Иммунологические аспекты диагностики и прогноза течения возрастной макулярной дегенерации и диабетической ретинопатии тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.03.09, кандидат наук Марных Сергей Анатольевич

  • Марных Сергей Анатольевич
  • кандидат науккандидат наук
  • 2015, ФГАОУ ВО Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Министерства здравоохранения Российской Федерации (Сеченовский Университет)
  • Специальность ВАК РФ14.03.09
  • Количество страниц 106
Марных Сергей Анатольевич. Иммунологические аспекты диагностики и прогноза течения возрастной макулярной дегенерации и диабетической ретинопатии: дис. кандидат наук: 14.03.09 - Клиническая иммунология, аллергология. ФГАОУ ВО Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Министерства здравоохранения Российской Федерации (Сеченовский Университет). 2015. 106 с.

Оглавление диссертации кандидат наук Марных Сергей Анатольевич

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Патогенез диабетической ретинопатии

1.1. Роль хронического воспаления, полиольного пути, протеинкиназы С и ростовых факторов в развитии микрососудистых осложнений сахарного диабета

1.2. Иммунные механизмы патогенеза и иммунологические маркеры

прогрессирования диабетической ретинопатии

Глава 2. Иммунные механизмы возрастной макулярной

дегенерации

2.1. Основные факторы патогенеза возрастной макулярной дегенерации

2.2. Система комплемента и возрастная макулярная дегенерация

2.3. Роль паравоспаления в патогенезе возрастной макулярной дегенерации

2.4. Активация инфламмасом при возрастной макулярной дегенерации

2.5. Системные иммунологические маркеры прогрессирования возрастной

макулярной дегенерации

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Глава 1. Изменения системных иммунологических показателей у больных диабетической ретинопатией

1.1. Субпопуляционный состав лимфоцитов периферической крови больных диабетической ретинопатией

1.2. Концентрации ТЫ/ТЬ2/Тг1-цитокинов в сыворотке крови больных диабетической ретинопатией

ретинопатией

Глава 2. Изменения системных иммунологических показателей у больных возрастной макулярной дегенерацией

2.1. Субпопуляционный состав лимфоцитов периферической крови больных возрастной макулярной дегенерацией

2.2. Концентрации ТЫ/^2/Тг1-цитокинов в сыворотке крови больных возрастной макулярной дегенерацией

2.3. Уровень растворимых форм мембранных антигенов иммунокомпетентных клеток в сыворотке крови больных возрастной

макулярной дегенерацией

ОБСУЖДЕНИЕ

ВЫВОДЫ

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

ЛИТЕРАТУРА

ВМД - возрастная макулярная дегенерация

ДАГ - диацилглицерин

ДР - диабетическая ретинопатия

ИЛ - интерлейкин

ИФН - интерферон

МКА - моноклональные антитела

МПК - мононуклеары периферической крови

СД - сахарный диабет

ФНО - фактор некроза опухоли

ЦТЛ - цитотоксические Т-лимфоциты

AGE - конечные продукты гликирования

CRP - C-реактивный белок

FITC - флюоресцеинизотиоцианат

Flt-3L - лиганд Flt-3

HbAlc - гликированный гемоглобин

IGF-1 - инсулиноподобный ростовой фактор-1

IL-1Ra - антагонист рецептора интерлейкина-1

IP-10 - интерферон-гамма-индуцированный белок-10

MCP-1 - моноцитарный хемоаттрактантный белок-1

MIP-1 - макрофагальный воспалительный белок-1

NK - естественные киллеры

NKT - естественные киллерные Т-клетки

NLR - NOD-подобные рецепторы

PBS - фосфатно-солевой буфер

PE - фикоэритрин

PKC - протеинкиназа C

RANTES - хемокин, экспрессируемый и секретируемый T-клетками при активации

RAGE - рецепторы конечных продуктов гликирования sCD40L - растворимая формы лиганда CD40 sIL-2R - растворимая форма рецептора интерлейкина-2 SNP - единичный нуклеотидный полиморфизм Th - T-хелперы

TLR - Toll-подобные рецепторы

TNFR2 - рецептор-2 к фактору некроза опухоли

Tr1 - регуляторные Т-клетки, продуцирующие интрлейкин-10

Treg - регуляторные Т-клетки

VCAM-1 - молекула адгезии сосудистых клеток

VEGF - фактор роста эндотелия сосудов

Сахарный диабет (СД) и его осложнения стремительно врываются в ряд наиболее значимых причин заболеваемости и смертности в мире [Дедов И.И. и др. 2011; Дедов И.И., Шестакова М.В., 2003; Sayin N. et al, 2015]. Распространённость СД быстро растет как в развитых, так и развивающихся странах, и может достичь масштабов эпидемии в ближайшем будущем [Whiting D.R. et al, 2011]. Этим заболеванием страдает более 240 миллионов человек во всем мире, а к 2030 году это число, по прогнозам специалистов, достигнет 370 миллионов [International Diabetes Federation, 2011].

Одним из наиболее частых осложнений СД являются поражения глаз, такие как диабетическая ретинопатия (ДР), диабетическая папиллопатия, глаукома и катаракта [Threatt J. et al, 2013]. ДР является наиболее распространенным микрососудистым осложнением СД и постепенно трансформируется в основную причину слепоты у работающего населения [Дедов И.И., 2001; Aiello L.M., 2003]. Среди больных СД 1 и 2 типов с длительностью заболевания более двадцати лет распространенность ДР составляет 95% и 60%, соответственно [Garg S., Davis R.M., 2009]. Вместе с тем при СД 2 типа отмечают более высокий процент пациентов с потерей зрения [Kumari S. et al, 2008]. В течение 10 лет примерно у 64% людей с исходной ДР развиваются более тяжелые формы заболевания, а у 17% -пролиферативная ДР, при которой существенно увеличивается риск ухудшения зрения и слепоты [Klein R., 2008].

Патогенез ДР тесно связан с гипергликемией, которая запускает каскад

событий, ведущий к нарушению функции эндотелия сосудов и

нейродегенерации [Heng L.Z. et al, 2013]. В качестве важнейших механизмов

прогрессирования ДР рассматриваются неоваскуляризация, хроническое

окислительное повреждение, хроническое воспаление и лейкостаз [Tarr J.M.

et al, 2013]. Эти процессы связаны или, по крайней мере, сопровождаются не

только местными, но и системными иммунными расстройствами [Ahsan H.,

6

2015]. Достаточно четко описан ряд иммунопатологических событий, лежащих в основе развития пролиферативной ДР, в частности повышение внутриглазных концентраций ростовых факторов, растворимых форм молекул межклеточной адгезии, некоторых хемокинов и провоспалительных цитокинов [Chernykh V.V. et al, 2015; Jonas J.B. et al, 2010]. Однако информация о том, могут ли системные иммунологические показатели отражать неоангиогенез и нейродегенеративные процессы в сетчатке, крайне противоречива [Караулов А.В. и др., 2006; Караулов А.В. и др., 2008] и не позволяет выделить четкие критерии ранней диагностики и прогноза развития пролиферативной формы этого заболевания.

Рост средней продолжительности жизни неминуемо оказывает влияние на увеличение распространённости заболеваний, связанных с пожилым возрастом, в частности возрастной макулярной дегенерации (ВМД) [Khandhadia S. et al, 2012]. ВМД является одной из ведущих причин слепоты в развитых странах, уступая в этом отношении только катаракте и глаукоме и обусловливая 8,7% всех зарегистрированных случаев потери зрения [Resnikoff S. et al, 2004]. В настоящее время выделяют сухую и влажную формы ВМД [Cheung L.K., Eaton A., 2013]. Ключевыми событиями на ранних этапах этого заболевания являются накопление экстрацеллюлярных депозитов, так называемых друз, между мембраной Бруха и пигментным эпителием сетчатки и атрофия последнего, что соответствует сухой форме ВМД [Jager R.D. et al, 2008]. Появление участков хориоидальной неоваскуляризации, сопровождающееся экссудацией и расширением зоны поражения, характеризует развитие влажной формы ВМД, при которой многие патогенетические процессы становятся необратимыми [Zarbin M.A., 2004]. Достаточно большое число работ посвящено изучению иммунных механизмов патогенеза ВМД. Показано, что развитие влажной ВМД ассоциировано с повышением внутриглазных концентраций ряда хемокинов, растворимых форм молекул адгезии [Jonas J.B. et al, 2010], фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) [Ng E.W., Adamis A.P., 2005] и некоторых

7

провоспалительных цитокинов [Jonas J.B. et al, 2012]. Вместе с тем данные о системных иммунологических сдвигах, отражающих прогрессирование ВМД, менее однозначны [Караулов А.В. и др., 2007, Караулов А.В. и др., 2009].

VEGF рассматривается как основной ангиогенный регулятор хориоидальной неоваскуляризации [Leung D.W. et al, 1989] и важный фактор, увеличивающий проницаемость сосудов при ВМД [Keck P.J. et a!, 1989; Senger D.R. et al, 1990]. Успехи последних лет в лечении влажной формы заболевания связаны с внедрением в клиническую практику анти-VEGF-препаратов [Campa C., Harding S.P., 2011]. Однако эти средства имеют ограниченный потенциал в плане улучшения зрения пациентов. В этой связи выявление новых и уточнение раннее описанных иммунных механизмов прогрессирования ВМД имеет большое практическое значение и с точки зрения разработки патогенетически обоснованных методов лечения, обеспечивающих восстановление зрения [Ishikawa M., 2015].

В поиске критериев ранней диагностики пролиферативной ДР и влажной ВМД мы придерживались единого алгоритма, ориентируясь на наиболее важные и интегральные системные иммунологические показатели: иммунофенотип лимфоцитов, концентрации в сыворотке крови цитокинов, характеризующих функцию хелперных/регуляторных субпопуляций CD4+-клеток, а также растворимых форм мембранных антигенов иммунокомпетентных клеток.

Цель работы - установить особенности системных иммунологических сдвигов при разных формах диабетической ретинопатии у больных сахарным диабетом 2 типа и возрастной макулярной дегенерации для выявления лабораторных критериев прогрессирования этих глазных болезней.

Задачи исследования:

1) Изучить субпопуляционный состав лимфоцитов периферической крови у больных СД 2 типа с препролиферативной и пролиферативной диабетической ретинопатией.

2) Определить концентрации ТЫ/ТЬ2/Тг1-цитокинов в сыворотке крови у больных СД 2 типа с препролиферативной и пролиферативной диабетической ретинопатией.

3) Изучить уровень растворимых форм мембранных антигенов иммунокомпетентных клеток в сыворотке крови у больных СД 2 типа с разными формами диабетической ретинопатии.

4) Определить субпопуляционный состав лимфоцитов периферической крови больных сухой и влажной возрастной макулярной дегенерацией.

5) Изучить концентрации ТЫ/ТИ2/Тг1-цитокинов в сыворотке крови больных сухой и влажной возрастной макулярной дегенерацией.

6) Определить уровень растворимых форм мембранных антигенов иммунокомпетентных клеток в сыворотке крови пациентов с разными формами возрастной макулярной дегенерации.

7) Выявить дополнительные иммунологические критерии диагностики и прогноза развития пролиферативной диабетической ретинопатии и влажной формы возрастной макулярной дегенерации. Научна новизна

Модернизированы представления о характере изменений ряда системных иммунологических показателей при различных формах ДР у больных СД 2 типа и ВМД:

1) иммунофенотипа лимфоцитов периферической крови;

2) концентрации цитокинов, характеризующих функцию хелперных/регуляторных субпопуляций СВ4+-клеток, в сыворотке крови;

3) уровня растворимых форм мембранных антигенов иммунокомпетентных клеток в сыворотке крови.

Выявлены новые иммунологические критерии прогрессирования ДР: снижение в периферической крови числа СЭ25+-лимфоцитов, повышение количества СЭ95 - и -клеток, а также содержания бНЬЛ-1 и бСВ8 в

сыворотке крови.

Установлены новые иммунологические маркеры развития влажной ВМД: увеличение в периферической крови количества СЭ3+-, СЭ8+- и СВ38+-лимфоцитов, а также содержания бСВ25 и бСВ54. Практическая значимость работы

Практическая ценность работы состоит в формулировке четких рекомендаций по мониторингу системных иммунологических показателей у больных препролиферативной ДР для оптимизации раннего выявления прогрессирования заболевания с развитием его пролиферативной формы.

Кроме того, установлены наиболее информативные системные иммунологические критерии, дополняющие и облегчающие своевременную верификацию влажной формы ВМД, что имеет высокий потенциал для практического использования.

Работа имеет практическую ценность и в связи с тем, что ее результаты могут предопределить рациональный поиск эффективных средств патогенетической, в том числе специфической, иммунотерапии ДР и ВМД. Положения, выносимые на защиту:

1) В периферической крови больных ДР выявлены особенности субпопуляционного состава лимфоцитов, содержания хелперных/регуляторных цитокинов и растворимых форм мембранных антигенов, отражающие разные клинические фенотипы заболевания.

2) Установлены изменения иммунофенотипа лимфоцитов периферической крови, уровня ТЫ/ТЬ2/Тг1-цитокинов и растворимых форм мембранных антигенов, характерные для сухой и влажной ВМД.

3) Мониторинг ряда системных иммунологических показателей у больных препролиферативной ДР может использоваться для раннего выявления прогрессирования заболевания и прогноза развития его пролиферативной формы.

4) У больных сухой ВМД дополнительным предиктором прогрессирования заболевания с развитием его влажной формы является рост

в периферической крови количества СБ3+-, СБ8+- и СБ38+-лимфоцитов, а также содержания бСВ25 и бСВ54. Личный вклад автора

Автор лично сформулировал цель и задачи работы, подобрал адекватные методы для решения поставленных задач, провел анализ данных литературы по теме диссертации, выполнял клинико-инструментальные исследования и наблюдение за всеми включенными в работу пациентами, осуществлял отбор образцов крови, принимал непосредственное участие в изучении иммунофенотипа лимфоцитов периферической крови, а также содержания цитокинов и растворимых форм мембранных молекул, лично провел математическую обработку и интерпретацию результатов диссертационной работы, сформулировал выводы и практические рекомендации. Отдельные исследования проведены совместно с сотрудниками НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей Российского онкологического научного центра им. Н.Н.Блохина (г. Москва) и НИИ молекулярной биологии и региональной экологии Нижегородского государственного университета им. Н.И.Лобачевского (г. Нижний Новгород). Апробация работы

Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на на 10-й Научно-практической конференции «Актуальные проблемы офтальмологии» (Москва, 2007), Научно-практической конференции «Офтальмоиммунология: итоги и перспективы» (Москва, 2007), Юбилейной конференции КБ № 85 ФМБА России «60 лет в науке и практике» (Москва, 2008), 5-й Международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» (Москва, 2008), Всемирном форуме по иммунорегуляции (Давос, 2012), Всероссийской научно-практической конференции «Иммунопатология и иммунореабилитация: от теории к практике» (Пенза, 2015).

Апробация работы состоялась на совместном заседании кафедры

клинической иммунологии и аллергологии и кафедры микробиологии,

11

вирусологии и иммунологии ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М.Сеченова Минздрава России 13 мая 2015 года. Публикации по теме диссертации

По материалам диссертации опубликовано 13 работ, в том числе 6 статей в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК при Минобрнауки России.

Рекомендованный список диссертаций по специальности «Клиническая иммунология, аллергология», 14.03.09 шифр ВАК

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Иммунологические аспекты диагностики и прогноза течения возрастной макулярной дегенерации и диабетической ретинопатии»

Структура и объем работы

Диссертация состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований, обсуждение, выводы, практические рекомендации и список литературы. Список литературы содержит 36 отечественных и 103 иностранных источников. Материалы диссертации изложены на 106 страницах машинописного текста и включают 52 рисунка, 4 схемы и 3 таблицы.

1.1. Роль хронического воспаления, полиольного пути, протеинкиназы С и ростовых факторов в развитии микрососудистых осложнений

сахарного диабета

Воспаление играет ключевую роль в развитии микрососудистых осложнений СД, в том числе ДР [Nguyen D.V. et al, 2012]. При СД в различных биологических образцах пациентов выявляют высокий уровень провоспалительных цитокинов, таких как фактор некроза опухоли (ФНО) и ИЛ-6, и С-реактивного белка (CRP). При хронической гипергликемии цитокины проникают в ткани сосудов, подавляют их функцию и репаративные процессы.

Ожирение, являющееся основным фактором риска СД 2 типа, стимулирует воспаление за счет активации Toll-подобных рецепторов (TLR) и последующей выработки провоспалительных цитокинов и хемокинов [Беспалова И.Д. и др., 2013; Калюжин В.В. и др., 2013; Kwon E.Y. et al, 2012]. В этом плане белая жировая ткань не только служит депо энергетических запасов, но также продуцирует различные биологически активные факторы, так называемые адипокины, обладающие про- и противовоспалительной активностью. При ожирении многие адипокины, в том числе лептин, резистин и ФНО, образуются в избыточном количестве и поддерживают низкоуровневое хроническое воспаление [St^pien M. et al, 2014]. Известно, что некоторые продукты жировой ткани (ФНО и ИЛ-6) способствуют развитию резистентности к инсулину [Rajala M.W., Scherer P.E., 2003; Suganami T. et al, 2005]. Наоборот, выработка противовоспалительных адипокинов, таких как адипонектин, уменьшается с увеличением степени ожирения [Jackson M.B. et al, 2005]. Подчеркнем, что на ранних стадиях

13

роста объема жировой ткани выработка адипонектина может даже усиливаться, что отражается повышением поглощения глюкозы и выработки оксида азота. Однако дальнейшее прогрессирование ожирения сопровождается падением уровня адипонектина и приводит к осложнениям, наблюдаемым при СД 2 типа [Matsuzawa У., 2005].

Висцеральное ожирение в большей степени связано с метаболическими нарушениями и хроническим низкоуровневым воспалением, чем подкожное ожирение [Дедов И.И. и др., 2004; Осихов И.А. и др., 2013]. Это объясняется тем, что висцеральная жировая ткань более уязвима к потере иммунной регуляции и, следовательно, имеет больший потенциал приобретения провоспалительных функций. Инфильтрация тучными клетками и пропорциональное снижение числа регуляторных Т-клеток (Тге§) более выражены в висцеральной, чем подкожной жировой ткани лиц, страдающих ожирением [Нап 1.М., Levings М.К., 2013].

Некоторые механизмы, лежащие в основе развития хронического воспаления при ожирении, в том числе ведущем к СД 2 типа, детально описаны. В этом отношении доказана роль клеток-эффекторов как врожденного, так и адаптивного иммунитета.

Характерной чертой является накопление в жировой ткани макрофагов, причем преимущественно их провоспалительного М1 -подтипа, которые окружают адипоциты, образуя так называемые короноподобные структуры [Мигапо I., 2008]. Кроме того, жировая ткань инфильтрируется мастоцитами, дендритными клетками и нейтрофилами. Продукция последними эластазы вносит вклад в развитие воспаления и является непосредственной причиной резистентности к инсулину [Машиу-АиЬеГ: V. et а1, 2013].

В висцеральной жировой ткани также выявляется большое число В- и Т-лимфоцитов [ВеБипа I et а1, 2013]. При ожирении среди Т-клеток преобладают субпопуляции с провоспалительным фенотипом. СЭ4+- и СЭ8+-Т-клетки экспрессируют маркеры эффекторных клеток памяти и продуцируют большое количество ИФН-у. СЭ8+-Т-клетки, кроме того,

14

вырабатывают целый ряд хемокинов (CCL5, CXCL1 и др.), привлекающих макрофаги [Yang H. et al, 2010].

При увеличении объема жировой ткани происходят расстройства механизмов иммунорегуляции: снижение числа и функции ИЛ-10-продуцирующих М2-макрофагов, инвариантных NKT-клеток и CD4+Foxp3+ Treg-клеток [Han J.M., Levings M.K., 2013].

Схема 1. Общий путь прогрессирования диабетических микрососудистых

осложнений [Nguyen D.V. et al, 2012]

AGE-RAGE

Окислительный стресс

Гипоксия

i

Каскад воспалительных сигналов

Локальная активация провоспалительных цитокинов

i

Воспаление

i

Нефропатия

Ретинопатия

Неропатия

Ожирение также ассоциируется с гиперлипидемией, в частности с повышенными уровнями холестерина и триглицеридов, что также способствует хроническому воспалению. По одним данным гиперлипидемия стимулирует развитие ДР [Dodson P.M. et al, 1981]; по другим - четкой взаимосвязи между уровнем липидов в сыворотке и ДР не обнаружено [Chew E.Y. et al, 2010].

На фоне персистирующего метаболического синдрома и низкоуровневого воспаления, существенный вклад в развитие микрососудистых осложнений СД вносят окислительный стресс, гипоксия, образование конечных продуктов гликирования (AGE), дисбаланс AGE и их рецепторов (RAGE) [Иванникова Е.В. и др., 2013, Vincent A.M., 2011].

Nguyen D.V. и соавторы представили общую схему патогенеза диабетических микрососудистых осложнений (Схема 1.).

Несмотря на то, что многие интимные механизмы развития ДР остаются открытыми, в качестве связующих цепочек между гипергликемией и этим микрососудистым осложнением СД рассматриваются несколько биохимических путей, в том числе активация протеинкиназы C (РКС) и полиольного пути утилизации глюкозы, повышение экспрессии факторов роста (фактора роста эндотелия сосудов /VEGF/ и инсулиноподобного ростового фактора-1 /IGF-1/), активация ренин-ангиотензин-альдостероновой системы [Tarr J.M. et al, 2013].

Значение полиольного пути в патогенезе ДР представлено на Схеме 2.

Накопление сорбитола при активации этого пути утилизации глюкозы имеет несколько разрушительных последствий для клеток сетчатки, в том числе за счет их осмотического повреждения [Gabbay K.H., 1973]. Кроме того, еще один продукт полиольного пути - фруктоза - может фосфорилироваться с образованием фруктозо-3-фосфата, который в свою очередь трансформируется в 3-дезоксиглюкозон. Оба продукта превращения фруктозы являются сильными гликирующими агентами и увеличивают уровень AGE [Szwergold B.S. et al, 1990].

Альдозоредуктаза

Сорбидтолдегидрогеназа

Глюкоза

Сорбитол

NADPH NADP NAD NADH

Ф

РКС представляет собой семейство из 10 ферментов. С развитием ДР связывают pi/2-изоформу РКС. Этот фермент является серин-треониновой киназой, участвующей в трансдукции сигналов в ответ на специфические гормональные, нервные и ростовые стимулы. Гипергликемия приводит к увеличению утилизации глюкозы путем гликолиза, который, в свою очередь, увеличивает синтез de novo диацилглицерина (ДАГ) - ключевого активатора PKC [Wang Q.J., 2006]. В клинике и эксперименте установлено повышение экспрессии ДАГ и активации PKC при СД [Koya D., King G.L., 1998]. РКС является важной молекулой в регуляции многочисленных физиологических процессов. Активации этого фермента имеет каскадный стимулирующий эффект на нескольких других биологических путей, которые вызывают увеличение эндотелиальной проницаемости, расстройства гемодинамики в сетчатке, повышение экспрессии VEGF в сетчатке, а также активацию и

Схема 3. Протеинкиназа C в регуляции патофизиологических процессов при диабетической ретинопатии [Tarr J.M. et б1, 2013]

Синтез/экспансия белков экстрацеллюлярного матрикса

Лейкостаз

Активация и пролиферация эндотелиальных клеток

Проницаемость эндотелия

f

Ретинальный кровоток (гемодинамика)

Не вызывает сомнений роль ростовых факторов в развитии ДР. В этом отношении обсуждается патогенетическое значение IGF-1, эпидермального ростового фактора, ангиопоэтинов-1 и -2, трансформирующего ростового фактора-р2, тромбоцитарного ростового фактора, эритропоэтина и некоторых других факторов роста. Наибольшее внимание ученых привлекает VEGF, который вызывает нарушение гематоретинального барьера, стимулирует рост эндотелия и неоваскуляризацию, а также увеличивает проницаемость сосудов сетчатки [Wirostko B., 2008]. Признание патофизиологической роли этой молекулы отражается во внедрении анти-VEGF-препаратов в лечение ДР [Gupta N. et al., 2013, Cheung N. et al, 2014].

Однако значение VEGF и медиаторов воспаления на разных стадиях заболевания требует уточнения. Так, A.Blum и соавторы продемонстрировали, что у больных СД 2 типа без ДР или с непролиферативной ДР уровень VEGF, растворимой формы молекулы адгезии сосудистых клеток 1 (sVCAM-1) и С-реактивного белка, определяемого высокочувствительным методом, действительно выше, чем у здоровых доноров, но при развитии пролиферативной ДР содержание этих молекул снижается практически до нормальных значений [Blum A. et al, 2012].

Отсутствие линейной закономерности возрастания биомаркеров воспаления и ангиогенеза при прогрессировании заболевания, затрудняет их использование в диагностических и прогностических целях и говорит о необходимости дальнейшего поиска надежных лабораторных предикторов развития пролиферативной формы ретинопатии у больных СД 2 типа.

1.2. Иммунные механизмы патогенеза и иммунологические маркеры прогрессирования диабетической ретинопатии

Некоторые ключевые системные механизмы иммунопатогенеза микрососудистых осложнений СД 2 типа, которые связаны с поддержанием хронического низкоуровневого воспаления в белой жировой ткани, были рассмотрены в предыдущем параграфе.

В ряде исследований установлено изменения общего числа лейкоцитов и иммунофенотипа гранулоцитов и лимфоцитов в периферической крови больных СД 2 типа с ДР. Повышение количества лейкоцитов и изменения их популяционного/субпопуляционного состава у тучных лиц рассматривается как одно из проявлений хронического воспаления [Rimmele T. et al, 2013] и, по мнению некоторых ученых, отражает пониженную секрецию инсулина и развитие резистентности к этому гормону [Vozarova B. et al, 2002].

У пациентов с СД 2 типа продемонстрирована значительная отрицательная корреляционная связь между числом TLR4+CD4+-Т-клеток и уровнем гипергликемии, а также между количеством TLR4+-В-клеток и индексом массы тела. Кроме того, установлено снижение содержания ГЬ-21R+CD4+-Т-клеток. В противоположность этому, число Т^ зависело не от особенностей метаболического статуса, а от возраста больных [Cucak К et а1, 2014].

У больных СД 1 типа с ДР обнаружено повышение относительного числа CD54+-гранулоцитов и лимфоцитов, больше выраженное у пациентов активной неоваскуляризацией [Кочемасова Т.В. и др., 2001].

Достаточно большое количество работ посвящено локальным патофизиологическим событиям при ДР, происходящим непосредственно внутри глаза. В этом отношение внимание ученых привлекают различные субпопуляции иммунокомпетентных клеток, про- и противовоспалительные цитокины, хемокины, растворимые формы молекул адгезии, ростовые (ангиогенные) и антиангиогенные факторы, растворимые формы рецепторов провоспалительных и ангиогенных медиаторов [Abcouwer S.F., 2013, Ahsan Н., 2015].

В стекловидном теле больных пролиферативной ДР выявляли большое число макрофагов/гистиоцитов, CD4+- и CD8+-Т-лимфоцитов, но не CD19+-B-лимфоцитов. Количество Т-клеток увеличивалось с повышением тяжести заболевания. Любопытно, что интравитреальное соотношение CD4/CD8 более чем в 2 раза превышало таковое в периферической крови. Внутриглазное относительное количество макрофагов/гистиоцитов также было выше, чем в системном кровотоке. Это свидетельствует о том, что воспалительные клетки в стекловидном теле находятся под влиянием локальных хемотаксических факторов M. et al, 2013].

Сходные данные были получены А.СаПюп и соавторами, которые показали увеличение процентного содержания CD4+- и CD28+-Т-лимфоцитов

в стекловидном теле в сравнении с периферической кровью у больных пролиферативной ДР [Cantón A. et al, 2004].

Однако в трактовке установленных фактов авторы двух вышеуказанных работ существенно разошлись. M.UrbanciC и соавторы делали заключение о патогенетическом значении Т-клеточной инфильтрации тканей глаза, тогда как A.Cantón с коллегами рассматривали это как саногенетическое (протективное) событие при прогрессировании ДР.

На наш взгляд, более аргументированной является интерпретация первой группы ученых, которые проводили параллели в патогенезе ДР и развитии аутоиммунного увеита, при котором также установлена патогенетическая роль С04+-Т-лимфоцитов и выявлено 4-кратное увеличение соотношения CD4/CD8 в сравнении с таковым в периферической крови [Davis J.L. et al, 2012]. Увеличение же доли CD8+-Т-лимфоцитов связывают, наоборот, с регрессией аутоиммунного внутриглазного воспаления [Калюжин О.В. и др., 2011, Дикинов З.Х. и др., 2014].

N.Dong и соавторы сравнили с помощью мультиплексного анализа

концентрации 27 цитокинов в водянистой влаге у больных СД 2 типа и

недиабетических пациентов для того, чтобы установить связь этих цитокинов

с развитием ДР [Dong N. et al, 2013]. Образцы водянистой влаги были

получены от 102 пациентов без диабета (102 глаз) и 136 больных СД (136

глаз), которые были разделены на девять групп в соответствии с тяжестью

ДР. По сравнению с недиабетическим контролем, диабетические пациенты

имели значительно более высокие концентрации KH-1ß, ИЛ-6, ИЛ-8,

моноцитарного хемоаттрактантного белка-1 (MCP-1), ИФН-у-

индуцированного белка-10 (IP-10) и VEGF. Наоборот, содержание ИЛ-10 и

ИЛ-12 было значительно ниже у больных СД. Уровень других цитокинов

существенно не различался между диабетическими пациентами и

контрольной группой. Внутриглазные концентрации KH-1ß, ИЛ-6, ИЛ-8

MCP-1 и IP-10 возрастали с увеличением тяжести ДР. В этом исследовании,

как и в описанной в параграфе 1.1 работе [Blum A. et al, 2012], не выявлено

21

прямой связи уровня VEGF с тяжестью ДР. Содержание ИЛ-10 и ИЛ-12 в водянистой влаге уменьшалась по мере увеличения выраженности ДР.

Также проводилось исследование уровня 27 цитокинов в слезной жидкости больных СД 2 типа с ДР или без нее [Liu J. et al, 2010]. Образцы слезы были собраны у 15 больных СД без ретинопатии, 15 пациентов с ДР и 15 здоровых доноров, сопоставимых по возрасту и полу с обследуемыми больными. Мультиплексный анализ показал, что IP-10 был преобладающим цитокином, выявляемым в слезной жидкости. Уровни IP-10 и МСР-1 были значительно выше у пациентов с ДР по сравнению с контрольной группой и больных СД без ДР. Содержание IL-1Ra существенно увеличивалось у пациентов с СД без ретинопатии. Соотношение ТЫ/^2-цитокинов - ИФН-у/ИЛ-5 и ИЛ-2/ИЛ-5 - было значительно выше у больных СД с ДР по сравнению с недиабетическим контролем и диабетиками без ДР. Баланс антиангиогенных/проангиогенных цитокинов - ИФН-у/МСР-1 и ИЛ-4/MCP-l - существенно снижался по сравнению с контролем у диабетиков вне зависимости от наличия/отсутствия ДР. Коэффициенты ИЛ-4/^-8 и ИЛ-12р70/ИЛ-8 у больных с ретинопатией были значительно ниже, чем в контроле. Не установлено связи между концентрациями цитокинов в слезной жидкости и уровнями гликированного гемоглобина или глюкозы в плазме крови натощак. Таким образом, в слезной жидкости больных СД 2 типа обнаружено преобладание проангиогенных цитокинов над антиангиогенными медиаторами, а развитие ДР сопровождалось повышением концентрации IP-10 и МСР-1, а также сдвигом функционального баланса Th1/Th2 в направлении Th1.

Большой интерес вызывают исследования, в которых внутриглазные концентрации факторов воспаления и ангиогенеза сопоставляются с таковыми в сыворотке или плазме крови. Данные таких работ привлекают внимание с точки зрения выявления в более доступных биологических образцах системных иммунологических показателей, которые не только

отражают внутриглазные патогенетические/саногенетические события, но и могут использоваться для диагностики и прогноза течения ДР.

R.Maier и соавторы определяли концентрации в стекловидном теле и сыворотке крови IP-10, МСР-1, макрофагальных воспалительных белков-1а и -1ß (MIP-1a и -1ß), хемокина, экспрессируемого и секретируемого T-клетками при активации (RANTES) и VEGF у 36 больных СД 2 типа и 69 недиабетических пациентов контрольной группы [Maier R. et al, 2008]. У больных СД интравитреальные уровни IP-10, MCP-1 и VEGF были значительно выше по сравнению с контролем. При этом концентрация VEGF коррелировала с таковыми IP-10 и МСР-1. Содержание в сыворотке крови MIP-1ß, RANTES и VEGF также существенно возрастало у пациентов с СД, а концентрации IP-10, MCP-1 и MIP-1a статистически значимо не изменялись. Таким образом, интравитреальный уровень VEGF коррелировал с таковым в сыворотке, тогда как концентрации IP-10 и MCP-1 возрастали только внутри глаза, а MIP-1ß и RANTES - лишь в системном кровотоке.

Повышение уровней провоспалительных и ангиогенных факторов в стекловидном теле может быть результатом трех путей. Во-первых, это прорыв гематоретинального барьера, приводящий к повышению внутриглазного уровня воспалительных и ангиогенных факторов у диабетиков [Yoshida S. et al, 2004]. Вторым вариантом является экспрессия воспалительных и ангиогенных факторов клетками (макрофагами, моноцитами, глиальными клетками, пигментными эпителиоцитами) непосредственно внутри стекловидного тела. В-третьих, хемокины и ангиогенные факторы индуцируются в сетчатке в результате гипоксии, что было показано на модели ретинальной ишемии-реперфузии [Jo N. et al, 2003]. Наличие различных путей объясняет отличия уровней некоторых медиаторов воспаления и ангиогенеза в сыворотке крови и стекловидном теле [Maier R. et al, 2008].

Целью работы H.Chen и соавторов было изучение роли различных субпопуляций Th-клеток в патогенезе ДР. Для этого в сыворотке крови 29

23

больных СД 2 типа с ретинопатией и 30 здоровых доноров определяли концентрации Th-продуктов: ИФН-у, ИЛ-lß, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6 , ИЛ-9, ИЛ-10, ИЛ-12, p70 ИЛ-13, ИЛ-17А, ИЛ-22 и ФНО-а с помощью технологии FlowCytomix [Chen H. et al, 2012]. Обнаружено, что сывороточный уровень ИЛ-22 у больных СД с ДР был выше, чем в контрольной группе. Иммуноферментный анализ содержания ИЛ-22 в надосадочной жидкости культур мононуклеаров периферической крови (МПК) установил значительное повышение этого показателя у больных пролиферативной ДР по сравнению с таковым у пациентов с непролиферативной ДР, больных СД без ретинопатии, а также здоровых доноров. Кроме того, концентрации ИЛ-22 в сыворотке крови и культуре МПК положительно коррелировали с длительностью диабета. Уровни других цитокинов в сыворотке крови больных СД 2 типа с ДР существенно не изменялись по сравнению с контрольной группой. Эти результаты указывают на патогенетическое значение Th22-клеток в ДР. Вероятно, ИЛ-22 участвует в развитии пролиферативной формы заболевания.

Мультиплексный анализ очень широкого спектра цитокинов и ассоциированных с ними молекул (антагонистов, растворимых форм рецепторов) - всего 39 факторов - в плазме крови больных СД с ретинопатией и без таковой проведен другой группой ученых [Hang H. et al, 2014]. В исследование включено 59 пациентов с СД 2 типа и 19 здоровых добровольцев. Уровни цитокинов оценивались с учетом стадии ДР. Плазменные концентрации десяти цитокинов - MCP-1, ИЛ-6, ИЛ-7, ИЛ -9, ИЛ-13, ИЛ-15, ИЛ-17, растворимой формы лиганда CD40 (sCD40L), sIL-2Ra и ФНО-ß - значительно увеличились в диабетической группе по сравнению с контрольной. Наоборот, уровень лиганда Flt-3 (Flt-3L), антагониста рецептора интерлейкина-1 (IL-1Ra), ИЛ-3, ИЛ-5 и ИЛ-12 (p40) у больных СД был ниже контроля. Содержание ФНО-а в плазме было значительно выше у пациентов с пролиферативной ДР по сравнению с таковым у пациентов с непролиферативной формой ДР и пациентов без манифестных форм этого

24

микрососудистого осложнения СД. Авторы делают вывод, что ФНО-а может быть вовлечен в прогрессировании ДР, особенно в патогенез пролиферативной формы заболевания, и может быть как критерием прогноза течения ДР, так и терапевтической мишенью.

M.Roy и соавторы изучили 28 биомаркеров воспаления, в том числе ростовые факторы, хемокины, про- и противовоспалительные цитокины, их антагонисты и растворимые рецепторы, растворимые формы молекул адгезии, в плазме крови 412 больных СД с разными стадиями ДР [Roy M. et al, 2013]. Установлено, что уровень E-селектина и ФНО-а отражает прогрессирование ДР и развитие пролиферативной формы заболевания, а сочетанное повышение концентраций sICAM-1 и ФНО-а ассоциировано с макулярным отеком. Обращает на себя внимание, что только 3 из 28 тщательно подобранных биомаркеров, которые по данным литературы вовлечены в патогенез микрососудистых осложнений СД, имели прогностическое значение при ДР.

В сыворотке крови больных СД типа 2 выявлено повышение содержания растворимых форм мембранных молекул: sCD38 и sCD54 (sICAM-1) и sHLA-I. При развитии ДР, кроме того, обнаружен рост уровня растворимых форм различных в функциональном отношении групп мембранных антигенов: адгезионных молекул (sCD50 /sICAM-3/ и sCD54 /sICAM-1/), маркеров активации (CD38, sCD95, sHLA-DR), а также молекул главного комплекса гистосовместимости I класса (sHLA-I). Степень этих изменений увеличивалась у больных с пролиферативной ДР [Караулов А.В., 2006].

Таким образом, несмотря на достаточно большое число работ, посвященных иммунным механизмам ДР, данных о системных иммунологических показателей, которые могли бы четко свидетельствовать о прогрессировании заболевания и развитии его пролиферативной формы, мало. Более того, зачастую результаты разных авторов противоречат друг другу.

2.1. Основные факторы патогенеза возрастной макулярной дегенерации

В развитии ВМД, помимо возраста, большое значение играют различные экологические и эпидемиологические факторы. Это нейродегенеративное поражение глаз ассоциировано с курением, действием света, сердечно-сосудистыми заболеваниями, ожирением, факторами питания, а также этнической принадлежностью [^ш L.S. е1 а1, 2012]. Недавние генетические исследования указывают на роль иммунной системы, в частности расстройств системы комплемента, в патогенезе ВМД. Хотя у пациентов с ВМД отсутствуют признаки выраженного внутриглазного воспаления, установлена связь атрофических поражений и неоваскуляризации сетчатки с присутствием макрофагов, лимфоцитов, тучных клеток и фибробластов [РепМё РХ. е1 а1, 2001].

Экстрацеллюлярные депозиты (друзы) между мембраной Бруха и пигментным эпителием сетчатки, являющиеся маркерами развития ВМД, содержат липиды, компоненты комплемента и другие потенциально иммунологически активные вещества, которые могут действовать как дополнительные триггеры иммунных реакций в глазу. Другими инициаторами воспаления являются окислительный стресс и вторичные флогогенные медиаторы, такие как цитокины. Вероятно, что, по крайней мере, некоторые из воспалительных внутриглазных реакций, наблюдаемых при ВМД, могут иметь защитно-приспособительный характер. Актуальность выявления четких данных о роли иммунной системы в патогенезе ВМД связана с их практической востребованностью с позиций разработки новых методов модуляции иммунного ответа для комплексного лечения этого заболевания.

Экологические факторы Врожденный иммунитет Адаптивный иммунитет Фото-оксидативные продукты

Курение Действие света (|) Масса тела (|) Гиперхолестери-немия Комплемент Инфламмасомы ТЬЯ-зависимые сигналы Инфильтрация иммуноцитами Паравоспаление Антитела к антигенам сетчатки и продуктам деградации Клеточная активация и иммунокомплексное повреждение Побочные продукты зрительного цикла Липофусцин Бис- ретинилиден-этаноламин

Повреждение пигментного эпителия, образование друз

Избыточная активация комплемента по альтернативному пути и других генетически обусловлен ных провоспалительных путей

Избыточное ретинальное воспаление в ответ на повреждение

ВОЗРАСТНАЯ МАКУЛЯРНАЯ ДЕГЕНЕРАЦИЯ

Степень, в которой врожденные и адаптивные иммунные реакции обусловливают развитие ВМД, и возможность управления этими реакциями для эффективного лечения заболевания, остаются предметом дискуссии.

Сложность интерпретации иммунологических исследований при ВМД определяется не только многогранностью выявляемых сдвигов показателей, но и неясностью вопроса о причинно-следственных связях местных и системных иммунных нарушений [Whitcup S.M. et al, 2013].

Известные и вероятные патогенетические факторы ВМД представлены на Схеме 4.

2.2. Система комплемента и возрастная макулярная дегенерация

Участие системы комплемента в развитии ВМД сегодня не вызывает сомнений. При этом заболевании выявлена избыточная активация комплемента по альтернативному пути [Khandhadia S., Cipriani V. et al, 2012].

Считается, что передача предрасположенности к ВМД по наследству примерно на 50% обусловлена единичным нуклеотидным полиморфизмом (SNP) в экзоне, кодирующем фактор комплемента H [Klein R.J. et al, 2005].

Фактор Н представляет собой гликопротеин, который в основном производится в печени и действует в качестве регулятора альтернативного пути активации комплемента. В связи с этим, он играет важную роль в предотвращении повреждения от случайного осаждения C3b в тканях хозяина. Фактор H связывается с полианионами тканей хозяина и выполняет функцию кофактора для протеолитической дезактивации C3b фактором I. Одним из семейств полианионных молекул являются гликозаминогликаны -вездесущие полисахариды, обнаруживаемые как на поверхности клеток, так и во внеклеточном матриксе тканей млекопитающих [Meri S., Pangburn M.K., 1990].

Аллельный вариант 402H (присутствие гистидина в позиции 402) не

позволяет фактору H также эффективно подавлять альтернативный путь

28

активации комплемента, как 402Y (тирозин в позиции 402). Замена тирозина на гистидин в указной аминокислотной позиции нарушает связывание фактора H с сульфатированными полисахаридами, в частности глюкозаминогликанами мембраны Бруха, что имеет драматические последствия в виде гиперактивации комплемента, в свою очередь ведущей к локальному хроническому воспалению [Clark S.J. et al, 2010].

Похожие диссертационные работы по специальности «Клиническая иммунология, аллергология», 14.03.09 шифр ВАК

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Марных Сергей Анатольевич, 2015 год

□ □

Контроль Пролиферат. ДР

Препролиф. ДР

МеС1ап 25%-75% I Мт-Мах

Не установлено межгрупповых различий по числу СЭ20+-клеток (В-лимфоцитов), тем не менее следует отметить тенденцию к его увеличению в обеих группах больных ДР (Рис. 7).

0

Неоднозначные данные были получены при изучении зависимости экспрессии на лимфоцитах различных активационных маркеров от клинической формы заболевания.

Установлено повышение количества -клеток в группе

пациентов с пролиферативной ДР (Рис. 8). Их число у этих больных превышало таковое как в контроле, так и в группе пациентов с препролиферативной ДР (подтверждено при парном сравнении с использованием критерия Манна-Уитни).

Рисунок 8. Число ИЬЛ-ВЯ+-лимфоцитов в крови больных препролиферативной и пролиферативной диабетической ретинопатией

500

450

£

400

§

со 350

о

н

^

300

о

250

с;

+ ОН а 200

<

_1 X 150

о

с;

о ^ 100

50

0

Контроль Пролиферат. ДР

Препролиф. ДР

МесМап 25%-75% I Мт-Маж

Значимость различия при множественном сравнении: р=0,036 (критерий Краскела-Уоллиса); в сравнении с контролем: * - р=0,035 (критерий Манна-Уитни) или р=0,052 (критерий Данна); в сравнении с больными препролиферативной диабетической ретинопатией: # - р=0,027 (критерий Манна-Уитни) или р=0,139 (критерий Данна)

Наоборот, количество СЭ71+-лимфоцитов статистически значимо увеличивалось только у больных с препролиферативной ДР; при пролиферативной форме заболевания число этих клеток не отличалось от показателей здоровых доноров (Рис. 9).

260

240

220

200

§

180

§

160

о

н

ф 140

+ 120

а о 100

о

с; о 80

^

!Т 60

40

20

Контроль Пролиферат. ДР

Препролиф. ДР

° МесМап

25%-75% I Мт-Маж

Значимость различия при множественном сравнении: р=0,006 (критерий Краскела-Уоллиса); в сравнении с контролем: * - р=0,003 (критерий Манна-Уитни) или р=0,004 (критерий Данна)

Количество СЭ25+-лимфоцитов у больных препролифетивной ДР было сходным с таковым в контрольной группе и вдвое превышало число этих клеток у пациентов с пролиферативной формой болезни (Рис. 10). Указанное различие подтверждалось с помощью критерия Манна-Уитни, тогда как множественное межгрупповое сравнение с использованием критерия Краскела-Уоллиса и парное сравнение с помощью критерия Данна не опровергали нулевую гипотезу.

Число лимфоцитов, экспрессирующих поздний активационный маркер (СЭ95), свидетельствующий о готовности клеток, выполнивших свою функцию, к апоптозу, возрастало по мере прогрессирования заболевания (Рис. 11). У больных препролиферативной ДР количество этих клеток превышало контроль вдвое, а в пролиферативной фазе заболевания дополнительно увеличивалось еще в полтора раза.

о

140

120

100

m

о

J

о

ю Ol

а о

о с;

о

80

60

40

20

Контроль Пролиферат. ДР

Препролиф. ДР

° Median

25%-75% I Min-Max

Значимость различия при множественном сравнении: p=0,073 (критерий Краскела-Уоллиса); в сравнении с больными препролиферативной диабетической ретинопатией: # -p=0,046 (критерий Манна-Уитни) или p=0,102 (критерий Данна)

Рисунок 11. Число СЭ95+-клеток в крови больных препролиферативной и пролиферативной диабетической ретинопатией

0

Значимость различия при множественном сравнении: p=0,001 (критерий Краскела-Уоллиса); в сравнении с контролем: * - p=0,001 (критерий Манна-Уитни) или p=0,047 (критерий Данна), ** - p=0,001 (критерий Манна-Уитни) или p<0,001 (критерий Данна); в сравнении c больными препролиферативной диабетической ретинопатией: # - p=0,046 (критерий Манна-Уитни) или p=0,548 (критерий Данна)

Если количество СВ11Ь+-клеток увеличивалось в сравнении со здоровыми донорами только у пациентов с препролиферативной ДР (Рис. 12), то число СЭ38+- и, особенно, СЭ54+-лимфоцитов повышалось примерно в равной степени при обеих формах заболевания. Значимость указанных изменений, несмотря на достаточно высокую индивидуальную вариативность показателей, подтверждалась при разных вариантах математической обработки данных.

Рисунок 12. Число СЭ11Ь+-клеток в крови больных препролиферативной и пролиферативной диабетической ретинопатией 1600

1400

ь2 1200

,11

* 1000 о н

+ | 800 .а

§ 600

о с;

о

^ 400 200 0

МесМап

_,_,_,_ 25%-75%

Контроль Пролиферат. ДР I М1п-Маж

Препролиф. ДР

Значимость различия при множественном сравнении: р=0,050 (критерий Краскела-Уоллиса); в сравнении с контролем: * - р=0,021 (критерий Манна-Уитни) или р=0,043 (критерий Данна)

о

н

ф

1000 900 800 700 600 500

оо со

О 400

О о

5 300 s Iг

200 100 0

Контроль Пролиферат. ДР

Препролиф. ДР

□ Median

25%-75% I Min-Max

Значимость различия при множественном сравнении: p=0,022 (критерий Краскела-Уоллиса); в сравнении с контролем: * - p=0,015 (критерий Манна-Уитни) или p=0,057 (критерий Данна), ** - p=0,015 (критерий Манна-Уитни) или p=0,041 (критерий Данна)

Рисунок 14. Число СЭ54+-клеток в крови больных препролиферативной и пролиферативной диабетической ретинопатией

700

600

500

400

ю 300

а о

о

" 200

100

**

Контроль Пролиферат. ДР

Препролиф. ДР

Median 25%-75% I Min-Max

Значимость различия при множественном сравнении: p<0,001 (критерий Краскела-Уоллиса); в сравнении с контролем: * - p<0,001 (критерий Манна-Уитни) или p=0,002 (критерий Данна), ** - p<0,001 (критерий Манна-Уитни) или p=0,001 (критерий Данна)

0

диабетической ретинопатией

У пациентов с ДР установлены разные по направленности тренды изменения концентрации в сыворотке крови ИЛ-2 и ИФН-у - цитокинов, отражающих функциональную активность ТЫ-субпопуляции СЭ4+-лимфоцитов.

Уровень ИЛ-2 у больных препролиферативной ДР практически не отличался от такового здоровых доноров; в группе пацеиентов с пролиферативной формой заболевания отмечена тенденция к снижению этого показателя (Рис. 15). Подчеркнем, что во всех группах, особенно у больных пролиферативной ДР, достаточно часто содержание ИЛ-2 в сыворотке крови было ниже уроня детекции используемой высокочувствительной тест-системы.

Рисунок 15. Концентрация ИЛ-2 (пг/мл) в сыворотке крови больных препролиферативной и пролиферативной диабетической ретинопатией

Контроль Пролиферат. ДР

Препролиф. ДР

□ МесМап

25%-75% I Мт-Маж

5

4

3

2

о

Медианы концетрации ИФН-у, наоборот, возрастали примерно в полтора раза в обеих группах больных ДР, при этом зависимости степени повышения уровня этого цитокина от формы заболевания не обнаружено (Рис. 16).

Рисунок 16. Концентрация ИФН-у (пг/мл) в сыворотке крови больных препролиферативной и пролиферативной диабетической ретинопатией

Значимость различия при множественном сравнении: p=0,004 (критерий Краскела-Уоллиса); в сравнении с контролем: * - p=0,006 (критерий Манна-Уитни) или p=0,014 (критерий Данна), ** - p=0,002 (критерий Манна-Уитни) или p=0,013 (критерий Данна)

Продемонстриована тенденция к снижению содержания в сыворотке крови Th2-продукта - ИЛ-4 - у пациентов с препролиферативной ДР; у больных с пролиферативной формой заболевания этот тренд достигал статистически значимого уровня (Рис. 17). При парном сравнении уровня ИЛ-4 в группах с разными клиническими фенотипами ДР отличий не выявлено.

Установлена обратная корреляционная связь между концентрациями ИЛ-4 и ИФН-у.

5,0 4,5 4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0

Контроль Пролиферат. ДР

Препролиф. ДР

° Median

25%-75% I Min-Max

Значимость различия при множественном сравнении: р=0,039 (критерий Краскела-Уоллиса); в сравнении с контролем: * - р<0,001 (критерий Манна-Уитни) или р=0,034 (критерий Данна)

Рисунок 18. Концентрация ИЛ-10 (пг/мл) в сыворотке крови больных препролиферативной и пролиферативной диабетической ретинопатией

Контроль

Препролиф. ДР

Пролиферат. ДР

□ Median

25%-75% I Min-Max

Значимость различия при множественном сравнении: p=0,001 (критерий Краскела-Уоллиса); в сравнении с контролем: * - p=0,002 (критерий Манна-Уитни) или p=0,004 (критерий Данна), ** - p=0,001 (критерий Манна-Уитни) или p=0,006 (критерий Данна)

9

8

7

6

5

4

3

2

0

Что касается ИЛ-10 - противовоспалительного продукта ^^-клеток, представляющих собой отдельную субпопуляцию регуляторных Т-лимфоцитов, - то его содержание прямо коррелировало с концентрацией ИФН-у - провоспалительного Th1-цитокина. При этом медиана уровня ИЛ-10 у больных ДР вне зависимости от формы заболевания была примерно вдвое выше таковой в контроле (Рис. 18).

1.3. Уровень растворимых форм мембранных антигенов иммунокомпетентных клеток в сыворотке крови больных диабетической ретинопатией

При изучении уровня растворимых форм мембранных антигенов иммунокомпетентных клеток в сыворотке крови больных ДР не установлено линейной закономерности их возрастания или снижения по мере прогрессирования заболевания от препролиферативной к пролиферативной форме заболевания.

Рисунок 19. Концентрация sCD38 (ед/мл) в сыворотке крови больных препролиферативной и пролиферативной диабетической ретинопатией

360 340 320 300 280 260 240 220 200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0

Контроль Пролиферат. ДР

Препролиф. ДР

° МесМап

25%-75% I Мт-Маж

Концентрации растворимых форм мембранных молекул адгезии бСВЗ8 и бСВ50, во многом благодаря высокой индивидуальной вариативности этих показателей, практически не отличались во всех группах обследованных пациентов с ДР и здоровых доноров (Рис.19 и 20).

Рисунок 20. Концентрация бСВ50 (ед/мл) в сыворотке крови больных препролиферативной и пролиферативной диабетической ретинопатией

700 650 600 550 500 450 400 350 300 250 200 150 100 50 0

Контроль Пролиферат. ДР

Препролиф. ДР

□ Median

25%-75% I Min-Max

Напротив, содержание растворимой формы другой адгезионной молекулы - бСВ54 - в сыворотке крови больных ДР возрастало. И хотя математически подтверждённых отличий между двумя группами пациентов с ДР не обнаружено, следует отметить тенденцию к снижению концентрации этой молекулы при переходе препролиферативной ДР в пролиферативную форму заболевания (Рис. 21).

Уровень бСВ8 - молекулы, мембранная форма которой является дифференцировочным маркером ЦТЛ и, взаимодействуя с ИЬЛ-1, ассоциированным с презентируемыми антигенами, обеспечивает распознавание этих антигенов Т-клеточным рецепторным комплексом, -повышался только у больных пролиферативной ДР (Рис. 22).

160

140

120

100

80

60

40

20

Контроль Пролиферат. ДР

Препролиф. ДР

° Median

25%-75% I Min-Max

Значимость различия при множественном сравнении: p=0,004 (критерий Краскела-Уоллиса); в сравнении с контролем: * - p=0,005 (критерий Манна-Уитни) или p=0,004 (критерий Данна), ** - p=0,003 (критерий Манна-Уитни) или p=0,049 (критерий Данна)

Рисунок 22. Концентрация sCD8 (ед/мл) в сыворотке крови больных препролиферативной и пролиферативной диабетической ретинопатией

800

700

600

500

400

300

200

100

■ т □ *# □

Median 25%-75%

Контроль Пролиферат. ДР I Min-Max

Препролиф. ДР

Значимость различия при множественном сравнении: p=0,041 (критерий Краскела-Уоллиса); в сравнении с контролем: * - p=0,021 (критерий Манна-Уитни) или p=0,132 (критерий Данна); в сравнении с больными препролиферативной диабетической ретинопатией: # - p=0,046 (критерий Манна-Уитни) или p=0,059 (критерий Данна)

0

Медиана концентрации бСВ8 была выше таковой не только в контроле, но и у больных препролиферативной формой заболевания.

В целом сходные закономерности изменения содержания в сыворотке крови отмечены и для бИЬА-! Концентрация этой молекулы у больных пролиферативной ДР была выше, чем в контрольной группе и у больных препролиферативной ДР (Рис. 23).

Рисунок 23. Концентрация бИЬА-1 (ед/мл) в сыворотке крови больных препролиферативной и пролиферативной диабетической ретинопатией

3400 3200 3000 2800 2600 2400 2200 2000 1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400 200 0

Контроль Пролиферат. ДР

Препролиф. ДР

Median 25%-75% I Min-Max

Значимость различия при множественном сравнении: р=0,021 (критерий Краскела-Уоллиса); в сравнении с контролем: * - р=0,010 (критерий Манна-Уитни) или р=0,030 (критерий Данна); в сравнении с больными препролиферативной диабетической ретинопатией: # - р=0,028 (критерий Манна-Уитни) или р=0,085 (критерий Данна)

Уровень растворимых комплексов бИЬА-1+СВ8 статистически значимо не различался между группами (Рис. 24). Вместе с тем следует отметить тенденцию к снижению концентрации бИЬА-1+СВ8 у больных препролиферативной ДР и к повышению - у пациентов с пролиферативной формой болезни.

1400

1200

1000

800

600

400

200

Контроль Пролиферат. ДР

Препролиф. ДР

° Median

25%-75% I Min-Max

0

Рисунок 25. Концентрация sHLA-DR (ед/мл) в сыворотке крови больных препролиферативной и пролиферативной диабетической ретинопатией

240 220 200 180 160 140 120 100 80 60 40 20

Median 25%-75%

Контроль Пролиферат. ДР I Min-Max

Препролиф. ДР

Значимость различия при множественном сравнении: p=0,001 (критерий Краскела-Уоллиса); в сравнении с контролем: * - p=0,015 (критерий Манна-Уитни) или p=0,078 (критерий Данна), ** - p<0,001 (критерий Манна-Уитни) или p=0,001 (критерий Данна)

Содержание бНЬЛ-ВК в сыворотке крови больных препролиферативной и пролиферативной ДР превышало соответственно в два и полтора раза таковое в группе здоровых доноров (Рис. 25). Парное сравнение не выявило отличий по уровню бНЬЛ-ВК между группами с разными формами заболевания.

Концентрация бСВ25 возрастала только у больных препролиферативной ДР, однако из-за высокой вариативности указанного показателя это повышение подтверждалось лишь с помощью критерия Манна-Уитни при сравнении с контролем (Рис. 26). При множественном сравнении различия между группами опровергались.

Рисунок 26. Концентрация бСВ25 (ед/мл) в сыворотке крови больных препролиферативной и пролиферативной диабетической ретинопатией

1200

1000

800

600

400

200

Контроль Пролиферат. ДР

Препролиф. ДР

□ Median

25%-75% I Min-Max

Значимость различия при множественном сравнении: р=0,083 (критерий Краскела-Уоллиса); в сравнении с контролем: * - р=0,038 (критерий Манна-Уитни) или р=0,111 (критерий Данна)

Уровень бСВ95 в сыворотке крови увеличивался в полтора раза только у больных препролиферативной ДР (Рис. 27). В пролиферативную фазу заболевания содержание этой молекулы не отличалось от контроля и было в

0

ДР.

Установлена прямая корреляционная связь между концентрациями бСВ25 и вСВ95.

Рисунок 27. Концентрация бСВ95 (ед/мл) в сыворотке крови больных препролиферативной и пролиферативной диабетической ретинопатией 1600

1400

1200

1000

800

600

400

200

□ Median 25%-75%

Контроль Пролиферат. ДР I Min-Max

Препролиф. ДР

Значимость различия при множественном сравнении: p=0,002 (критерий Краскела-Уоллиса); в сравнении с контролем: * - p=0,001 (критерий Манна-Уитни) или p=0,003 (критерий Данна); в сравнении с больными препролиферативной диабетической ретинопатией: # - p=0,003 (критерий Манна-Уитни) или p=0,022 (критерий Данна)

2.1. Субпопуляционный состав лимфоцитов периферической крови больных возрастной макулярной дегенерацией

У больных с различными клиническими формами ВМД содержание лейкоцитов в периферичекой крови не отличалось от такового в контрольной группе и было в пределах общепринятых референсных значений нормы (Рис. 28).

Также не выявлено математически подтврежденных различий числа лимфоцитов в крови между группами обследованных больных и здоровых доноров (Рис. 29). Вместе с тем следует отметить тенденцию к возрастанию количества этих клеток в ряду: контрольная группа ^ больные сухой ВМД ^ пациенты с влажной ВМД.

Рисунок 28. Число лейкоцитов (кл./мкл) в крови больных возрастной

макулярной дегенерацией

11000 10000 9000 8000 7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000 0

□ МесМап

25%-75% I Мт-Маж

Рисунок 30. Число СЭЭ -лимфоцитов (кл./мкл) в крови больных возрастной

макулярной дегенерацией

Значимость различия при множественном сравнении: р=0,045 (критерий Краскела-Уоллиса); в сравнении с больными сухой ВМД: # - р=0,026 (критерий Манна-Уитни) или р=0,046 (критерий Данна)

Число СD3+-клеток (Т-лимфоцитов) при сухой ВМД не отличалось от такового у здоровых доноров (Рис. 30). У больных с влажной формой заболевания количество этих клеток существенно превосходило соответствующие показатели в группе пациентов с сухой ВМД.

Это было в значительной степени связано с увеличением числа СD8+-лимфоцитов у больных влажной ВМД (Рис. 31), тогда как межгрупповых различий по содержанию СD4+-клеток при разных вариантах статистической обработки полученных данных не обнаружено (Рис. 32).

Количество СD16+-лимфоцитов (МК-клеток) у больных обеими клиническими формами ВМД примерно вдвое превосходило контрольные значения (Рис. 33).

Рисунок 31. Число СD8+-лимфоцитов (кл./мкл) в крови больных возрастной

макулярной дегенерацией

Значимость различия при множественном сравнении: p=0,085 (критерий Краскела-Уоллиса); в сравнении с больными сухой ВМД: # - p=0,036 (критерий Манна-Уитни) или p=0,088 (критерий Данна)

Рисунок 33. Число СЭ16+-лимфоцитов (кл./мкл) в крови больных возрастной

макулярной дегенерацией

Значимость различия при множественном сравнении: р=0,013 (критерий Краскела-Уоллиса); в сравнении с контролем: * - р=0,001 (критерий Манна-Уитни) или р=0,038 (критерий Данна), ** - р=0,001 (критерий Манна-Уитни) или р=0,012 (критерий Данна)

Число В-лимфоцитов (СD20+-клеток) между группами не отличалось (Рис. 34). При этом следует отметить высокую индивидуальную вариативность содержания этих клеток у всех больных ВМД и, особенно, у больных с влажной формой заболевания.

Рисунок 34. Число СD20+-лимфоцитов (кл./мкл) в крови больных возрастной

макулярной дегенерацией

Не выявлено однотипных изменений числа лимфоцитов, экспрессирующих различные молекулы, свидетельствующие об активации клетки.

У больных сухой ВМД отмечены выраженные тенденции к снижению числа СD25+-лимфоцитов (Рис. 35) и к повышению - СD71+-клеток (Рис. 36). Количество этих субпопуляций лимфоцитов у пациентов с влажной ВМД и содержание HLA-DR+-клеток при обоих вариантах заболевания не отличалось от показателей контрольной группы (Рис. 37).

Контроль Сухая ВМД Влажная ВМД

Значимость различия при множественном сравнении: p=0,098 (критерий Краскела-Уоллиса); в сравнении с контролем: * - p=0,049 (критерий Манна-Уитни) или p=0,136 (критерий Данна)

Рисунок 36. Число СD71+-лимфоцитов (кл./мкл) в крови больных возрастной

макулярной дегенерацией

400

350

300

250

200

150

100

50

□ □

—1- 1_ _!_

МесМап 25%-75% I Мт-Маж

0

900

800

700

600

500

400

300

200

100

° МесМап

25%-75% I Мт-Маж

Контроль Сухая ВМД Влажная ВМД

0

Напротив, установлен линейный возрастающий тренд числа СЭ95+-лимфоцитов (клеток с поздним активационным маркером, свидетельствующим об их готовности к апоптозу) при прогрессировании заболевания от сухой к влажной форме ВМД (Рис. 38). И хотя парное сравнение не выявило различий между двумя группами больных, у пациентов сухой ВМД количество СЭ95+-клеток статистически значимо превышало контроль в полтора раза, а у пациентов с влажной формой заболевания - в два раза.

Содержание лимфоцитов, экспрессирующих молекулу адгезии СD11b, у больных ВМД не отличалось от такового здоровых доноров (Рис. 39). Однако при влажной ВМД отмечена выраженная тенденция к увеличению числа этих клеток.

При влажной форме заболевания медиана количества СЭ38+-лимфоцитов в периферической крови в 1,7 раз превышала соответствующий показатель в группе больных сухой ВМД и в 2,7 раза - в контрольной группе (Рис. 40).

Контроль Сухая ВМД Влажная ВМД

Значимость различия при множественном сравнении: р=0,025 (критерий Краскела-Уоллиса); в сравнении с контролем: * - р=0,018 (критерий Манна-Уитни) или р=0,074 (критерий Данна), ** - р=0,011 (критерий Манна-Уитни) или р=0,023 (критерий Данна)

Рисунок 39. Число СЭ11Ь+-лимфоцитов (кл./мкл) в крови больных возрастной макулярной дегенерацией

2200 2000 1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400 200 0

□ . 1 □

±

□ МесМап

25%-75% I Мт-Маж

Значимость различия при множественном сравнении: р=0,003 (критерий Краскела-Уоллиса); в сравнении с контролем: * - р=0,001 (критерий Манна-Уитни) или р=0,003 (критерий Данна); в сравнении с больными сухой ВМД: # - р=0,013 (критерий Манна-Уитни) или р=0,074 (критерий Данна)

Рисунок 41. Число СВ54+-лимфоцитов (кл./мкл) в крови больных возрастной

макулярной дегенерацией

1200

1000

800

600

400

200

Т

Контроль Сухая ВМД Влажная ВМД

□ МесМап

25%-75% I Мт-Маж

0

Значимость различия при множественном сравнении: р<0,001 (критерий Краскела-Уоллиса); в сравнении с контролем: * - р<0,001 (критерий Манна-Уитни) или р=0,001 (критерий Данна)

Число СD54+-лимфоцитов весьма значительно и примерно в равной степени (в 4,5 раза) повышалось при влажной и сухой формах ВМД в сравнении с контрольной группой (Рис. 41).

2.2. Концентрации ТЫ/ТИ2/Тг1-цитокинов в сыворотке крови больных возрастной макулярной дегенерацией

У больных ВМД, также как и у пациентов с ДР (см. параграф 1.2. раздела «Результаты собственных исследований»), не выявлено корреляционной связи между уровнями цитокинов, отражающих функциональную активность ТЫ-клеток.

Концентрация ИЛ-2 в сыворотке крови больных сухой и влажной ВМД не отличалась от таковой в контрольной группе (Рис. 42), тогда как медиана содержания ИФН-у у пациентов с сухой ВМД почти в полтора раза превосходила соответствующий показатель у здоровых доноров и у больных влажной формой заболевания.

Рисунок 42. Концентрация ИЛ-2 (пг/мл) в сыворотке крови больных возрастной макулярной дегенерацией

Контроль

Сухая ВМД Влажная ВМД

□ МеС1ап

25%-75% I Мт-Маж

6

5

4

3

2

10

° МесМап

25%-75% I М1п-Маж

Контроль

Обратите внимание, представленные выше научные тексты размещены для ознакомления и получены посредством распознавания оригинальных текстов диссертаций (OCR). В связи с чем, в них могут содержаться ошибки, связанные с несовершенством алгоритмов распознавания. В PDF файлах диссертаций и авторефератов, которые мы доставляем, подобных ошибок нет.