Иммунотоксины, полученные на основе моно- и поликлональных антител и А-цепи рицина тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, кандидат биологических наук Тоневицкий, Александр Григорьевич

• Тоневицкий, Александр Григорьевич
• кандидат биологических наук
• 1985

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Тоневицкий, Александр Григорьевич

ВВЕДЕНИЕ.6

ГЛАВА I. ШШЮТОКСИШ. Обзор литературы.10

1.1. Использование антител в качестве векторов иммунотоксинов . 10

1.1.1. Особенности использования поликлональных антител, их F(ab)2- и Раь-фрагментов . I0-II

1.1.2. Новые возможности, связанные с применением моноклональных антител

1.2. Токсины, использующиеся для конъюгации с антителами .12

1.2.1. Преимущества токсинов белковой природы . 13

1.2.2. Структура белковых токсинов.14

1.2.3. Механизм действия токсинов .15

1.3. Методы конъюгации белковых токсинов и антител . 18

1.3.1. Методы конъюгирования целых токсинов и антител.19

1.3.2. Методы получения конъюгатов, содержащих А-цепь токсинов . 25

1.3.3. Другие способы получения иммунотоксинов

1.4. Механизм проникновения внутрь клетки А-цепи .29—

1.5. Изучение действия иммунотоксинов в культуре клеток.33

I.5.I. Действие ИТ, содержащих антитела к целым клеткам.39

1.5.2. Цитотоксические свойства ИТ, содержащих поликлональные антитела к антигенам клеточной поверхности.40

1.5.3. Ингибирующая активность ИТ, содержащих моноклональные антитела к отдельным цепям ig и искусственным антигенам, расположенным на поверхности клеток-мишеней

1.5.4. Действие ИТ, содержащих моноклональные антитела к опухолево-специфическим, диф-ференцировочным и другим антигенам . . . 44

1.6. Использование иммунотоксинов для ингибиро-вания опухолевого роста.45

1.6.1. Удаление опухолевых клеток из смеси обработкой ИТ с последующим возвращением донору.46

1.6.2. Действие ИТ на раковые клетки у безтимусных мышей.48

1.6.3. Применение ИТ при прямом подавлении роста опухоли .49

1.7. Модуляция специфического иммунного ответа с помощью иммунотоксина .54

1.8. Что ограничивает эффективность действия иммунотоксинов .56

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Иммунотоксины, полученные на основе моно- и поликлональных антител и А-цепи рицина»

Пауль Эрлих был первым, кто указал на возможность использования антител как векторов для направленного транспорта к клеткам фармакологических агентов / I /. Разновидностью такого транспорта является избирательное взаимодействие клеток с антителом, которое связало с токсином. Такие искусственно созданные молекулы получили название иммунотоксинов (ИТ). ИТ -это конъюгаты растительных или бактериальных токсинов с антителами, которые связываются со специфическими рецепторами на поверхности клеток-мишеней. За последнее время достигнуты значительные успехи в создании и применении таких конъюгатов in vitro И in vivo.

Большинство токсинов растительной или бактериальной природы, которые используют для конъюгирования с антителами, содержат одну или несколько связывающих В-субъединиц, отвечающих за взаимодействие токсина с клеткой, и одну ферментативно активную А-цепь, проникающую внутрь клетки и определяющую ци-тотоксичность. Основная задача, которую надо решить при приготовлении ИТ состоит в том, что необходимо заменить В-цепь токсина, реагирующую с поверхностью практически любой клетки, на молекулу антитела, способную реагировать только с определенными клетками-мишенями. Наиболее простой способ решения этой задачи - прямая замена В-цепи на молекулу антитела. В качестве векторов ИТ используют поли- шш моноклональные антитела против дифференцировочных и опухолево-специфических антигенов. Характер химической связи между молекулой антитела и А-цепыо в составе конъюгата должен быть подобен связи между А- и Вцепями в нативном токсине.

Основным требованием к способу получения конъюгата является сохранение активностей составных частей иммунотокси-на после конъюгирования. Значительный прогресс в этой области достигнут благодаря использованию в качестве "сшивающего" агента n -сущинимидил-3-/2-пиридилдитио/пропионата (СПДП). Способы тестирования активностей антител, А-цепи рицина, анализ качественного состава получаемых конъюгатов с помощью СЦДО изложены в Главе Ш.

Наиболее цростой модельной системой для изучения цито-токсических свойств иммунотоксинов является система, состоящая из клеток-мишеней + конъюгат, содержащий суммарную фракцию igG из антисыворотки против этих клеток. В данном случае происходит максимально возможное насыщение поверхности клеток ИТ, что позволяет установить максимально возможную активность ИТ. Результаты, полученные при изучении такой системы, содержащей в качестве клеток-мишеней миеломные клетки мыши линии P3-X63. Ад 8.653, изложены в Главе 1У.

Однако такой конъюгат обладает невысокой избирательностью действия по отношению к другим клеткам. Поэтому для получения более специфичного ИТ использовали аффинно выделенные кроличьи антитела к l -цепям igG человека. Конъюгат таких антител с А-цепью рицина обладает специфическим цитотоксическим действием на опухолевые клетки лимфомы Беркитта ЕВ-3, несущие на поверхности ig , но не активен для клеток, не несущих специфического антигена. Изучено действие данного ИТ на распределение по клеточному циклу популяции клеток ЕВ-3. Предложен эффективный способ усиления действия полученного ИТ с помощью конъюгата, содержащего В-цепь рицина и антитела против igG кролика. Результаты изложены в Главе IУ.

Во многих случаях опухолевые клетки не несут специфических маркеров. Однако часто на их поверхности имеются дифферен-цировочные антигены. Одним из наиболее изучаемых видов ИТ являются конъюгаты, содержащие антитела к таким антигенам. В данной работе описана модельная система, состоящая из опухолевых эритробластных клеток мыши и конъюгата А-цепи рицина и моноклональных антител против дифференцировочного антигена эритробластов. Этот антиген присутствует на поверхности нормальных и опухолевых эритробластов и ретикулоцитов, но отсутствует у эритроцитов и стволовых кроветворных клеток. Это белок с мол. массой 69 кД. Аналогичный антиген обнаружен и у других млекопитающих, в том числе и человека. Обработка опухолевых клеток in vitro конъюгатом А-цепи рицина и антител против антигена эритробластов эффективно ингибирует синтез белка в этих клетках в культуре клеток и подавляет рост селезеночных колоний in vivo . При этом данный конъюгат обладает высокой специфичностью действия и не оказывает заметного действия на клетки, у которых этот антиген отсутствует, в том числе и на стволовые кроветворные клетки. Результаты этих исследований изложены в Главе У. Впервые показана возможность высокоэффективной элиминации опухолевых эритробластных клеток с помощью ИТ, что составляет практическую ценность данной работы.

Кроме того, ИТ являются эффективным и перспективным инструментом для изучения: а) взаимоотношений различных клеточных популяций; б) поверхностных рецепторов; и в) процессов, связанных с проникновением внутрь клетки различных биологически активных веществ. Освоение методов получения и тестирования активности таких гибридов представляет как научную, так и практическую ценность работы.

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Тоневицкий, Александр Григорьевич

ВЫВОДЫ

1. В настоящей работе в трех модельных системах проведен анализ цитотоксической активности конъюгатов А-цепи растительного токсина рицина и разных препаратов антител.

В качестве векторов иммунтоксинов использовали суммарную фракцию I(?G из антисыворотки к целым клеткам, поликлональные антитела к ь-цепями igG человека и моноклональные антитела к дифференцировочному антигену эритробластов шши. Все полученные конъюгаты обладают высокой специфичностью действия на соответствующие клетки-мишени.

2. В модельной системе, состоящей из миеломных клеток мыши P3.X63 Ад8.653 и конъюгата, содержащего суммарную фракцию igG из антисыворотки против этих клеток, оценили активность конъюгатов между антителами и А-цепью рицина. Цитотоксичность конъюгатов оказалась в 30 раз ниже цитотоксичности нативного рицина, что указывает на важную роль В-цепи рицина для трансмембранного переноса А-цепи.

3. Получен конъюгат А-цепи рицина и кроличьих поликлональных антител к l-цепям igG человека. Обработка этим конъюга-том приводит к избирательной элиминации клеток лимфомы Бэркит-та ЕВ-3, несущих на поверхности ig .

4. Последовательная обработка клеток-мишеней иммунотокси-ном и конъюгатом, содержащим В-цепь рицина и антитела против вектора иммунотокеина, позволяет увеличить активность специфического конъюгата. Предложенный метод является универсальным способом усиления действия иммунотокеина. В нашей модельной системе, содержащей клетки лимфомы Бэркитта, такая обработка в 15 раз увеличивала цитотоксичность иммунотоксина.

5. Изучено действие иммунотоксина, контрольного конъюгата и изолированной А-цепи рицина на распределение популяции клеток лимфомы Бэркитта ЕВ-3 по клеточному циклу. Обработка иммунотоксином, содержащим А-цепь рицина и антитела к l-цепям igG человека, приводит к увеличению % клеток на стадии gq + gx , уменьшению % клеток на стадиях s , g2 + м . Аналогичные изменения происходят и при обработке контрольным конъ-югатом, содержащим неиммунные IgG с А-цепью рицина, но при концентрации примерно в 100 раз более высокой, чем при воздействии иммунотоксина, что указывает на высокую избирательность действия иммунотоксина.

6. Получен конъюгат А-цепи рицина и моноклональных антител против диффюренцировочного антигена эритробластов мыши. Данные иммунотоксин обладает высокой специфичностью действия в культуре опухолевых эритробластов мыши. Он в 100 раз активнее контрольного конъюгата и изолированной А-цепи рицина.

7. Высокая избирательность действия иммунтоксина установлена с помощью метода подавления роста селезеночных колоний in vivo . Описанный конъюгат эффективно ингибирует рост колоний опухолевых эритробластов, но не оказывает значительного действия на стволовые кроветворные клетки.

Использованные сокращения

1. AT - антитела

2. ИТ - иммунотоксин

3. Рд - А-цепь рицина

4. Pg - В-цепь рицина

5. ДТд - А-фрагмент дифтерийного токсина

6. ДТ^ - В-фрагмент дифтерийного токсина

7. ЛДзд - концентрация цитотоксического агента, при которой ти наблюдается 50% ингибирования включения С -лейцина

8. DDC-Na - додецилсульфат Ыа.

9. СПДП - n- сукциншлидил-3/2 пиридилдитио/пропионат 10. АГ - антиген.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Иммунотоксины представляют собой новое направление в фармакологии. Высокая специфичность действия обусловливается прямой доставкой активного начала, в данном случае токсина, к клеткам-мишеням с помощью антител к поверхностным антигенам этих клеток. Ясно, что для успешного применения ИТ на практике еще необходимы дополнительные сведения о структуре ИТ, механизме его действия, физиологических последствиях его применения на уровне целого организма. На сегодняшний день на основании полученных за последние 5-6 лет результатов в этой области наиболее перспективными являются следующие способы использования конъюгатов: обработка костного мозга перед пересадкой при разv о личных имглунодефицитных состояниях и различных лейкозах; модуляция специфического иммунного ответа путем воздействия на ре-гуляторные клетки (киллеры, супрессоры). Кроме того, ИТ найдут широкое применение и в фундаментальных исследованиях по изучению поведения клеточных рецепторов, их взаимосвязи с состоянием клетки.

Одна из задач настоящей работы заключается в отработке методов конъюгирования А-цепи рицина и антител, тестирование спе-циф)ическ0й активности составных частей иммунотоксина и оценке цитотоксического действия конъюгатов. В качестве конъпгирующе-го агента использовали гетеробифункциональный реагент n -сукци-нимидил-З/2-пиридилдитио/пропионат. Его использование позволяет соединить Рд и AT s-s связью, что соответствует связи между субъединицами в нативном рицине. Это важно для проявления цито-токсической активности гибрида. Этот метод конъюгирования белков предложен в / 70 / и получил широкое распространение цри получении иммунотоксинов. В нашей работе эффективность конъюгирования {% AT, перешедших .в состав гибридов) составляет от 40 до 55%. Качественный состав препарата иммунотоксина определяли электрофоретически. В работе использовали конъюгаты, в которых на I молекулу AT приходилось как I молекула Рд, таге и до 4 молекул Рд. По литературным данным оптимальное количество Рд -2 молекулы на I молекулу вектора.

Сохранение активности антител после конъюгирования проверяли, как правило, с помощью непрямого ж1муноашуор есцентного метода. Если антиген тлеется в изолированном состоянии, то с помощью радиоиммунологического метода можно количественно оценить активность AT в составе гибрида. В нашей работе такую оценку провели для конъюгата Рд и поликлональных AT к ь -цепям igG человека. После конъюгирования AT сохраняют 65% активности.

Наличие в гибриде Рд устанавливают с помощью электрофореза в отсутствие восстанавливающих s-s связь агентов. Денсито-граммы таких гелей представлены, например на Рис. 5. Кроме того, наличие Рд можно определить по его ферментативной активности. Для этого использовали бесклеточную белок-синтезирующую систему из ретикулоцитов кролика. Рд ингибирует включение -^С -лещина в осаждаемый трихлоруксусной кислотой продукт. Подробно это тестирование описано в Главе Ш. Интересно отметить, что активность изолированной Рд примерно в 10 раз выше, чем у Рд в составе гибрида. Это связано, по-видимому, с тем, что А-цепь максимально активна в свободном состоянии. Полученные данные согласуются с результатами работы / 3 /.

Цитотоксическее действие различных препаратов оценивали по ингибированию а) роста клеток в культуре; б) включения 14С -лейцина клетками-мишенями в культуре; в) роста селезеночных колоний in vivo . Два первых метода универсальны, т.е. применимы для любых клеток -мишеней, а третий - только для клеток, способных образовывать такие колонии. Это свойство определенных штаммов опухолевых клеток, тропных к селезенке и печени. В работе главным образом использовали метод с применением

С -лейцина, так как его можно значительно механизировать. Результаты, полученные разными методами, хорошо согласуются между собой.

Существует два основных способа получения активных высокоспецифических конъюгатов. В одном случае AT конъюгируют с целым токсином, в другой - с его ферментативной частью. Цитотоксичес-кая активность конъюгатов, содержащих целый токсин, как правило, выше (см. Табл. 4). Но для достижения специфичности действия таких конъюгатов в среду необходимо добавлять, например, в случае рицина, лактозу или галактозу, чтобы блокировать связывание В-цепи токсина. Однако это нельзя сделать при прямом использовании in vivo . Пока нет строгих доказательств того, что активность любого гибрида AT-s-s- (Рд)п ниже, чем у натив-ного рицина, так как конъюгат и токсин могут различаться по количеству доступных рецепторов на поверхности клетки, по константе ассоциации с рецепторами и, кроме того, по свойствам самих рецепторов. При обработке иммунотоксином взаимодействие с клеткой осуществляется только по строго определенным рецепторам, например, ig. Рицин же связывается со всеми компонентами поверхности, содержащими концевую галактозу. Возможно, это определяет и различные пути транспорта А-цепи в цитоплазму. Для определения максимальной активности конъюгатов AT- s-s -Рд использовали иммунотоксин, содержащий суммарную фракцию igG из антисыворотки против целых клеток. В такой модельной системе связывание конъюгата аналогично связыванию рицина по гетерогенности рецепторов и примерно одинаковому их количеству для В-цепи и антител. Содержание AT в суммарной фракции igG от 5 до 10%. С учетом этого активность рицина в несколько раз выше, чем у конъюгата AT- s-s-Рд. Это црямо указывает на то, что В-цепь выполняет не только векторные функции, но и способствует трансмембранному переносу А-цепи. В работе / 5 / в такой же модельной системе тестировали конъюгат, содержащий Fab -фрагменты суммарной фракции igG из антисыворотки. Активность такого иммунотоксина в 10 раз ниже, чем у нас. Это указывает на важность наличия двух центров связывания у вектора гибрида. Интересно отметить, что В-цепь рицина также имеет два центра связывания галактозы.

Одно из основных свойств активного специфического иммунотоксина - высокая избирательность действия. При обработке должны элиминироваться клетки, несущие специфический антиген, но сохраняться клетки, не имеющие такого антигена. Недостатком конъюгатов, содержащих AT цротив целых клеток, является низкая избирательность действия. Изучение цитотоксических свойств конъюгатов и способов увеличения их активности целесообразнее проводить на более специфических моделях. Для этого был получен конъюгат Рд и поликлональные AT цротив l-цепей IgG человека. Активность такого иммунотоксина для клеток лимфомы Бэркитта ЕВ-3, несущих на поверхности ig , в 100 раз выше, чем у контрольного конъюгата, содержащего igG из нормальной сыворотки.

Влияние различных цитотоксических агентов на распределение клеток-мишеней по стадиям клеточного цикла является одной из важнейших характеристик препарата и отражает механизм его действия. В нашей работе мы попытались оценить такое влияние при обработке клеток лимфомы Бэркитта, описанным выше иммунотоксином. Наблюдается значительное уменьшение клеток на стадии s , увеличение числа клеток на стадии gq+ g1 и незначительное уменьшение на стадии G2 + м . Аналогичный эффект дает обработка изолированной А-цепыо рицина и контрольным конъюгатом, но для этого требуется примерно в 100 раз более высокая концентрация таких агентов. Как правило, конъюгаты AT- s-s -Рд дают примерно 100кратное превышение над активностью контрольного конъюгата (см. Табл. 4). Однако это не всегда достаточно для эффективного их использования, поэтому вопрос о способах усиления цито-токсического действия -является очень актуальным. Недавно было предложено 2 интересных метода. Один - обработка клеток-мишеней смесью конъюгатов AT-s-s-Рд и AT-s-s -Pg / 46 /, второй -последовательная обработка конъюгатом AT-s-s -Рд и изолированной Pg / 13,76 /. Достоинства и недостатки обоих методов изложены в Главе Ш. В настоящей работе мы сравнили эти два метода и новый, достаточно эффективный способ усиления действия иммунотоксина. Клетки-мишени последовательно обрабатывали конъюгатом AT- s-s—Рд, а затем АТЙ- s-s -Pg, где АТЙ - антитела против вектора иммунотоксина. В нашей модельной системе, содержащей клетки лимфюмы Бэркитта, этот метод давал 15-20-кратное усиление активности, что выше, чем при обработке смесью АТ-Рд и AT-Pg, но несколько ниже, чем при обработке АТ-Рд и Pg.

Одна из основных проблем при достижении направленного воздействия на определенные клетки-мишени - поиск специфических антигенных маркеров и получение к ним антител. Как правило, опухолевые клетки не обладают высокоспецифическими маркерами, но часто несут на поверхности дифференцированные антигены, присущие всем нормальным клеткам, находящимся на данной стадии развития.

Успешное применение иммунотоксина в этом случае возможно при условии быстрого восстановления популяции нормальных клеток, несущих такой антиген. В работах / 78,79 / сообщалось о наличии специфического дифференцированного антигена на поверхности эритробластных клеток мыши. Он обнаруживается, кроме того, на проэритробластах и ретикулоцитах, но отсутствует на поверхности стволовых клеток и эритроцитах. Аналогичный антиген выявлен и на эритробластных клетках других млекопитающих и человека. Кроме того, он присутствует при некоторых формах лейкозов на опухолевых клетках. В нашей работе мы использовали самоподдерживающийся штамм эритролейкоза, вызванного у мышей вирусом Раушера. Характерным признаком этих клеток является блок джхференцир овки на стадии эритробластов. Задачей настоящей работы являлось получение конъюгата А-цепи рицина и моноклональных антител (MAE-I5) против этого дифференцировоч-ного антигена эритробластов и изучение цитотоксического действия такого иммунотоксина на разные клетки-мишени. Полученные данные изложены в Главе 1У. Конъюгат MAE-I5 - Рд, содержащий в среднем 2 молекулы Рд, специфически действует на эритроблас-ты мыши К-2. ЛДзд иммунотоксина при 30 мин. инкубации с этими клетками-мишенями в культуре 6 х Ю-9 М, а ЛД5д контрольного 7 конъюгата, содержащего неиммунные igG крысы, 6 х 10 ' М. Кроме того, конъюгат MAE-I5 - Рд эффективно подавляет рост опухолевых селезеночных колоний in vivo , но не оказывает значительного действия на рост колоний стволовых кроветворных клеток. Предварительная обработка иммунотоксина AT против igG крысы значительно снижает цитотоксическое действие на клетки К-2.

В заключение следует отметить, что результаты и методические приемы, разработанные при выполнении настоящей работы, могут быть использованы в дальнейших исследованиях по изучению действия конъюгатов токсинов и антител.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Тоневицкий, Александр Григорьевич, 1985 год

1. Raso V., Griffin T. Specific cytotoxicity of a human immunoglobulin directed Fab'-ricin A chain conjugate. J. Immunol. 1980, v. 125, pp 2610-2616.

2. Vitteta E.S., Krolick K.A., Miyama-Inaba M., Cushley W., Uhr J.W. Immunotoxins: A new approach to cancer therapy. Science, 1983, v. 219, pp. 644-650.

3. Masuho Y., Нага T. Target-cell cytotoxicity of a hybrid of Fab' of immunoglobulin and A-chain of ricin. Gann: Jap. J. Cancer Res., 1980, v. 71, pp. 759-765.

4. Raso V. Antibody mediated delivery of toxic molecules to antigen bearing target cells. Immunol. Rev., 1982, v. 62, pp. 93-117.

5. Youle R.J., Neville D.M. Jr. Anti-Thy 1.2 monoclonal antibody linked to ricin is a potent cell-type specific toxin. -Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1980, v. 77, pp. 5483-5486.

6. Krolick K.A., Villemez C., Isakson P., Uhr J.WVetteta E.S. Selective killing of normal or neoplastic В cells L antibodies coupled to the A-chain of ricin. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, v. 77, pp. 5419-5423.

7. Trowbridge I.S., Domingo D.L. Anti-transferrin receptor monoclonal antibody and toxin-antibody conjugates affect :, v growth of human tumour cells. Nature, 1981, v. 294, p.171-173.

8. Youle R.J., Neville D.M.Jr. Kinetics of protein synthesis inactivation by ricin-anti-Thy 1.1 monoclonal antibody hybrids. J. Biol. Chem., 1982, v. 257, pp. 1598-1601.

9. Ghose Т., Blair A.H. Antibody-linked cytotoxic agents in the treatment of cancer: current status and future prospects.

10. J. Natl. Cancer Inst., 1978, v. 61, pp. 657-676.

11. Arnon R., Sela M. Targeted chemotherapy: drugs conjugated to anti-tumor antibodies. Cancer Surveys, 1982, v. 1,pp. 429-449.

12. Moolten F.L., Schreiber B.M., Zajdel S.H. Antibodies cun-jugated to potent cytotoxins as specific antitumor agents. Immunol. Rev., 1982, v. 62, pp. 47-73.

13. Yamaizumi M., Mekada E., Uchida Т., Okada Y. One molecule of diphteria toxin fragment A introduced into a cell can kill the cell. Cell, 1978, v. 15, pp. 245-250.

14. Eiklid K., Olsnes S., Pikl A. Entry of lethal doses of abrin, ricin and modeccin into the cytosol of HeLa cells. Exp. Cell Res., 1980, v. 126, pp. 321-326.

15. Thorpe P.E., Ross W.C.J., Brown A.N.F., Myers C.D., Cumber A.J., Foxwell B.M.J., Forrester J.T. Blockade of the galactose-binding sites of ricin by its lankage to antibody. Eur. J. Biochem., v. 140, pp. 63-71.

16. Pappenheiraer A.M.Jr. Diphteria toxin. Ann. Rev. Biochem., 1977, v. 46, pp. 69-94.

17. Roberts W.K., Stewart T.S. Purification and properties a translation inhibitor from wheat germ. Biochemistry, 1979, v. 18, pp. 2615-2621.

18. Stirpe F., Pession-Brizzi A., Lozenroni E., Strocchi P., Montanaro L., Sperti S. Studies on the proteins from the seeds of Croton tiglium and of Jatropha Curcas. Biochem. J., 1976, v. 156, pp. 1-6.

19. Gasperi-Campani A., Barbieri L., Morelli P., Stirpe F. Seed extracts inhibiting protein synthesis in vitro. Biochem. J., 1980, v. 186, pp. 439-441.

20. Van Ness B.G., Howard J.В., Bodley J.W. ADP-ribosylation of elongation factor 2 by diphteria toxin. NMR spectra and proposed structured of ribosyldiphthamide and its hybrolysis products. J. Biol. Chem., 1980, v. 255, pp 10710-10716.

21. Moolten F.L., Cooperband S.R. Selective destruction of target cells by diphtheria toxin conjugated to antibody directed against antigens on the cells. Science, 1970, v. 169, pp. 68-70.

22. Moolten F.L., Zajdel S., Cooperband S. Immunotherapy of experimental animal tumors with antitumor antibodies conjugated to diphteria toxin or ricin. Ann. N.Y. Acad. Sci.,1976, v. 277, p. 690.

23. Moolten F.L., Capparell N.J., Cooperband S.R. Antitumor effects of antibody-diphteria toxin conjugates: use of hapten-coated tumor cells as an antigenic target. J. Natl. Cancer Inst., 1972, v. 49, pp. 1057-1062.

24. Thorpe P.E., Ross W.C.J., Cumber A.J., Hinson C.A., Edwards D.C. , Davies A.J.S. Toxicity of diphtheria toxin for lymphoblastoid cells is increased by conjugation to antilymphocytic globulin. Nature, 1978, v. 271, pp. 752-755.

25. Edwards D.C., Smith A., Ross W.C.J., Cumber A.J., Thorpe P.E. Davies A.J.S. The effect of abrin, anti-lymphocyte globulin and their conjugates on the immune response of mice to sheep red blood cells. Experientia, 1981, v. 37, pp. 256-259.

26. Thorpe P.E., Ross W.C.J. The preparation and cytotoxic properties of antibody-toxin conjugates. Immunol. Rev., 1982, v. 62, pp. 119-158.

27. Neville D.M., Youle R.J., Monoclonal antibody ricin or ricin A-chain hybrids: kinetic analysis of cell killing for tumor therapy. Immunol. Rev., 1982, v. 62, pp. 75-91.

28. Sandvig K., Olsnes S., Pihl A. Chemical modifications of the toxic lectins abrin and ricin. Eur. J. Biochem., 1978, v. 84, pp. 323-331.

29. Miyazaki H., Beppu M. , Terao Т., Osawa T. Preparation of antibody (JgG)-ricin A chain conjugate and its biological activity. Gann: Jap. j. Cancer Res., 1980, pp. 766-774.

30. Gilliland G.D., Collier J,R. A model system involving anti-concanavalin A for antibody targeting of diphtheria toxin fragment A. Cancer Res., 1980, v. 40, pp. 3564-3569.

31. Masuho Y., Нага Т., Noguchi T. Preparation of hybrid of fragment Fab' of antibody and fragment A of diphtheria toxin and its cytotoxicity. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1979, v. 90, p. 320-326.

32. Martinez 0., Wallace E.F., Wofsy L. Preparation of disulfide- linked conjugates of fragment A of diphtheria toxin with biotin, avidin and antibodies. Fed. Proc. Fed. Amer. Soc. Exp. Biol., 1980, v. 39, p. 719.

33. Martinez 0., Kimura J., Gottfried T.D., Seicher M., Wofsy L. Variance in cytotoxic effectiveness of antibody-toxin A hybrids. Cancer Surveys, 1982, v. 1, pp. 373-388.

34. Raso V., Griffin T. Hybrid antibodies with dual specificity for the delivery of ricin to immunoglobulin-bearing target cells. Cancer Res., 1981, v. 41, pp. 2073-2078.

35. Nisonoff A. , Rivers Mi.M. Recombination of mixture of un-valent antibody fragments of different specificity. Arch. Biochem. Biophys., 1961, v. 93, pp. 460-467.

36. Delfini C., Amici C., Belardelli F., Oberholtzez G., Sorrentino M. Concanavalin A induced inhibition of abrin and ricin activity parallel with a decrease of the number of toxin-binding uptake-elution cycles. Exp. Cell Res., 1982, v. 142, pp. 427-435.

37. Sargiacomo M., Hughes R.C. A cytotoxic, photolabile cross-linking derivative of ricin. Exp. Cell Res., 1982, v. 142, pp. 283-292.

38. Olsnes S., Pihl A. Abrin, ricin and their associated agglutinins. In: The specificity and Action of Animal, Bacterial and Plant Toxins. Receptors and Recognition, series B. ed. Cuatrecasas P., Chapman and Hall. London, 1976, v. 1,pp. 129-161.

39. Raso V., Lawrence J. Carboxylic ionophores enhance the cytotoxic potency of ligand and antibody-delivered ricin A chain. J. Exp. Med., 1984, v. 160, pp. 1234-1240.

40. Vitetta E.S., Cushley W. , Uhr J.W. Synergy of ricin A chain containing immunotoxins and ricin В chain-containing immunotoxins in vitro, killing of neoplastic human В cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, v. 80, pp. 6332-6335.

41. Vitetta E.S., Fulton J.R., Uhr J.W. Cytotoxicity of a cell-reactive immunotoxin containing ricin A chain is potentiated by an anti-immunotoxin containing ricin В chain. J. Exp. Med., 1984, v. 160, pp. 341-346.

42. Fu S.M., Winchester R.J., Kunkel H.G. Occurence of surface IgM, IgD and free light chains on human lymphocytes. J. Exp. Med., 1974, v. 139, pp. 451-458.

43. Filippa D.A., Lieberman P.H., Erlandson R.A., Koziner В., Siegel F.P., Turnbull A., Zimring A., Good R.A. A study of malignant lymphomas using light and ultramicroscopic, cytochemical and immunologic tehnics. Amer. J. Med., 1978, v. 64, pp. 259-266.

44. De Petris S., Faff M.C. Normal distribution, patching and capping of lymphocyte surface immunoglobulin studies by electron microscopy. Nature, New Biol., 1973, v. 241,pp. 257-259.

45. Uhr J.W., Vitetta E.S. The use of ricin A-chain-containing immunotoxins to kill neoplastic В cells. In: Progress in immunology, Academic Press, 1983, v. 5, pp. 1409-1416.

46. Casellas P., Carriere D., Gros 0., Laurent J.C., Poncelet P. Jansen F.K. Properties of antibody-ricin A chain conjugates (immunotoxins) in specific cell killing. In: Bacterial Protein Toxins. Academic Press, 1983, pp. 28-36.

47. Blythman H.E., Casellas P., Gros 0., Gros P., Jansen F.K., Paolucci F., Pau В., Vidal H. Immunotoxins: hybrid molecules of monoclonal antibodies and toxin subunit specifically kill tumor cells. Nature, 1981, v. 290, pp. 145-146.

48. Thorpe P.E., Mason D.W., Brown A.N.F., Simmonds S.J., Ross W.C.J., Cumber A.J., Forrester J.A. Selective killing of malignant cells in a leukaemic rat bone marrow using an antibody-ricin conjugate. Nature, 1982, v. 297, pp.594-596.

49. Raso V., Ritz J., Basala M., Schlossman S.F. Monoclonal antibody-ricin A chain conjugate selectively cytotoxic for cells bearing the common acute lymphoblastic leukemia antigen. Cancer Res., 1982, v. 42, pp. 457-464.

50. Krolick K.A., Yuan D., Vitetta E.S. Specific killing of a human breast carcinoma cell line by a monoclonal antibody coupled to the A-chain of ricin. Cancer Immunol. Immunother., 1981, v. 12, pp. 39-41.

51. Osawa Т., Watanabe Y., Yamaguchi Т., Miyazaki H. Preparation and cytotixic properties of concanavalin A- and anti-car cinoembryonic antigen antibody-ricin A chain conjugates. Cancer Surveys, 1982, v. 1, pp. 353-372.

52. Bumol T.F., Wang Q.C., Reisfeld R.A., Kaplan N.O. Monoclonal antibody and an antibody-toxin conjugate to a cell surface proteoglycan of melanoma cells suppress in vivo tumor growth. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1983, v. 80, pp. 529-533.

53. Mason D.W., Thorpe P.E., Ross W.C.J. Elimination of leukemic cells from rodent bone marrow in vitro with antibo-dy-ricin conjugates: implications for autologous marrow transplantation in man. Cancer Surveys, 1982, v. 1,pp. 389-415.

54. Volkman D.J., Atteg Ahmad, Fauci A.S., Neville D.M.Jr. Selective abrogation of antigen-specific human B-cell responses by antigen-ricin conjugates. J. Exp. Med., 1982, v. 156, pp. 634-639.

55. Moolten F.L., Capparell N.J., Zajdel S.H. Antitumor effects of antibody-diphtheria toxin conjugates. III. Cyclophos-phamide-induced immune unresponsiveness to conjugates.

56. J. Natl. Cancer Inst., 1975, v. 55, pp. 709-712.

57. Nicolson V.E., Blaustein J. The interaction of Ricinus communis agglutinin with normal and tumor cell surfaces. Biochem. biophys. acta, 1972, v. 266, pp. 543-547.

58. Olsnes S., Pihl A. Different biological properties of the two constituent peptide chains of ricin, a toxic protein inhibiting protein synthesis. Biochemistry, 19 83, v. 12, pp. 3121-3126.

59. Anderson C.W., Baum P.R., Gesteland R.F. SDS-gel-electro-phoresis of proteins. J. Virol., 1973, v. 12, pp. 241-254.

60. Ramakrishnan S.,Eagle M.R., Honston L.L. Radioimmunoassay of ricin A- and B-chains applied to samples of ricin A-chain prepared by chromatofocusing and by DEAE Bio-Gel A chromatography. Bioch. Biophys. Acta, 1982, v. 719,pp. 341-348.

61. Jones V.E. Isolation of pure normal IgG from mouse serum. Immunology, 1969, v. 16, pp. 589-592.

62. Bale W.F., Helkamp R.W., Izzo M.J., Contreras M.A., Spar131

63. L. High specific activity labeling of protein with I by the iodine monochloride method. Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 1966, v. 122, pp. 407-414.

64. Рохлин O.B., Незлин P.С. Определение антигенов с помощью фиксированных на целлюлозе чистых антител. Вопросы мед. хим., 1969, т. 15, W k, стр. 439-^1.

65. Carlsson J., Drebin Н., Axen R. Protein thiolation and reversible protein-protein conjugation. Biochem. J., 1978, v. 173, pp. 723-737.

66. Till G.E., McCullach E.A. A direct measurement of radiation sensivity of mouse bone marrow cells. Radiat. Res., 1961, v. 14, pp. 213-217.

67. Gray J.W., Coffino P. Cell cycle analysis by flow cytometry. In: Methods in Enzymology. Cell Culture. Eds. Jakoby В., Pastan I.H. N.Y. etc: Academic Press, 1979, v. 58, pp. 233-248.

68. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem., 1976, v. 72, pp. 248-254.-!Тзб1

69. Towbin Н., Staehelin Т., Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some application. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1979, v. 76, pp. 4350-4354.

70. Kearney J.F., Radbrush A. Liesegang В., Rajewsky K.

71. A new mouse myeloma cell line that has lost immunoglobulin expression but permits the construction of antibody-secreting hybrid cell lines. J. Immunol., 1979, v. 123, p. 1548.

72. Ирлин И.С,, Тихонова З.Н. Розинова Э.Н., Макарова Г.Ф., Колобков С.Л., Иевлева Е.С. Получение и свойства самоподдерживающейся суспензионной культуры мышиных эритробластов. Пробл. гематол., 1977, т. 9, стр. k2-k6.

73. Ievleva E.S., Engelhardt N.V., Abelev G.I., Specific antigen of murine erythroblast. Int. J. Cancer, 1976, v. 17, pp. 798-805.

74. Иевлева E.C., Энгельгардт H.B., Абелев Г.И. Эритроидный антиген у мышей с вирусными лейкозами. Бюлл. Экс. Биол. Мед., 197^, т. 6, стр. 82-84.

75. Мечетнер Е.Б., Розинова Э.Н., Ирлин И.С. Свойства клоногенн генных клеток самоподдерживающихся штаммов эритробластов Раушера. Пробл. гематол., 1978, т. 10, стр. 26-28.

76. Розинова Э.Н., Ирлин И.С. Получение самоподдерживающихся линий эритробластоза у мышей AKR. Пробл. гематол., 1977, т. 9, стр. hG-kS.

77. Мечетнер Е.Б., Иевлева Е.С., Розинова Э.Н., Ирлин И.С., Чижевская М.А. Свойства и идентификация клоногенных клеток лейкоза Раушера. Пробл. гематол., 1979, т. 9,стр. 51-59.