Иммунобиологические подходы к диагностике и лечению COVID-19 тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Костин Никита Николаевич

• Костин Никита Николаевич
• кандидат наук
• 2026

Оглавление диссертации кандидат наук Костин Никита Николаевич

Оглавление

Список сокращений

Введение

Актуальность темы исследования

Цель работы и поставленные задачи

Научная новизна и практическая значимость работы

Положения, выносимые на защиту

Апробация работы

1. Обзор литературы

1.1. Строение и жизненный цикл бетакоронавирусов

1.1.1. Строение бетакоронавирусов

1.1.2. Жизненный цикл бетакоронавирусов

1.2. Современные методы серологических исследований вирусных заболеваний

1.2.1. Определение спектра иммуноглобулинов при инфицировании SARS-CoV-2

1.2.2. Определение нейтрализующих антител

1.3. Таргетные препараты в терапии и профилактике бетакоронавирусов

1.3.1. Вирус-нейтрализующие антитела

1.3.2. Вирус-нейтрализующие пептиды и белки

2. Материалы и методы

2.1. Методы работы с нуклеиновыми кислотами

2.1.1. Амплификация фрагментов ДНК методом полимеразной цепной реакции

2.1.2. Рестрикция

2.1.3. Лигирование

2.1.4. Электрофорез ДНК в агарозном геле

2.1.5. Электрофорез ДНК в полиакриламидном геле

2.2. Методы работы с E.coli

2.2.1. Получение электрокомпетентных клеток

2.2.2. Трансформация E.coli методом электропорации

2.2.3. Получение химически компетентных клеток E. coli

2.2.4. Трансформация E.coli методом теплового шока

2.2.5. Скрининг трансформантов методом ПЦР

2.2.6. Ночная культура

2.2.7. Экспрессия белков в E.coli

2.2.8. Лизис и выделение белков из телец включения E.coli

2.3. Методы работы с линиями эукариотических клеток

2.3.1. Культивирование клеточных линий

2.3.2. Получение клеточной линии HEK293 -ACE2/TMPRS S2

2.3.3. Получение лентивирусных векторов

2.3.4. Трансдукция клеток HEK293-ACE2

2.3.5. Сортировка трансдуцированных клеток

2.3.6. Экспрессия в клетках HEK293F

2.3.7. Тест нейтрализации псевдовирусов (pVNT)

2.3.8. Определение нейтрализующих активность LCB1-ABD-Bn антител

2.3.9. Классический вирус-нейтрализующий тест (cVNT)

2.4. Методы работы с белками

2.4.1. Денатурирующий электрофорез в полиакриламидном геле

2.4.2. Вестерн-блоттинг

2.4.3. Фармакокинетический анализ методом количественной хромато-масс-спектрометрии без меток (Label-Free LC-MS/MS)

2.4.4. Иммуноферментный анализ

2.4.5. Количественное определение IgG, специфичных к RBD, и определение их изотипов методом ИФА

2.4.6. Определение мышиных IgG к LCB1-ABD-Bn

2.4.7. Количественное определение RBD-специфичных нейтрализующих антител методом конкурентного ИФА

2.5. Методы работы с животными

2.5.1. Оценка защитных свойств соединений против живого вируса SARS-CoV-2

2.5.2. Определение фармакокинетических параметров и иммуногенности

2.6. Статистический анализ

3. Результаты и обсуждение

3.1. Исследование антительного ответа к вирусу SARS-CoV-2 при прогрессии COVID-19

3.1.1. Определение динамики гуморального ответа пациентов на вирус SARS-CoV-2

3.1.2. Влияние возраста и пола на динамику гуморального ответа

3.1.3. Вклад антигенов в чувствительность ИФА

3.1.4. Связь тяжести заболевания с уровнем и спектром антител

3.2. Исследование активности SARS-CoV-2 нейтрализующих антител

3.2.1. Создание тест-системы для количественного определения нейтрализующей активности антител к SARS-CoV-2 на основе ИФА

3.2.2. Сравнение RBD нейтрализующей активности сывороток, измеренной методом кИФА с вирус-нейтрализацией в псевдовирусной системе и на живом вирусе

3.2.3. Сравнительный анализ активности RBD-нейтрализующих антител у вакцинированных и переболевших COVID-19

3.2.4. Взаимосвязь RBD-нейтрализующей активности антител и концентрации анти-RBD IgG

3.3. Создание таргетного иммунопрепарата на основе нейтрализующего SARS-CoV-2 пептида LCB1 и высокоактивной РНКазы барназы

3.3.1. Получение и характеристика конъюгата LCB1 -Барназа in vitro и in vivo

3.3.2. Создание и in vitro исследование пролонгированной формы LCB1-Barnase

3.3.3. Токсичность, фармакокинетика и in vivo активность LCB1-ABD-Barnase

3.3.4. Иммуногенность и специфичность гуморального ответа к компонентам конструкции

Выводы

Список литературы

Приложения

Приложение

Приложение

Приложение

Приложение

Приложение

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ACE2 — Angiotensin-Converting Enzyme 2 (ангиотензинпревращающий фермент 2) ADA — Anti-Drug Antibodies (антитела против лекарственного препарата) ABD — Albumin-Binding Domain (домен связывания с альбумином)

ADCC — Antibody-Dependent Cell-mediated Cytotoxicity (антитело-зависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность)

ADCP — Antibody-Dependent Cellular Phagocytosis (антитело-зависимый клеточный фагоцитоз)

BAU — Binding Antibody Units (международные единицы связывающих антител, ВОЗ)

BSL — Biosafety Level (уровень биологической безопасности)

CHO — Chinese Hamster Ovary cells (клетки яичника китайского хомячка)

CLIA — Chemiluminescent Immunoassay (хемилюминесцентный иммуноанализ)

CM — Convoluted Membranes (извилистые мембраны)

DMV — Double-Membrane Vesicles (двухмембранные везикулы)

cVNT — Classical Virus Neutralization Test (классический вирус-нейтрализующий тест) DLS — Dynamic Light Scattering (динамическое рассеяние света) ELISA (ИФА) — Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (иммуноферментный анализ) ER — Endoplasmic Reticulum (эндоплазматический ретикулум)

ERGIC — Endoplasmic Reticulum-Golgi Intermediate Compartment (промежуточный ЭПР-Гольджи компартмент)

FACS — Fluorescence-Activated Cell Sorting (флуоресцентно-активированная сортировка клеток)

FP — Fusion Peptide (фузогенный пептид)

FRNT — Foci Reduction Neutralization Test (тест на редукцию очагов инфекции)

HSA — Human Serum Albumin (альбумин сыворотки человека)

HR1/HR2 — Heptad Repeat 1/2 (спиральные повторы 1 и 2)

HRP — Horseradish Peroxidase (пероксидаза хрена)

IgA, IgG, IgM — Immunoglobulin A, G, M (иммуноглобулины A, G, M)

KD — Equilibrium Dissociation Constant (константа диссоциации)

LC-MS/MS — Liquid Chromatography with Tandem Mass Spectrometry (жидкостная хроматография с тандемной масс-спектрометрией)

LOD/LOQ — Limit of Detection / Limit of Quantification (предел обнаружения / предел количественного определения)

MOI — Multiplicity of Infection (кратность заражения)

MSA — Mouse Serum Albumin (мышиный сывороточный альбумин)

NTD — N-terminal Domain of spike protein (N-концевой домен S-белка) PBS — Phosphate-Buffered Saline (фосфатно-солевой буфер) PCR — Polymerase Chain Reaction (полимеразная цепная реакция) PK — Pharmacokinetics (фармакокинетика)

pVNT — Pseudovirus Neutralization Test (тест нейтрализации с псевдовирусами)

qRT-PCR — Quantitative Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (количественная ОТ-

ПЦР в реальном времени)

RBD — Receptor-Binding Domain (рецептор-связывающий домен S-белка) RBM — Receptor-Binding Motif (рецептор-связывающий мотив) RT — Room Temperature (комнатная температура)

SDS-PAGE — Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis (денатурирующий электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия)

SEC-MALS — Size-Exclusion Chromatography with Multi-Angle Light Scattering (гель-фильтрация с многоугловым рассеянием света)

SPR — Surface Plasmon Resonance (поверхностный плазмонный резонанс)

sVNT/кИФА — Surrogate Virus Neutralization Test (конкурентный ИФА)

TMB — Tetramethylbenzidine (тетраметилбензидин, субстрат для HRP)

TMPRSS2 — Transmembrane Protease, Serine 2 (трансмембранная сериновая протеаза 2)

WHO — World Health Organization (Всемирная организация здравоохранения)

WT — Wild Type (дикий тип, исходная форма вируса/белка)

ВВЕДЕНИЕ

Несмотря на значительные успехи современной молекулярной биологии и биоорганической химии в области создания основ диагностики и терапии вирусных заболеваний, глобальные вызовы, связанные с прошедшей пандемией и возможными будущими вирусными экспансиями, требуют постоянного и пристального внимания к проблеме. Существенное развитие эти подходы получили в связи с пандемией COVID-19. Пандемия была вызвана вирусом SARS-CoV-2, относящемся к бетакоронавирусам, представляющим собой подгруппу коронавирусов, обладающих патогенными свойствами по отношению к высшим организмам. Эти вирусы характеризуются средними размерами вирионов, наличием липидной оболочки и одноцепочечной (+)РНК, формирующей геном размером от 27 до 32 тыс. нуклеотидов.

Бетакоронавирусы относятся к семейству Coronaviridae и подразделяются на отдельные филогенетические линии на основании сходства их геномных последовательностей. Линия В включает вирус SARS-CoV, тогда как к линии С относят МЕЯ^-CoV и SARS-CoV-2. Генетическое разнообразие внутри этих линий определяет различия в патогенности и спектре восприимчивых хозяев. Основными природными резервуарами бетакоронавирусов являются млекопитающие, в частности летучие мыши и верблюды, играющие ключевую роль в зоонозной передаче инфекции человеку. Широкое поражение населения планеты вирусом SARS-CoV-2 стимулировало инновационные подходы для диагностики вирусного поражения, определения стадии заболевания, глубины поражения, а также разработку новых подходов к лечению.

Актуальность темы исследования

Значительные успехи в области молекулярной вирусологии, связанные с диагностическими подходами, обеспечиваются в основном ПЦР-тестированием. Специалистами в области биоорганической химии создан широкий набор низкомолекулярных противовирусных препаратов значительной эффективности. Вместе с тем существенные трудности при диагностике новой короновирусной инфекции и терапии пораженных индивидов инициировало привлечение методов современной иммунологии. Данная диссертационная работа описывает результаты, связанные с адаптацией подходов биоорганической химии к области иммунологии. Необходимо признать, что серологические методы остаются одним из основных инструментов диагностики и эпидемиологического анализа вирусных инфекций. Важно учитывать преимущества этих подходов, так как наряду с определением антител к белкам оболочки вируса спектр идентифицированных антител позволяет оценить сроки перенесённой инфекции, включая случаи с лёгким или

бессимптомным течением, а также оценить уровень гуморального иммунитета как в популяции в целом, так и в отдельных группах риска. Диагностические подходы, основанные на иммунологических данных органично связаны с разработкой терапии вирусной инфекции с помощью иммунологических подходов. В данной диссертационной работе использование методов биоорганической химии позволяет развить иммунотерапию вирусной инфекции.

Антитела играют центральную роль в защите от вирусных инфекций, обеспечивая активацию комплемента, опсонизацию и антитело-зависимые эффекторные функции, включая антитело-зависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность, антитело-зависимый клеточно-опосредованный фагоцитоз, а также нейтрализацию вируса - блокирование его проникновения в клетку. Среди различных механизмов именно нейтрализующие антитела рассматриваются как наиболее надёжный показатель протективного иммунитета. Вместе с тем для полноценного понимания динамики и структуры гуморального ответа необходимо учитывать не только наличие антител различных классов (IgM, IgA, IgG), но и их функциональные свойства. Создание иммунопротективных препаратов, сконструированных на специфических иммуноглобулиновых фолдах и на специфических пептидных фрагментах, специфичных к белкам вирусной оболочки обладает существенными преимуществами перед подходом, связанным с разработкой низкомолекулярных противовирусных препаратов, так как направлены на создание первичного протективного эффекта при проникновении вирусной частицы в организм человека.

Цель работы и поставленные задачи

Цель данной работы заключалась в создании новых диагностических платформ на основе рекомбинантных фрагментов белков вирусной оболочки, а также создание иммунобиологических препаратов пролонгированного действия, нейтрализующего активность вируса SARS-CoV-2.

В диссертационной работе были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать особенности гуморального ответа у пациентов с COVID-19, определить вирусные мишени и динамику формирования антител различных классов (IgM, IgA, IgG) в зависимости от тяжести заболевания, возраста и пола.

2. Разработать тест-систему для количественного анализа вирус-нейтрализующих антител к SARS-CoV-2, сопоставимую по эффективности с традиционными тестами вирус-нейтрализации (pVNT, cVNT).

3. Оценить гуморальный ответ у лиц, привитых вакцинами Гам-КОВИД-Вак (Sputnik V) и КовиВак, в сравнении с переболевшими COVID-19 пациентами.

4. Создать таргетный иммунопрепарат нового типа на основе вирус-нейтрализующего пептида LCB1, специфичного к SARS-CoV-2, и бактериальной РНКазы барназы.

5. Предложить пролонгированную форму препарата с увеличенным временем циркуляции в кровотоке.

6. Провести пилотные доклинические испытания полученного препарата: оценить токсичность, фармакокинетику, иммуногенность и противовирусную активность in vivo на модели SARS-CoV-2-инфицированных трансгенных мышей CAG-hACE2.

Научная новизна и практическая значимость работы

Представленные в диссертационной работе данные в части разработки диагностической платформы иммунологического статуса пациентов, инфицированных SARS-CoV-2, имеют как фундаментальное, так и сугубо практическое значение. На основе разработанных подходов были созданы тест-системы, которые были зарегистрированы как медицинские изделия в Росздравнадзоре (регистрационные номера РЗН 2020/11104; РЗН 2020/11010; РЗН 2020/11531; РЗН 2020/11529; РЗН 2022/16875) и были использованы в практической и трансляционной медицине. Полученный и апробированный в ходе пилотных доклинических испытаний препарат может в дальнейшем быть использован на последующих стадиях клинических испытаний.

Положения, выносимые на защиту

1. Установлено, что наибольшей иммуногенностью обладает N-белок SARS-CoV-2, а комбинация N-белка и RBD позволит повысить чувствительность серологических тестов. Создана ИФА-тест-система для одновременного определения IgM, IgA и IgG к вирусу SARS-CoV-2 с высокой диагностической точностью (№РЗН 2020/11104; РЗН 2020/11010; РЗН 2020/11531; РЗН 2020/11529).

2. Создана и апробирована тест-система для количественного анализа вирус-нейтрализующей активности, сопоставимая по эффективности с традиционными тестами вирус-нейтрализации in vitro (№РЗН 2022/16875). Показано, что среди российских вакцин наибольшим индексом протективности обладает Гам-КОВИД-Вак.

3. На основе разработанных медизделий проведен анализ иммунологического статуса пациентов, переболевших SARS-CoV-2 и вакцинированных вакцинами Гам-КОВИД-Вак и КовиВак.

4. Разработана и охарактеризована новая платформа направленной противовирусной терапии, основанная на слиянии вирус-нейтрализующего пептида LCB1, специфичного к SARS-CoV-2, с рибонуклеазой барназой.

5. Для иммунобиологического препарата LCB1 -ABD-Bn пролонгированного действия на основе барназы, вирус-нейтрализующего пептида, и альбумин связывающего домена (ABD), проведены пилотные доклинические испытания. Исследованы фармакокинетические параметры, токсичность и иммуногенность. Показано, что введение ABD обеспечивает почти 100-кратное увеличение периода полувыведения. В условиях двухдозовой схемы иммунизации антитела, нейтрализующие активность препарата, формировались лишь у 2 из 10 животных. Определена максимально переносимая доза препарата - 10 мг/кг, при которой не наблюдалось гистопатологических изменений в тканях.

6. На трансгенных мышах с встроенным в геном человеческим рецептором ангиотензин-превращающего фермента CAG-hACE2, продемонстрирована эффективность предложенного подхода при различных путях введения препарата. Показано, что наибольшего терапевтического эффекта удалось добиться при однократном внутрибрюшинном введении препарата LCB1-ABD-Bn в дозе 3 мг/кг.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Иммунобиологические подходы к диагностике и лечению COVID-19»

Апробация работы

Результаты диссертационной работы были представлены в виде устных и стендовых докладов и опубликованных тезисов на X Российском симпозиуме "Белки и пептиды" 2021 г., VIII Российском конгрессе лабораторной медицины 2022 г., и на международной конференции FEBS в 2022 г., Лиссабон (Португалия).

По теме работы опубликованы следующие статьи в рецензируемых научных журналах:

1. Bobik, T. V.; Kostin, N. N.; Skryabin, G. A.; Tsabai, P. N.; Simonova, M. A.; Knorre, V. D.; Stratienko, O. N.; Aleshenko, N. L.; Vorobiev, I. I.; Khurs, E. N.; Mokrushina, Y. A.; Smirnov, I. V.; Alekhin, A. I.; Nikitin, A. E.; Gabibov, A. G. COVID-19 in Russia: Clinical and Immunological Features of the First-Wave Patients. Acta Naturae 2021, 13 (1), 102-115.

2. Kostin, N. N.; Bobik, T. V.; Skryabin, G. A.; Simonova, M. A.; Knorre, V. D.; Abrikosova, V. A.; Mokrushina, Y. A.; Smirnov, I. V.; Aleshenko, N. L.; Kruglova, N. A.; Mazurov, D. V.; Nikitin, A. E.; Gabibov, A. G. An ELISA Platform for the Quantitative Analysis of SARS-CoV-2 RBD-Neutralizing Antibodies As an Alternative to Monitoring of the Virus-Neutralizing Activity. Acta Naturae 2022, 14 (3), 109-119.

3. Kostin, N. N.; Bobik, T. V.; Konovalova, E. V.; Kocharovskaya, M. V.; Simonova, M. A.; Rushkevich, N. Y.; Mokrushina, Y. A.; Skryabin, G. A.; Kalinin, R. S.; Kovalchuk, S. I.; Ziganshin, R. H.; Kaluzhskiy, L. A.; Gnedenko, O. V.; Yablokov, E. O.; Ivanov, A. S.; Chernov, A. S.; Kazakov, V. A.; Khokhlova, O. N.; Murashev, A. N.; Hong, S.; Shramova, E. I.; Schulga, A. A.; Lyukmanova, E. N.; Kirpichnikov, M. P.; Smirnov, I. V.; Belogurov, A. A.; Rubtsov, Y. P.; Stepanov, A. V.; Zhang,

H.; Gabibov, A. G.; Deyev, S. M. Fusion of SARS-CoV-2 Neutralizing LCB1 Peptide with Bacillus Amyloliquefaciens RNase Improves Antiviral Efficacy. Sci Rep 2025, 15 (1), 28039.

По результатам работы получены следующие патенты:

I. Костин Н. Н., Бобик Т. В., Цабай П. Н., Скрябин Г. А., Балмасова И. П., Симонова М. А., Мокрушина Ю. А., Смирнов И. В., Алешенко Н. Л., Никитин А. Э., Быков А. Ю., Чехонин В. П., Габибов А. Г., Способ использования рекомбинантных белков SARS-CoV-2 в составе тест-системы для иммуноферментного анализа с определением уровней антител классов IgM, IgG и IgA в сыворотке или плазме крови больных COVID-19 (2020). Пат. РФ № 2730897.

2. Костин Н. Н., Бобик Т. В., Скрябин Г. А., Симонова М. А., Балмасова И. П., Абрикосова В. А., Мокрушина Ю. А., Смирнов И. В., Алешенко Н. Л., Никитин А. Э., Чехонин В. П., Габибов А. Г., Способ определения активности нейтрализующих антител к SARS-CoV-2 в сыворотке или плазме крови людей, перенесших COVID-19, или привитых вакцинами для профилактики новой коронавирусной инфекции COVID-19, с использованием набора реагентов для иммуноферментного анализа, содержащего рекомбинантный рецептор-связывающий домен (RBD) поверхностного гликопротеина S коронавируса SARS-CoV-2 и рекомбинантный человеческий рецептор ACE2 (2021). Пат. РФ № 2784655.

3. Бобик Т. В., Симонова М. А., Рушкевич Н. Ю., Костин Н. Н., Скрябин Г. А., Шульга А. А.,

Коновалова Е. В., Лукьянова Т. И., Зиганшин Р. Х., Прошкина Г. М., Габибов А. Г., Деев С. М.,

Полипептид с анти-SARS-CoV-2 активностью и пролонгированным временем циркуляции в

кровотоке (2024). Пат. РФ № 2822355.

Диссертация выполнена при поддержке Министерства науки и высшего образования РФ (грант № 075-15-2024-536)

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Строение и жизненный цикл бетакоронавирусов

Бетакоронавирусы (представители рода Betacoronavirus) представляют собой подгруппу коронавирусов, обладающих патогенными свойствами по отношению к высшим организмам. В этой связи они являются предметом исследований в области ветеринарных и медицинских науках. Эти вирусы характеризуются средними размерами вирионов, наличием липидной оболочки и одноцепочечной (+)РНК, формирующей геном. [1]. Размер геномов у этих вирусов варьируются в пределах от 27 до 32 тыс. нуклеотидов. Внутри рода Betacoronavirus выделяют несколько филогенетических линий, среди которых наиболее изучены линии В и С, включающие такие патогены, как коронавирус тяжёлого острого респираторного синдрома SARS-CoV, коронавирус ближневосточного респираторного синдрома MERS-CoV, а также новый SARS-CoV-2, ставший причиной пандемии COVID-19 [2,3].

Бетакоронавирусы относятся к семейству Coronaviridae и подразделяются на отдельные филогенетические линии на основании сходства их геномных последовательностей. Линия В включает вирус SARS-CoV, тогда как к линии С относят MERS-CoV и SARS-CoV-2. Генетическое разнообразие внутри этих линий определяет различия в патогенности и спектре восприимчивых хозяев [4,5]. Основными природными резервуарами бетакоронавирусов являются млекопитающие, в частности летучие мыши и верблюды, играющие ключевую роль в зоонозной передаче инфекции человеку [3].

1.1.1. Строение бетакоронавирусов

Бетакоронавирусы представляют собой оболочечные вирусы сферической формы, диаметр которых составляет в среднем около 120 нм. Вирусная оболочка формируется из клеточных мембранных структур клетки хозяина и образована липидным бислоем, окружающим нуклеокапсид, построенный из одноцепочечной РНК вируса и нуклеокапсидного (Ы) белка [6]. Вирион содержит несколько структурных белков, к которым относятся шиповидный гликопротеин белок оболочки (Е), мембранный белок (М) и нуклеокапсидный белок (Ы) (Рисунок 1) [7].

Мембранный белок (М) является ключевым компонентом структуры бетакоронавирусов и состоит из 221 аминокислоты. Он играет основную роль в формировании вириона в клетке хозяина, обеспечивая процессы сборки, происходящие в области между эндоплазматическим ретикулумом (ЭПР) и аппаратом Гольджи [8]. Структура М-белка включает три основных домена: Ы-концевой домен, выступающий за пределы липидного

бислоя; трансмембранные домены; а также два С-концевых домена. Амфипатический участок, расположенный рядом с трансмембранным доменом, взаимодействует с мембраной хозяина и играет важную роль в сборке и выходе новых вирусных частиц [8,9]. Структурные исследования показали, что М-белок может существовать в различных конформациях, в частности в «короткой» и «длинной» формах. «Короткая форма» преобладает в структурах, полученных методом крио-ЭМ в липидных нанодисках, тогда как «длинная форма», обнаруженная в комплексе с Fab-фрагментами антител, указывает на возможный физиологический контекст, в котором М-белок взаимодействует с липидами, S-белками или вирусной РНК [10]. Молекулярно-динамическое моделирование свидетельствует о том, что М-белок способен к масштабным структурным перестройкам, что указывает на наличие определённой гибкости в его жёстком каркасном ядре [10].

Белок оболочки (Е) представляет собой небольшой трансмембранный белок, который может существовать как в мономерной, так и в пентамерной формах. Он играет важную роль в процессах сборки вируса и присутствует примерно в 20 копиях на один вирион. Показано, что мутации в гене Е существенно влияют на заразность вируса: варианты, лишённые этого белка, демонстрируют снижение эффективности репликации в клетках хозяина [8,11].

Нуклеокапсидный белок (К) выполняет множество функций, включая инкапсидацию геномной РНК и регуляцию процессов транскрипции и репликации вируса [12]. В комплексе с вирусной РНК он образует нуклеокапсид, обеспечивающий структурную целостность и функциональную активность вирусной частицы. Помимо этого, К-белок взаимодействует с различными компонентами клетки хозяина, способствуя завершению жизненного цикла вируса и, вероятно, влияя на иммунный ответ организма [9].

Рисунок 1. Два пути проникновения бетакоронавируса SARS-CoV-2 в клетку. Для процесса входа коронавируса обычно необходимы два последовательных расщепления S-белка: на границе субъединиц S1 и S2, а также в участке S2' внутри субъединицы S2. В случае SARS-Со^2 основный мотив на границе S1-S2 расщепляется ещё на стадии созревания вириона в инфицированной клетке, тогда как сайт S2' подвергается расщеплению уже в клетке-мишени после связывания с ангиотензинпревращающим ферментом 2 (АСЕ2). Связывание вируса с АСЕ2 (шаг 1) индуцирует конформационные перестройки в субъединице S1 и экспонирует сайт S2' в составе субъединицы S2. В зависимости от пути проникновения SARS-CoV-2 сайт S2' расщепляется различными протеазами. Слева: если клетка-мишень экспрессирует недостаточное количество трансмембранной сериновой протеазы 2 (ТМРЯ^2) либо комплекс вирус-АСЕ2 не встречается с ТМРЯ^2, то комплекс вирус-АСЕ2 интернализуется через клатрин-зависимый эндоцитоз (шаг 2) в эндолизосомы, где расщепление S2' осуществляется катепсинами, требующими кислой среды для своей активности (шаги 3 и 4). Справа: при наличии ТМРЯ^2 расщепление по сайту S2' происходит на поверхности клетки (шаг 2). В обоих вариантах пути проникновения расщепление S2' приводит к экспонированию фузогенного пептида (РР), а диссоциация субъединицы S1 от S2 вызывает значительные

конформационные перестройки в S2, в особенности в области спирального повтора НЮ, в результате которых фузогенный пептид «выстреливает» в мембрану клетки-мишени и инициирует процесс слияния мембран (шаг 5 слева и шаг 3 справа). Слияние вирусной и клеточной мембран приводит к образованию поры, через которую вирусная РНК поступает в цитоплазму клетки-хозяина для разупаковки и репликации (шаг 6 слева и шаг 4 справа). Адаптировано из [13].

Шиповидный гликопротеин S (S-Spike), или S-белок, является крупнейшим структурным белком бетакоронавирусов и играет ключевую роль в проникновении вируса в клетки хозяина за счёт взаимодействия с рецепторами на их поверхности (Рисунок 1). S-белок формирует тримеры, образующие характерные выступы на поверхности вириона. Эти структуры обеспечивают связывание с рецепторами клетки хозяина и опосредуют слияние вирусной и клеточной мембран [14]. В составе белка присутствуют сайты расщепления, распознаваемые протеазами (TMPRSS2, фурин, катепсин L) хозяина, что повышает его инфекционность и способствует более эффективному внедрению вируса в клетку [8,11,12].

1.1.2. Жизненный цикл бетакоронавирусов

Жизненный цикл бетакоронавирусов, включая SARS-CoV и SARS-CoV-2, включает несколько ключевых этапов, обеспечивающих проникновение вируса в клетку хозяина, репликацию и образование новых вирионов (Рисунок 2).

Рисунок 2. Структура и жизненный цикл бетакоронавируса, на примере вируса SARS-CoV-2. Вирион коронавируса состоит из структурных белков: шиповидного (S), оболочечного (E), мембранного (M), нуклеокапсидного (N), а у некоторых бетакоронавирусов - также гемагглютининэстеразы (на рисунке не показана). Одноцепочечный геном вируса с положительной полярностью (+ssRNA) упакован N-белком; белки M и E обеспечивают включение генома в собирающийся вирион. Тримеры S-белка выступают на поверхности оболочки, обеспечивая специфичность взаимодействия с клеточными рецепторами. Частицы коронавируса связываются с клеточными рецепторами (например, ACE2) и факторами хозяина (например, протеазой TMPRSS2), что способствует проникновению вируса и слиянию его мембраны с мембраной клетки или эндосомы. После входа геномная РНК освобождается и транслируется в полипротеины ORF1a и ORF1b. Полипротеины pp1a и pp1ab процессируются на отдельные неструктурные белки (non-structural proteins (nsps)), формирующие репликационно-транскрипционный комплекс. Одновременно формируются характерные репликационные органеллы: двухмембранные везикулы (double-membrane vesicles (DMVs)), извилистые мембраны (convoluted membranes (CMs)) и сферулы с двойной мембраной (double-

membrane spherules (DMSs)), которые создают защищённую среду для репликации геномной РНК и транскрипции субгеномных мРНК. Синтезированные структурные белки транслоцируются в мембраны эндоплазматического ретикулума (ЭПР) и далее проходят через промежуточный ЭПР-Гольджи компартмент (ER-to-Golgi intermediate compartment (ERGIC)). Взаимодействие этих белков с новыми копиями геномной РНК, инкапсидированными N-белком, приводит к отпочкованию вирионов в просвет секреторных везикул. Завершённые вирионы высвобождаются из клетки путём экзоцитоза. Сокращения: An - З'-поли(А)-последовательность; cap - кэп-структура 5'-конца; L - лидерная последовательность. Адаптировано из [12].

Проникновение вируса в клетку реализуется за счёт взаимодействия шиповидного белка с клеточными рецепторами хозяина, в первую очередь с ангиотензинпревращающим ферментом 2-го типа (ACE2), а также дополнительными белками, такими как TMPRSS2 и NRP1 [15,16]. S-белок состоит из двух функциональных областей: субъединицы S1, содержащей рецептор-связывающий домен (RBD), и субъединицы S2, ответственной за слияние мембран.

Как показано на рисунках 1 и 2, вирус может проникать в клетку двумя путями: (1) посредством прямого слияния вирусной и плазматической мембран, опосредованного активностью мембранных протеаз (например, TMPRSS2), или (2) через эндоцитоз с последующим выходом вируса из эндосомы после протеолитической активации S-белка эндосомальными катепсинами. Оба пути приводят к высвобождению геномной РНК в цитоплазму.

Геномная РНК коронавирусов содержит 5'-кэп и 3'-поли(А)-хвост, что позволяет ей функционировать как мРНК для трансляции репликативных белков. Геном бетакоронавирусов включает 6-15 открытых рамок считывания (ORF), при этом около двух третей его длины занимает репликазный ген, представленный перекрывающимися ORF1a и ORF1b. Эти участки кодируют полипротеины pp1a и pp1ab; для синтеза pp1ab требуется программируемый рибосомальный сдвиг рамки считывания. Полипротеины подвергаются процессингу вирусными протеазами с образованием 15-16 зрелых неструктурных белков (nsp1-nsp16), которые формируют репликационно-транскрипционный комплекс (RTC) [11]. Он осуществляет репликацию геномной РНК и синтез субгеномных мРНК, кодирующих S, M, E и N-белки. Одновременно образуются характерные репликационные органеллы: двухмембранные везикулы (double-membrane vesicles, DMVs), извилистые мембраны (convoluted membranes, CMs) и сферулы с двойной мембраной (double-membrane spherules, DMSs). Эти структуры создают защищённую микросреду для репликации и транскрипции вирусного генома [8,11].

На стадии сборки синтезированные структурные белки транслоцируются в мембраны эндоплазматического ретикулума (ЭПР) и далее транспортируются в промежуточный ЭПР-Гольджи компартмент (ER-to-Golgi intermediate compartment, ERGIC). Здесь они взаимодействуют с геномной РНК, инкапсидированной N-белком, что приводит к отпочкованию вирионов в просвет секреторных везикул. Завершённые вирусные частицы перемещаются к плазматической мембране и высвобождаются во внеклеточное пространство путём экзоцитоза, распространяя инфекцию на новые клетки [8,11].

1.2. Современные методы серологических исследований вирусных

заболеваний

Серологические методы, наряду с ПЦР-тестированием, остаются одним из основных инструментов диагностики и эпидемиологического анализа вирусных инфекций. Они имеют ряд неоспоримых преимуществ, так как наряду с определением антител к белкам вируса, спектр идентифицированных антител позволяет оценить сроки перенесённой инфекции, включая случаи с лёгким или бессимптомным течением, а также оценить уровень гуморального иммунитета как в популяции в целом, так и в отдельных группах риска [17,18].

В свою очередь, антитела играют центральную роль в защите от вирусных инфекций, обеспечивая активацию комплемента, опсонизацию и антитело-зависимые эффекторные функции, включая антитело-зависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (АОСС), антитело-зависимый клеточно-опосредованный фагоцитоз (АОСР)), а также нейтрализацию вируса - блокирование его проникновения в клетку. Среди различных механизмов именно нейтрализующие антитела рассматриваются как наиболее надёжный показатель протективного иммунитета. Вместе с тем для полноценного понимания динамики и структуры гуморального ответа необходимо учитывать не только наличие антител различных классов (^М, ^А, IgG), но и их функциональные свойства.

1.2.1. Определение спектра иммуноглобулинов при инфицировании SARS-CoV-2

Иммунный гуморальный ответ при вирусных и, в частности, бетакоронавирусных инфекциях представлен несколькими основными классами антител, каждый из которых играет специфическую роль (Рисунок 3):

-^М - первые антитела, формирующиеся в остром периоде. Они появляются в сыворотке на 7-10-й день после заражения, обладают низким сродством, но высокой авидностью благодаря пентамерной структуре. ^М используются как маркеры недавней инфекции и отражают раннюю фазу иммунного ответа [19].

-^А - основной класс антител слизистых оболочек. Секреторный ^А существует преимущественно в виде димеров, блокирует прикрепление вируса к клеткам эпителия дыхательных путей и ЖКТ, обеспечивая первую линию защиты организма [20].

-IgG - доминирующий класс антител, ответственный за долговременную защиту. IgG выявляются через 2-3 недели после инфицирования, обладают высокой аффинностью и запускают Fc-опосредованные эффекторные механизмы (АВСС, АВСР, активацию комплемента). Подклассы IgG выполняют различные функции: IgG1 и IgG3 наиболее эффективны против белковых антигенов [21].

Динамика иммунного ответа обычно следует последовательности: ^М ^ ^А ^ IgG, хотя при разных заболеваниях и у разных пациентов возможны вариации [22,23].

Рисунок 3. (А) Иллюстрация активации основных классов иммуноглобулинов (1§М, ^А, IgG1-4) при инфицировании человека вирусом SARS-CoV-2, их структура, функции и регуляция переключения изотипов цитокинами. (Б) Кинетика появления вирусной РНК и антител разных классов: 1§М возникает в ранней фазе инфекции и быстро снижается; IgA обеспечивает защиту слизистых и достигает пика вскоре после 1§М; IgG появляется позднее, сохраняется дольше и определяет долговременный иммунитет. Адаптировано из [24].

Главными мишенями антител при SARS-CoV-2 являются S-белок и нуклеокапсидный №белок. S-белок, и в частности RBD, является главной мишенью для нейтрализующих антител и присутствует в большинстве вакцин. №белок окутывает геномную РНК и обильно экспрессируется в клетках при инфекции. Антитела к нему полезны как диагностические маркеры, однако они не обладают нейтрализующей активностью [25,26]. Таким образом, антитела против^-белка позволяют оценить уровень защитного иммунитета, а антитела

против N-белка - отличить естественную инфекцию от вакцинации [27]. Для их выявления применяются классические серологические методы:

Иммуноферментный анализ (ELISA). Применяются прямой, непрямой, сэндвич- и конкурентный форматы. Метод позволяет количественно определять уровни антител, отличается высокой воспроизводимостью и используется для эпидемиологических исследований COVID-19. Время анализа составляет 2-8 часов, а в усовершенствованных протоколах 1-4 часа [28].

Хемилюминесцентный иммуноанализ (CLIA). В основе метода лежит реакция пероксидазы хрена с люминесцентным субстратом, пропорциональная концентрации антител. CLIA отличается высокой чувствительностью, низким уровнем фонового сигнала и высокой возможностью автоматизации. Время выполнения теста составляет 30-120 минут (в некоторых наборах - 10-35 минут). Метод активно применялся для оценки иммунного ответа на вакцинацию и эффективность бустеров [29].

Иммунохроматографический анализ (LFIA, экспресс-тесты). Основан на капиллярном движении жидкости и связывании антител с антигенами, меченными наночастицами (золото, латекс, флуорофоры). Результат доступен через 10-20 минут, что делает метод удобным для диагностики вне лечебных учреждений. Есть возможность полуколичественного приборного считывания результатов. Ограничения включают низкую чувствительность и высокую вероятность ложноположительных и ложноотрицательных результатов [30]

Иммунофлюоресцентный анализ (IFA). Метод визуализирует комплексы антиген-антитело с помощью конъюгатов антител с флуоресцентными красителями методом флуоресцентной микроскопии или путём определения интенсивности флуоресценции [31].

В совокупности классические методы позволяют выявлять общие антитела (IgM, IgA, IgG), формируя основу для оценки серопревалентности в популяции, мониторинга иммунного ответа и дифференциации естественной инфекции и вакцинации. Однако для функциональной оценки защитного потенциала гуморального иммунитета требуется определение нейтрализующих антител.

1.2.2. Определение нейтрализующих антител

Нейтрализующие антитела (нАт, nAb) представляют собой особый класс иммуноглобулинов, способных блокировать критические этапы жизненного цикла вируса. Для SARS-CoV-2 они в первую очередь препятствуют связыванию S-белка с рецептором ACE2 и кофакторами, а также ингибируют конформационные перестройки, необходимые для слияния

вирусной и клеточной мембран (Рисунок 4) [32,33]. В отличие от общих антител, нейтрализующие антитела отражают не просто факт перенесённой инфекции, но и реальный протективный потенциал иммунного ответа.

Рисунок 4. Иллюстрация механизмов действия нейтрализующих антител (пЛЬ) против SARS-Со^2. Нейтрализующие антитела реализуют свою активность через несколько путей. (1) Связывание с рецептор-связывающим доменом (RBD) S-белка предотвращает взаимодействие с рецептором АСЕ2 на поверхности клетки хозяина и тем самым блокирует проникновение вируса. (2) Нейтрализующие антитела могут распознавать эпитопы вне RBD, в этом случае контакт S-белка с АСЕ2 не предотвращается, однако ингибируется взаимодействие с протеазой TMPRSS2 и протеолитическое расщепление S-белка, необходимое для слияния мембран. (3) Альтернативный механизм связан с блокированием процесса мембранного слияния, что также препятствует проникновению вируса в клетку. Адаптировано из [34].

Именно поэтому определение титров нейтрализующих антител имеет решающее значение для:

• оценки постинфекционного и поствакцинального иммунитета,

• сопоставления эффективности различных вакцинных платформ,

• мониторинга снижения нейтрализующей активности в отношении новых вариантов SARS-CoV-2.

PRNT (Plaque Reduction Neutralization Test, метод образования бляшек) считается «золотым стандартом» оценки нейтрализующих антител. Метод основан на измерении способности сыворотки снижать количество инфекционных единиц живого вируса, формирующих бляшки на монослое клеток (Рисунок 5). Сыворотку исследуемого пациента последовательно разводят, инкубируют с заданной дозой SARS-CoV-2 и заражают клетки (чаще всего Vero

E6/ACE2+TMPRSS2+). После инкубации и окрашивания подсчитывают количество бляшек в контрольных и опытных образцах [35].

PRNT (Plaque Reduction Neutralization Test, тест на редукцию бляшек) традиционно считается «золотым стандартом» для количественной оценки нейтрализующих антител. Суть метода заключается в прямом измерении способности антител в сыворотке пациента подавлять репликацию живого вируса, что проявляется уменьшением числа бляшек, формирующихся при заражении клеточного монослоя (Рисунок 5). В классическом протоколе исследуемую сыворотку подвергают серийным разведением, после чего каждую пробу инкубируют с определённой дозой SARS-CoV-2. Полученные смеси вносят на клетки-мишени (наиболее часто применяются линии Vero E6, экспрессирующие ACE2 и TMPRSS2), и после периода инкубации фиксируют и окрашивают клетки. Подсчёт числа бляшек в контрольных и опытных образцах позволяет судить о степени вирус-нейтрализации [34].

Рисунок 5. Принцип теста на нейтрализацию с подсчётом бляшек (PRNT). Образцы сывороток последовательно разводят и инкубируют с живым вирусом SARS-CoV-2 необходимого изолята для оценки способности антител блокировать инфекцию. Для выявления функциональных вирусных частиц в систему добавляют клетки Vero E6, которые подвергаются заражению. После инкубации в течение >48 ч клетки фиксируют, окрашивают и подсчитывают количество образовавшихся бляшек на монослое. Анализ может выполняться в 24-луночных или аналогичных планшетах в зависимости от требуемой пропускной способности. Подсчёт числа бляшек проводится вручную или с использованием автоматизированных систем.

Ключевыми преимуществами метода являются его высокая специфичность, клиническая значимость и способность моделировать полный инфекционный цикл вируса (включая прикрепление, проникновение, репликацию и выход вирионов). В то же время у PRNT существуют и существенные ограничения: необходимость работы с живым SARS-CoV-

2 в лаборатории уровня BSL-3, трудоёмкость и продолжительность анализа (результат обычно получают через 48-72 часа), низкая пропускная способность, а также выраженная межлабораторная вариабельность, связанная с различиями в используемых штаммах вируса, клеточных линиях и условиях инкубации [36].

FRNT (Foci Reduction Neutralization Test, метод образования очагов) является модификацией классического метода PRNT. В основе лежит тот же принцип оценки способности сыворотки подавлять размножение вируса, однако вместо подсчёта бляшек используют иммуноокрашивание инфицированных клеток с последующей визуализацией и подсчётом очагов инфекции. Для окраски, как правило, применяют антитела против нуклеокапсидного белка SARS-CoV-2, что позволяет идентифицировать даже небольшие кластеры инфицированных клеток. Такой подход существенно облегчает автоматизацию анализа и повышает его пропускную способность, делая метод более удобным для серийных исследований и сравнительных тестов [37,38]. Несмотря на это, FRNT по-прежнему требует работы с инфекционным вирусом и выполнения экспериментов в условиях лаборатории уровня BSL-3, что ограничивает его широкое использование [39].

pVNT (pseudoVirus Neutralization Test, тест нейтрализации с использованием псевдовируса) был разработан как более безопасная и доступная альтернатива PRNT и FRNT. В этом методе применяются искусственно собранные, не способные к размножению вирусные частицы (чаще всего на основе лентивирусов или вируса везикулярного стоматита, VSV), на поверхности которых экспрессируется S-белок SARS-CoV-2 соответствующего варианта. В геном псевдовируса встраивается репортёрный ген (например, люциферазы или флуоресцентного белка), что позволяет количественно регистрировать эффективность заражения клеток. После инкубации сыворотки с псевдовирусом и инфицирования клеточной линии (обычно HEK293T/ACE2 или аналоги) измеряют уровень экспрессии репортёра: снижение сигнала по сравнению с контролем отражает степень нейтрализации (Рисунок 6). Преимущества pVNT включают высокую воспроизводимость, относительную простоту стандартизации, возможность масштабирования и работы в лабораториях уровня BSL-2, что делает его особенно востребованным при скрининге больших массивов образцов.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Костин Никита Николаевич, 2026 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Brant A.C. и др. SARS-CoV-2: from its discovery to genome structure, transcription, and replication // Cell Biosci. 2021. Т. 11, № 1. С. 136.

2. Deng Y., Angelova A. Coronavirus-Induced Host Cubic Membranes and Lipid-Related Antiviral Therapies: A Focus on Bioactive Plasmalogens // Front. Cell Dev. Biol. 2021. Т. 9. С. 630242.

3. Wang M.-Y. и др. SARS-CoV-2: Structure, Biology, and Structure-Based Therapeutics Development // Front. Cell. Infect. Microbiol. 2020. Т. 10. С. 587269.

4. Trougakos I.P. и др. Insights to SARS-CoV-2 life cycle, pathophysiology, and rationalized treatments that target COVID-19 clinical complications // J Biomed Sci. 2021. Т. 28, № 1. С. 9.

5. Li X. и др. Genomic Feature Analysis of Betacoronavirus Provides Insights Into SARS and COVID-19 Pandemics // Front. Microbiol. 2021. Т. 12. С. 614494.

6. Saville J.W. и др. Three-Dimensional Visualization of Viral Structure, Entry, and Replication Underlying the Spread of SARS-CoV-2 // Chem. Rev. 2022. Т. 122, № 17. С. 14066-14084.

7. Pizzato M. и др. SARS-CoV-2 and the Host Cell: A Tale of Interactions // Front.Virol. 2022. Т. 1. С.815388.

8. Kakavandi S. и др. Structural and non-structural proteins in SARS-CoV-2: potential aspects to COVID-19 treatment or prevention of progression of related diseases // Cell Commun Signal. 2023. Т. 21, № 1. С. 110.

9. Khalaf K. и др. SARS-CoV-2: Pathogenesis, and Advancements in Diagnostics and Treatment // Front. Immunol. 2020. Т. 11. С. 570927.

10. Dolan K.A. и др. Structure of SARS-CoV-2 M protein in lipid nanodiscs // eLife. 2022. Т. 11. С.e81702.

11. Maison D.P., Deng Y., Gerschenson M. SARS-CoV-2 and the host-immune response // Front. Immunol. 2023. Т. 14. С. 1195871.

12. V'kovski P. и др. Coronavirus biology and replication: implications for SARS-CoV-2 // Nat Rev Microbiol. 2021. Т. 19, № 3. С. 155-170.

13. Jackson C.B. и др. Mechanisms of SARS-CoV-2 entry into cells // Nat Rev Mol Cell Biol. 2022. Т. 23, № 1. С. 3-20.

14. Wu W. и др. The SARS-CoV-2 nucleocapsid protein: its role in the viral life cycle, structure and functions, and use as a potential target in the development of vaccines and diagnostics // Virol J. 2023. Т. 20, № 1. С. 6.

15. Zeng C. и др. SARS-CoV-2 spreads through cell-to-cell transmission // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2022. Т. 119, № 1. С. e2111400119.

16. Cantuti-Castelvetri L. и др. Neuropilin-1 facilitates SARS-CoV-2 cell entry and infectivity // Science. 2020. Т. 370, № 6518. С. 856-860.

17. Gaebler C., Nussenzweig M.C. All eyes on a hurdle race for a SARS-CoV-2 vaccine // Nature. 2020. Т. 586, № 7830. С. 501-502.

18. Ohst C. и др. Reliable Serological Testing for the Diagnosis of Emerging Infectious Diseases // Dengue and Zika: Control and Antiviral Treatment Strategies / под ред. Hilgenfeld R., Vasudevan S.G. Singapore: Springer Singapore, 2018. Т. 1062. С. 19-43.

19. Schroeder H.W., Cavacini L. Structure and function of immunoglobulins // Journal of Allergy and Clinical Immunology. 2010. Т. 125, № 2. С. S41-S52.

20. Breedveld A., Van Egmond M. IgA and FcaRI: Pathological Roles and Therapeutic Opportunities // Front. Immunol. 2019. Т. 10. С. 553.

21. Vidarsson G., Dekkers G., Rispens T. IgG Subclasses and Allotypes: From Structure to Effector Functions // Front. Immunol. 2014. Т. 5.

22. Mo H. и др. Evaluation by indirect immunofluorescent assay and enzyme linked immunosorbent assay of the dynamic changes of serum antibody responses against severe acute respiratory syndrome coronavirus // Chin Med J (Engl). 2005. Т. 118, № 6. С. 446-450.

23. Al-Abdely H.M. u gp. Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus Infection Dynamics and Antibody Responses among Clinically Diverse Patients, Saudi Arabia // Emerg. Infect. Dis.

2019. T. 25, № 4. C. 753-766.

24. Galipeau Y. u gp. Humoral Responses and Serological Assays in SARS-CoV-2 Infections // Front. Immunol. 2020. T. 11. C. 610688.

25. Liu S. u gp. Immunological characterizations of the nucleocapsid protein based SARS vaccine candidates // Vaccine. 2006. T. 24, № 16. C. 3100-3108.

26. Ahmed S.F., Quadeer A.A., McKay M.R. Preliminary Identification of Potential Vaccine Targets for the COVID-19 Coronavirus (SARS-CoV-2) Based on SARS-CoV Immunological Studies // Viruses. 2020. T. 12, № 3. C. 254.

27. Huang A.T. u gp. A systematic review of antibody mediated immunity to coronaviruses: kinetics, correlates of protection, and association with severity // Nat Commun. 2020. T. 11, № 1. C. 4704.

28. Weissleder R. u gp. COVID-19 diagnostics in context // Sci. Transl. Med. 2020. T. 12, № 546. C.eabc1931.

29. Bryant J.E. u gp. Serology for SARS-CoV-2: Apprehensions, opportunities, and the path forward // Sci. Immunol. 2020. T. 5, № 47. C. eabc6347.

30. Bissonnette L., Bergeron M.G. Diagnosing infections—current and anticipated technologies for point-of-care diagnostics and home-based testing // Clinical Microbiology and Infection. 2010. T. 16, № 8. C. 1044-1053.

31. Dowlatshahi S., Shabani E., Abdekhodaie M.J. Serological assays and host antibody detection in coronavirus-related disease diagnosis // Arch Virol. 2021. T. 166, № 3. C. 715-731.

32. Yi C. u gp. Key residues of the receptor binding motif in the spike protein of SARS-CoV-2 that interact with ACE2 and neutralizing antibodies // Cell Mol Immunol. 2020. T. 17, № 6. C. 621-630.

33. Liu L. u gp. Potent neutralizing antibodies against multiple epitopes on SARS-CoV-2 spike // Nature. 2020. T. 584, № 7821. C. 450-456.

34. Rocha V.P.C. u gp. An Overview of the Conventional and Novel Methods Employed for SARS-CoV-2 Neutralizing Antibody Measurement // Viruses. 2023. T. 15, № 7. C. 1504.

35. Mendoza E.J. u gp. Two Detailed Plaque Assay Protocols for the Quantification of Infectious SARS-CoV-2 // CP Microbiology. 2020. T. 57, № 1. C. cpmc105.

36. Valcourt E.J. u gp. Evaluating Humoral Immunity against SARS-CoV-2: Validation of a Plaque-Reduction Neutralization Test and a Multilaboratory Comparison of Conventional and Surrogate Neutralization Assays // Microbiol Spectr / nog peg. Perez D.R. 2021. T. 9, № 3. C. e00886-21.

37. Fournier C. u gp. A focus reduction neutralization assay for hepatitis C virus neutralizing antibodies // Virol J. 2007. T. 4, № 1. C. 35.

38. Vanderheiden A. u gp. Development of a Rapid Focus Reduction Neutralization Test Assay for Measuring SARS-CoV-2 Neutralizing Antibodies // CP in Immunology. 2020. T. 131, № 1. C. e116.

39. Whiteman M.C. u gp. Virus Reduction Neutralization Test: A Single-Cell Imaging High-Throughput Virus Neutralization Assay for Dengue // The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 2018. T. 99, № 6. C. 1430-1439.

40. Case J.B. u gp. Neutralizing Antibody and Soluble ACE2 Inhibition of a Replication-Competent VSV-SARS-CoV-2 and a Clinical Isolate of SARS-CoV-2 // Cell Host & Microbe.

2020. T. 28, № 3. C. 475-485.e5.

41. H. D. Crawford K. u gp. Pseudotyping lentiviral particles with SARS-CoV-2 Spike protein for neutralization assays v2. 2021.

42. Zou J. u gp. A Single-Round Infection Fluorescent SARS-CoV-2 Neutralization Test for COVID-19 Serological Testing at a Biosafety Level-2 Laboratory // Viruses. 2022. T. 14, № 6. C. 1211.

43. Huang D. h gp. A Rapid Assay for SARS-CoV-2 Neutralizing Antibodies That Is Insensitive to Antiretroviral Drugs // The Journal of Immunology. 2021. T. 207, № 1. C. 344-351.

44. Abe K.T. h gp. A simple protein-based surrogate neutralization assay for SARS-CoV-2 // JCI Insight. 2020. T. 5, № 19. C. e142362.

45. Tan C.W. h gp. A SARS-CoV-2 surrogate virus neutralization test based on antibody-mediated blockage of ACE2-spike protein-protein interaction // Nat Biotechnol. 2020. T. 38, № 9. C. 10731078.

46. Corti D. h gp. Tackling COVID-19 with neutralizing monoclonal antibodies // Cell. 2021. T. 184, № 17. C. 4593-4595.

47. Castro Dopico X. h gp. Immunity to SARS-CoV-2 induced by infection or vaccination // J Intern Med. 2022. T. 291, № 1. C. 32-50.

48. Quagliata M., Papini A.M., Rovero P. Chemically modified antiviral peptides against SARS-CoV-2 // J Pept Sci. 2023. C. e3541.

49. Aboul-Fotouh S. h gp. What are the current anti-COVID-19 drugs? From traditional to smart molecular mechanisms // Virol J. 2023. T. 20, № 1. C. 241.

50. Chaudhary N., Weissman D., Whitehead K.A. mRNA vaccines for infectious diseases: principles, delivery and clinical translation // Nat Rev Drug Discov. 2021. T. 20, № 11. C. 817838.

51. Dolgin E. Pan-coronavirus vaccine pipeline takes form // Nat Rev Drug Discov. 2022. T. 21, № 5. C. 324-326.

52. Li G. h gp. Therapeutic strategies for COVID-19: progress and lessons learned // Nat Rev Drug Discov. 2023. T. 22, № 6. C. 449-475.

53. Chen Y. h gp. Broadly neutralizing antibodies to SARS-CoV-2 and other human coronaviruses // Nat Rev Immunol. 2023. T. 23, № 3. C. 189-199.

54. Guo Y. h gp. A SARS-CoV-2 neutralizing antibody with extensive Spike binding coverage and modified for optimal therapeutic outcomes // Nat Commun. 2021. T. 12, № 1. C. 2623.

55. Shilova O.N., Shilov E.S., Deyev S.M. Design of targeted antiviral polypeptides specific to SARS-CoV-2. Challenges and prospects // Russ Chem Rev. 2024. T. 93, № 6. C. RCR5128.

56. Karoyan P. h gp. Human ACE2 peptide-mimics block SARS-CoV-2 pulmonary cells infection // Commun Biol. 2021. T. 4, № 1. C. 197.

57. Li T. h gp. A novel linear and broadly neutralizing peptide in the SARS-CoV-2 S2 protein for universal vaccine development // Cell Mol Immunol. 2021. T. 18, № 11. C. 2563-2565.

58. Senefeld J.W. h gp. COVID-19 Convalescent Plasma for the Treatment of Immunocompromised Patients: A Systematic Review and Meta-analysis // JAMA Netw Open. 2023. T. 6, № 1. C. e2250647.

59. Cohen J. Update: Here's what is known about Trump's COVID-19 treatment // Science. 2020.

60. Rothenberger S. h gp. The trispecific DARPin ensovibep inhibits diverse SARS-CoV-2 variants // Nat Biotechnol. 2022. T. 40, № 12. C. 1845-1854.

61. Zakharova M.Y. h gp. Pre-Steady-State Kinetics of the SARS-CoV-2 Main Protease as a Powerful Tool for Antiviral Drug Discovery // Front Pharmacol. 2021. T. 12. C. 773198.

62. Lei S. h gp. Small molecules in the treatment of COVID-19 // Sig Transduct Target Ther. 2022. T. 7, № 1. C. 387.

63. Weisblum Y. h gp. Escape from neutralizing antibodies by SARS-CoV-2 spike protein variants // eLife. 2020. T. 9. C. e61312.

64. Walls A.C. h gp. Structure, Function, and Antigenicity of the SARS-CoV-2 Spike Glycoprotein // Cell. 2020. T. 181, № 2. C. 281-292.e6.

65. Hoffmann M. h gp. SARS-CoV-2 Cell Entry Depends on ACE2 and TMPRSS2 and Is Blocked by a Clinically Proven Protease Inhibitor // Cell. 2020. T. 181, № 2. C. 271-280.e8.

66. Cai Y. h gp. Distinct conformational states of SARS-CoV-2 spike protein // Science. 2020. T. 369, № 6511. C. 1586-1592.

67. Henderson R. h gp. Controlling the SARS-CoV-2 spike glycoprotein conformation // Nat Struct Mol Biol. 2020. T. 27, № 10. C. 925-933.

68. Piccoli L. и др. Mapping Neutralizing and Immunodominant Sites on the SARS-CoV-2 Spike Receptor-Binding Domain by Structure-Guided High-Resolution Serology // Cell. 2020. Т. 183, № 4. С. 1024-1042.e21.

69. Barnes C.O. и др. SARS-CoV-2 neutralizing antibody structures inform therapeutic strategies // Nature. 2020. Т. 588, № 7839. С. 682-687.

70. Chen P. и др. SARS-CoV-2 Neutralizing Antibody LY-CoV555 in Outpatients with Covid-19 // N Engl J Med. 2021. Т. 384, № 3. С. 229-237.

71. Ai J. и др. Antibody evasion of SARS-CoV-2 Omicron BA.1, BA.1.1, BA.2, and BA.3 sub-lineages // Cell Host Microbe. 2022. Т. 30, № 8. С. 1077-1083.e4.

72. Wang P. и др. Antibody resistance of SARS-CoV-2 variants B.1.351 and B.1.1.7 // Nature. 2021. Т. 593, № 7857. С. 130-135.

73. Chen Y. и др. Broadly neutralizing antibodies to SARS-CoV-2 and other human coronaviruses // Nat Rev Immunol. 2023. Т. 23, № 3. С. 189-199.

74. Hansen J. и др. Studies in humanized mice and convalescent humans yield a SARS-CoV-2 antibody cocktail // Science. American Association for the Advancement of Science, 2020.

75. Copin R. и др. The monoclonal antibody combination REGEN-COV protects against SARS-CoV-2 mutational escape in preclinical and human studies // Cell. 2021. Т. 184, № 15. С. 3949-3961.e11.

76. Coronavirus (COVID-19) Update: FDA Authorizes Monoclonal Antibodies for Treatment of COVID-19 | FDA [Электронный ресурс]. URL: https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/coronavirus-covid-19-update-fda-authorizes-monoclonal-antibodies-treatment-covid-19 (дата обращения: 01.10.2025).

77. Weinreich D.M. и др. REGEN-COV Antibody Combination and Outcomes in Outpatients with Covid-19 // N Engl J Med. 2021. Т. 385, № 23.

78. O'Brien M P. и др. Subcutaneous REGEN-COV Antibody Combination to Prevent Covid-19 // N Engl J Med. 2021. Т. 385, № 13. С. 1184-1195.

79. Westendorf K. и др. LY-CoV1404 (bebtelovimab) potently neutralizes SARS-CoV-2 variants // Cell Reports. 2022. Т. 39, № 7. С. 110812.

80. Pinto D. и др. Cross-neutralization of SARS-CoV-2 by a human monoclonal SARS-CoV antibody // Nature. 2020. Т. 583, № 7815. С. 290-295.

81. Starr T.N. и др. SARS-CoV-2 RBD antibodies that maximize breadth and resistance to escape // Nature. 2021. Т. 597, № 7874. С. 97-102.

82. Research C. for D.E. and. FDA updates Sotrovimab emergency use authorization // FDA. FDA, 2024.

83. Luo S. и др. An antibody from single human Vh -rearranging mouse neutralizes all SARS-CoV-2 variants through BA.5 by inhibiting membrane fusion // Sci. Immunol. 2022. Т. 7, № 76. С. eadd5446.

84. ter Meulen J. и др. Human monoclonal antibody combination against SARS coronavirus: synergy and coverage of escape mutants // PLoS Med. 2006. Т. 3, № 7. С. e237.

85. Yuan M. и др. A highly conserved cryptic epitope in the receptor binding domains of SARS-CoV-2 and SARS-CoV // Science. 2020. Т. 368, № 6491. С. 630-633.

86. Yuan M. и др. Structural and functional analysis of VYD222: a broadly neutralizing antibody against SARS-CoV-2 variants. bioRxiv, 2025. С. 2025.08.28.672883.

87. Wolfe C.R. и др. Safety and Efficacy of Pemivibart, a Long-Acting Monoclonal Antibody, for Prevention of Symptomatic Coronavirus Disease 2019: Interim Results From a Phase 3 Randomized Clinical Trial (CANOPY) // Clinical Infectious Diseases. 2025. С. ciaf265.

88. Cerutti G. и др. Potent SARS-CoV-2 neutralizing antibodies directed against spike N-terminal domain target a single supersite // Cell Host & Microbe. 2021. Т. 29, № 5. С. 819-833.e7.

89. Huang Y. и др. Identification of a conserved neutralizing epitope present on spike proteins from all highly pathogenic coronaviruses. Biochemistry, 2021.

90. Silva R.P. и др. Identification of a conserved S2 epitope present on spike proteins from all highly pathogenic coronaviruses // eLife. 2023. Т. 12. С. e83710.

91. Jennewein M.F. h gp. Isolation and characterization of cross-neutralizing coronavirus antibodies from COVID-19+ subjects // Cell Rep. 2021. T. 36, № 2. C. 109353.

92. Li D. h gp. In vitro and in vivo functions of SARS-CoV-2 infection-enhancing and neutralizing antibodies // Cell. 2021. T. 184, № 16. C. 4203-4219.e32.

93. Wang L. h gp. Fusogenicity of SARS-CoV-2 BA.2.86 subvariant and its sensitivity to the prokaryotic recombinant EK1 peptide // Cell Discov. 2024. T. 10, № 1. C. 6.

94. Xia S. h gp. A pan-coronavirus fusion inhibitor targeting the HR1 domain of human coronavirus spike // Sci. Adv. 2019. T. 5, № 4. C. eaav4580.

95. Xia S. h gp. Fusion mechanism of 2019-nCoV and fusion inhibitors targeting HR1 domain in spike protein // Cell Mol Immunol. 2020. T. 17, № 7. C. 765-767.

96. Tang M. h gp. Peptide-based inhibitors hold great promise as the broad-spectrum agents against coronavirus // Front. Microbiol. 2023. T. 13. C. 1093646.

97. Xia S. h gp. Inhibition of SARS-CoV-2 (previously 2019-nCoV) infection by a highly potent pan-coronavirus fusion inhibitor targeting its spike protein that harbors a high capacity to mediate membrane fusion // Cell Res. 2020. T. 30, № 4. C. 343-355.

98. Xia S. h gp. Peptide-based pan-CoV fusion inhibitors maintain high potency against SARS-CoV-2 Omicron variant // Cell Res. 2022. T. 32, № 4. C. 404-406.

99. Xia S. h gp. SARS-CoV-2 Omicron subvariants exhibit distinct fusogenicity, but similar sensitivity, to pan-CoV fusion inhibitors // Emerging Microbes & Infections. 2023. T. 12, № 1. C. 2178241.

100. ACTIV-3/TICO Study Group h gp. Efficacy and Safety of Ensovibep for Adults Hospitalized With COVID-19 : A Randomized Controlled Trial // Ann Intern Med. 2022. T. 175, № 9. C. 12661274.

101. Kingsley J. h gp. The Designed Ankyrin Repeat Protein Antiviral Ensovibep for Nonhospitalized Patients With Coronavirus Disease 2019: Results From EMPATHY, a Randomized, Placebo-Controlled Phase 2 Study // Open Forum Infect Dis. 2024. T. 11, № 6. C. ofae233.

102. Abrishamian L. h gp. 1130. Ensovibep antiviral activity in ambulatory patients with COVID-19 is independent of baseline anti-SARS-CoV-2 antibodies and exhibits minimal selective pressure - Results from the placebo-controlled EMPATHY trial // Open Forum Infect Dis. 2022. T. 9, № Supplement_2. C. ofac492.969.

103. Cao L. h gp. De novo design of picomolar SARS-CoV-2 miniprotein inhibitors // Science. 2020. T. 370, № 6515. C. 426-431.

104. Wu T. h gp. Resistance profile and mechanism of severe acute respiratory syndrome coronavirus-2 variants to LCB1 inhibitor targeting the spike receptor-binding motif // Front. Microbiol. 2022. T. 13. C. 1022006.

105. Zhu Y. h gp. Development of highly effective LCB1-based lipopeptides targeting the spike receptor-binding motif of SARS-CoV-2 // Antiviral Research. 2023. T. 211. C. 105541.

106. Jin H. h gp. Susceptibility and Resistance of SARS-CoV-2 Variants to LCB1 and Its Multivalent Derivatives // Viruses. 2023. T. 16, № 1. C. 36.

107. Case J.B. h gp. Ultrapotent miniproteins targeting the SARS-CoV-2 receptor-binding domain protect against infection and disease // Cell Host & Microbe. 2021. T. 29, № 7. C. 1151-1161.e5.

108. Hsieh C.-L. h gp. Structure-based design of prefusion-stabilized SARS-CoV-2 spikes // Science. 2020. T. 369, № 6510. C. 1501-1505.

109. Qiu M. h gp. Antibody responses to individual proteins of SARS coronavirus and their neutralization activities // Microbes Infect. 2005. T. 7, № 5-6. C. 882-889.

110. Grzelak L. h gp. A comparison of four serological assays for detecting anti-SARS-CoV-2 antibodies in human serum samples from different populations // Sci Transl Med. 2020. T. 12, № 559. C. eabc3103.

111. Ma H. h gp. Serum IgA, IgM, and IgG responses in COVID-19 // Cell Mol Immunol. 2020. T. 17, № 7. C. 773-775.

112. Lou B. и др. Serology characteristics of SARS-CoV-2 infection after exposure and postsymptom onset // Eur Respir J. 2020. Т. 56, № 2. С. 2000763.

113. Ren L. и др. The kinetics of humoral response and its relationship with the disease severity in COVID-19 // Commun Biol. 2020. Т. 3, № 1. С. 780.

114. Garcia-Basteiro A.L. и др. Seroprevalence of antibodies against SARS-CoV-2 among health care workers in a large Spanish reference hospital // Nat Commun. 2020. Т. 11, № 1. С. 3500.

115. Madariaga M.L.L. и др. Clinical predictors of donor antibody titre and correlation with recipient antibody response in a COVID-19 convalescent plasma clinical trial // J Intern Med. 2021. Т. 289, № 4. С. 559-573.

116. Chen J. и др. The clinical and immunological features of pediatric COVID-19 patients in China // Genes Dis. 2020. Т. 7, № 4. С. 535-541.

117. Cervia C. и др. Systemic and mucosal antibody responses specific to SARS-CoV-2 during mild versus severe COVID-19 // J Allergy Clin Immunol. 2021. Т. 147, № 2. С. 545-557.e9.

118. Burbelo P.D. и др. Sensitivity in Detection of Antibodies to Nucleocapsid and Spike Proteins of Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 in Patients With Coronavirus Disease 2019 // J Infect Dis. 2020. Т. 222, № 2. С. 206-213.

119. Poh C.M. и др. Two linear epitopes on the SARS-CoV-2 spike protein that elicit neutralising antibodies in COVID-19 patients // Nat Commun. 2020. Т. 11, № 1. С. 2806.

120. Lynch K.L. и др. Magnitude and Kinetics of Anti-Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 Antibody Responses and Their Relationship to Disease Severity // Clin Infect Dis. 2021. Т. 72, № 2. С. 301-308.

121. Qin C. и др. Dysregulation of Immune Response in Patients With Coronavirus 2019 (COVID-19) in Wuhan, China // Clin Infect Dis. 2020. Т. 71, № 15. С. 762-768.

122. WHO COVID-19 vaccine tracker and landscape [Электронный ресурс]. URL: https://www.who.int/publications/m/item/draft-landscape-of-covid-19-candidate-vaccines.

123. Calina D. и др. Towards effective COVID-19 vaccines: Updates, perspectives and challenges (Review) // Int J Mol Med. 2020. Т. 46, № 1. С. 3-16.

124. Shang J. и др. Structural basis of receptor recognition by SARS-CoV-2 // Nature. 2020. Т. 581, № 7807. С. 221-224.

125. Zhou X. и др. Molecular deconvolution of the neutralizing antibodies induced by an inactivated SARS-CoV-2 virus vaccine // Protein Cell. 2021. Т. 12, № 10. С. 818-823.

126. Establishment of the WHO International Standard and Reference Panel for anti-SARS-CoV-2 antibody.

127. Kristiansen P. A. и др. WHO International Standard for anti-SARS-CoV-2 immunoglobulin // Lancet. 2021. Т. 397, № 10282. С. 1347-1348.

128. Byrnes J.R. и др. Competitive SARS-CoV-2 Serology Reveals Most Antibodies Targeting the Spike Receptor-Binding Domain Compete for ACE2 Binding // mSphere. 2020. Т. 5, № 5. С. e00802-20.

129. Tan C.W. и др. A SARS-CoV-2 surrogate virus neutralization test based on antibody-mediated blockage of ACE2-spike protein-protein interaction // Nat Biotechnol. 2020. Т. 38, № 9. С. 10731078.

130. Muruato A.E. и др. A high-throughput neutralizing antibody assay for COVID-19 diagnosis and vaccine evaluation // Nat Commun. 2020. Т. 11, № 1. С. 4059.

131. Ferrara F., Temperton N. Pseudotype Neutralization Assays: From Laboratory Bench to Data Analysis // Methods Protoc. 2018. Т. 1, № 1. С. 8.

132. Cantoni D., Mayora-Neto M., Temperton N. The role of pseudotype neutralization assays in understanding SARS CoV-2 // Oxf Open Immunol. 2021. Т. 2, № 1. С. iqab005.

133. Logunov D.Y. и др. Safety and immunogenicity of an rAd26 and rAd5 vector-based heterologous prime-boost COVID-19 vaccine in two formulations: two open, non-randomised phase 1/2 studies from Russia // Lancet. 2020. Т. 396, № 10255. С. 887-897.

134. Kozlovskaya L.I. и др. Long-term humoral immunogenicity, safety and protective efficacy of inactivated vaccine against COVID-19 (CoviVac) in preclinical studies // Emerg Microbes Infect. 2021. Т. 10, № 1. С. 1790-1806.

135. Костин Н.Н. и др. Способ определения активности нейтрализующих антител к SARS-CoV-2 в сыворотке или плазме крови людей, перенесших COVID-19 или привитых вакцинами для профилактики новой коронавирусной инфекции COVID-19, с использованием набора реагентов для иммуноферментного анализа, содержащего рекомбинантный рецептор-связывающий домен (RBD) поверхностного гликопротеина S коронавируса SARS-CoV-2 и рекомбинантный человеческий рецептор ACE2.

136. Avery D.T. и др. IL-21-induced isotype switching to IgG and IgA by human naive B cells is differentially regulated by IL-4 // J Immunol. 2008. Т. 181, № 3. С. 1767-1779.

137. Chu T.H., Patz E.F., Ackerman M.E. Coming together at the hinges: Therapeutic prospects of IgG3 // MAbs. 2021. Т. 13, № 1. С. 1882028.

138. Collins A.M., Jackson K.J.L. A Temporal Model of Human IgE and IgG Antibody Function // Front Immunol. 2013. Т. 4. С. 235.

139. Damelang T. и др. Role of IgG3 in Infectious Diseases // Trends Immunol. 2019. Т. 40, № 3. С. 197-211.

140. Bobik T.V. и др. COVID-19 in Russia: Clinical and Immunological Features of the First-Wave Patients // Acta Naturae. 2021. Т. 13, № 1. С. 102-115.

141. Moriyama S. и др. Temporal maturation of neutralizing antibodies in COVID-19 convalescent individuals improves potency and breadth to circulating SARS-CoV-2 variants // Immunity. 2021. Т. 54, № 8. С. 1841-1852.e4.

142. Chia W.N. и др. Dynamics of SARS-CoV-2 neutralising antibody responses and duration of immunity: a longitudinal study // Lancet Microbe. 2021. Т. 2, № 6. С. e240-e249.

143. Bosnjak B. и др. Low serum neutralizing anti-SARS-CoV-2 S antibody levels in mildly affected COVID-19 convalescent patients revealed by two different detection methods // Cell Mol Immunol. 2021. Т. 18, № 4. С. 936-944.

144. Oostindie S.C. и др. Avidity in antibody effector functions and biotherapeutic drug design // Nat Rev Drug Discov. 2022. Т. 21, № 10. С. 715-735.

145. Vidarsson G., Dekkers G., Rispens T. IgG Subclasses and Allotypes: From Structure to Effector Functions // Front. Immunol. 2014. Т. 5. С. 520.

146. Araste F. и др. Peptide-based targeted therapeutics: Focus on cancer treatment // Journal of Controlled Release. 2018. Т. 292. С. 141-162.

147. Lu R. и др. Genomic characterisation and epidemiology of 2019 novel coronavirus: implications for virus origins and receptor binding // Lancet. 2020. Т. 395, № 10224. С. 565-574.

148. Hartley R.W. Barnase and barstar: two small proteins to fold and fit together // Trends Biochem Sci. 1989. Т. 14, № 11. С. 450-454.

149. Yang S. и др. Comparison of model-specific histopathology in mouse models of COVID-19 // Journal of Medical Virology. 2022. Т. 94, № 8. С. 3605-3612.

150. Liu G. и др. A highly susceptible hACE2-transgenic mouse model for SARS-CoV-2 research // Front. Microbiol. 2024. Т. 15. С. 1348405.

151. Chevalier A. и др. Massively parallel de novo protein design for targeted therapeutics // Nature. 2017. Т. 550, № 7674. С. 74-79.

152. Mathieu C. и др. Prevention of Measles Virus Infection by Intranasal Delivery of Fusion Inhibitor Peptides // J Virol / под ред. Dermody T.S. 2015. Т. 89, № 2. С. 1143-1155.

153. Leyva-Grado V.H. и др. Direct Administration in the Respiratory Tract Improves Efficacy of Broadly Neutralizing Anti-Influenza Virus Monoclonal Antibodies // Antimicrob Agents Chemother. 2015. Т. 59, № 7. С. 4162-4172.

154. Beukenhorst A.L. и др. Intranasal administration of a panreactive influenza antibody reveals Fc-independent mode of protection // Sci Rep. 2025. Т. 15, № 1. С. 10309.

155. Halwe S. и др. Intranasal Administration of a Monoclonal Neutralizing Antibody Protects Mice against SARS-CoV-2 Infection // Viruses. 2021. Т. 13, № 8. С. 1498.

156. Kim T.Y. h gp. Prolonged half-life of small-sized therapeutic protein using serum albumin-specific protein binder // Journal of Controlled Release. 2019. T. 315. C. 31-39.

157. Kontermann R.E. Strategies for extended serum half-life of protein therapeutics // Current Opinion in Biotechnology. 2011. T. 22, № 6. C. 868-876.

158. Hijazi Y. Prediction of Half-Life Extension of Peptides via Serum Albumin Binding: Current Challenges // Eur J Drug Metab Pharmacokinet. 2021. T. 46, № 2. C. 163-172.

159. Jonsson A. h gp. Engineering of a femtomolar affinity binding protein to human serum albumin // Protein Engineering Design and Selection. 2008. T. 21, № 8. C. 515-527.

160. Siraj Y.A. Promises of eukaryotic ribonucleases for cancer treatment: a systematic review // transl med commun. 2022. T. 7, № 1. C. 5.

161. Dickson K.A., Haigis M.C., Raines R.T. Ribonuclease Inhibitor: Structure and Function // Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology. Elsevier, 2005. T. 80. C. 349-374.

ПРИЛОЖЕНИЯ Приложение 1

Аминокислотные последовательности и характеристики белков, использованных в работе по созданию таргетных противовирусных агентов.

>ЬСБ1

MDKEWILQKIYEIMRLLDELGHAEASMRVSDLIYEFMKKGDERLLEEAERLLEEVERGSSSGSSSLP ETGGHHHHHH

Длина — 77 аминокислот, молекулярная масса — 8956.09 Да, изоэлектрическая точка — 5.09, алифатический индекс — 82.34.

>ЬСБ1-Бп

MDKEWILQKIYEIMRLLDELGHAEASMRVSDLIYEFMKKGDERLLEEAERLLEEVEREFPKPSTPPG SSGGAPAQVINTFDGVADYLQTYHKLPDNYITKSEAQALGWVASKGNLADVAPGKSIGGDIFSNREGKLPGKS GRTWREADINYTSGFRNSDRILYSSDWLIYKTTDHYQTFTKIRGAPHHHHH

Длина — 191 аминокислота, молекулярная масса — 21712.30 Да, изоэлектрическая точка — 5.80, алифатический индекс — 73.09.

>LCБ1-AБD

MDKEWILQKIYEIMRLLDELGHAEASMRVSDLIYEFMKKGDERLLEEAERLLEEVERGSSSGSSSGS SSLAEAKVLANRELDKYGVSDFYKRLINKAKTVEGVEALKLHILAALPGSHHHHH

Длина — 122 аминокислоты, молекулярная масса — 13818.72 Да, изоэлектрическая точка — 5.80, алифатический индекс — 95.98.

>LCБ1-AБD-Бn

MDKEWILQKIYEIMRLLDELGHAEASMRVSDLIYEFMKKGDERLLEEAERLLEEVERGSSSGSSSGS SSLAEAKVLANRELDKYGVSDFYKRLINKAKTVEGVEALKLHILAALPEFPKPSTPPGSSGGAPAQVINTFDG VADYLQTYHKLPDNYITKSEAQALGWVASKGNLADVAPGKSIGGDIFSNREGKLPGKSGRTWREADINYTSGF RNSDRILYSSDWLIYKTTDHYQTFTKIRGAPHHHHH

Длина — 249 аминокислот, молекулярная масса — 27759.14 Да, изоэлектрическая точка — 6.27, алифатический индекс — 79.20.

Сенсограммы поверхностного плазмонного резонанса (ППР), полученные при взаимодействии между: Иммобилизованным ЧСА на оптическом чипе и ABD при концентрации 400 нМ; (Б) иммобилизованным ЧСА и LCB1-ABD при концентрациях 100, 200 и 400 нМ; (В) иммобилизованным ЧСА и LCB1-ABD-Bn при 25, 50, 100, 200 и 400 нМ; (Г) иммобилизованным МСА и LCB1-ABD-Bn при 400, 500 и 750 нМ; (Д) иммобилизованным МСА и LCB1-ABD при 1000 и 2000 нМ; (Е) иммобилизованным МСА и LCB1-ABD-Bn при 2000, 4000, 8000 и 16000 нМ. Сенсограммы и аппроксимирующие кривые (теоретические модели) представлены красным и чёрным цветом соответственно.

Сенсограммы поверхностного плазмонного резонанса (ППР), полученные при взаимодействии между: (А) Иммобилизованным БСА и ABD при концентрациях 1000, 2000, 4000, 8000 и 16000 нМ; (Б) иммобилизованным БСА и LCB1-ABD при 200, 500, 750, 1000 и 1500 нМ; (В) иммобилизованным БСА и LCB1-ABD-Bn при 500, 1000, 1500 и 2000 нМ; (Г) иммобилизованным тримерным S-белком и LCB1-ABD при 25, 50, 100, 200 и 400 нМ; (Д) иммобилизованным тримерным S-белком и LCB1-ABD-Bn при 25, 50, 100, 200 и 400 нМ. Сенсограммы и аппроксимирующие кривые представлены красным и чёрным цветом соответственно.

Носитель

1_СВ1-АЕЮ-Вп 2.7 мг/кг

1_СВ1-АВО-Вп 10 мг/кг

1_СВ1-АВО-Вп 20 мг/кг

Сердце

Печень

Селезенка

Легкое

Почки

шишиге и ,

- • л-:;-: й- "'И ди,У4''•'-.' Л?;'-'"';.. ■■'■ !■■'. '■' г:-:'-; 51 V .¿Эй© V "•■••. .• . ■ ■'.- ■ -> •

■¿•йжт*? »пий ■■Ш^'Щ ■л У* • . " ■ ' о«.:'^ь^.-тяг г шшш. (Я ! \1 ">*" * • V »V • Г •г ;

■ ш

шШЩт щШШш ЙШЦ и

- А

Тимус

Гистологический анализ тканей, окрашенных гематоксилином и эозином (Н&Е), у мышей, получивших LCB1-ABD-Bn, и контрольных животных. Представлены изображения сердца, печени, селезёнки, лёгких, почек и тимуса от контрольной мыши и мышей через две недели после введения LCB1-ABD-Bn в дозах 2,7 мг/кг, 10 мг/кг и 20 мг/кг. Увеличения изображений: 50* (почки), 100* (сердце, печень, селезёнка, лёгкие, тимус) и 400* (печень).

(А) Аппроксимация индивидуальных фармакокинетических кривых для химерных белков. (Б) Аппроксимация усреднённой фармакокинетической кривой, отражающей динамику изменения концентрации белка в крови во времени. Расчёт параметров выполнен с использованием некомпартментного анализа.