Иммуногенные и протективные свойства компонентов микобактерий для включения в состав противотуберкулезных вакцин нового поколения тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.00.36, доктор медицинских наук Еремеев, Владимир Витальевич

• Еремеев, Владимир Витальевич
• доктор медицинских наук
• 2005

Оглавление диссертации доктор медицинских наук Еремеев, Владимир Витальевич

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Современные стратегии противотуберкулезной вакцинации 11 1.1. Типы, преимущества и недостатки современных противотуберкулезных вакцин.

1.1.1. Вакцина BCG

1.1.2. Цельноклеточные вакцины

1.1.3. Субъединичные вакцины

1.1.4. Адъюванты

1.1.5. ДНК-вакцины

2. Кандидаты в новые противотуберкулезные вакцины

2.1. Цельноклеточные вакцины

2.1.1. Модифицированные вакцины BCG

2.1.2. Живые атенуированные штаммы М. tuberculosis

2.1.3. Естественным путем атенуированные микобактерии

2.1.4. Живые вакцины немикобактериального происхождения '

2.2. Субъединичные вакцины

2.3. ДНК-вакцины

2.4. Терапевтические вакцины, предназначенные для уменьшения длительности химиотерапии туберкулеза

3. Экспериментальные модели для тестирования вакцин

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 34 2.1 Животные

2.2. Приготовление культуры М. tuberculosis

2.3. Индукция экспериментальной туберкулезной инфекции

2.4. Подсчет микобактериальных колоний

2.5. Культуральные среды

2.6. Получение суспензий клеток селезенки и лимфатических узлов

2.7. Получение суспензий клеток легкого 36 2.7.1. Обогащение суспензий клеток легкого и селезенки Т-лимфоцитами путем удаления клеток, прилипающих к пластику и нейлоновой вате

2.7.2. Выделение макрофагов легкого

2.8. Постановка пролиферативного теста

2.9. Определение антител методом ELISA

2.10. Определение продукции цитокинов

2.11. Бактериальные штаммы и плазмиды

2.12. Гель-электрофорез и Вестерн-блотинг

2.13. Вакцинация мышей

2.13.1. Цельноклеточные вакцины, убитые нагреванием

2.13.2. Цельноклеточные живые вакцины

2.13.3. ДНК вакцины

2.13.4. Белковые вакцины

2.14. Измерение реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ)

2.15. Статистическая обработка результатов

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 Антиген с молекулярной массой 19 кД и протективный иммунитет на модели туберкулеза у мышей

3.1.1 Инактивированная нагреванием вакцина

3.1.2 Гуморальный ответ на АГ19 44 3.1.2 Продукция цитокинов иммунными спленоцитами в ответ на стимуляцию АГ19 in vitro

3.1.4 Влияние на резистентность к туберкулезу

3.2 Живая вакцина и вакцинация плазмидной ДНК

3.2.1 Влияние микобактериальных вакцин на ССЖ

3.2.2 Влияние микобактериальных вакцин на бактериальную нагрузку в органах зараженных животных

3.2.3 Вакцинация плазмидной ДНК АГ

3.2.4 Иммунный ответ на вакцинацию

3.2.5 Иммунный ответ после заражения

3.3 Делеция АГ19 не изменяет протективных свойств вакцины BCG

3.4 Делеция АГ19 снижает вирулентность М. tuberculosis

3.5 Секретируемые белки М. tuberculosis как компоненты новых противотуберкулезных вакцин

3.5.1 Белки раннего культурального фильтрата М. tuberculosis (ST-CF)

3.5.2 Компоненты ST-CF

3.5.3 Иммунный ответ на компоненты вТ-СР

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Иммуногенные и протективные свойства компонентов микобактерий для включения в состав противотуберкулезных вакцин нового поколения»

Актуальность темы.

Несмотря на то, что еще в 1994 году Всемирная Организация Здравоохранения объявила туберкулез проблемой для всего мирового сообщества [WHO, 1994], и предпринимаемые соответственно этому меры, туберкулез остается одной из основных инфекционных причин заболеваемости и смертности в мире, и более того, количество выявляемых за год новых случаев туберкулеза продолжает возрастать. Ежегодно туберкулез уносит от 1,6 до 2,2 миллионов жизней, в зависимости от того относят ли смерть полумиллиона больных инфицированных одновременно ВИЧ и М. tuberculosis на счет СПИДа или туберкулеза [WHO, 1994]. Учитывая высокую стоимость химиопрофилактики для лиц с подозрением на туберкулез, а также появление и распространение устойчивых к антибиотикам штаммов микобактерий, отсутствие равноэффективной во всех регионах земного шара и безопасной для уже инфицированных микобактериями людей вакцины, способной остановить развитие у них пост-первичного контагиозного заболевания легких, служит главной причиной нашей неспособности контролировать распространение туберкулеза [Fine, 1998]. К счастью, в настоящее время завершена характеристика генома М. tuberculosis [Cole et al, 1998] и разработаны методы переноса генов от одних видов микобактерий к другим, что позволяет изучать роль разнообразных антигенных составляющих в индукции различных типов иммунного ответа и определять потенциал их воздействия на протективные свойства новой вакцины.

Ряд особенностей туберкулезной инфекции определяют специфичность задач, стоящих перед создателями новой противотуберкулезной вакцины, в отличие от проблем, которые приходится решать исследователям других заболеваний. Во-первых, гуморальный ответ на возбудитель не влияет, или влияет очень слабо на устойчивость к инфекции. Напротив, сопротивляемость организма критически зависит от иммунного ответа по типу Т-хелперов 1 (Thl). Во-вторых, наши знания об иммунопатогенезе туберкулеза все еще крайне недостаточны, что обусловливает почти полностью эмпирический подход к созданию вакцин. В-третьих, за тысячелетия коэволюции со своим хозяином -человеком - М. tuberculosis сумела исключительно хорошо к нему адаптироваться и научилась модулировать потенциально протективный ответ хозяина, обеспечивая собственное выживание. Наконец, в-четвертых, не существует надежных иммунологических критериев, позволяющих прогнозировать созданный противотуберкулезной вакциной уровень защиты человека или животного. Тем самым, единственным способом оценить уровень резистентности после вакцинации новым препаратом остается заражение провакцинированных животных вирулентным штаммом М. tuberculosis. Критериями оценки результатов подобных экспериментов обыкновенно служат массивность высева микобактерий из органов зараженных животных, гистопатологические изменения в легких и/или время наступления и выраженность симптомов заболевания [McMurray, 2001J.

Целыо настоящей работы явилось исследование иммуногенных и иммуно-модулирующих свойств ряда компонентов М. tuberculosis с точки зрения их перспективности для использования в составе новых противотуберкулезных вакцин, а также разработка общих критериев отбора микобактериальных антигенов для включения в состав субъединичных вакцин.

Задачи исследования

1. Изучить иммупогенные и иммуномодулирующие свойства иммунодоминантного АГ19 из М. tuberculosis.

2. Оценить влияние гиперэкспрессии АГ19 на вакцинные свойства BCG.

3. Оценить влияние удаления АГ19 на вакцинные свойства BCG.

4. Оценить влияние удаления АГ19 на вирулентность М. tuberculosis.

5. Изучить иммуногенные свойства белков раннего культурального фильтрата М. tuberculosis в комбинации с разными адъювантами для определения перспективности их использования в составе многокомпонентной субъединичной противотуберкулезной вакцины.

6. Определить влияние различных способов комбинирования отдельных белков раннего культурального фильтрата М. tuberculosis в одном вакцинном препарате на эффективность индуцируемой протекции.

7. С целью исследования перспективности использования в составе многокомпонентной субъединичной вакцины изучить иммуногенные и протективные свойства Rpf-подобных белков из М. tuberculosis.

Научная новизна

• Впервые в мировой практике продемонстрировано ^ антипротективное влияние индивидуального белка М. / tuberculosis (АГ19) на результат противотуберкулезной вакцинации. При этом впервые показано, что АГ19 является фактором вирулентности М. tuberculosis. Установлено кроме того, что элиминация индивидуального белка М. tuberculosis — АГ19 — не улучшает протективных свойств классической вакцины BCG.

• Впервые проведено сравнительное исследование иммуногенности ряда белков раннего культурального фильтрата М. tuberculosis в комбинации с новым адъювантом. Показано, что как простая смесь из двух белков - АГ85В и ESAT6 - так и гибридная молекула на основе тех же белков способна эффективно защищать мышей от заражения вирулентной М. tuberculosis.

• Впервые изучены иммуногенные и иммунопротективные свойства Rpf-подобных белков из М. tuberculosis. Показано, что эта группа факторов, активирующая переход микобактерий из стадии латентной персистенции в фазу логарифмического роста, при введении мышам стимулирует развитие сильного гуморального и клеточного иммунного ответа, а также защищает животных от последующего заражения вирулентным штаммом микобактерий туберкулеза. Таким образом продемонстрирована перспективность включения подобных белков в новую субъединичную противотуберкулезную вакцину.

Практическая значимость. Создана эффективная экспериментальная модель скрининга вакцинных противотуберкулезных препаратов, которая может быть использована как для непосредственных испытаний новой вакцины, так и для предварительного тестирования ее отдельных компонентов. Проведенные с использованием данной модели исследования особенностей иммунного ответа мышей на отдельные белки М. tuberculosis показали, что не все иммунодоминантные антигены, даже стимулирующие ответ по типу 1, заслуживают включения в состав субъединичной вакцины. Напротив, некоторые из них могут обладать контрпротективным действием, и наличие их в вакцинном препарате строго противопоказано. На основании исследования вакцинных свойств белков раннего культурального фильтрата микобактерий, а также белков, синтезируемых микобактериями в латентной стадии роста, экспериментально обоснована возможность создания субъединичной вакцины, защищающей как против активной стадии заболевания, так и от возможной реактивации латентной инфекции.

Материалы диссертации используются в курсе лекций для аспирантов и ординаторов ЦНИИТ РАМН.

Апробация работы. Апробация диссертации состоялась 11 января 2005 года на научной конференции отдела иммунологии ЦНИИТ РАМН. Материалы диссертации были доложены на: 13-м Европейском Съезде Иммунологов (Амстердам, 1997), Иммунологической конференции памяти М.М. Авербаха (Москва, 1998), 4-ой и 5-ой школах им. Джона Хамфри (Пущино, 1998, 2000), 11 Международном Иммунологическом Конгрессе (Стокгольм, 2001), конференции: ИЛ-13 и родственный факторы при воспалении и болезни (Кейптаун, 2003).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 20 печатных работ. Структура и объем работы.

Заключение диссертации по теме «Аллергология и иммулология», Еремеев, Владимир Витальевич

выводы

1. Рекомбинантный АГ19 М. tuberculosis, экспрессированный в М. vaccae либо введенный непосредственно в мышечную ткань в виде ДНК-вакцины, стимулирует у мышей иммунный ответ по типу Т-хелперов 1, выражающийся в преимущественной продукции ИФНу и специфических антител класса IgG2a.

2. Несмотря на иммунодоминантность, АГ19, встроенный в М. vaccae или М. smegmatis, не усиливает, а подавляет иммуногенность и вакцинные свойства этих непатогенных микобактерий.

3. Показано, что удаление кодирующего АГ19 гена из М. bovis BCG не влияет существенным образом на протективные свойства вакцины в модели туберкулеза у мышей.

4. Удаление АГ19 из М. tuberculosis приводит к снижению способности модифицированной бактерии размножаться в тканях инфицированных мышей, и к увеличению срока выживаемости животных после заражения. Тем самым показано, что кодирующий АГ19 ген является геном вирулентности М. tuberculosis.

5. Установлено, что комбинация двух белков раннего культурального фильтрата, а именно АГ85В и ESAT-6, в сочетании с двухкомпонентным адъювантом MPL/DDA более эффективно защищает мышей от туберкулеза, чем каждый из этих белков по отдельности. При этом по эффективности комбинированная вакцина сравнима с вакциной BCG.

6. Продемонстрировано, что Rpf-подобные белки микобактерий эффективно индуцируют гуморальный и клеточный иммунный ответ у мышей, что позволяет квалифицировать их как иммунодоминантные антигены М. tuberculosis.

7. Вакцинация мышей рекомбинантными Rpf-подобными белками защищает их от последующего заражения вирулентными бактериями туберкулеза. Тем самым, учитывая предполагаемую способность этих белков активировать переход микобактерий из дормантного состояния в фазу логарифмического роста, они представляют несомненный интерес в качестве компонентов субъединичной противотуберкулезной вакцины.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проведенных исследований продемонстрирована высокая иммуногенность АГ19. При этом применение различного типа адъювантов позволяет модулировать специфический анти-АГ19 иммунный ответ в желаемом направлении. Так, иммунизация плазмидной ДНК АГ19, смесью АГ19 и М. vaccae, а также рекомбинантной М. vaccae, экспрессирующей АГ19, приводит к преимущественному развитию иммунного ответа по типу 1. В то же время применение белка в неполном адъюванте Фрейнда ведет к преобладанию ответа типа 2. Однако, само по себе наличие иммунного ответа по типу 1 или по типу 2 на микобактериальный белок не гарантирует защиту мышей от заражения М. tuberculosis. В разделе 3.2.3 собственных исследований и в Таблице 1 показано, что ни иммунизация АГ19 в НАФ (иммунный ответ по типу 2), ни ДНК-вакцинация (иммунный ответ по типу 1) не защищают мышей от инфекции. Более того, экспрессия рекомбинантного АГ19 в М. vaccae отменяет слабую протекцию, индуцируемую самой микобактерией. При этом «антипротективный» эффект АГ19 не зависит от использованной конструкции (плазмида или космида) или бактериального вектора {М. vaccae или М. smegmatis). Не исчезает данный эффект и при замене убитой нагреванием рекомбинантной вакцины на живую. Тем самым, особенности процессинга АГ19 и длительность его персистенции в организме мыши, по-видимому, не оказывают существенного влияния на способность этого белка препятствовать проявлению защитных качеств вакцины.

Судя по всему, в основе описываемого эффекта лежит обнаруженная нами (супрессия реакции ГЗТ) и другими авторами (ингибиция экспрессии молекул МНС класса II, а также экспрессии ряда генов и белков инициируемого ИФНу каскада) способность АГ19 подавлять иммунный ответ на другие белки микобактерий. Представляется вероятным, что продемонстрированная нами в данном исследовании, а также другими авторами [Lathigra et al., 1996], роль АГ19 как фактора вирулентности М. tuberculosis связана именно с этой его способностью влиять на иммунный ответ хозяина. В то же время, дополнительная экспрессия АГ19 в BCG не оказывает влияния на ее протективные свойства у мышей и не приводит к повышению вирулентности вакцинного штамма. По-видимому, возможности модификации длительное время адаптировавшейся вакцины BCG путем манипуляций с одним из приблизительно четырех тысяч экспрессируемых BCG белков достаточно ограничены. Данная гипотеза подкрепляется и неудачей нашей попытки улучшения протективных свойств вакцины BCG за счет удаления гена АГ19. Вероятно, другие входящие в состав микобактерии липопротеины, такие, например, как описанный Avi-Hai Hovav и соавторами [2003] липопротеин с мол.м. 27 кД, обладающий сходным с АГ19 «антипротективным» действием, способны компенсировать отсутствие АГ19 в вакцине. В связи с этим представляет интерес изучение протективных свойств двойного нокаута — BCG, не экспрессирующей ни АГ19 ни белок с мол.м. 27 кД.

В проведенных нами исследованиях получила подтверждение гипотеза о перспективности включения белковых компонентов раннего культурального фильтрата микобактерий в состав противотуберкулезных вакцин нового поколения. Важным с нашей точки зрения результатом является продемонстрированное выше усиление протективных свойств вакцины при включении в ее состав двух белков - компонентов раннего культурального фильтрата, а именно - АГ85В и ESAT-6. По данным высеваемости микобактерий из легких, смесь этих белков или составленная из них гибридная молекула по своим протективным свойствам не уступают вакцине BCG. Интересно отметить, что данное направление получило дальнейшее развитие в только что опубликованной работе Avi-Hai Hovav и соавт. [2005]. В их руках мультивалентная вакцина на основе 6 рекомбинантных микобактериальных антигенов (АГ85В, 38кДа, ESAT-6, CFP21, Mtb8.4 и 16кДа) в сочетании с адъювантом Ribi и ИФНу по данным высеваемости микобактерий из легких и селезенок мышей Balb/c не уступала, а в некоторых экспериментах превосходила вакцину BCG. Любопытно, что при анализе иммунного ответа мышей на индивидуальные компоненты вакцины оказалось что АГ85В, 38кДа, CFP21 и Mtb8.4 ведут себя как иммунодоминантные антигены, а ответ на16кДа и ESAT-6 - слабый. В то же время по нашим данным, и по результатам, опубликованным группой Питера Андерсена (Statens Serum Institut, Копенгаген, Дания), ESAT-6 принадлежит к иммунодоминантным антигенам микобактерии туберкулеза. По-видимому, при применении мультивалентной вакцины Avi-Hai Hovav и соавт. имеет место конкуренция между отдельными эпитопами за сайты связывания. Тем самым, при отборе кандидатов для включения в состав субъединичных противотуберкулезных вакцин нового поколения необходимо не только избегать включения белков, обладающих «антипротективным» действием (подобно АГ19кД и 27кД), но и учитывать возможность конкуренции между отдельными «протективными» антигенами. Эта ситуация дополнительно осложняется тем, что для различных гаплотипов главного комплекса гистосовместимости межэпитопная конкуренция может носить разный характер. Поэтому окончательное заключение об эффективности новой вакцины можно дать лишь после проведения широкомасштабных клинических испытаний.

Одной из важнейших задач новой противотуберкулезной вакцины является генерация защиты взрослого населения от реактивации туберкулезного процесса. В связи с этим существенное значение имеет продемонстрированная нами способность Преподобных белков индуцировать клеточный и гуморальный иммунный ответ у мышей и защищать животных от заражения вирулентной микобактерией туберкулеза.

Список литературы диссертационного исследования доктор медицинских наук Еремеев, Владимир Витальевич, 2005 год

1. Еремеев В.В., Майоров К.Б., Авдиенко В.Г., Кондратов С.И., Апт A.C. Экспериментальное исследование возможности использования Mycobacterium smegmatis в качестве вектора для разработки новой противотуберкулезной вакцины. Пробл. Туб., №1, 1996, с. 49.

2. Abou-Zeid С, Gares М-Р, Inwald J et al. Induction of a type 1 immune response to a recombinant antigen from Mycobacterium tuberculosis expressed in Mycobacterium vaccae. Infect Immun, 1997, 65:1856-1862.

3. Andersen P. Effective vaccination of mice against Mycobacterium tuberculosis infection with a soluble mixture of secreted mycobacterial proteins. Infect. Immun., 1994, 62:2536-2544.

4. Apt AS, Avdienko VG, Nikonenko BV, Moroz AM, Skamene E. Distinct H-2 complex control of mortality, and immune responses to tuberculosis infection in virgin and BCG-vaccinated mice. Clin Exp Immunol 1993; 94:322-329.

5. Attanasio R, Pehler К & Mcclure HM. Immunogenicity and safety of Mycobacterium tuberculosis culture filtrate proteins in non-human primates. Clin. Exp. Immunol., 2000, 119:84-91.

6. Avi-Hai Hovav, Jacob Mullerad, Liuba Davidovitch, et al. The Mycobacterium tuberculosis recombinant 27-kilodalton lipoprotein induces a strong Thl-type immune response deleterious to protection. Infect. Immun., 2003, 71:3146-3154.

7. Avi-Hai Hovav, Yolanta Fishman, and Herve Bercovier.Gamma interferon and monophosphoryl lipid A-trehalose dicornomycolate are efficient adjuvants for Mycobacterium tuberculosis multivalent acellular vaccine. Infect. Immun., 2005, 73:250-257.

8. Baldwin S.L. et al. Evaluation of new vaccines in the mouse and guinea pig model of tuberculosis. Infect. Immun., 1998 66:2951-2959.

9. Baldwin SL and Orme IM. Unpublished observations.

10. Baldwin SL, D'Souza CD, Orme IM, et al. Immunogenicity and protective efficacy of DNA vaccines encoding secreted and non-secreted forms of Mycobacterium tuberculosis Ag85A. Tuber. Lung. Dis., 1999, 79:251-259.

11. Behr MA, Wilson MA, Gill WP, et al. Comparative genomics of BCG vaccines by whole-genome DNA microarray. Science, 1999, 284:1520-1523.

12. Berthet FX, Lagranderie M, Gounon P, et al. Attenuation of virulence by disruption of the Mycobacterium tuberculosis erp gene. Science, 1998, 282:759-762.

13. Bomford R. Will adjuvants be needed for vaccines of the future? Dev. Biol. Stand., 1998, 92:13-17.

14. Boyle JS, Brady JL, Lew AM. Enhanced responses to a DNA vaccine encoding a fusion antigen that is directed to sites of immune induction. Nature, 1998,392:408-410.

15. Brandt L, Elhay M, Rosenkrands I, Lindblad EB, Andersen P. ESAT-6 subunit vaccination against Mycobacterium tuberculosis. Infect. Immun. 2000; 68:791-795.

16. Brandt, L., T. Oettinger, A. Holm, and P. Andersen. Key epitopes on the ESAT-6 antigen recognized in mice during the recall of protective immunity to Mycobacterium tuberculosis. J. Immunol. 1996. 157:3527-3533.

17. Brewer TF, Colditz GA. Relationship between Bacille Calmette-Guerin strains and the efficacy of BCG vaccine in the prevention of tuberculosis. Clin Infect Dis 1995;20:126-35.

18. Brightbill HD, Libraty DH, Krutzil SR, et al. Host defense mechanisms triggered by microbial lipoproteins through Toll-like receptors. Science, 1999, 285:732.

19. Brosch R, Gordon SV, Brillaut A et al. Use of Mycobacterium tuberculosis H37Rv bacterial chromosome library for genome mapping, sequencing, and comparative genomics. Infect. Immun. 1998, 66:2221-2229.

20. Calmette A, Guerin C, Negre L & Bocquet A. Sur la vaccination preventive des enfants nouveau-nes contre la tuberculose par le BCG. Ann. Inst. Pasteur, 1927,3:201.

21. Cano, C. A. 1999. The multi-epitope polypeptide approach in HIV-1 vaccine development. Genet. Anal. 15:149.

22. Cole ST, Brosch R, Parkhill J et al. Deciphering the biology of Mycobacterium tuberculosis from the complete genome sequence. Nature 1998;393:537-44.

23. Cole ST. Learning from the genome sequence of Mycobacterium tuberculosis H37Rv. FEBS Lett., 1999,452:7-10.

24. Collins ME, Patki A, Wall S, et al. Cloning and characterization of the gene for the "19 kDa" antigen of Mycobacterium bovis. J. Gen. Microbiol., 1990, 136:1429-1436.

25. Connel ND, Medina-Acosta E, McMaster, et al. Effective immunization against cutaneous leishmaniasis with recombinant bacille Calmette-Guerin expressing Leishmania surface proteinase gp63. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1993,90:11473-11477.

26. Conradt P, Hess J and Kaufmann SHE. Cytolitic T-cell responses to human dendritic cells and macrophages infected with Mycobacterium bovis BCG and recombinant BCG secreting listeriolysin. Microbes Inf., 1999, 1:753-764.

27. Corlan E, Marica C, Macavei C, Stanford JL, Stanford CA. Immunotherapy with Mycobacterium vaccae in the treatment of tuberculosis in Romania. 1. Newly diagnosed pulmonary disease. Respir. Med., 1997, 91:13{PRIVATE "TYPE=PICT;ALT=a€«"}9.

28. Corlan E, Marica C, Macavei C, Stanford JL, Stanford CA. Immunotherapy with Mycobacterium vaccae in the treatment of tuberculosis in Romania. 2.

29. Chronic or relapsed disease. Respir. Med., 1997, 91:21 {PRIVATE "TYPE=PICT;ALT=a€«"}

30. Del-Val, M., H. J. Schlicht, T. Ruppert, M. J. Reddehase, and U. H. Koszinowski. 1991. Efficient processing of an antigenic sequence for presentation by MHC class I molecules depends on its neighboring residues in the protein. Cell 66:1145.

31. Demangel C, Bean AGD, Martin E et al. Protection against aerosol Mycobacterium tuberculosis infection using Mycobacterium bovis Bacillus Calmette Guerin-infected dendritic cells. Eur. J. Immunol., 1999, 29:19721979.

32. Dillon DC. Molecular characterization and human T-cell responses to a member of a novel Mycobacterium tuberculosis mtb39 gene family. Inf. Immun., 1999,67:2941-2950.

33. Donnelly JJ, Ulmer JB, Shiver JW, Liu MA. DNA vaccines. Ann. Rev. Immunol., 1997, 15:617-648.

34. Druilhe, R., P. Hagan, and G. A. W. Rook. 2002. The importance of models of infection in the study of disease resistance. Trends Microbiol. 10:S38-S46.

35. Durban Immunotherapy Group. Immunotherapy with Mycobacterium vaccae in patients with newly diagnosed pulmonary tuberculosis: a randomised controlled trial. Lancet, 1999, 354:116.{PRIVATE "TYPE=PICT;ALT=a€«"}

36. Elhay, M., and P. Andersen. 1997. Immunological requirements for a subunit vaccine against tuberculosis. Immunol. Cell Biol. 75:595-603.

37. Erb KJ, Kirman J, Woodfield L et al. Identification of potential CD8+ T-cell epitopes of the 19 kDa and AphC proteins from Mycobacterium tuberculosis.

38. No evidence for CD8+ T-cell priming against the identified peptides after DNA-vaccination of mice. Vaccine 1998; 16:692-697.

39. Faith A, Moreno C, Lathigra R, et al. Analysis of human T-cell epitopes in the 19,000 MW antigen of Mycobacterium tuberculosis: influence of HLA-DR. Immunology, 1991, 74:1-7.

40. Fearon DT, Locksley RM. The instructive role of innate immunity in the aquired immune response. Science, 1996, 272:50-54.

41. Feltquate DM, Heaney S, Webster RG, Robinson HL. Different T helper cell types and antibody isotypes generated by saline and gene gun DNA immunization. J. Immunol, 1997, 158:2278-2284.

42. Fine PE. Vaccines, genes and trials. Novartis Found Symp 1998; 217:57-69; discussion 69-72.

43. Fine PE. Variation in protection by BCG: Implications of and for heterologous immunity. Lancet, 1995, 346:1339-1345.

44. Flynn JL, Chan J, Triebold KJ, et al. An essential role for interferon y in resistance to Mycobacterium tuberculosis infection. J. Exp. Med., 1993, 178:2249-2254.

45. Freidag BL, Melton GB, Collins F, et al. CpG oligodeoxynucleotides and IL-12 improve the efficacy of BCG vaccination in mice challenged with Mycobacterium tuberculosis. Infect Immun, 2000, 68: 2948-2953.

46. Gallucci S, Lolkema M, Matzinger P. Natural adjuvants: endogenous activators of dendritic cells. Nat. Med., 1999, 5:1249-1255.

47. Garbe T, Harris D, Vordermeier M, et al. Expression of the Mycobacterium tuberculosis 19-kilodalton antigen in Mycobacterium smegmatis:immunological analysis and evidence of glycosylation. Infect. Immun., 1993, 61:260-267.

48. Garbe TR, Barathi J, Barnini S, et al. Transformation of mycobacterial species using hygromycin resistance as selectable marker. Mycrobiology, 1994, 140:133-138.

49. Good MF, Zevering Y, Currier J, and Bilsborough. "Original antigenic sin", T cell memory, and malaria sporozoite immunity: an hypothesis for immune evasion. Parasite Immunol. 1993; 15:187-193.

50. Gordon SV, Brosch R, Billault A, Gamier T, Eiglmeier K, Cole ST. Identification of variable regions in the genomes of tubercle bacilli using bacterial artificial chromosome arrays. Mol Microbiol 1999;32: 643-55.

51. Griffith AS. The cultural characters and pathogenicity for some laboratory animals of the vole strain of acid-fast bacillus. J Hyg (Lond) 1942; 42:527-31.

52. Guleria I, Teitelbaum R, McAdam RA, et al. Auxotrophic vaccines for tuberculosis. Nature Med., 1996, 2:334-337.

53. Hart PDA, Sutherland I. BCG and vole bacillus vaccines in the prevention of tuberculosis in adolescence and early adult life. Br Med J 1977; 2:293-5.

54. Hernandez-Pando R and Rook GAW. The role of TNF-a in T-cell mediated inflammation depends on the TH1/TH2 cytokine balance. Immunology, 1994, 82:591-595.

55. Herrmann J, O'Gaora P, Gallagher A, Thole J, Young D. Bacterial glycoproteins: a link between glycosylation and proteolytic cleavage of a 19 kDa antigen from Mycobacterium tuberculosis. EMBO J., 1996, 15:3547.

56. Hess J and Kaufmann SHE. Live antigen carriers as tools for improved antituberculosis vaccines. FEMS Immunol. Med. Microbiol., 1999, 23:165-173.

57. Hess J. and Kaufmann SHE. Vaccination strategies against intracellular microbes. FEMS Microbiol. Immunol., 1993, 7:95-103.

58. Horwitz MA, Harth G. A new vaccine against tuberculosis affords greater survival after challenge than the current vaccine in the guinea pig model of pulmonary tuberculosis. Inf. Immun., 2003, 71: 1672-1679.

59. Horwitz, M. A., B. W. Lee, B. J. Dillon, and G. Harth. Protective immunity against tuberculosis induced by vaccination with major extracellular proteins of Mycobacterium tuberculosis. Proc. Natl. Acad. Sci. 1995. USA 92:15301534.

60. Huebner RE. BCG vaccination in the control of tuberculosis. Curr. Top. Microbiol., 1996,215:263-282.

61. Hunt, J. D., L. E. Brown, P. R. Wood, D. J. Stewart, and D. C. Jackson. 1996. Manipulation of the helper T cell response to influence antigenic competition occurring with a multivalent vaccine. Immunol. Cell Biol. 74:81.

62. Huygen K, Content J, Denis O et al. Immunogenicity and protective efficacy of a tuberculosis DNA vaccine. Nature Medicine, 1996, 2:893-898.

63. Huygen K, Content J, Denis O et al. Immunogenicity and protective efficacy of a tuberculosis DNA vaccine. Nature Med 1996; 2:893-898.

64. Huygen K. DNA vaccines: application to tuberculosis. Int. J. Tuberc. Lung Dis., 1998,2:971-978.

65. Jackson M, Phalen SW, Lagranderie M et al. Persistence and protective efficacy of a Mycobacterium tuberculosis auxotroph vaccine. Infect. Immun. 1999, 67:2867-2873.

66. Jacobs DM. Immunomodulatory effects of bacterial lipopolysaccharide. J. Immunopharmacol. 1981;3:119-132.

67. Janeway C. Immunogenicity signals 1, 2, 3 and 0. Immunol. Today, 1989, 10:283-286.

68. Janeway CA Jr, Goodnow HG, Medzhitov R. Immunological tolerance: danger pathogen on the premises! Curr. Biol., 1996, 6:519-522.

69. Johnson JL, Kamya RM, Okwera A et al. Randomized controlled trial of Mycobacterium vaccae immunotherapy in non-human immunodeficiency virus-infected Ugandan adults with newly diagnosed pulmonary tuberculosis. J. Infect. Dis., 2000, 181:1304-1312.

70. Kamath AT, Feng CG, Macdonald M et al. Differential protective efficacy of DNA vaccines expressing secreted proteins of Mycobacterium tuberculosis. Infect. Immun., 1999, 67:1702-1707.

71. Kim JJ, Bagarazzi ML, Trivedy N et al. Engineering of in vivo immune responses to DNA immunization via codelivery of costimulatory molecule genes. Nature Biotechnology, 1997, 15:641-646.

72. Klinman DM, Yi A-K, Beaucage SL, et al. CpG motifs present in bacterial DNA rapidly induce lymphocytes to secrete IL-6, IL-12 and IFN-y. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1996, 93:2879-2883.

73. Ladel CH, Blum C, Dreher A, et al. Protective role of gamma/delta T cells and alpha/beta T cells in tuberculosis. Eur. J. Immunol., 1995, 25:2877-2881.

74. Lagranderie MRR, Balazuc AM, Deriaud E, Leclerc CD, Gheorghiu M. Comparison of immune responses of mice immunized with five different Mycobacterium bovis BCG vaccine strains. Infect Immun 1996;64:1-9.

75. Langermann S, Palaszynski S, Sadziene A, et al. Systemic and mucosal immunity induced by BCG vector expressing outer-surface protein A of Borrelia burgdorfery. Nature, 1994, 372:552-555.

76. Lathigra R, Zhang Y, Hill M, et al. Lack of production of the 19kDa glycoprotein in certain strains of Mycobacterium tuberculosis. Res. Microbiol., 1996, 147:237-249.

77. Lefevre P, Braibant M, De Wit L, et al. Three different putative transport receptors are encoded by the M. tuberculosis genome and are present at the surface of M. bovis BCG. J. Bacterid., 1997, 179:2900-2906.

78. Lefevre P, Olivier D, De Wit L, et al. Cloning of the gene encoding a 22-kilodalton cell surface anrigen of Mycobacterium bovis BCG and analysis of its potential for DNA vaccination against tuberculosis. Infect. Immun., 2000, 68:1040-1047.

79. Lindblad, E. B„ M. J. Elhay, R. Silva, R. Appelberg, and P. Andersen. 1997. Adjuvant modulation of immune responses to tuberculosis subunit vaccines. Infect. Immun. 65:623-629.

80. London, C. A., V. L. Perez, and A. K. Abbas. 1999. Functional characteristics and survival requirements of memory CD+ T lymphocytes in vivo. J. Immunol. 162:766.

81. Londono, J. A., H. Gras-Masse, C. Dubeaux, A. Tartar, and P. Druilhe. 1990. Secondary structure and immunogenicity of hybrid synthetic peptides derivedfrom two Plasmodium falciparum pre-erythrocytic antigens. J. Immunol. 145:1557.

82. Lowrie DB, Silva CL, Colston MJ et al. Protection against tuberculosis by plasmid DNA vaccine. Vaccine, 1997, 15:834-837.

83. Lowrie DB, TasconRE, BonatoVLD, etal. Therapy of tuberculosis in mice by DNA vaccination. Nature, 1999, 400: 269-271.

84. Maharias GG, Sabo PJ, Hickey MJ et al. Molecular analysis of genetic differences between Mycobacterium bovis BCG and virulent M. bovis. J. Bacteriol. 1996, 178:1274-1282.

85. Manabe YC, Scott CP, Bishai WR. Naturally attenuated, orally administered Mycobacterium microti as a tuberculosis vaccine is better than subcutaneus Mycobacterium bovis BCG. Infect. Immun., 2002, 70:1566-1570.

86. McAdam RA, Weisbrod TR, Martin J, et al. In vivo growth characteristics of leucine and methionine auxotrophic mutants of Mycobacterium bovis BCG generated by transposon mutagenesis. Infect. Immun., 1995, 63:1004-1012.

87. McMurray D, личное сообщение.

88. Mollenkopf, H. J., D. Groine-Triebkorn, P. Andersen, J. Hess, and S. H. Kaufmann. 2001. Protective efficacy against tuberculosis of ESAT-6 secreted by a live Salmonella typhimurium vaccine carrier strain and expressed by naked DNA. Vaccine 19:4028.

89. Mossman TR and Sad S. The expanding universe of T cell subsets: TH1, TH2 and more. Immunol. Today, 1996, 17:138-146.

90. Mostowy S, Tsolaki AG, Small PM, Behr MA. The in vitro evolution of BCG vaccines. Vaccine, 2003, 21: 4270-4274.

91. Mukamolova, G. V., O. A. Turapov, K. A. Kazarian, M. Telkov, A. S. Kaprelyants, D. B. Kell, and M. Young. 2002. The rpf gene of Micrococcus luteus encodes an essential secreted growth factor. Mol. Microbiol. 46:611621.

92. Murray PJ, Aldovini A & Young RA. Manipulation and potentiation of antimycobacterial immunity using recombinant bacille Calmette-Guerin strains that secrete cytokines. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, 93:934-939.

93. Mustafa Abu S, Al-Attiyah R. Tuberculosis: looking beyond BCG vaccines. J Postgrad Med serial online. 2003 [cited 2004 Apr 28 ];49:134-140.

94. Nair J, Rouse DA and Morris SL. Nucleotide sequence analysis and serologic characterization of thr Mycobacterium intracellular homologue of the Mycobacterium tuberculosis 19 kDa antigen. Mol. Microbiol., 1992, 6:14311439.

95. Nikonenko BV, Apt AS, Mezhlumova MB et al. Influence of the mouse Beg, Tbc-1 and xid genes on resistance and immune responses to tuberculosis infection and efficacy of BCG vaccination. Clin Exp Immunol 1996; 104:3743.

96. Nikonenko, B. V., M. M. Averbakh, Jr., C. Lavebratt, E. Schurr, and A. S. Apt. 2000. Comparative analysis of mycobacterial infections in susceptible I/St and resistant A/Sn inbred mice. Tuber. Lung. Dis. 80:15.

97. Noss EH, Pai RK, Sellati TJ et al. Toll-like receptor 2-dependent inhibition of macrophage class II MHC expression and antigen processing by 19-kDa lipoprotein of Mycobacterium tuberculosis. J. Immunol, 2001, 167:910-918.

98. Olsen AW, Williams A, Okkels LM, Hatch G, Andersen P. Protective effect of a tuberculosis subunit vaccine based on a fusion of antigen 85B and ESAT-6 in the aerosol guinea pig model. Infect. Immun., 2004, 72:6148-6150.

99. Olsen, A. W., L. A. H. van Pinxteren, L. M. Okkels, P. B. Rasmussen, and P. Andersen. 2001. Protection of mice with a tuberculosis subunit vaccine based on a fusion protein of Antigen 85B and ESAT-6. Infect. Immun. 69:2773.

100. Orme I.M. The immunopathogenesis of tuberculosis: a new working hypothesis. Trends Microbiol., 1998, 6:94-97.

101. Orme IM, Andersen P and Boom WH. T cell response to Mycobacterium tuberculosis. J. Infect. Dis., 1993, 167: 1481-1497.

102. Orme, I. M., D. N. McMurray, and J. T. Belisle. 2001. Tuberculosis vaccine development: recent progress. Trends Microbiol. 9:115-118.

103. Orme, I., and A. M. Cooper. 1999. Cytokine/chemokine cascades in immunity to tuberculosis. Immunol. Today 20:307-312.

104. Oukka M, Manuguerra JC, Livaditis N, et al. Protection against lethal viral infection by vaccination with nonimmunodominant peptides. J. Immunol. 1996; 157:3039-3045.

105. Pai RK, Convery M, Hamilton TA, Boom WH, Harding CV. Inhibition of IFN-gamma-induced class II transactivator expression by a 19-kDa lipoprotein from Mycobacterium tuberculosis: a potential mechanism for immune evasion. J.Immunol., 2003, 171:175-184.

106. Pal PG & Horwitz MA. Immunization with extracellular proteins of Mycobacterium tuberculosis induces cell-mediated immune responses and substantial protective immunity in guinea pig model of pulmonary tuberculosis. Infect. Immun., 1992, 60:4781-4792.

107. Parish CR, O'Neil ER. Dependence of the adaptive immune response on innate immunity. Some questions answered but new paradoxes emerge. Immunol. Cell. Biol., 1997, 75:523-527.

108. Partidos, C. D., C. M. Stanley, and M. W. Steward. 1991. Immune responses in mice following immunization with chimeric synthetic peptides representing B and T cell epitopes of measles virus proteins. J. Gen. Virol. 72:1293.

109. Pelicic V, Jackson M, Reyrat JM et al. Efficient allelic exchange and transposon mutagenesis in Mycobacterium tuberculosis. PNAS USA, 1997, 94:10955-10960.

110. Pennisi E. Teetering on the brink of danger. Science, 1996, 271:1665-1667.

111. Perkins, D. L., G. Berriz, T. Kamradt, J. A. Smith, and M. L. Gefter. 1991. Immunodominance: intramolecular competition between T cell epitopes. J. Immunol. 146:2137.

112. Post FA, Manca C, Neyrolles O, et al. Mycobacterium tuberculosis 19-kilodalton lipoprotein inhibits Mycobacterium smegmatis-induced cytokine production by human macrophages in vitro. Infect. Immun., 2001, 69:14331439.

113. Pym AS, Brodin P, Majlessi L, Brosch R, Demangel C, Williams A, Griffiths KE, Marchai G, Leclerc C, Cole ST. Recombinant BCG exporting ESAT-6 confers enhanced protection against tuberculosis. Nat. Med. 2003, 9:533-539.

114. Ria, F., B. M. Chan, M. T. Scherer, J. A. Smith, and M. L. Gefter. 1990. Immunological activity of covalently linked T-cell epitopes. Nature 343:381.

115. Ribi E, Meyer TJ, Azuma I et al. Biologically active components from mycobacterial cell walls. IV. Protection of mice against aerosol infection with virulent Mycobacterium tuberculosis. Cell. Immunol. 1975; 16:1-10.

116. Ridge JP, Fuchs EJ, Matzinger P. Neonatal tolerance revisited: turning on newborn T cells with dendritic cells. Science, 1996, 271:1723-1726.

117. Roberts AD, Sonnenberg MG, Ordway DJ, et al. Characteristics of protective immunity engendered by vaccination of mice with purified culture filtrate protein antigens of Mycobacterium tuberculosis. Immunology, 1995, 85:502508.

118. Roche, P. W., P. W. Peake, H. Billman-Jacobe, T. Doran, and W. J. Britton. T-cell determinants and antibody binding sites on the major mycobacterial secretory protein MPB59 of Mycobacterium bovis. Infect. Immun. 1994, 62:5319-5326.

119. Roche, P. W., P. W. Peake, H. Billman-Jacobe, T. Doran, and W. J. Britton. 1994. T-cell determinants and antibody binding sites on the major mycobacterial secretory protein MPB59 of Mycobacterium bovis. Infect. Immun. 62:5319-5326.

120. Romano M., Denis O., D'Souza S., et al. Induction of in vivo functional Db-restricted cytolytic T cell activity against a putative phosphate transport receptor of Mycobacterium tuberculosis. J. Immunol., 2004, 172:6913-6921.

121. Rook GAW and Hernandez-Pando R. The pathogenesis of tuberculosis. Annu. Rev. Microbiol., 1996, 50:259-284.

122. Rook GAW, Hernandez-Pando R. The pathogenesis of tuberculosis. Annu. Rev. Microbiol., 1996, 50:259-84.

123. Schaible UE, Collins HL and Kaufmann SHE. Confrontation between intracellular bacteria and the immune system. Advances in Immunology, 1999, 71:267-377.

124. Schijns V. Immunological concepts of vaccine adjuvant activity. Immunol. Rev., 2000, 12:456-463.

125. Schluger, N. W., and W. N. Rom. 1998. The host immune response to tuberculosis. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 157:679-691.

126. Schmidt LH. Improving existing methods of control of tuberculosis a prime challenge to the experimentalist. The John Barnwell Lecture. Am. Rev. Respir. Dis., 1972, 105:183-205.

127. Singh, M., and D. O'Hagan. 1999. Advances in vaccine adjuvants. Nat. Biotechnol. 17:1075-1081.

128. Skjot RLV, Oettinger T, Rosenkrands I et al. Comparative evaluation of low-molecular-mass proteins from Mycobacterium tuberculosis identifies members of the ESAT-6 family as immunodominant T-cell antigens. Infect. Immun., 2000, 68:214-220.

129. Stanford JL, Bahr GM, Rook GAW, et al. Immunotherapy with Mycobacterium vaccae as an adjunct to chemotherapy in the treatment of pulmonary tuberculosis. Tubercle, 1990, 71:87. {PRIVATE "TYPE=PICT;ALT=a€«"}

130. Stanford JL, Rook GAW, Bahr GM. et al. Mycobacterium vaccae immunoprophylaxis and immunotherapy of leprosy and tuberculosis. Vaccine, 1990, 8:525-530.

131. Stanford JL. Improving on BCG. Apmis, 1991, 99:103-113.

132. Sula L, Radkovsky I. Protective effects of M. microti vaccine against tuberculosis. J Hyg Epidemiol Microbiol Immunol 1976; 20:1-6.

133. Svensson M, Stockinger B and Wick MJ. Bone-marrow derived dendritic cells can process bacteria for MHC-I and MHC-II presentation to T cells. J. Immunol., 1997, 158:4229-4236.

134. Tanghe A, Denis O, Lambrecht B, Motte V, et al. Tuberculosis DNA vaccine encoding Ag85A is immunogenic and protective when administered by intramuscular needle injection but not by epidermal gene gun bombardment. Infect. Immun., 2000, 68:3854-3860.

135. Tanghe A, Lefevre P, Denis O, et al. Immunogenicity and protective efficacy of tuberculosis DNA vaccines encoding putative phosphate transport receptors. J. Immunol., 1999, 162:1113-1119.

136. Tascon RE, Colston MJ, Ragno S et al. Vaccination against tuberculosis by DNA injection. Nature Med 1996; 2:888-892.

137. Tascon RE, Colston MJ, Ragno S et al. Vaccination against tuberculosis by DNA injection. Nature Medicine, 1996,2:888-892.

138. Tascon, R. E., M. J. Colston, S. Ragno, E. Stavropoulos, D. Gregory, and D. B. Lowrie. Vaccination against tuberculosis by DNA injection. Nat. Med. 1996.2:888-892.

139. Tighe H, Corr M, Roman M, Raz E. Gene vaccination: plasmid DNA is more than just a blueprint. Immunol. Today, 1998, 2:89-97.

140. Torres CAT, Iwasaki A, Barber BH, Robinson HL. Differential dependence on target site tissue for gene gun and intramuscular DNA immunizations. J. Immunol., 1997, 158:4529-4532.

141. Tuberculosis vaccine trials committee. B.C.G. and vole bacillus vaccines in the prevention of tuberculosis in adolescents. Br.Med.J., 1956, 1:413-427.

142. Villacres-Eriksson M, Behboudi S, Morgan AJ, et al. Immunomodulation by Quillaja saponaria adjuvant formulations: in vivo stimulation of interleukin-12 and its effects on the antibody response. Cytokine, 1997, 9:73-82.

143. Walsh GP, Tan EV, dela Cruz EC et al. The Philippine cynomolgus monkey (Macaca fasicularis) provides a new nonhuman primate model of tuberculosis that resembles human disease. Nature Med., 1996, 2:430-436.

144. Watson DL, Lovgren K, Watson WA, et al. Inflammatory response and antigen localization following immunization with influenza virus iscoms. Inflammation, 1989, 13:641-649.

145. Wells AQ and JAH Wylie. Vaccination against tuberculosis with the vole bacillus. Br.Med.Bull., 1954,10:96-100.

146. Wells AQ. The murine type of tubercle bacillus. Spec Rep Ser Med Res Counc(GB) 1946;259:1-42.

147. Wells AQ. Tuberculosis in wild voles. Lancet 1937; 1:1221.

148. World Health Organization. TB a global emergency. Geneva: World Health Organization, 1994.

149. World Health Organization. The World Health Report 1999: Making a Difference. 1999.

150. Wu, Q. L., D. Kong, K. Lam, and R. N. Husson. 1997. A mycobacterial extracytoplasmic function sigma factor involved in survival following stress. J. Bacteriol. 179:2922-2929.

151. Xiang Z, Ertl HCJ. Manipulation of the immune response to a plasmid-encoded viral antigen by coinoculation with plasmids expressing cytokines. Immunity, 1995,2:129-135.

152. Yeremeev V.V., Stewart G.R., Neyrolles O., Skrabal K., Avdienko V.G., Apt A.S., Young D.B. Deletion of the 19kDa antigen does not alter the protective efficacy of BCG. Tubercle and Lung Disease, 2000, 80:243-247.

153. Yeremeev VV, Lyadova IV, Nikonenko BV et al. The 19-kD antigen and protective immunity in a murine model of tuberculosis. Clin. Exp. Immunol. 2000; 120:274-279.

154. Zhu X, Venkataprasad N, Ivanyi J, Vordermeier HM. Vaccination with recombinant vaccinia viruses protects mice against Mycobacterium tuberculosis infection. Immunology 1997(b); 92:6-9.

155. Zhu X, Venkataprasad N, Thangaraj HS et al. Functions and specificity of T cells following nucleic acid vaccination of mice against Mycobacterium tuberculosis infection. J Immunol 1997(a); 158:5921-5926.