Исследование частоты мутантных по локусу гликофорина A клеток у лиц, подвергшихся действию ионизирующего излучения тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.01, кандидат биологических наук Селиванова, Елена Ивановна

• Селиванова, Елена Ивановна
• кандидат биологических наук
• 2000

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Селиванова, Елена Ивановна

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Методы биологической дозиметрии.

1.2 Метод определения клеток, мутантных по локусу гликофорина А.

1.2.1 Характеристика гликофорина А и его М и N аллельных форм.

1.2.2 Разные способы определения мутантных по локусу гликофорина А клеток.

1.2.3 Уровень частоты мутантных клеток у контрольных доноров.

1.2.4 Использование гликофоринового теста в биологической дозиметрии острого радиационного воздействия.

1.2.5 Пролонгированное облучение и уровень мутантных клеток по локусу гликофорина А.

1.2.6 Определение уровня мутаций в соматических клетках с целью оценки риска онкологических заболеваний.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Доноры.

2.2 Фенотипирование крови доноров.

2.3 Фиксация клеток.

2.4 Иммунофлуоресцентное окрашивание фиксированных эритроцитов и их анализ. Подбор оптимальных условий протекания реакции.

2.5 Приготовление биотинилированных антител.

2.6 Проверка качества биотинилирования.

2.7 Приготовление антител, меченных ФИТЦ.

2.8 Проверка качества конъюгирования антител.

2.9 Статистическая обработка результатов.

ГлаваЗ. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1 Воспроизводимость лабораторного контроля.

3.2 Зависимость выхода мутантных по локусу гликофоринаА эритроцитов от возраста контрольных доноров.

3.3 Зависимость частоты мутантных клеток от дозы острого облучения.

3.4 Зависимость частоты мутантных клеток от дозы пролонгированного облучения.

3.5 Частота мутантных клеток по локусу гликофорина А у онкологических больных.

Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

4.1 Анализ распределения эритроцитов по экспрессии М-формы гликофорина А.

4.2 Частота мутантных клеток в различных популяциях необлученных контрольных доноров.

4.3 Влияние острого облучения на уровень мутантных клеток по локусу гликофорина А.

4.4 Влияние пролонгированного облучения на уровень мутантных клеток по локусу гликофоринова А.

4.5 Повышенная частота мутантных по локусу гликофорина А клеток как возможный критерий для формирования группы риска онкологических заболеваний.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Исследование частоты мутантных по локусу гликофорина A клеток у лиц, подвергшихся действию ионизирующего излучения»

С момента открытия мутагенного действия ионизирующих излучений на живые организмы Меллером в 1927 году прошло немало времени, но проблема воздействия радиации стоит сейчас еще острее, чем прежде. Человечество реально вступило в эпоху практического применения ядерной энергии и катастроф, с ней связанных. При этом возникла острая необходимость решения таких жизненно важных проблем, как влияние повышенного фона радиации и других мутагенных факторов окружающей среды на наследственность человека; оценка влияния малых доз и отдаленных последствий облучения, как фактора, вызывающего злокачественное перерождение клеток и т. д. После аварии на ЧАЭС проблема особенно обострилась в связи с настоятельной необходимостью ретроспективной оценки накопленных доз в различных популяциях облученных людей - ликвидаторов аварии и жителей загрязненных радионуклидами территорий.

Традиционный для биодозиметрии метод - оценка нестабильных хромосомных аберраций - позволяет оценить поглощенную дозу в короткие сроки после облучения. Для оценки радиационного воздействия в отдаленные сроки более перспективными являются методы, основанные на выявлении стабильных мутаций в геноме. К их числу следует отнести методы дифференциальной окраски хромосом и флуоресцентной in situ гибридизации, позволяющие выявлять стабильные структурные мутации и ряд тестов, выявляющих мутации по отдельным генным локусам. В качестве материала для этих тестов используются клетки крови. Несомненно метод определения мутантных по локусу гликофорина А клеток является одним из наиболее перспективных в этом отношении, поскольку мутации по этому локусу способны сохраняться и даже накапливаться в течение всей жизни человека (Langlois R.G., Begbee W.L., 1987.). Кроме того, к преимуществам метода следует отнести то, что он выполняется на эритроцитах и для исследования необходимо всего 0,1 мл периферической крови, т.е. проблема доступности биоматериала решается легко. Анализ производится на проточном цитофлуориметре, что делает метод высокотехнологичным и позволяет избегать рутинных и малопроизводительных методик. Возможность использования гликофоринового теста с целью биодозиметрии исследована американскими и японскими учеными у лиц, переживших атомную бомбардировку (Langlois R.G. et al, 1987, Bigbee W.L. et al, 1990, Akiyama M. et al, 1991). Ими показано, что число мутантных клеток, выявленных данным методом, положительно коррелирует с дозой, полученной при остром облучении. Генотоксическое действие пролонгированного облучения представляется практически неизученным, несмотря на его актуальность.

Цель и задачи исследования:

Целью работы является оценка информативности гликофоринового теста для биодозиметрии и биоиндикации у людей при пролонгированном облучении в сравнении с острым облучением.

Для этого предполагалось решить следующие задачи: -проанализировать уровень мутантных клеток по локусу гликофорина А у лиц, подвергшихся острому облучению, и оценить зависимость этого параметра от дозы острого облучения; -определить частоту мутантных клеток по локусу гликофорина А после пролонгированного облучения, оценить зависимость этого параметра от дозы облучения;

-сравнить информативность метода при остром и при пролонгированном облучении;

-исследовать возможность использования гликофоринового метода для индивидуальной оценки риска отдаленных (канцерогенных) последствий облучения и формирования групп риска в отношении онкологических заболеваний.

Заключение диссертации по теме «Радиобиология», Селиванова, Елена Ивановна

ВЫВОДЫ:

1. В работе подтверждено наличие возрастной зависимости для выхода N0 мутантных клеток по локусу гликофорина А для контрольных доноров, который составляет около 3% в год от исходного уровня.

2. В работе определена зависимость выхода N0 мутантных клеток по локусу гликофорина А от дозы острого облучения. Выход N0 мутантных клеток составляет 32.2 х10~6 клеток при увеличении дозы на 1 Гр. Параметры линейной регрессии, установленные в настоящей работе, мало отличаются от значений, установленных независимо в разных лабораториях, что свидетельствует о высокой надежности и воспроизводимости метода.

3. Установлено наличие дозовой зависимости для образования N0 мутантных клеток при пролонгированном облучении. Выход

Заключение

Выполненные в данной работе исследования направлены на решение актуальной проблемы современной радиобиологии и радиационной медицины - разработку методов биоиндикации и биодозиметрии в отдаленные сроки после действия ионизирующей радиации. С этой целью проведена оценка информативности метода определения клеток мутантных по локусу гликофорина А при остром и пролонгированном облучении.

Данный метод предполагает использование проточного цитофлуориметра, что делает его высокотехнологичным и позволяет избежать рутинных методик. Современный прибор и использование моноклональных антител, меченных флуорохромами, позволило выявлять достаточно редкие события (2-4 мутантных клетки на 105 нормальных клеток) и оперативно обследовать поступающий материал.

В ходе выполнения работы была определена фоновая частота N0 и NN мутантных клеток по локусу гликофорина А у необлученных доноров. Эти данные послужили контролем для последующей работы по выявлению мутантных клеток у облученных лиц.

В результате обследования лиц, подвергшихся острому облучению более 10 лет тому назад, были подтверждены данные о сохранении радиационно индуцированных гликофориновых мутаций в организме продолжительное время. Более того, наши результаты определения зависимости доза - эффект хорошо согласуются с данными, полученными в других лабораториях мира при обследовании сходного контингента.

При обследовании лиц с пролонгированным облучением было показано, что выход N0 мутантных клеток на единицу дозы в 3-5 раз ниже, чем при остром облучении. Это приводит к уменьшению чувствительности гликофориного метода при проведении биологической дозиметрии пролонгированного облучения по сравнению с острым облучением, учитывая значительные колебания индивидуальных значений частоты мутантных клеток у контрольных лиц и различия в индивидуальной реакции на облучение. Потому существенно ухудшаются возможности использования этого метода в целях индивидуальной биологической дозиметрии. В представленной работе исследована зависимость частоты мутантных клеток от мощности облучения в двух достаточно узких диапазонах доз и показано, что эта зависимость может быть немонотонной.

Результаты определения частоты мутантных клеток у онкологических больных свидетельствуют о перспективности использования данного метода для выделения группы риска в отношении онкологических заболеваний с целью последующего наблюдения и контроля. Данный метод также может применяться для выявления лиц, непригодных по индивидуальным особенностям генома для работы в условиях, связанных с генотоксическим действием различных агентов.

Таким образом, в данной работе рассмотрены широкие возможности использования теста, выявляющего мутации по локусу гликофорина А, метода относительно нового и в нашей стране практически невыполняемого .

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Селиванова, Елена Ивановна, 2000 год

1. Аклеев А.В., Веремеева Г.А., Куоизуми С. Влияние хронического радиационного воздействия на уровень соматических мутаций в клетках периферической крови людей в отдаленные сроки// Радиационная биология. Радиоэкология -1998.-T.38.-N4.-C.573-586.

2. Бурлакова Е.Б., Голощапов А.Н., Жижина Г.Н., Конрадов А. А. Новые аспекты закономерностей действия низко интенсивного облучения в малых дозах // Радиационная биология. Радиоэкология -1999.-Т.39.-N1.-C.26-35.

3. Веремеева Г.А. Влияние хронического радиационного воздействия на уровень соматических мутаций в клетках периферической крови людей в отдаленные сроки. Автореферат кандидатской диссертации.- Москва. -1996.

4. Воробцева И.Е., Дженсен Р., Евстратов И.Е. и др. Биологическая дозиметрия и реконструкция доз облучения: реальность и перспектива // Вестник новых медицинских технологий.-1996.-T.3.-N 2. -С.9-22.

5. Имянитов Е. Н., Князев П.Г. Роль антионкогенов в опухолевом процессе // Эксперим. Онкология.-1991.-Т.14.-С.З-18.

6. Имянитов У.Н., Комочков И.В., Лыщев А.А., Того А.В. Молекулярная и клиническая онкология: точки соприкосновения // Экспериментальная онкология.-1993.-Т. 15.-С.З-8

7. Ленц. Медицинская генетика. Медицина. Москва.- 1984.тС.59.

8. Лихтенштейн А.В., Шапот B.C. Опухолевый рост: ткани, клетки, молекулы //Пат. физиол. Экспер. Тер.- 1998.-N3.-C.25-41.

9. Ю.Мораска, Эрба. Проточная цитометрия // Культура животных клеток. Методы (под ред. Фрешни). Мир.-1989.-С. 182-211.

10. П.Рождественский Л.М., Окладникова Н.Д., Смирнова и др. Оценка уровня мутаций в локусе гликофорина А у лиц, подвергавшихся хроническому воздействию ионизирующей радиации // Радиационная биология. Радиоэкология.- 1998.-T.38.-N3.-C.443-450.

11. Севанькаев А.В., Саенко А.С. Соматический мутагенез как биологический дозиметр радиационного воздействия // Радиационная биология. Радиоэкология.- 1997.-T.37.-N4.-С.560-565.

12. Севанькаев А.В., Насонов А.П. Биологическая дозиметрия по хромосомным аберрациям в культуре лимфоцитов человека // Обнинск.-1979.

13. Сугахара Т., Ватанате М., Нива О., Никайдо О. Новое в концепции радиационного канцерогенеза // Мед. Радиология и Радиацион. Безопастность.-1995.-Т5.-С.57-60.

14. Урбах В.Ю. Биометрические методы // "Наука".- Москва.-1964.-С.247-250.

15. Akiyama М., Kyozumi S, Hirai Y et al. Studes on chromosome aberrations and HPRT mutations in lymphocytes and GPA mutation in erythrocytwes ol atomic bomb survivors // Mut. and the Envir.-1990.-partC.-P.69-80.

16. Akiyama M., Nakamura N.,Hakoda M. et al. Somatic cell mutations in Atomic Bomb survivors // Radiat. Res., Supplement. -1991.-P.278-282.

17. Akiyama M., Kusunoki Y.,Umeki S. et. al.Evaluation of four somatic mutation assays as biological dosimeter in humans // Radiation Research.-1992.-V.il. -P. 177-182.

18. Akiyama M., Kyoizumi S., Hirai Y et al. Mutation frequency in human blood cells increase with age // Mutation Res.-1995.-V.338. -P.141-149.

19. Akiyama M, Umeki S, Kusunoki Yet. al. Somatic-cell mutation as a possible predictor of cancer risk//Health Phys.-1995. -V. 68(5). -P.643-649.

20. Aklyev A.V., Kossenko M.M., Silkina et al. Health effects of radiation incidents in the Southern Urals // Stem cells -1995 -V.13- Suppl.-P.58-68.

21. Albertini R. J. Somatic gene mutations in vivo as indicated by the 6-thioguanine-resistant T-lymphocytes in human blood // Mutation Res.-1985.-V.150.-P.411-422.

22. Albertini R.J., Sullivan L. M., Berman J.K.et al. Mutagenicity monitoring in humans by autoradiographic assay for mutant T lymphocytes // Mutation Res.-1988. -V.204. -P.481-492.

23. Albertini R.J., Nickas J.A., Robison S.H. et al. Human environmental monitoring using in vivo somatic cell gene mutations as indicators of adverse effects // Environ, and Mol. Mutagen.-1990.-V.15.-N17-1990.

24. Anstee D.J. Blood group MNS-active saloglycoproteins of the human erythrocyte membrane. Immunobiology of erythrocyte. (Sandler S.G.,Nusbacher J.,Schanfield M.S.,Ed.) New York.- 1980-p.67.

25. Arlett C. F., Lehmann A. R. Human disorders showing increased sensitivity to the induction of genetic damage // Annu. Rev. Genet.- 1987.-V.12.- P.95-115.

26. Awa A. A. Persistent chromosome aberration in the somatic cells of A-bomb survivors, Hiroshima and Nagasaki // J. Radiat. Res.- 1991 -Y.32. P.265-274.

27. Awa A. A, Neriishi S., Honda T. et al. Chromosome aberration frequency in cultured blood-cells in relation to radiation dose of A-bomb survivors // Lancet. -1971-V.2.-P.903-905.

28. Awa A.A., Sofuni Т., Honda T.et al. Relationship between the radiation dose and chromosome aberrations in atomic bomb survivors of Hiroshima and Nagasaki // J. Radiat. Res.-1978-V.19.-P.126-140.

29. Awa A. A., Ohtaki K., Iton M.et al. Chromosome aberration data for A-bomb dosimerty reassessment // New Dosimetry at Hiroshima and Nagasaki and Its Implications for Risk Estimates.-1988.-N9.-P. 185-202.

30. Bender M.A., Gooch P.C. Types and rates of X-ray-induced chromosome aberrations in human blood irradiated in vitro // Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A.- 1962.-V.48.-N4.-P.522-532.

31. Bigbee W.L.,Langlois R.G., Swift M.et al. Evidence for an elevated frequency of in vivo somatic cell mutations in ataxia telangiestasia // Am. J. Hum. Genet.-1989.-V.44. -P.670-674.

32. BigbeeW.L., LangloisR.G., Stanker L.H. et al. Flow cytometric analysis of erythrocyte populations in Tn syndrome blood using monoclonal antibodies to glycophorin A and Tn antigen // Cytometry.-1990.-V. 11.-P.261-271.

33. Bigbee W.L.,Jensen R.H., Veidebaum T et al. Biodosimetry of Chernobyl cleanup workers from Estonia and Latvia using the glycophorin A in vivo somatic cell mutation assay // Radiat. Research. -1997. -V.147. -P.215-224.

34. Bigbee W.L.,Jensen R.H., Veidebaum T. et al. Glycophorin A biodosimetry in chernobyl cleanup workes from the Baltic countries // В M J.-1996.-V.312.-P. 1078-1079.

35. Bishop J.M. Molecular themes in oncogenesis // Cell.-1991.-V.64.-P.235-248.

36. Cole J., Skopek T.R. Somatic mutant frequency, mutation rates and mutational spectra in the human population in vivo // Mutation Res.-1994.-V.304.-P.33-105.

37. DuPont B.R., Bigbee W.L., Grant S.G et al. Molecular analysis of glycophorin A variant reticulocytes // Environmental and Mol. Mutagen.-1991 .-V. 17.-N. 19.-P.23.(abstract)

38. Ekblom M.,Gahmberg G.G., Anderson L.C. Late expression of M and N antigens on glycoforin A during erytroid differentiation // Blood.-1985.-V.66-P.233-236.

39. Furthmayer, Structural comparison of glycophorins and immunochemical analysis of genetic variants //Nature.-1978.-V.271.-P.519-526.

40. Grant S.G, Bigbee W.L., In vivo somatic mutation and segregation at the human glycophorin A (GPA) locus: Phenotypic variation encompassing both gene-specific and chromosomal mechanisms // Mutation Res.-1993.-V.288.-P.163-172.

41. Gui H.X., Cheng W.Y. Detection of the variant frequency in human erythrocytes using glycophorin A locus mutation assay // Radiat. Prot. Dosimetry.-1998.-V.77.-N.l/2.-P.37-41.

42. Gullick G. The role of epidermal frowth factor receptor and c-erbB-2 protein in breast cancer // Int. J. Cancer.-1990.-N5.-P.55-61.

43. Hagman L.,Brogger A., Hansteen E. et al. Cancer risk in humans predicted by increased levels of chromosomal aberrations in lymphocytes :Nordic study group on the health risk of choromosome damage // Cancer Res.-1994.-V.54.-P.2919-2922.

44. Jensen R.H., Bigbee W.L. Direct immunofluorescence labeling provides an improved method for the glycophorin A somatic cell mutation assay // Cytometry.-1996.-V.23 .-P.337-343.

45. Jensen R.H.,Langlois R.G.,Bigbee W. L.,Grant S.G.,Dan Moorell, Pilinskya M.,Vorobtsova I.,Pleshanov P. Elevated freguency of Glycophorin A mutations in erythrocytes from Chernobyl accident victims // Radiatian Research.- 1995 .-V. 141 .-P. 129-13 5.

46. Jensen R.H., Leary J.F. Mutagenesis as measured by flow cytometry and cell sorting // Flow cytometry and sorting.-1990.-Wiley-Liss,Inc.-P.553-562.

47. Jensen R.H., Langlois R.G., Bigbee W.et al. Laser-based flow cytometric analysis of genotocity of human exposed to ionising radiation during the Chernobyl accident // SPIE, Laser applications in life sciences.-1990.-V.1403.-P.372-380.

48. Kyoizumi S., Nakamura N., Hakoda M. et.al.Detection of somatic mutations at the Glycoforin A locus in erithrocytes of Atomic bomb survivors using a single beam Flow sorter // Cancer Reseach.- 1989.-V.49.-P.581-589.

49. Kyoizumi S., Akiyama M., Cologne J.B. et al. Somatic cell mutations at the Glycoforin A locus in erithrocytes of Atomic bomb survivors: implication for radiation carcinogenesis // Radiat. Res.-1996.-V.146.-P.43-52.

50. Langlois R.G., Bigbee W.L., Jensen R.H. Measurements of the frequency of human erythrocytes with gene expression loss phenotypes at the glycophorin A locus // Hum. Genet.-1986.-V.74.-P.353-362.

51. Langlois R.G., Bigbee W.L., Kyozumi S., Nakamura N., Bean M.A.,Akiyama M., Jensen R.H. Evidence for increased cell mutations at the glycoforin A locus in atomic bomb survious // Science.- 1987.-P.236.

52. LangloisR.G., Nisbet В.А., Bigbee W.L., Ridinger D.N., Jensen R.H. An improved flow cytometric assay for somatic mutation at the Glycoforin A locus in humans // Cytometry.- 1990.-V.11.-P.513-521.

53. Langlois Bigbee W.Z.,Jensen R.M.Flow cytometric characterization of normal and variant cells with monoclonal antibodies specific for glycophorin A // J.Immunol.- 1985.-V.134.-P.4009-17.

54. Livingston G. K., Jensen R.H, Silberstein E.B.et al. Radiobioligical evaluation of immigrants from the vicinity of Chernobyl // Int. J. Radiat. Biol.-1997.-V.72.-N6.-P.703-713.

55. Lloyd D.C., Purrott R.J., Dolphin G.W.et al. The relatioship between chromosome aberrations and low LET radiation dose to human lymphocytes // Int. J. Radiat. Biol.-1975.-V.28.- P.75-90.

56. Lloyd D.C., Purrott R.J., Ruder E.J. The incide of unstable chomocome aberrations in peripheral blood lymphocytes from unirradited and accupationally fxposed people // Mut. Res.-1980.-V.72.-P.523-532.

57. Loken M.R., Shah V.O., Dattilio K.L., Civin С. I. Flow cytometric analysis of human bone marrow. I. Normal erythroid development // Blood. 1987. -V.69. - P.255-263.

58. Maurer J., Janssen J.W.G., Thiel et al., Detection of chimeric BCR-ABL genes in acute lymphoblastic leukemia by the polymerase chain reaction // Lancet.-1991.-V.337.-P. 1055-1058.

59. Menichine P., Abbondandolo A. Somatic gene mutation in Humans // New Horizons in Biological Dosimetry-1991.-P.267-279.

60. Mott G.M., Boyese J., Hewitt M., Radford M. Do mutation at the glycophorin A locus in pacients treated for Hodgkin s disease predict secondary leukaemia?// The Lancet.-1994.-V.343.-P.828-829.

61. Sala-Trepat M., Boyese J., Richard P.et al. Frequency of HPRT-lymphocytes andglycophorin A variants erythrocytes in Fanconi anemia patients, their parents and control donors // Mutation Res.- 1993.-V.289.-P.115-126.

62. Sevan'kaev A.V., Lloyd D.S., Edwards A.A., Moiseenko V.V. High exposures to radiation received by workers inside the Chernobyl sarcophagus // Radiat. Prot. Dosimetry.-1995.-V.59.-N2.-P.85-91.

63. Skvortsov V., Ivannikov A., Stepanenko et. al. Application of EPR retrospective dosimetry for large-scale accidental situation // International

64. Conference on Biodosimetry and 5 Internation Symposium on ESR Dosimetry and Applications.-Moscow/Obninsk.-1998.-P.45.

65. Slamon D.J., Clark G.M., Wong S.G. human breast cancer: correlation of relapse and survival with amplification of the HER-2/NEU oncogene //Science.-1987.-V.235.- P. 117-182.

66. Straume Т., Langlois R.G., Lucas J.et al. Novel biodosimetry methods applied to victims of the Goiania accident // Health Physics.-1991.-V.60.-P.71-76.

67. Tates A.D., Bernini L.F., Natariajan A.T.et al. Detection of somatic mutations in man, HPRT mutations in lymphocytes and hemoglobin mutations in erythrocytes // Mutation Res.-1989.-V.213.- P.73-82.

68. Tawn E.J., Daniel C.P., Whitehouse C.A.et al. Advances in the approach to the study of somatic mutations in workes occupationally exposed to ionising radiation // Health effects of low dose radiation.- BNES.- London.-1997.

69. Tomita M, Furthmayer H., Marchesi V.I. Primary structure of human erythrocyte glycophorin A. Isolation and characterization of peptides anc complete amino acid sequence // Biochemestry.-1978.-V.17.-P.4756-4770.

70. Tucker .D.,Tawn E.J.,Holdsworth D. Biological dosimetry of radiatior workers at the Sellafild nuclear facility // Radiation Reseach 148,216-226 1997.