Исследование эффектов действия антител к кальций-связывающему белку S100 на изменения поведения у виноградной улитки и нематоды C.elegans тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.13, кандидат биологических наук Тимошенко, Алия Халиловна

• Тимошенко, Алия Халиловна
• кандидат биологических наук
• 2007

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Тимошенко, Алия Халиловна

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Внутриклеточные сигнальные системы.

2.1.1. Аденилатциклазная сигнальная система.

2.1.2.140-сигнальная система.

2.2. Внутриклеточная кальциевая система сигнализации.

2.2.1. Са как универсальный вторичный посредник.

2.2.2. Внутриклеточная регуляция свободного кальция.

2.2.3. Внутриклеточные кальциевые буферы.

2.3. Кальций-связывающий белок 8100 и его функции.

2.3.1. Кальций-связывающий белок 8100: открытие и специфические особенности.

2.3.2. Функциональная роль кальций-связывающего белка Б

2.3.2.1. Внутриклеточные функции белков 8100.

2.3.2.2. Внеклеточные функции белков 8100.

2.3.3. Исследования роли кальций-связывающего белка 8100 с применением антител к нему.

2.3.4. Кальций-связывающий белок 8100 и нервно-патологические процессы.

2.4. Пластичность поведения.

2.4.1. Оборонительное поведение и локомоция у виноградной улитки.

2.4.2. Простые формы обучения и ассоциативное обучение у виноградной улитки.

2.4.3. Тепловой стресс и сенсорная изоляция свободноживущей почвенной нематоды СаепогкаЪйШз е1е%ат как модели экстремального воздействия.

2.5. Долговременная сенситизация.

2.5.1. Долговременная сенситизация оборонительного рефлекса у виноградной улитки, длительность его сохранения.

2.5.2. Роль серотонина и дофамина в формировании долговременной сенситизации.

2.5.3. Мембранные и кальций-зависимые метаболические механизмы долговременной сенситизации.

3. ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

3.1. Объекты исследования.

3.1.1. Виноградная улитка Helix lucorum.

3.1.2. Почвенная нематода Caenorhabditis elegans.

3.2. Растворы, использованные в исследовании.

3.2.1. Использованные антитела.

3.3. Методы исследования.

3.3.1 Выработка долговременной сенситизации и тестирование поведенческих реакций

3.3.2. Экспериментальные группы животных (виноградная улитка).

3.3.3. Количественное измерение содержания оксида азота.

3.3.4. Препарат. Регистрация электрических характеристик нейронов.

3.3.5. Определение термостабильности локомоции свободноживущей почвенной нематоды С.elegans.

3.3.6. Тестирование локомоции C.elegans.

4. РЕЗУЛЬТАТЫ ИСЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЕ.

4.1. Исследование эффектов влияния антител к Са - связывающему белку S100 на формирование долговременной сенситизации у виноградной улитки.

4.1.1. Динамика формирования долговременной сенситизации: анализ оборонительного поведения и локомоции.

4.1.2. Эффекты влияния антител к Са2+- связывающему белку S100 на формирование долговременной сенситизации.

4.2. Исследование роли оксида азота и мембранных механизмов влияния антител к Са2+- связывающему белку S100 на формирование долговременной сенситизации

-у ¡.

4.2.1. Исследование мембранных механизмов влияния антител к Са" -связывающему белку S100 на формирование долговременной сенситизации.

4.2.2. Исследование роли оксида азота в эффектах влияния антител к Са2+- связывающему белку 8100 на формирование долговременной сенситизации методом ЭПР спектроскопии.

4.3. Исследование эффектов влияния антител к Са2+- связывающему белку 8100 на нарушения локомоции нематоды C.elegans тепловым стрессом и сенсорной изоляцией

4.3.1. Исследование влияния антител к Са - связывающему белку 8100 на нарушения локомоции нематоды С.е1е%ат тепловым стрессом.

4.3.2. Исследование влияния антител к Са - связывающему белку 8100 на нарушения локомоции нематоды С.е^ат сенсорной изоляцией.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Исследование эффектов действия антител к кальций-связывающему белку S100 на изменения поведения у виноградной улитки и нематоды C.elegans»

Актуальность исследования. Известно, что в долговременных формах пластичности важную роль играют ионы кальция (Hawkins R.D. et al., 1993; Schaffhausen J.H. et al., 2001, Balaban P.M. et al., 2004). Ионы Са2+ участвуют в регуляции разнообразных нейрональных процессов, что обусловлено их специфическими физико-химическими характеристиками, благодаря которым они являются наиболее универсальными внутриклеточными посредниками (Костюк П.Г. и др., 1998; Бухараева Э.А. и др., 2001; Зефиров A.JL, Ситдикова Г.Ф., 2002; Rizzuto R. et al., 2002; Rusakov D.A., 2006). Ионы кальция, осуществляя связь между электрическими явлениями, происходящими в поверхностной мембране клетки, и реакциями, протекающими внутри нее, принимают непосредственное участие в интегративной деятельности нервной клетки (Berridge M.J., 1998; Verkhratsky А., 2005). Исключительно высокая способность внутриклеточной среды связывать ионы кальция определяется наличием в ней эффективных буферных систем. Они состоят главным образом из Са2+ -связывающих белков (Костюк П.Г., 1986; Brini M., Carafoli Е., 2000). Все Са2+-связывающие белки классифицируют на три группы: EF-hand белки, Са2+/фософолипид-связывающие белки и Са2+-запасающие белки (Braunewell К.-Н., Gundelfînger E.D., 1999; Северин Е.С. и др., 2001). Интенсивно исследуются в последнее время функции такого Са -связывающего белка, как белок S100 (Heizmann C.W. et al., 2002; Donato R., 2003).

S100 - это группа белков, характеризуемых наличием Са2+- связывающих доменов и наличием таких фундаментальных свойств как ткане- (мозго-) специфичность, эволюционная стабильность и способность связывать ионы Са2+, взаимодействуя с ними (Baudier J., et al., 1986; Kubista H. et al., 1999; Santamaria-Kisiel L. et al., 2006). Эволюционная стабильность этого белка была отмечена еще в первых исследованиях его распределения в тканях разных животных. S100 обнаруживаются у всех позвоночных (Moore B.W., 1973) и у многих беспозвоночных (Donato R., 1999), например, у виноградной улитки (Jankovic B.D., 1985; Штарк М.Б., 1985; Kubista H. et al., 1996). Функции белков SlOO можно разделить на внутриклеточные и внеклеточные (Donato R., 1999; 2003). Внутриклеточные функции белков S100 разделяются по следующим разделам: регуляция фосфорилирования белков, регуляция ферментативной активности, регуляция Са2+-гомеостаза, регуляция динамики цитоскелета и его компонентов. Внеклеточные функции белков S100 разделяются по следующим разделам: нейротропные эффекты дисульф и дно-связанного димера белка S100, участие этого белка в дегенеративных заболеваниях, участие в формировании когнитивного поведения и ряд других функций. Белок S100В является успешным маркером мозговых нарушений (Anderson R.E. et al., 2001; PelinkaL.E. et al., 2004; Delgado P. et al., 2006).

Оксид азота (II) (NO) является внутри- и межклеточным посредником, выполняющим различные сигнальные функции (Schuman Е.М., Madison D.V., 1994; Ванин А.Ф., 1998; Реутов В.П. и др., 1998; Уразаев А.Х., Зефиров А.Л., 1999). Эффекты оксида азота связаны с его влиянием на ионные каналы, секрецию медиатора, обмен ионов кальция, метаболизм клетки и ее геном (Мухтаров М.Р. и др., 2000; Erxleben С., Hermann А., 2001; Яковлев A.B. и др., 2002;). В последние годы NO-синтезирующие нейроны обнаружены и в нервной системе беспозвоночных, в том числе моллюсков (Huang Е.Р., 1997; Gelperin А., 2000). Показано, что серотонин и доноры NO взаимно усиливают эффекты друг друга (Дьяконова Т.Л., 2000). Найдены доказательства, что белок S100B производит нейротоксический эффект in vitro, вызывая апоптоз как в нейрональных, так и глиальных клетках за счет активации NO-синтазной активности (Hu J. et al., 1996). Имеющиеся результаты предполагают, что пока белок S100В удерживается внутри клетки на физиологическом уровне экспрессии он оказывает протекторный эффект, в то время как повышение или понижение его концентрации будут нарушать нормальное протекание'процессов в клетке (Scotto С. et al., 1998 а).

Молекулярные механизмы сохранения следов памяти широко исследуются в контексте взаимоотношений ассоциативного обучения с сенситизацией как элементарной формой обучения, при которой животное учится усилению ответной реакции на ранее неэффективный стимул, следующей за нанесением сильных стимулов в другом участке (Балабан П.М., Захаров И.С., 1992; Гайнутдинов X.JI. и др., 2002). В настоящее время большое внимание привлекает такая нейробиологическая модель долговременных модификаций поведения как долговременная сенситизация (Cleary L.J. et al., 1998; Philips G.T. et al., 2006). Она позволяет успешно исследовать мембранные механизмы формирования устойчивых очагов возбуждения в нервной системе животного (Castellucci V.F. et al., 1986; Гайнутдинов Х.Л., Береговой H.A., 1994; Никитин В.П., Козырев С.А., 1995; Antzoulatos E.G., Byrne J.H., 2007). Долговременная сенситизация (ДС), являясь видонеспецифическим феноменом, т.е. присущим животным разного уровня организации (Кэндел Э., 1980; Antzoulatos E.G. et al., 2006), позволяет проводить исследование реакций высших животных на относительно простых объектах или моделях, удобных для анализа.

Таким образом, анализ литературы показывает, что роль Са2+-связывающего белка S100B, кальциевой системы, а также оксида азота в проявлении долговременных эффектов сенситизации на уровне поведения животного и характеристик нейрональной мембраны выяснены недостаточно и их исследования являются актуальными.

Цель и основные задачи исследования. Целью работы явилось исследование эффектов действия антител к Са2+-связывающему белку S100B на формирование долговременной сенситизации у виноградной улитки и на нарушения локомоции тепловым стрессом и сенсорной изоляцией у нематоды C.elegans. В соответствии с этой целью были поставлены следующие задачи:

1. провести анализ эффектов действия антител к Са2+-связывающему белку S100B на формирование долговременной сенситизации у виноградной улитки,

2. исследовать мембранные механизмы и роль оксида азота в развитии эффектов действия антител к Ca -связывающему белку S100B на формирование долговременной сенситизации,

3. провести анализ эффектов действия антител к Са2+-связывающему белку S100B на нарушения локомоции у нематоды C.elegans тепловым стрессом,

4. исследовать эффекты действия антител к Са2+-связывающему белку S100В на нарушения локомоции у нематоды C.elegans сенсорной изоляцией.

Положения, выносимые на защиту:

1. Введение антител к Са2+-связывающему белку S100 в разведении 10~12 перед началом формирования долговременной сенситизации оказывает протекторный эффект на оборонительное поведение виноградной улитки. Найдено, что данный протекторный эффект сопровождается частичным восстановлением мембранного и порогового потенциалов командных нейронов и уровня синтеза оксида азота в нервной системе и сердце виноградной улитки.

2. Преинкубация нематоды САе^ат в среде, содержащей антитела к Са2+-связывающему белку Б100 в разведении 10"12, повышает как базовую термостабилыюсть локомоции С.е\е%ат, так и эффективность быстрой адаптации червей к переносимому организмом повышению температуры среды (вызывает увеличение среднего времени появления ошибок моторной программы плавания, индуцированных повышением температуры).

Научная новизна. Впервые обнаружено, что введение антител к Са2+-связывающему белку 8100 в разведении 10"12 препятствует формированию долговременной сенситизации оборонительных реакций у виноградной улитки без влияния на двигательную активность животного. Впервые найдено, что при л . предварительном введении антител к Са -связывающему белку 8100 при нанесении электрошоков улитке мембранный и пороговый потенциалы командных нейронов имеют более высокое значение, чем после ДС. Экспериментально методом ЭПР спектроскопии показано, что после формирования долговременной сенситизации в нервной системе и сердце виноградной улитки происходит снижение продукции оксида азота. Впервые найдено, что протекторный эффект 2+ антител к Са -связывающему белку 8100 у виноградной улитки сопровождается частичным восстановлением уровня синтеза оксида азота в нервной системе и сердце.

Впервые показано, что преинкубация C.elegans при 20°С в среде,

2+ 12 содержащей антитела к Са -связывающему белку 8100 в разведении 10" , вызывает увеличение среднего времени появления ошибок моторной программы плавания, индуцированные повышением температуры до 36°С. Впервые показано, что ингибитор синтеза белков циклогексимид не оказывает влияния на эффективность адаптации C.elegans к высокой температуре, т.е. экспрессия генов стрессовых белков не может быть причиной повышения термостабильности локомоции С.е1е%ат двухчасовой экспозицией к температуре +30°С. Впервые показано, что А8100 в разведении 10"12 замедляют развитие нарушений спонтанной локомоции сенсорной изоляцией, причем максимальный протекторный эффект

А8100 наблюдается в первые 30 минут изоляции.

Научно-практическая ценность. Полученные результаты позволяют составить более полное представление о роли Са2+-связывающих белков в механизмах пластичности и в изменениях поведения. Протекторный эффект антител к Са2+-связывающему белку S100 в разведении 10"12 при применении перед началом формирования нейробиологической модели тревожности и депрессивного состояния позволяет определить пути поиска фармакологических веществ, способных влиять на нарушения поведения. Полученные результаты, видимо, свидетельствуют, что дисбаланс Са -связывающего белка S100 может привести к торможению или изменению хода определенных процессов, развивающихся при формировании пластических перестроек в организме и, особенно при патологических процессах. Результаты свидетельствуют об участии мембранных структур в развитии протекторного эффекта антител к S100 на формирование долговременной сенситизации. Полученные результаты позволяют составить более полное представление о роли оксида азота в механизмах долговременной сенситизации. Прямыми измерениями N0 методом ЭПР спектроскопии показано, что формирование долговременной сенситизации у виноградной улитки сопровождается снижением продукции оксида азота. Данный результат может помочь в выборе стратегии применения фармакологических веществ при нарушениях поведения и деятельности нервной системы. Полученные результаты используются при чтении курсов лекций в КГУ и ТГГПУ.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы доложены на: Conference of the International Society for Invertebrate Neurobiology (Kaliningrad, 2003 г), VI Республиканской научной конференции Актуальные экологические проблемы республики Татарстан (Казань, 2004 г), Международной научной конференции «Актуальные проблемы экологической физиологии, биохимии и генетики животных» (Саранск, 2005 г), 9-ой и 10-ой Путинской Международной школы-конференции молодых ученых (Пущино, 2005, 2006 гг), 9-ой Всероссийской конференции молодых исследователей «Человек и его здоровье» (Санкт-Петербург, 2006 г). Conference of the International Society for Invertebrate Neurobiology (Kazan, 2006 г), VIII Всероссийском симпозиуме "Растущий организм" (Казань, 2006 г.), Международном симпозиуме "Активные формы кислорода, азота и хлора в регуляции клеточных функций в норме и при патологии" (Гродно, 2006 г.), Самойловских чтениях (Казань, 2007 г.), XX Съезде физиологического общества имени И.П.Павлова (Москва, 2007 г.), Conference of the International "Modern Developments in Magnetic Resonance Imaging and Spectroscopy in Medicine" (Kazan, 2007 г.).

Реализация результатов исследования. Материалы исследования отражены в 4 статьях, опубликованных в рецензируемых журналах, и в 16 тезисах докладов.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа объемом 142 страниц состоит из введения, обзора литературы, описания объекта и методов исследования, главы результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов и указателя цитируемой литературы. Список цитируемой литературы включает 275 источника, из них 173 - иностранных авторов. Диссертация иллюстрирована 30 рисунками.

Заключение диссертации по теме «Физиология», Тимошенко, Алия Халиловна

выводы

1. Введение антител к кальций-связывающему белку S100 в разведении 10"12 перед началом процедуры сенситизации блокирует формирование долговременной сенситизации у виноградной улитки: препятствует увеличению оборонительных реакций закрытия пневмостома и отдергивания омматофоров.

2. Введение антител к кальций-связывающему белку S100 в разведении 10"12 перед началом формирования долговременной сенситизации не оказывает влияния на локомоторную активность виноградной улитки.

3. Введение антител к кальций-связывающему белку S100 в разведении 10"12 перед началом процедуры сенситизации препятствует снижению мембранного и порогового потенциалов командных нейронов до уровня, характерного для долговременной сенситизации.

4. После формирования долговременной сенситизации у виноградной улитки в тканях нервной системы и сердца происходит снижение продукции оксида азота.

12

5. При введении антител к кальций-связывающему белку S100 в разведении 10' перед началом формирования долговременной сенситизации происходит частичное восстановление содержания оксида азота в тканях нервной системы и сердца виноградной улитки.

6. Преинкубация нематоды C.elegans при 20°С в среде, содержащей антитела к

1 "7 кальций-связывающему белку S100 в разведении 10" , вызывает увеличение среднего времени появления ошибок моторной программы плавания, индуцированных повышением температуры до 36°С.

7. В жидкой среде, без агара, большие группы червей (нематода C.elegans) при высокой их плотности не только сохраняют способность к спонтанной локомоции в течение 4 часов при 19°С, но и повышают устойчивость спонтанной локомоции червей при последующем ее индивидуальном измерении.

8. Введение в среду AS 100 в разведении 10"12 замедляет развитие нарушений спонтанной локомоции сенсорной изоляцией, причем максимальный протекторный эффект AS 100 наблюдается в первые 30 минут изоляции.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Ионы Са играют огромную роль в запуске различных клеточных реакций. Биохимический механизм такого запуска состоит из двух основных звеньев: во-первых, поступающие в клетку во время ее возбуждения ионы Са2+" взаимодействуют со специфическими нейронными белками, кальмодулином и тропонином С; во-вторых, комплексы Са2+-белок, которые взаимодействуют со специфическими энзиматическими системами, обеспечивающими фосфорилирование других белков, непосредственно участвующих в выполнении соответствующей клеточной функции (Костюк П.Г, 1986; Blackwell К.Т, AIkon D.L, 1999; Verkhratsky А, 2005). Очень интересно, что в запуске биохимических процессов непременно принимают участие ионы Са2+, запускающие каскад вторичных посредников, набор которых одинаков в пре- и постсинаптических нейронах, но изменения могут идти разными путями (Smith С. et al, 1998; Brini М, Carafoli Е, 2000; Rizzuto R, Pozzan T, 2006). В отличие от большинства других вторичных посредников, например циклических нуклеотидов, диацилглицерина, фософоинозитидов и др, представляющих собой быстро метаболизирующие эффекторные молекулы,

Са2+ является неметаболизирующим (стабильным) посредником. Следовательно, его внутриклеточный уровень регулируется иным способом, а именно посредством изменения концентрации, доступной Са -связывающим белкам-мишеням (Пивоваров А.С. и др, 1989; Brini М, Carafoli Е, 2000; Крутецкая З.И. и др, 2003). К последним относятся также Са -связывающие белки, которые непосредственно модулируют активность различного рода эффекторных молекул. Согласованная работа всех перечисленных механизмов приводит к тому, что выполняется главное условие, определяющее возможность выполнения кальцием функции вторичного посредника - наличие высокого концентрационного градиента. После прекращения действия сигнала системы активного и пассивного связывания ионов понижают концентрацию Са2+ в цитоплазме до исходного уровня (Meldolesi J, Pozzan Т, 1998; Северин Е.С. и др, 2001; Berridge M.J. et al, 2003; Нистратова В.Л, Пивоваров А.С, 2004).

Интенсивно исследуются в последнее время функции такого Са -связывающего белка, как белок S100 (Heizmann C.W. et al, 2002; Donato R, 2003). SI00 - это группа белков, характеризуемых наличием Са2+- связывающих доменов рис. 29) и наличием таких фундаментальных свойств как ткане- (мозго-) специфичность, эволюционная стабильность и способность связывать ионы Са2\ взаимодействуя с ними (Baudier J, Gerard D, 1983; Fano G. et al, 1995; Kubista H. et al, 1999; Santamaria-Kisiel L. et al, 2006). Эволюционная стабильность этого белка была отмечена еще в первых исследованиях его распределения в тканях разных животных. S100 обнаруживаются у всех позвоночных (Moore B.W, 1973; Donato R, 1999) и у многих беспозвоночных, например, у виноградной улитки (Jankovic B.D., 1985; Штарк М.Б, 1985; Kubista H. et al, 1996).

Ca -связывающий белок S100 обладает большим набором функций (рис. 30), которые можно разделить на внутриклеточные и внеклеточные (Donato R, 1999; 2003). Внутриклеточные функции белков S100 относятся преимущественно к регуляции функционирования внутриклеточных сигнальных систем, таким, как фосфорилирование белков, ферментативная активность внутриклеточных

Л I ферментов (прежде всего протеинкиназ), регуляция Са -гомеостаза, регуляция динамики цитоскелета и его компонентов. Одной из важнейших функций белков S100 является регуляция Са2+-гомеостаза. Внеклеточные функции белков S100 включают нейротропные эффекты белков S100, участие этих белков в формировании когнитивного поведения и их роль в дегенеративных заболеваниях. Эти функции белков S100 определяют актуальность исследований их физиологической роли, как на уровне поведенческих реакций, так и на уровне нейронных сетей. Это и определило выбор нами нейробиологической модели долговременной сенситизации, которая в зависимости от параметров его формирования может служить моделью пластичности, но, с другой стороны, может отражать состояние тревожности животного и депрессивного состояния (Кэндел Э, 1980; Гайнутдинов Х.Л. и др., 2002; Gasull X. et al, 2005; Antzoulatos E.G. et al. 2006).

Нами у виноградной улитки была получена долговременная сенситизация -выраженное усиление оборонительной реакции закрытия пневмостома. ДС в настоящее время привлекает большое внимание как модель, которая позволяет успешно исследовать мембранные механизмы формирования устойчивых очагов возбуждения в нервной системе животного (Cleary L.J. et al, 1998; Antzoulatos E.G. et al, 2006; Philips G.T. et al, 2006). Во многих экспериментах была показана возможность существования долговременной формы сенситизации, зависимой от белкового синтеза (Castellucci V.F. et al, 1989; Balaban P.M., Bravarenko N.I, 1993; ClarkG.A,Kandel E.R, 1993; Гайнутдинов X.JI, Береговой H.A., 1994; Никитин В.П, Козырев С.А, 1995; Cleary L.J. et al, 1998). При исследовании мембранных механизмов формирования ДС изменения были найдены, прежде всего, в эффективности синаптической передачи (Castellucci F.V. et al, 1986; Clark G.A, Kandel E.R, 1993) и увеличении возбудимости сенсорных и командных нейронов (Dale N. et al, 1987; Walters E.T, 1987; Никитин В.П. и др., 1992; Гайнутдинов Х.Л, Береговой H.A., 1994; Cleary L.J. et al, 1998). Нами также показано снижение мембранного и порогового потенциалов в командных нейронах, что свидетельствует о повышении возбудимости при ДС.

В данном исследовании нами получены результаты, которые показывают, что AS 100 в определенном разведении препятствуют формированию ДС, которая является нейробиологической моделью состояния тревожности (Кэндел Э, 1980; Гайнутдинов Х.Л. и др, 2002; Gasuli X. et al, 2005; Antzoulatos E.G., Byrne J.H, 2007), в то же время изменений двигательной активности не наблюдается. Следует отметить, что оборонительные реакции у виноградной улитки определяются командными нейронами, а двигательная активность контролируется мотонейронами педального ганглия, имеющими совершенно другой характер активности. Разный тип активности этих нейронов может свидетельствовать о том, что в их функционировании внутриклеточные сигнальные системы действуют по-разному. Показанное частичное восстановление значений мембранного и порогового потенциалов командных нейронов свидетельствует, что часть протекторного эффекта AS 100 реализуется за счет внутриклеточных функций белка S100, а часть является следствием изменений в нейронной сети (синаптическая активность), т.е. является проявлением внеклеточных функций белка S100.

Другой моделью для исследования эффектов S100 были термостабильность локомоции C.elegans и их сенсорная изоляция. Преинкубация C.elegans при 20°С в среде, содержащей низкие (10"13-10'12 М) концентрации AS100, вызывает увеличение среднего времени появления ошибок моторной программы плавания, индуцированные повышением температуры до 36°С. Сходное с эффектом AS100, но более сильное влияние на термостабилыюсть локомоции C.elegans вызывает двухчасовая экспозиция червей к температуре 30°С. При совместном действии AS 100 и адаптации к температуре 30°С выявляется синергизм этих двух воздействий на организм. Результаты этих экспериментов показывают, что AS 100 повышают не только базовую термостабильность локомоции C.elegans, но и эффективность быстрой адаптации червей к переносимому организмом повышению температуры среды. Протекторный эффект AS100 в условиях нарушения поведения C.elegans тепловым стрессом свидетельствует о значительной роли Са -связывающих белков S100 в развитии обратимых тепловых нарушениях поведения червей.

Полученные результаты, видимо, свидетельствуют, что дисбаланс Са2+-связывающего белка S100 может привести к торможению или изменению хода процессов, развивающихся при формировании пластических перестроек в организме, в том числе при патологических процессах. Наши результаты показывают участие мембранных структур в развитии протекторного эффекта антител к S100 на формирование ДС. В пользу такой возможности свидетельствуют данные, демонстрирующие участие S100 в работе Са2+-зависимых К+- каналов (Kubista H. et al., 1999), a также наличие прямого эффекта антител к белку S100 на Са2+-каналы (Солнцева Е.И., 1988; Гайнутдинов X.JI. и др., 1996) и возможность модуляции изменениями внеклеточной концентрации ионов Са эффекта AS 100 вплоть до полного его ингибирования (Shtark М.В. et al., 1987).

Другой аспект проведенного исследования связан с ролью оксида азота (NO), который является внутри- и межклеточным посредником, выполняющим различные сигнальные функции (Schuman Е.М., Madison D.V., 1994; Реутов В.П. и др., 1998; Уразаев А.Х., Зефиров АЛ., 1999). В последние годы NO-сшггезирующие нейроны обнаружены и в нервной системе беспозвоночных, в том числе моллюсков (Huang Е.Р., 1997). Показано, что серотонин и доноры NO взаимно усиливают эффекты друг друга (Дьяконова Т.Д., 2000). Найдены доказательства, что белок S100В производит нейротоксический эффект in vitro, вызывая апоптоз как в нейрональных, так и глиальных клетках за счет активации NO-синтазной активности, что ведет в итоге к апоптической смерти клетки (Ни J. et al., 1996; 1997). Поэтому нами были проведены исследования изменений содержания NO в органах улитки при влиянии AS 100 на формирование ДС, где основным медиатором является серотонин (Castellucci V.F. et al, 1986; Clark G.A, Kandel E.R., 1993).

В проведенном исследовании нами показано, что выработка ДС сопровождается снижением интенсивности формирования N0 в организме улитки. Поскольку выработка ДС является следствие резкого выброса серотонина, то эти результаты свидетельствуют о том, что серотонин и N0 действуют либо однонаправлено, либо эффект одного выражается через действие другого. Вторая половина наших исследований демонстрирует, что антитела к Са2+-связывающему белку S100 оказывают протекторное действие на формирование ДС, т.е. они могут снимать феномены или проявления тревожности.

Таким образом, полученные результаты, видимо, свидетельствуют, что дисбаланс Са2+-связывающего белка S100 может привести к торможению или изменению хода процессов, развивающихся при формировании пластических перестроек в организме.

Рис. 29. Модель действия 8100В на клеточную мембрану.

8100А12 ог г* 5100В2 ог

Бевшш т с

2+

Рис. 30. Схема строения димерной структуры белка Б100В с Са -связывающими участками.