Иммуноферментные тесты определения витамина B12, фолиевой кислоты, гомоцистеина и трансферринового рецептора в гематологической практике тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, кандидат биологических наук Мамукова, Юлия Иосифовна

• Мамукова, Юлия Иосифовна
• кандидат биологических наук
• 2004

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Мамукова, Юлия Иосифовна

Введение

1.Обзор литературы

1.1 Значение определения витамина В12, фолиевой кислоты, гомоцистеина и трансферринового рецептора

1.2 Характеристика современных методов анализа, используемых для определения витамина В12, фолиевой кислоты, гомоцистеина и трансферринового 17 рецептора

Собственные результаты

2. Материалы и методы

2.1 Получение конъюгатов В12-БСА и фол-БСА

2.2 Получение конъюгатов Нсу-ПАК и Нсу-БСА

2.3 Получение антисывороток

2.4 Проведение иммуноферментного анализа

3. Результаты исследований

3.1 Разработка иммуноферментного метода определения витамина В12, фолатов и гомоцистеина.

3.2 Приготовление растворов калибраторов

3.3 Оптимизация иммуноферментного анализа витамина В

3.4 Разработка и оптимизация твердофазного иммуноферментного анализа для определения фолиевой кислоты

3.5 Постановка иммуноферментного анализа для количественного определения 40 витамина В12 и фолатов

3.6 Разработка метода определения гомоцистеина

3.7 Разработка метода определения трансферринового рецептора

3.8 Клиническое использование разработанных тестов

3.8.1 Определение витамина В12 и фолиевой кислоты при ряде 51 гематологических заболеваний

3.8.2 Определение гомоцистеина при гематологических и микрореологических заболеваниях

3.8.3 Определение трансферринового рецептора при гематологических 56 нарушениях

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Иммуноферментные тесты определения витамина B12, фолиевой кислоты, гомоцистеина и трансферринового рецептора в гематологической практике»

Дифференциальная диагностика анемий по-прежнему остается актуальной проблемой гематологии. В связи с этим разработка и внедрение в практику лабораторных методов, позволяющих уточнить характер анемий, обусловленных разными причинами, имеет существенное значение как с научной, так и с практической точек зрения. Показано, что определение и контроль уровней витамина В12 и фолатов целесообразно в клинической гематологии. Витамин В12 и фолаты необходимы для нормального метаболизма в организме (синтез ДНК, обмен жирных кислот и др.). Дефицит этих витаминов вызывает нарушение функции быстро пролиферирующих клеток и в первую очередь мегалобластную анемию, а также неврологические и нейропсихические изменения. Кроме того, по концентрации витамина В12 в ряде случаев проводится дифференциальная диагностика хронических миелопролиферативных заболеваний. Нарушение обмена фолиевой кислоты и вызванное этим увеличение в крови концентрации гомоцистеина (Нсу), как продукта метаболизма фолатов, ведет к сердечно-сосудистым заболеваниям и тромбозам, в основе которых лежит токсическое действие гомоцистеина на эндотелий сосудов. Метаболизмы витамина В12 и фолиевой кислоты тесно взаимосвязаны, и дефицит одного из них влияет на биохимические реакции, контролируемые этими витаминами. Биохимические механизмы, посредством которых дефицит этих витаминов приводит к анемиям, на сегодня еще не полностью ясен, хотя и доказано, что наблюдается дефект синтеза ДНК при сохранном синтезе РНК и белков. Скорее всего, появление дефектной ДНК вызвано нарушениями в реакции превращения урацил-монофосфата в тимидин-монофосфат, который, включаясь в ДНК, необходим для образования ее больших тяжей, требуемых для формирования хромосомы. Таким образом, поскольку содержание в организме витамина В12, фолиевой кислоты и гомоцистеина взаимосвязаны, определение их концентраций важно для точной диагностики заболеваний, а также для контроля проводимой терапии.

Среди анемий различной этиологии значительное место занимают анемии хронических воспалительных заболеваний (АХВЗ). По ряду признаков они отличаются от истинных железодефицитных анемий. Однако, без дополнительных исследований их трудно дифференцировать с истинным дефицитом железа. Одним из информативных дифференциальных показателей является концентрация трансферринового рецептора. Трансферриновый рецептор (ТфР) является мембранным гликопротеином, выполняющим роль медиатора в передаче железа из плазмы в клетку. Этот процесс осуществляется путем связывания трансферрина плазмы, насыщенного железом, с трансферриновым рецептором с последующей интернализацией образовавшегося комплекса в эндоплазматическую везикулу путем эндоцитоза, где железо освобождается из комплекса с белком при уменьшении рН. ТфР освобождается из ретикулоцитов во время их созревания до эритроцитов. ТфР, находящийся в плазме, представляет собой растворимые фрагменты экстрацеллюлярной части рецептора. Уровень растворимого трансферринового рецептора, присутствующего в плазме, позволяет судить о состоянии гемопоэза, поскольку при недостатке в клетке свободного железа происходит увеличение синтеза ТфР, а следовательно, и увеличение поступления железа в клетку. При избытке железа в клетке синтез рецептора прекращается. Эритроидные клетки содержат основную массу трансферринового рецептора в организме. В норме плазма содержит небольшое количество ТфР (1,5 -2,5 мкг/мл). Концентрация ТфР в плазме хорошо коррелирует с общей массой рецептора на незрелых эритроидных клетках. В связи с этим при истинных ЖДА уровень растворимого трансферринового рецептора резко повышен в отличие от анемии воспалений и хронических заболеваний. Поэтому определение уровня трансферринового рецептора включают в методы дифференциальной; диагностики этих анемий:

Поскольку все указанные соединения находятся в сыворотке крови; в крайне незначительных количествах, определение их возможно лишь современными высокочувствительными методами анализа, такими как радио-, флюро- или ферментоиммунными.

В настоящее время отечественных наборов для определения витамина В12, фолатов, гомоцистеина и ТфР нет, а выпускаемые за рубежом — дороги и их применение возможно только при наличии специального оборудования - автоматизированных «закрытых» систем.

В связи с этим целью нашей работы является разработка и внедрение в клиническую практику иммуноферментных методов количественного определения витамина В12, фолиевой кислоты, гомоцистеина и трансферринового рецептора.

Задачи исследования

1. Получить конъюгаты витамина В12 с бычьим сывороточным альбумином (БСА), фолатов с БСА, S - аденозил - L - гомоцистеина (SAH) с БСА, SAH с полиакриловой кислотой; (ПАК), необходимые при проведении иммуноферментного анализа для использования в качестве антигенов и иммуносорбентов.

2. Оптимизировать параметры проведения иммуноферментной реакции для количественного определения В12, фолатов, гомоцистеина (Нсу).

3. Провести эксперименты по получению реагентов для иммуноферментного анализа ТфР (очищенного препарата ТфР и кроличьих антисывороток к ТфР) и разработать методику количественного определения ТфР методом твердофазного ИФА.

4. Изучить аналитические характеристики сконструированных тест-систем (специфичность, чувствительность, воспроизводимость, сходимость результатов) и провести сравнительный анализ полученных результатов с данными других иммунохимических методов.

5. Оценить клиническую информативность разработанных методов количественного определения витамина В12, фолиевой кислоты, гомоцистеина и трансферриновго рецептора.

Научная новизна

Разработан оригинальный подход для получения антисыворотки против гомоцистеина на основании использования конъюгата Б-аденозил-Ь-гомоцистеина с полимером (полиакриловой кислотой), обеспечивший получение антисывороток с высоким уровнем специфических антител и высокой константой аффинности, необходимых для целей ИФА.

Разработаны иммуноферментные количественные методы анализа витамина В12, фолиевой кислоты, гомоцистеина и трансферринового рецептора.

Показана высокая информационная значимость комплексного определения витамина В12, фолиевой кислоты и трансферринового рецептора для дифференциальной диагностики анемий.

Показана целесообразность контроля уровня гомоцистеина у больных с повышенным риском развития тромбозов и микроциркуляторными нарушениями для выбора оптимальной тактики лечения.

Практическая значимость

1. Разработаны высокочувствительные и специфичные методики количественного определения > витамина В12, фолатов, гомоцистеина и трансферринового рецептора на основе твердофазного иммуноферментного анализа.

2. Разработаны и утверждены Ученым Советом Гематологического научного центра РАМН методические рекомендации «Иммуноферментный метод определения витамина В12 и фолиевой кислоты» (протокол № 4 от 28 мая 2002 г.).

3. С 2001 г. разработанные лабораторные тесты внедрены в клиническую практику ГНЦ РАМН.

4. Показана целесообразность динамического контроля уровня гомоцистеина у больных с повышенным риском развития тромбозов.

Апробация работы

Материалы, изложенные в диссертации, доложены на научной конференции ГНЦ РАМН (Москва, 2004). Результаты диссертации обсуждены на заседании проблемной комиссии «Опухоли лимфатической системы, патология красной крови, порфирии» ГНЦ РАМН (Москва, 1 июля 2004).

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Мамукова, Юлия Иосифовна

ВЫВОДЫ

1. Разработаны высокочувствительные и специфичные иммуноферментные методы для количественного определения витамина В12, фолиевой кислоты, гомоцистеина и трансферринового рецептора.

2. Разработан оригинальный метод получения моноспецифической антисыворотки против гомоцистеина посредством иммунизации кроликов конъюгатом SAH-IIAK.

3. Получены и охарактеризованы конъюгаты витамин В12 -БСА, фолат-БСА,. SAH-BCA для приготовления иммуносорбентов — полистироловых планшетов для проведения иммуноферментного анализа.

4. Определены аналитические характеристики разработанных методик: чувствительность, коэффициент вариации, тест на открытие.

5. Показана высокая информативность определения концентраций витамина В12, фолиевой кислоты, гомоцистеина и трансферринового рецептора для дифференциальной диагностики анемий, выбора тактики лечения и контроля за проводимой терапией.

Заключение

Дифференциальная диагностика анемий является актуальной проблемой гематологии. В связи с этим разработка и внедрение в практику лабораторных методов, позволяющих уточнить характер анемий, обусловленных разными причинами, имеет существенное значени. Анемии, вызванные дефицитом витамина В12 и фолиевой кислоты, встречаются во всех странах мира. Эти витамины ответственны за пролиферативную активность клеток.

Структурно витамин В12 относится к кобаламинам в состав которых входит корриновое кольцо, в центре его находится атом кобальта, верхний лиганд, ковалентно связанный с кобальтом, и нуклеотидная боковая цепь. Фолиевая кислота относится к птероглютаминовым кислотам: и состоит из трех компонентов: птероидинового кольца, парааминобензойной и глутаминовой кислот. Как витамин В12, так и фолаты имеют много дериватов. Среди известных витаминов кобаламины и фолаты занимают первое место по структурной сложности и разнообразию, а по концентрации в организме - одно из последних. Однако, реакции, в которых они принимают участие, крайне важны для нормального метаболизма. Это прежде всего реакции переноса метальных и формальных групп на. гомоцистеин и другие соединения, участие в метаболизме метионинсинтетазы, которая является одним из звеньев в каскаде реакций, ответственных за проведение нервных импульсов, а также реакция мугазного типа по превращению метилмалонила-СоА в сукцинил-СоА. Витамин В12 и фолаты участвуют в нормальном эритробластическом кроветворении путем образования из уридин-монофосфата тимидин-монофосфата, включаемого в ДНК. Крайне важным является также участие витамина В12 в обмене жирных кислот, в результате чего образуется янтарная кислота из метилмалоновой кислоты, а при дефиците витамина В12 накапливается метилмалоновая кислота, являющаяся токсичной для нервной ткани и вызывающая демиелинизацию нервных волокон и развитие фуникулярного миелоза. При развитии дефицита кобаламинов и фолатов наблюдаются нарушения в созревании эритробластов, что приводит к появлению гигантских клеток, в которых сохраняется аномальное ядро, нарушается развитие тромбоцитарного и лейкоцитарного рядов, а также образование эпителия желудочно-кишечного тракта. Дефицит фолиевой кислоты приводит к накоплению гомоцистеина, токсичной промежуточной формы обмена метионина, что может вызывать изменения в свертывающей системе крови и в окислительно-восстановительных реакциях в организме, приводящие к сердечно-сосудистым нарушениям. Метаболизм витамина В12 и фолиевой кислоты тесно взаимосвязаны, и дефицит одного из них влияет на биохимические реакции, контролируемые этими витаминами. Гомоцистеин является аминокислотой, содержащей тиоловую группу и принимающей участие в процессах ре- и деметилирования метионина. В то же время гомоцистеин является промежуточным звеном в метаболизме витамина В12 и фолиевой кислоты. Значительное место в катаболизме гомоцистеина принадлежит транссульфированию, причем эти реакции протекают под действием ферментов, зависимых от витамина В12 и фолатов.

Таким образом, поскольку содержание в организме витамина В12, фолиевой кислоты и гомоцистеина взаимосвязаны, определение их концентраций важно для точной диагностики заболеваний, а также для контроля за состоянием больного и проводимой терапией.

Среди анемий различной этиологии значительное место занимают анемии хронических воспалительных заболеваний (АХВЗ). По ряду признаков они отличаются от истинных железодефицитных анемий. Однако, без дополнительных исследований их трудно дифференцировать с истинным дефицитом железа. Одним из информативных дифференциальных показателей является трансферриновый рецептор. Трансферриновый рецептор (ТфР) является мембранным гликопротеином, выполняющим роль медиатора в передаче железа из плазмы в клетку. Экстрацеллюлярная часть трансферринового рецептора, освобождающаяся с поверхности клеток при их созревании, остается в циркуляции и представляет собой растворимый фрагмент ТфР. Концентрация растворимого ТфР в плазме хорошо коррелирует с общей массой рецептора на незрелых эритроидных клетках.

Поскольку уровень трансферринового рецептора связан с активностью эритропоэза, этот показатель вызывает законный интерес исследователей и с точки зрения диагностики, и с научной.

Нормальные значения для витамина В12 в сыворотке - 300-900 пг/мл, для фолатов - 412 нг/мл, в эритроцитах витамин В12 содержится в количестве 150-450 пг/мл, фолаты - 100300 нг/мл или 80-300 пг/г НЬ и 3-10 нг/г НЬ. Уровень гомоцистеина в сыворотке крови составляет в норме от 5 до 12 мкМ . Концентрация трансферринового рецептора также мала и измеряется мкг/мл (1,5-2,5 мкг/мл). Низкие концентрации этих соединений обуславливают необходимость в использовании высокочувствительных методов анализа. Для их определения чаще всего используются иммунохимические методы с различными системами детекции. В связи с этим, разработка относительно недорогого иммуноферментного метода, приспособленного для «открытой» системы, позволяющего проводить исследования достаточно большому контингенту больных, является актуальной проблемой. Аналогичные импортные коммерческие наборы приспособлены для «закрытых» систем и очень дороги.

Мы разработали методы для количественного определения витамина В12, фолатов, гомоцистеина и трансферринового рецептора позволяющие работать в «открытой» иммуноферментной системе. Поскольку витамин В12, фолиевая кислота и гомоцистеин являются гаптенами, их участие в иммунохимической системе возможно лишь в виде конъюгатов этих соединений с белком или полимером.

В настоящее время для определения гаптенов чаще всего используется конкурентный вариант иммуноферментного твердофазного анализа.

Трансферриновый рецептор - белок, а наиболее распространенным методом определения белков является сэндвич-вариант иммуноферментного анализа. Критериями идеального метода анализа как для гаптенов, так и для белков являются: специфичность (метод должен быть специфичен к определяемому антигену и его дериватам и неспецифичен к другим антигенам); точность и надежность, необходимые для клинических целей; простота, позволяющая проводить анализ относительно быстро и на недорогом оборудовании; отсутствие влияния на результаты анализа других белков и компонентов сыворотки; высокая чувствительность метода, позволяющая использовать небольшие количества образца.

Иммунохимические методы определения антигенов обладают всеми указанными достоинствами.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1) создать методику для определения уровня витамина В12, фолиевой кислоты и гомоцистеина, которые могут работать в фотоколориметрической системе детекции;

2) получить и охарактеризовать конъюгаты (витамин В12-БСА, фолат-БСА, SAH-BCA, SAH-TIAK), необходимые для проведения иммобилизации антигенов на твердой фазе и получения антисывороток;

3) разработать методику определения ТфР для расширения возможностей дифференциальной диагностики анемий;

4) определить аналитические характеристики разработанных тест-систем (специфичность, чувствительность, воспроизводимость, сходимость результатов);

5) оценить клинико-диагностическую значимость определения концентраций витамина В12, фолиевой кислоты, гомоцистеина и трансферринового рецептора в крови и сравнить полученные результаты с данными других аналитических методов;

6) представить методические рекомендации по определению витамина В12, фолатов и гомоцистеина в биологических жидкостях для использования в клинико-диагностической практике.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Мамукова, Юлия Иосифовна, 2004 год

1. Воробьев А.И. Руководство по гематологии, Москва, Ньюдиамед, 2002, т.1,стр. 55-60.

2. Дасон Р.Справочник биохимика,пер.с анг.,Москва, 1996, стр.327.

3. ЕгоровАМ.,Осипов А.П., Дзаитиев Б.Б., Теория и практика Иммуноферментного анализа, Москва, Высшая школа, 1991, стр.35-49.

4. Инструкция по определению общего белка в сыворотке крови по биуретовой реакции, приказ Мин.здр.290 от 11апр. 1972 г

5. Кабанов В.А.,Петров Р.В., Хаитов P.M., Новый принцип создания искусственных иммуногенов, Журн.Всесоюзн. хим. общ-ва им. Менделеева, 1982, 27,4,417-424.

6. Капустин С.И., Блинов М.Н.,Филановская Л.И., Генетические детерминанты наследственной тромбофилии в патогенезе венозного тромбоза., Тер.арх., 2003,10,78-80

7. Ким Б.Б. Физико-химические закономерности взаимодействия пероксидазы хрена с поликлональными и моноклональными антителами. Диссерт. на соискание уч. степ. канд. хим. наук, Москва, 1990 г.

8. Колосова А.Ю. Иммуноферментный анализ антибиотиков и принципы его использования для лекарственного мониторинга и контроля продуктов питания, Диссерт. на соискание уч. степ. канд. хим. наук, Москва, 2000 г.

9. Конопкайте С. Кобаламины, Вильнюс, Мокслас, 1978 г.

10. Реброва О.Ю.Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ STATISTDCA, Москва, Медио Сфера, 2002 г.

11. Шевченко О.П.,Олефиренко Г. А., Червякова Н.В., Гомоцистеин, Москва, Реафарм, 2002 г.

12. Andrews N.C, The molecular regulation of iron metabolism. 5-th congressof European. Haemotol. associat., 2000,Birmingham, session 14.

13. Andrews N.C., Levy J.E., Iron is hot: an update on the pathophysiology of hemochromatosis. Blood, 1998,92,1845-1851.

14. Applegarth D.A.,Hardwick D.F., Ingram C.F., et.al., Excretion of S-adenosil-L-homocysteine in homocysteinuria. N.Eng.J.Med. 1971,285, 1265-1268.

15. Bianco I., Mastropietro F., D'Asero C., et.al., Serum levels of eiythropoietin and soluble transferrin receptor in the course of pregnancy in non P-thalassemia and P-thalassemia women. Haemotol., 1994, 79, 6, 493-499.

16. Blount В С, Ames В N, DNA damage in folate deficiency, Baillere's Clinical Haematology, 1995, 8, 3, 461-476.

17. Blount B.C., MackM.M., Wehr C.M., et.al., Folate deficiency causes uracil misincorporation into human DN A and chromosome breakage: implication for cancer and neuronal damage. PNAS USA, 1997, 94, 3290-3295.

18. Brattstrom L.E., Israelsson В., Jeppsson J.O., et.al., Folic acid an innocuous means to reduce plasma homocysteine Scand.J.Clin.Lab. Invest., 1988,48,215-221.

19. Cassola M., Beguin Y., Bergamaschi G., et.al., Soluble transferrin receptor as a potential determination of iron loading in congenital anaemias due to ineffective erythropoiesis. Brit. J. Haemot., 1999,106, 3, 752-755.

20. Castle W.B ., The conquest of pernicious anemia in Wintrobe. Blood and eloquet, New York N Y, McGano-Hill, 1980, 283-317.

21. Chadefaux B, Coude M, Harmet M, AupetitJ., Kamoun P, Rapid determination of total homocysteine in plasma, Clin Chem, 1989, 35, 2002-5.

22. Chanarin J., Deacon N., Lumb M., et.al:,Vitamin В12 regulates folate metabolism by the supply. Lancet, 1980, 2, 505-507.

23. Chanarin J., The megaloblastic anaemies, 1979, Oxford, UK, Blackwell scientific, 4556.

24. Christensen В., Refsum H., Vintermyr O.,et.al., Homocysteine export from cells cultured in presence of physiological or superfluous levels of methionine. J. Cell Biol., 1991, 1, 146-152.

25. Christensen В., Rosenblatt D.C., Effect of folate deficiencyon embryonic development. Bailliere's Clin.Haemot., 1995,8,617-637.

26. Cichwicz D. J., Shane B. Mammalian folypoly-y-glutamate sythetase. Substrate specificity and kinetic properties. Biochemistry, 1987, 26, 513-521.

27. Citro G., Perotti D., Cucco C., Inhibition of leukemia cell proliferation by receptor-mediated uptake of c-myb antisense oligodeoxynucleotides. PNAS USA, 1992, 89, 7031-7035.

28. Clarke R, Evans J.G.,Schneede J.,et. al., Vitamin B12 and folate deficiency in later life. Age and ageing, 2004, 33, 34-41.

29. Clarke R and Stansbie D. Assessment of homocysteine as a cardiovascular risk factor in clinical practice. Ann Clin Biochem, 2001, 38,624-632.

30. Clarke R., Smith A.D., Jobst K.A., et.al., Folate,- vitamin B12 and serum total homocysteine levels in confirmed Alzheimer disease., Arch Neurol., 1998, 55, 14491455.31. d'Angello A., Selhud J., Homocesteine and thrombotic disease, Blood, 1997,1,1-11.

31. Daley S., Mills J.L., Molley A.M., et.al., Minimum effective dose of folic acid for food fortification to prevent neural tube defects. Lancet, 1998; 350, 1666-1669.

32. Den Heijer M., Koster Т., Blom H.J., et.al., Hiperhomocysteinemia as a risk factor for deep vein thrombosis. N.Engl.J.Med., 1996, 334,759-762.

33. Di Minno G., Davi G., Margaglione M., Abnormally high thromboxane biosyntesis in homozygous homocystinuria. J. Clin. Invest., 1993, 92, 1400-1405.

34. Didman N.P.B., Wileken D.E.L., Wang J., et.al., Disordered methionine homocysteine metabolism in premature vascular disease., Arterioscl., Thromb., 1993, 13, 1253-1258.

35. Engel W.D., Khana P.L., Effective method of receaving conjgates for immunoassay., J.Immun.Meth., 1992, 150, 1-2, 99-102.

36. Ferguson B.J., SkikneB.S., Simpson K.M., et.al., Serum transferrin receptor distinguishes the anemia of chronic disease from iron deficiency anemia., J.Lab.Clin.Med., 1992, 19, 385-390.

37. Fermo I, De Vecchi E, Arcelloni С et al, Methodological aspects of total plasma homocysteine measurement, Haematologica, 1997,82,246-250.

38. Finkelstein J.D., Kyle W.E., Martin J.J., et.al., Activation of cystathione syntase by adenosylmethionine and adenosylthionine., Biochem.Biophys.Res.Commun.,1975, 66,81-87.

39. Fiskenrstrand T, Refsumm H, Kvalheim G, UelanP M, Homocysteine and other thiols in plasma and urine: automated determination and sample stability,Clin Chem, 1993, 39, 263-71.

40. Fleming R.E., Ahmann J.R., MigesM.C., et.al., Targeted mutagenesis of the murine transferrin receptor-2 gene produces hemochromatosis., PNAS USA, 2002, 99, 16, 10653-10658.

41. Flowers C.H., Skikne B.S., Covell A.M., The clinical measurement of serum transferrin receptor., J.Lab.Clin. Med.,1989, 114,368-377.

42. Fowler В., Kraus J., Packman S., et.al., Homocystinuria: evidance for there distinct classes of cysthathionine-P-syntase mutant in cultured fibroblasts., J.Clin.Invest., 1978, 61,645-653.

43. Frantzen F., Faaren A.L., Altheim J., Enzyme conversation immunoassay for determining total homocysteinein plasma or serum., Clin.Chem., 1998, 44, 311-316.

44. Frenkel E.P., Abnormal fatty acid metabolism in peripheral nerves of patients with pernicious anemia., J.Clin.Invest., 1973,52,1237-1245.

45. Friguet В., Chatfote A.F., Djavadi-Ohaniance A. et.al., Measurements of true affinity constant in solution antigen-antibody complexes by enzyne-linked immunosorbent assay., J. Immun.Meth., 1985, 77,305-319.

46. Frosst P., Blom H.J., Milos R., et.al., A candidate genetic risk factor for vascular disease: a common mutation in MTHFR:, Nat.Gen., 1995, 10, 111-117.

47. Frost Т., Blom H.J., Milos R., et.al., A common genetic risk factor for vascular disease, Am.J.Hum.Genet., 1995, 58, 35-41.

48. Georqiet M.K., Berry S.A., Wobken J.D., Increased placental iron regulatory protein-1 expression in iron deficiency., Placenta, 1999, 20, 1, 87-93.

49. Glueck C.J., Shaw P., LangJ.E., et.al., Evidence that homocysteine is independent riskfactor for atherosclerosis in hyperlipidemic patient., Am.J.Cardiol., 1995,72,132-137.

50. Green R, Joshua W., Miller O., Folate deficiency beyond megaloblastic anemia: hyperhomocysteinemia and other manifestations of dysfunctional folate status., Semin. In Hematol., 1999,36,1,47-64.

51. Green R., Metabolite assays in cobalamin and folate deficiencies., Baillieres Clin. Haemot., 1995, 8, 533-566.

52. Harding C.O., Georgianne A., Lewis A.B., et.al;, Functional methionine synthase deficiency due to cblG disorder: a report of two patients and a review. , Am.J.Med.Genet., 1997,71,384-390.

53. Hash R.B., Sargent M.A., Katner H:, Anemia secondary to combined deficiencies of iron and cobalamin., Arch. Fam.Med., !996, 5, 585-588.

54. Herbert V., Folic acid in Modern nutrition in health and disease, Philadelphia P. A., 1999,434-446.

55. Herbert V., Protecting millions of elderly from early morbility., Blood, 1999,93,125128.

56. Herbert V., The assay and nature of folic acid activity in human serum., J. Clin.Invest., 1961,40,81-91.

57. Herbert V., Zalusky R., Interrelation of vitamin В12 and folic acid metabolism: folic acid clearance studies., J.Clin.Invest., 1962,41,1263-1276.

58. Hibbard E.D., Smithells R.W., Folic acid metabolism and human embryopathy., Lancet, 1965, 1, 1254-1258.

59. Hoffbrand A.V., Herbert V., Nutriotional anemias. Seminars in Hematol., 1999, 36,4, 13-23.

60. Hyland K., Smith J., Bottiglieri Т., et.al., Demyelination and decreased S-adenosylmethionine in 5,10-MTHFR deficiency., Neurology, 1988, 38,459-462.

61. Iacopetta B.J., Morgan E.H., YeohG.C.T., Transferrin receptor and iron uptake during erythroid cell development., BBA, 1982, 687, 204-210.

62. Ingram C.F., Davidoff A.N., Marais E., Evalution of DNA analysis for evidence of apoptosis in megaloblastic anaemia., Br.J.Haemot., 1997, 96, 576-583.

63. Kang S.S., Passen E.L., Ruggie N., et.al., Thermolabile defect in MTHFR in coronary artery disease., Circulation, 1993,88,1463-1469.

64. Kang S.S., Wong P.W.K., Susmano A., et.al., Thermolabile MTHFR: an wherited risk factor for coronary artery disease., Am.J.Hum.Genet., 1991,48,536-540.67