA segment. JCB 139(1): 295-307.

62. Massague, J., Chen, Y.G., 2000. Controlling TGF-P signaling. Genes Dev. 14: 627-644.

63. McCarville, M.E., Furman, W.L., 2007. Hepatoblastoma. eMedicine Specialities.

64. Melhuish, T.A., Gallo, C.M., Wotton, D., 2001. TGIF2 Interacts with Histone Deacetylase 1 and represses transcription. J. Biol. Chem. 276(34):32109-32114.

65. Mendel, D.B., Hansen, L.P., Graves, M.K., Conley, P.B., Crabtree, G.R., 1991. HNF-1 alpha and HNF-1 beta (vHNF-1) share dimerization and homeo domains, but not activation domains, and form heterodimers in vitro. Gen. Dev. 5: 1042-1056.

66. Mendel, D.B., Khavari, P.A., Conley, P.B., Graves, M.K., Hansen, L.P., Admon, A., Crabtree, G.R., 1991. Characterization of a cofactor that regulates dimerization of a mammalian homeodomain protein. Science 254: 1762-1767.

67. Mittelstadt, P.R., Ashwell, J.D., 2001. Inhibition of AP-1 by the Glucocorticoid-inducible protein GILZ. J. Biol. Chem. 276(31): 29603-29610.

68. Moreno, M., Molina, H., Amigo, L., Zanlungo, S., Arreses, M., Rigotti, A., Miquel, J.F., 2003. Hepatic overexpression of Caveolins increases bile salt secretion in mice. Hepatology 38(6): 1477-1488.

69. Morrisey, E.E., Tang, Z., Sigrist, K., Lu, M.M., Jiang, F., Ip, H.S., Parmacek, M.S., 1998. GATA6 regulates HNF4 and is required for differentiation of visceral endoderm in the mouse embryo. Gen. Dev. 12(22): 3579-3590.

70. Moustakas, A., Heldin, C.H., 2005. Non-Smad TGF-beta signals. J. Cell Sci. 118(16): 3573-3584.

71. Oda, H., Imai, Y., Nakatsuru, Y., Hata, J.-I., Ishikawa, Т., 1996. Somatic mutations of the APC gene in sporadic hepatoblastomas. Cancer Res. 56: 3320-3323.

72. Peinado, H., Portillo, F., Cano, A., 2004. Transcriptional regulation of cadherins during development and carcinogenesis. Int. J. Dev. Biol. 48: 365-375.

73. Pessah, M., Prunier, С., Marais, J., Ferrand, N., Mazars, A., Lalemand, F., Gauthier, J.M., Atfi, A., 2001. C-Jun interacts with the corepressor TG-interacting factor (TGIF) to suppress Smad2 transcriptional activity. PNAS 98(ll):6198-6203.

74. Petrescu, A.D., Hertz, R., Bar-Tana, J., Schroeder, F., Kier, A.B., 2002. Ligand Specificity and Conformational Dependence of the Hepatic Nuclear Factor-4a (HNF-4a). J. Biol. Chem. 277(27): 23988-23999.

75. Ping, A., Reeve, A., Law, D., Young, M., Boehnke, M., Feinberg, A., 1989. Genetic linkage of Beckwith-Wiedemann syndrome to 1 lpl5. Am. J. Hum. Genet. 44: 720-723.

76. Power, S.C., Cereghini, S. (1996). Positive regulation of the vHNFl promoter by the orphan receptors COUP-TFl/ЕагЗ and COUP-TFII/Arpl. Mol Cell Biol 16(3): 778-91

77. Rana, В., Y. Xie, D. Mischoulon, N.L. Bucher,.S.R. Farmer (1995). The DNA binding activity of C/EBP transcription factor is regulated in the G1 phase of the hepatocyte cell cycle. J Biol Chem 270(30): 18123-32.

78. Rangaswami, H., Bulbule, A., Kundu, G.C., 2005. JNK1 Differentially regulates osteopontin-induced Nuclear Factor-inducing Kinase/MEKKl-dependent Activating Protein-1-mediated promatrix Metalloproteinase-9 activation. J. Bio Chem. 280(19): 19381-19392.

79. Rastegar, M., Rousseau, G. G. and Lemaigre, F. P., 2000. CCAAT/enhancer-binding protein-cr is a component of the growth hormone-regulated network of liver transcription factors. Endocrinology 141: 1686-1692.

80. Report of the Expert Committee on the Diagnosis and Classification of Diabetes Mellitus, 2003. Diabetes care 26: 5-20

81. Rocken C., McGrath, SC, 2001. Pathology and pathogenesis of hepatocellular carcinoma. Dig. Dis. 19:269-278.

82. Satohisa, S., Chiba, H., Osanai, M., Ohno, S., Kojima, Т., Saito, Т., Sawada, N., 2005. Behavior of tight-junction and cell polarity proteins during HNF-4a-induced epithelial polarization. Exp. Cell Res. 310(l):66-78.

83. Schrem, H., Klempnauer, J., Borlak, J., 2002. Liver enriched transcription factors in liver function and development.part 1: The Hepatocyte Nuclear Factor network and liver-specific gene expression. Pharmocol. Rev. 54(1): 129-158.

84. Shi, X., Bai, S., Li, L., Cao, X., (2001),. Hoxa-9 Represses Transforming Growth Factor-P induced Osteopontin Gene Transcription. J. Biol. Chem. 276(1): 850-855.

85. Shi, X., Shi, W., Li, Q., Song, В., Wan, M., Bai, S., Cao, X., (2003). A glucocorticoid-indused leucione-zipper protein, GILZ, inhibits adipogenesis of mesenchymal cells. EMBO reports 4(4): 374-380.

86. Shiojiri, N., Lemire, J. M. and Fausto, N., 1991. Cell lineages and oval cell progenitors in rat liver development. Cancer Res. 51: 2611 -2620.

87. Shiojiri, N., Takeshita, K., Yamasaki, H. and Iwata, Т., 2004. Suppression of С/ЕВР a expression in biliary epithelial cells during mouse liver development. J. Hepatol. 41: 790 -798.

88. Shmuel, M., Santy, L.C., Frank, S., Avrahami, D., Casanova, J.E., Altschuler, Y., 2006. ARNO through its Coiled-coil domain regulates endocytosis at the apical surface of polarized epithelial cells. J. Biol. Chem. 281(19) 13300-13308.

89. Smart, E.J., Graf, G.A., McNiven, M.A., Sessa, W.C., Engelman, J.A., Scherer, P.E., Okamoto, Т., Lisanti, M.P., 1999. Caveolins, liquid-ordered domains, and signal transduction. Mol. Cell Biol. 19(11): 7289-7304.

90. Soutoglou, E., Katrakili, N., Talianidis, I., 2000. Acetylation regulates transcription factor activity at multiply levels. Mol. Cell 5:745-751.

91. Spath, G.F., Weiss, M.C., 1998. Hepatocyte nuclear factor 4 provokes expression of epithelial marker genes, acting as a morphogen in dedifferentiated hepatoma cells. J Cel Biol 140(4): 935-946.

92. Taraviras, S., Monaghan, A.P., Schutz, G., Kelsey, G., 1994. Characterization of the mouse HNF-4 gene and its expression during mouse embryogenesis. Mech. Dev. 48: 67-79.

93. Thiery, J.P., 2002. Epithelial-mesenchymal transitions in tumour progression. Nature Rev. Cancer 2: 442-454.

94. Thorgeirsson, S.S., Grisham, J.W., 2002. Molecular pathogenesis of human hepatocellular carcinoma. Nat. Gen. 31: 339-345.

95. Torres-Padilla, M.E., Fougere-Deschatrette, C., Weiss, M.C., 2001. Expression of HNF4alpha isoforms in mouse liver development is regulated by sequential promoter usage and constitutive 3' end splicing. Mech. Dev. 109: 183-193.

96. Tronche, F., Ringeisen, F., Blumenfeld, M., Yaniv, M., Pontoglio, M., 1997. Analysis of the distribution of binding sites for a tissue-specific transcription factor in the vertebrate genome. J. Mol. Biol. 266: 231-245

97. Verrecchina, F., Mauviel, A., 2007. Transforming growth factor-beta and fibrosis.W. J. Gastroenterol. 13(22): 3056-3062.

98. Vincent-Salomon, A., Thiery, J.P., 2003. Host microenvironment in breast cancer development: Epithelial-mesenchymal transition in breast cancer development. Breast Cane. Res. 5(2): 101-106

99. Wang, D., Yamamoto, S., Hijiya, N., Benveniste, E.N., Gladson, C.L., 2000. Transcriptional regulation of the human osteopontin promoter: functional analysis and DNA-protein interactions. Oncogene 19: 5801-5809.

100. Weber, R.G., Pietsch, Т., Schweinitz, D., Lichter, P., 2000. Characterization of genomic alterations in hepatoblastomas. A role for gains on chromosomes 8q and 20 as predictors of poor outcome. Am. J. Path. 157: 571-578.

101. Weigel, D., Jackie, H., 1990. The fork head domain: a novel DNA binding motif of eukaryotic transcription factors? Cell 63: 455-456

102. William, C., Hahn, M.D., Weinberg, R.A., 2002. Rules for making humamtumor cells. N. Engl. J. Med. 347(20): 1593-1601.

103. Williams, T.M., Lisanti, M.P., 2005. Caveolin-1 in oncogenic transformation, cancer, and metastasis. Am J. Physiol. Cell Physiol. 288: 494-506.

104. Yamagata K., et al., 1996. Mutations in the hepatocyte nuclear factor-1 gene in maturity-onset diabetes of young (MODY3). Nature 384(6608): 455-458.

105. Zaret, K., 2002. Regulatory phases of early liver development: paradigms of organogenesis. Nat Rev Genet. 3(7): 499-512.

106. Zhao, R. and Duncan, S. A., 2005. Embryonic development of the liver. Hepatology 41: 956-967.

107. Zhao, L., Samuels, Т., Winckler, S., Korgaonkar, C., Tompkins, V., Home, M.C., Quelle, D.E., 2003. Cyclin G1 has growth inhibitory activity linked to the ARF-Mdm2-p53 and pRb tumor suppressor pathways. Mol. Cancer Res. 1:195-206.

108. Zhong, W., Mirkkovitch, J., Darnell, J., 1994. Tissue-specific regulation of mouse hepatocyte nuclear factor 4 expression. Mol. Cell Biol. 14(11): 7276-7284.