Исследование фетальной и материнской внеклеточной ДНК при нормальной беременности и нарушениях развития плода тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.15, кандидат биологических наук Токарева, Анастасия Григорьевна

• Токарева, Анастасия Григорьевна
• кандидат биологических наук
• 2006

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Токарева, Анастасия Григорьевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Внеклеточные нуклеиновые кислоты в крови человека

1.1.1. Механизмы появления внеклеточных нуклеиновых 13 кислот в крови

1.1.2. Возможные функции внеклеточных нуклеиновых кислот

1.2. Внеклеточные нуклеиновые кислоты плода в крови матери

1.2.1. Происхождение внеклеточной ДНК плода в крови матери

1.2.2. Внеклеточная ДНК плода как маркер для неинвазивной пренатальной диагностики

1.2.3. Внеклеточная ДНК плода как маркер патологии 32 беременности

1.2.4. Внеклеточная фетальная РНК в крови матери

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

2.1. Материал исследования

2.2. Выделение фракций внеклеточной ДНК

2.3. Измерение концентрации ДНК с помощью Hoechst

2.4. Выделение ДНК из фракций крови

2.5. Полимеразная цепная реакция

2.6. Электрофорез в полиакриламидном геле

2.7. Полимеразная цепная реакция в режиме реального времени

2.8. Статистическая обработка результатов

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 45 3.1. Особенности циркуляции фракций внеклеточной ДНК в крови женщин при нормально протекающей беременности

3.2. Концентрация циркулирующей и связанной с клеточной поверхностью внеклеточной ДНК матери и плода при нормальной беременности

3.3. Динамика концентрации фетальной и материнской внеклеточной ДНК в течение беременности

3.4. Влияние возраста беременной женщины на уровень внеклеточной ДНК плода

3.5. Концентрация внеклеточной ДНК при нарушениях развития плода

3.5.1. Уровень фетальной и материнской ДНК в крови беременных женщин, вынашивающих плоды с пороками развития

3.5.2. Концентрация внеклеточной ДНК в крови женщин при ранней гибели плода вследствие хромосомных аномалий

3.6. Соотношение фетальной и материнской внеклеточной ДНК при различных состояниях беременности

3.7. Внеклеточная ДНК плода в крови матери как маркер неинвазивной пренатальной диагностики

3.7.1. Оценка потенциального использования концентрации внеклеточной ДНК в целях выявления нарушений 68 внутриутробного развития плода

3.7.2. Циркулирующая и связанная с клеточной поверхностью фетальная ДНК как маркер для ранней неинвазивной диагностики пола плода

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Исследование фетальной и материнской внеклеточной ДНК при нормальной беременности и нарушениях развития плода»

Актуальность темы. С накоплением информации о генетических основах ряда заболеваний человека и развитием методической базы для их анализа существенное значение в настоящее время приобретает служба пренатальной диагностики, направленной на раннее выявление и предотвращение рождения ребенка с наследственной патологией. Однако, несмотря на довольно успешное применение имеющихся методов в клинической практике, в настоящее время продолжается поиск новых неинвазивных маркеров, которые могут быть применимы как для выявления хромосомного дисбаланса у плода, так и для диагностики моногенных заболеваний. Необходимость разработки новых методов неинвазивной диагностики нарушений развития плода продиктована следующими причинами. Г одной стороны, генетический анализ плодного материала, полученного с помощью инвазивных процедур, отражает истинный хромосомный статус клеток плода с высокой точностью, с другой стороны, такие манипуляции сопряжены с некоторым риском прерывания беременности, который оценивается в среднем как 1,5-2%. Имеющиеся же неинвазивные методы дородовой диагностики хромосомной патологии безопасны для здоровья матери и плода, однако их информативность не превышает 60% [Золотухина, Шилова, 1999].

Одним из перспективных и достаточно новых направлений неинвазивной пренатальной диагностики может быть анализ внеклеточной ДНК плода в крови беременных женщин. В 1997 году впервые было продемонстрировано присутствие фетальной внеклеточной ДНК в плазме и сыворотке беременных женщин [Lo et al., 1997]. Данное открытие послужило стимулом к интенсивному изучению плодной ДНК в качестве потенциального маркера для неинвазивной дородовой диагностики. Так, например, появились работы по обнаружению последовательностей Y-хромосомы плода в целях выявления наследственных заболеваний, сцепленных с полом [Honda et al., 2001; Sekizawa et al., 2001a; Zolotukhina et а1., 2005], по выявлению резус-антигена ШЮ плода в крови резус-негативных женщин [Ьо е1 а1., 1998а; Лупёеге е1 а1., 2004а], а также исследования, посвященные изучению уровня внеклеточной ДНК плода при анеуплоидиях [Ьее ег а!., 2002; Ьо ег а1., 1999а; Wataganaгa ег а1., 2003]. Так, например, было показано, что уровень фетальной ДНК возрастает, по сравнению с нормой, в крови женщин, вынашивающих плоды с трисомиями 13 и 21 [Ьо е1 а1., 1999а], тогда как в случае трисомии 18 повышения концентрации ДНК отмечено не было [Wataganara й а1., 2003]. Однако до настоящего времени остается невыясненной причина повышения концентрации внеклеточной фетальной ДНК в крови женщин, вынашивающих плоды с анеуплоидиями, а также различий в уровне фетальной ДНК при различных хромосомных нарушениях у плода. Предполагается, что концентрация внеклеточной ДНК при развитии плода с аномальным кариотипом повышается благодаря интенсификации гибели клеток трофобласта ^аШ§апага е1 а1., 2003]. Однако данная гипотеза полностью не объясняет отсутствия увеличения уровня плодной ДНК при трисомии по 18 хромосоме и нуждается в дальнейшем экспериментальном подтверждении. В целях изучения влияния хромосомной патологии плода на изменение концентрации внеклеточной ДНК в крови матери, наиболее удобным модельным объектом представляются тяжелые нарушения эмбрионального развития, такие как неразвивающиеся беременности и анэмбрионии. Кроме того, исследование уровня ДНК плода в крови матери при данной патологии позволило бы определить вклад экстраэмбриональных тканей в формирование пула внеклеточной фетальной ДНК. Помимо хромосомной патологии, до настоящего времени остается неизвестной связь концентрации внеклеточной материнской и фетальной ДНК и развития плодов с пороками развития, не имеющих аномалий хромосомного набора.

Недавно было показано, что основная часть циркулирующих внеклеточных нуклеиновых кислот в крови здоровых доноров связана с поверхностью форменных элементов [ТаткоуюЬ е1 а!., 2005]. Кроме того, характер распределения внеклеточных ДНК и РНК между плазмой и клетками крови изменяется при онкологических заболеваниях [Тамкович и др., 2005а; Ьакйопоу е! а1., 2004]. Однако исследований, посвященных изучению уровня материнской и фетальной ДНК во фракции внеклеточной ДНК, связанной с поверхностью клеток, в крови беременных женщин в норме и при вынашивании плодов с нарушениями внутриутробного развития, до настоящего времени не проводилось. Не исключено, что изменения характера распределения внеклеточной ДНК имеют место и в случаях вынашивания плодов с нарушениями развития. Возможно, что полученные данные об особенностях распределения ДНК матери и плода в крови беременных женщин будут положены в основу разработки новых методов неинвазивной пренатальной диагностики нарушений внутриутробного развития.

Целью работы явилось изучение уровня материнской и фетальной внеклеточной ДНК в крови матери при нормально протекающей беременности и нарушениях развития плода.

Задачи исследования:

1. Оценить характер распределения внеклеточной ДНК матери и плода между плазмой и форменными элементами в крови беременных женщин, вынашивающих здоровые плоды и не имеющих осложнений течения беременности.

2. Определить зависимость уровня внеклеточной фетальной ДНК (циркулирующей в плазме и связанной с клеточной поверхностью) от срока беременности и возраста матери при нормально протекающей беременности.

3. Изучить уровень материнской и фетальной внеклеточной ДНК при вынашивании плодов с пороками развития.

4. Оценить влияние хромосомных аномалий плода на изменение концентрации свободной и связанной внеклеточной ДНК в крови матери.

5. Изучить соотношение фетальной и материнской ДНК в плазме и во фракции ДНК, связанной с клеточной поверхностью, в крови беременных женщин, вынашивающих здоровые плоды и оценить изменение данного показателя в крови матери в случаях нарушения внутриутробного развития.

6. Оценить возможности использования фракций внеклеточной ДНК в крови беременных женщин в целях ранней неинвазивной пренатальной диагностики пола плода и нарушений внутриутробного развития.

Научная новизна. В ходе работы впервые проведена оценка характера распределения внеклеточной ДНК матери и плода между плазмой и форменными элементами в крови беременных женщин, а также исследован уровень связанной с поверхностью клеток крови ДНК при нормально протекающей беременности и в случаях вынашивания плодов с нарушениями внутриутробного развития. Установлено, что большая часть фетальной и материнской внеклеточной ДНК связана с поверхностью форменных элементов крови матери. Определено соотношение фетальной и материнской ДНК во фракции ДНК, связанной с поверхностью клеток крови, а также оценена связь различных нарушений развития плода с изменением этого соотношения.

Практическая значимость работы. Проведено исследование концентрации материнской и фетальной внеклеточной ДНК в течение нормальной беременности и в случаях вынашивания плодов с нарушениями развития. Полученные данные позволили оценить возможности использования изменений уровня и характера распределения внеклеточной ДНК в качестве неинвазивного маркера патологии внутриутробного развития. Информация об особенностях циркуляции материнской и фетальной ДНК при нарушениях развития может быть положена в основу разработки новых подходов к анализу генома плода. Показана возможность использования внеклеточной ДНК, связанной с поверхностью клеток крови, в качестве неинвазивного маркера нарушений развития, а также дополнительного источника биологического материала плода в целях анализа локусов его генома. Установлено, что применение фракции ДНК, связанной с поверхностью клеток крови матери, повышает информативность ранней неинвазивной диагностики пола плода.

Положения, выпоен чые на защиту:

1. В крови беременных женщин при нормально протекающей беременности основная часть внеклеточной ДНК матери (более 90%) и плода (более 60%) связана с поверхностью форменных элементов крови матери. Концентрация внеклеточной ДНК связанная с поверхностью клеток крови, возрастает с течением беременное™, тогда как связи между уровнем внеклеточной ДНК плода и возрастом беременной женщины не наблюдается

2. При вынашивании плодов с пороками развития, не имеющих нарушений кариотипа. уровень внеклеточной ДНК матери, связанной с клеточной поверхностью, значимо снижен, по сравнению с группой женщин, вынашивающих здоровые плоды,

3, В случаях невынашивания беременности вследствие хромосомных аномалий у плода концентрация материнской ДНК в суммарной фракции ДНК, связанной с поверхностью клеток крови, снижена, по сравнению с нормой. В то же время, наблюдается повышение уровня фетальнон ДНК, связанной с белками клеточной поверхности.

4, В крови беременных женщин, вынашивающих здоровые плоды, соотношение феталыюЛ н материнской ДНК выше в плазме и во фракции ДНК, связанной с поверхностью клеток посредством ионных взаимодействий, чем во фракции, связанной с мембранными белками. В случае тяжелых нарушений развития плодов, имеющих аномалии хромосомного набора, доля фетальной ДНК, наоборот, выше но фракини ДНК. связанной с белками клеточной поверхности.

Апробации работы. Материалы диссертационной работы были представлены ни научно-практической конференции "Актуальные вопросы медицинской генетики" (Томск, 2004); научной конференции молодых ученых "Актуальные вопросы здоровья населения регионов Сибири" (Красноярск, 2006); 38 Европейской конференции по генетике человека

Амстердам, 2006); межлабораторном семинаре ГУ НИИ медицинской генетики ТНЦ СО РАМН (Томск, 2006).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов, результатов собственных исследований с обсуждением по разделам, заключения, выводов, списка цитируемой литературы и приложений. Диссертация изложена на 120 страницах машинописного текста, содержит 13 таблиц, 6 рисунков и 2 приложения. Список литературы включает 171 источник, из них 8 отечественных и 163 зарубежных.

Заключение диссертации по теме «Генетика», Токарева, Анастасия Григорьевна

ВЫВОДЫ В крови беременных женщин, вынашивающих здоровые плоды, основная часть фетальной (более 60%) н материнской (более 90%) внеклеточной ДНК саязана с поверхностью клеток крови матери,

2- У стл.-чалено, что концентрация внеклеточной ДНК, как матери, так н плода, связанной с поверхностью клеток кровн, возрастает а течение нормально протекающей беременности.

3. Выявлено снижение концентрации внеклеточной ДНК матери, связанной с поверхностью клеток крови, как в группе беременных женщин, вынашивающих плоды с пороками развития и нормальным карнотипом, так и в случаях невынашивания беременности вследствие хромосомной патологии у плода.

4. Установлено, что уровень внеклеточной ДНК плода, связанной с мембранными белками клеток, повышен в кровн женщин с клиническим диагнозом неразвивающаяся беременность в случае хромосомных аномалий в клетках зародыша.

5. Показано, что в течение нормальной беременности соотношение фетальной и материнской ДНК выше в плазме и во фракции ДНК. связанной с поверхностью клеток кровн посредством ионных взаимодействий, чем во фракции ДНК. связанной с белками поверхности клеток. б Выявлены изменения распределения фракций внеклеточной ДНК плода н матери в случаях Н«развиваюшсйся беременности с хромосомными аномалиями у зародыша, по сравнению с нормой: максимальное соотношение фетальной н материнской ДНК наблюдается во фракции, связанной с белками клеточной поверхности. В случае выкашивания плодов с пороками развития и нормальным карнотипом изменений в распределении фракций фетальной и материнской ДНК не обнаружено.

7, Показано, что для повышения информативности неннвазивной диагностики пола плода с применением локуса БИУ на ранних сроках беременности представляется целесообразным использовать фракции фатальной внеклеточной ДНК, связанные с поверхностью клеток кроен матери

Считаю своим приятным долгом выразить глубокую благодарность ли per гору ГУ НИИ медицинской генетики ТНЦ СО РАМН академику' РАМН, доктору медицинских наук, профессору В.П. Пузырсву за поддержку работы на всех этапах ее выполнения. Признательна безвременно ушедшему члену-корреспонденту РАМН, доктору биологических наук, профессору С.А. Назаренко как инициатору и руководителю настоящей работы, а также заведующему лабораторией цитогенетики, кандидату бноло]31ческнх наук И.Н. Лебедеву как руководителю работы за неоценимую помощь н поддержку во время выполнения данного исследования. Благодарна руководителю Группы клеточной биологии Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН. г. Новосибирск, кандидату биологических наук П.П. Лактионову за помощь в освоении методов работы с внеклеточными нуклеиновыми кислотами человека. Выражаю свою искреннюю признательность сотрудникам лаборатории цитогенетики 1"У НИИ медицинской гекетнкн и Группы клеточной биологии ИХБФМ за участие, помощь в выполнении работы и обсуждении результатов исследования. Огромная благодарность Главному врачу Генетической клиники ГУ НИИ медицинской генетики ЛЯ Назаренко, врачам акушерам-гинекологам Генетической клиники за помощь в сборе материала для настоящего исследован ня.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В 1997 году впервые было продемонстрировано присутствие внеклеточной ДИК плода в плазме и сыворотке беременных женщин [Lo et al. 1997]. Данное открытие послужило мощным стимулом к разработке новых методов неинвазнвной пренаталькой диагностики, основанных на анализе внеклеточной фетальной ДНК, циркулирующей в материнском кровотоке. Так, показано, что феталъная ДНК в крови матери может служить источником биологического материала для определения пола плода с целью диагностики X-сцепленных заболеваний [Rijndere et al., 2004а], выявления антигена RhD плода в крови резус-негативных женщин [Lo ei al. 199Ва], a также для определения унаследованных плодом от отца полиморфных ДНК-маркеров [Tang ct aU 1^99; Amieucci et al,, 2000; Pert) et al., 2000]. Помимо этого, установлено, что концентрация внеклеточной фетальной ДНК возрастает в материнской плазме а случаях вынашивания плодов с синдромом Дауна [Lo et al. 1999а] н при некоторых осложнениях течения беременности [Leung ct al., 1998; Lo et al., 1999b; Seftzawa et al. 2001b; Sckizawa ct al., 2002]. Недавно было обнаружено, что в кровн здоровых доноров, помимо свободно циркулирующей в плазме ДНК, существуют к связанные с поверхностью клеток внеклеточные НК [Tamkovich et al., 2005]. Кроме того, характер распределения внеклеточных ДНК и РНК может изменяться при некоторых онкологических заболеваниях [Тамкович и др., 2005а; Laktionov et at. 2004]. Однако исследований, посвященных анализу концентрации циркулирующей и связанной с клеточной поверхностью внеклеточной ДНК в кровн беременных женщин, до настоящего времени не проводилось.

В настоящей работе был изучен уровень свободно циркулирующей в плазме н связанной с поверхностью клеток внеклеточной ДНК матери н плода при нормально протекающей беременности и в случаях вынашивания плолов с нарушениями развития. Впервые показано, что в крови беременных женщин основная часть как материнской (более 90%), так и фетальной (более

60%) внеклеточной ДНК связана с поверхностью клеток. Механизмы, благодаря которым наблюдается такое распределение ДНК матери и плода в крови беременных женщин, к настоящему1 аременн неизвестны.

Из данных литературы известно, что в течение нормальной беременности концентрация внеклеточной ДНК плода, циркулирующей в плазме матери, несколько снижается »о И триместре [Smut et ah, 1997; Smid ct al., 2001; Birch et al„ 2005; Galbiati et al„ 2005]. В проведенном нами исследовании показано, что также имеется некоторая тенденция к снижению уровня как материнской, так н феталыюй внеклеточной ДНК. элюированной с поверхности клеток крови, в течение II триместра беременности По всей видимости, изменение концентрации именно во фракции ДНК, связанной с поверхностью клеток кровн, может оказывать наибольшее влияние на динамику уровня внеклеточной ДНК на протяжении беременности. Однако причины, обусловливающие снижение концентрации ДНК во II триместре, к настоящему времени неизвестны. В настоящей работе установлено, что концентрация материнской н фетальной ДНК, связанной с поверхностью клеток крови, в целом возрастает с течением беременности. Так, уровень ДНК матери и плода во фракции, связанной с клеточной поверхностью, составил 3655 и 83 копий/мл в I трнмсстрс беременности, соответственно, тогда как в Ш триместре концентрация материнской и плодной ДНК оказалась равной 4079 и 124 копий/мл, соответственно,

Высказано предположение, что возраст беременной женшмны может оказывать влияние на уровень фетальной ДНК [Wataganara et а]., 2004]. В настоящем исследований было изучено возможное влияние возраста матери на концентрацию циркулирующей и связанной с клеточной поверхностью внеклеточной ДНК плода. В результате проведенного анализа связи между возрастом беременных и концентрацией внеклеточной ДНК плода обнаружено не было. Подобно полученным в настоящей работе данным, отсутствие связи между возрастом матери и уровнем фетальной ДНК было продемонстрировано и в исследованиях других авторов [Lo el al., 1998b;

Farina et al-, 3002; Waiagaiwa et al., 2004; Birch el al. 2005]. Однако следует отметить, что на фойе довольно широкого охвата возрастов беременных женшин (от 18 до 36 лет) число матерей в нашем исследовании с возрастом старше 35 лет было небольшим, что. возможно, могло стать причиной отсутствия взаимосвязи возраста матери и концентрации ДНК плода,

Несмотря на интенсивные исследования уровня внеклеточной ДНК ы крови матери при различных патологических состояниях беременности, до настоящего времени остается неизученным уровень материнской и феталыюй ДНК при вынашивании плодов с нарушениями развития, не имеющих отклонений по числу и структуре хромосом. Также не описан характер распределения внеклеточной ДНК между плазмой и форменными элементами крови матери при таких патологических состояниях плода. В настоящем исследовании мы впервые проанализировали уровень циркулирующей и связанной с поверхностью клеток материнской и фстапьной ДНК в крови беременных женщин, вынашивающих плоды с пороками развития, Показано, что концентрация внеклеточной ДНК матери, связанной с поверхностью клеток крови, значимо снижена, по сравнению с нормой, в случаях вынашивания плодов с пороками развития, тогда как статистическн значимых отличий между концентрациями фетальной ДНК в исследованных группах выявлено не было. Однако следует отметить, что информативность анализа локуса SRY плода снижалась во фракции фстальной ДНК, связанной с поверхностью клеток, в крови женщин, выкашивающих плоды с пороками развития, Так, в данной выборке беременных женщин, плодная ДНК была выявлена в 53% случаев во фракции, связанной с поверхностью клеток через ионные взаимодействия, и только в 7% случаев во фракции ДНК, связанной с белками клеточной поверхности; тогда как среди женщин, вынашивающих здоровые плоды, эти значения составили 73 и 46%, соответственно.

В настоящей работе мы оценили влияние хромосомной патологии плода на изменение концентрации циркулирующей н связанной материнской и фстальной ДНК- Данная связь была изучена в группе женщин, вынашивающих плоды с тяжелыми нарушениями эмбрионального развития (неразвивающаяся беременность)- При сравнении средних значений уровней внеклеточной ДНК матери и плода было обнаружено, что концентрация материнской ДНК, связанной с поверхностью клеток крови, подобно случаям вынашивания плодов с пороками развития, значимо снижена в группе женщин с клиническим диагнозом неразвивающаяся беременность (»следствие уромосомкых аномалий у зародыша). Также было показано, что концентрация ДНК плода во фракции» связанной с мембранными белками, а обследованной группе значимо выше данного показателя при нормальной беременностн

В нашем исследовании был проведен анализ соотношения фстальной н материнской внеклеточной ДНК в плазме н элтоатах с поверхности клеток крови беременных женщин, вынашивающих здоровые плоды и плоды с нарушениями внутриутробного развития. Изучение соотношения ДНК плода нматерн »ю фракциях крови является необходимым а свете тога, что успешная детекция некоторых фетальных локусов зависит от количества плодной ДНК, находящейся среди молекул ДНК материнского происхождения [Ding et аЦ 2004; Ц el ai, 2004; Birch et al., 2005; Li ei aJ„ 20051. В нашем исследовании показано, что соотношение ДНК плода н матери при нормальной беременности выше в плазме н во фракции, связанной с клетками с помощью ионных связей, чем во фракции внеклеточной ДНК, связанной с мембранными белками, Следует отметить* «гго такое соотношение ДНК наблюдалось а течение всех периодов беременности В случаях вынашивания плодов с пороками развития соотношение фстальной и материнской ДНК было сходно с таковым при нормальной беременности, тогда как в случаях гибели плодов вследствие хромосомных нарушений соотношение фстальной н материнской внеклеточной ДНК было выше во фракции, связанной с поверхностью клеток крови, чем ч плазме матерн- Необходимо подчеркнуть, что оценка баланса фетальной н материнской ДНК ею фракции, связанной с поверхностью клеток крови при нормальной беремен кости и в случаях вынашивания гтодов с аномалиями развития, проведена впервые.

Существенное внимание в службе прснаталькоП диагностики уделяется выявлению и предотвращению рождения детей с пороками развития н хромосомными аномалиями. Одним из достаточно новых н перспективных маркеров для раннего выявления нарушений развития плода может быть анализ концентрации внеклеточной ДНК в крови беременных жен шин. В настоящей работе впервые продемонстрировано, что характер распределении внеклеточной ДНК в крови беременных женщин изменяется в случае вынашивай''? плодов с пороками ратнвгтия, имеющих нормальный карм от ни, к ранней гибели зародышей с аномалиями карнотипа. Показано, что при таких нарушениях развития, концентрация ДНК матери значимо снижена, по сравнению с нормой, во фракции ДНК, связанной с поверхностью клеток крови. Кроме того, обнаружено, что в случаях вынашивания плодов с хромосомными аномалиями концентрация фетальной ДНК повышаете н во фракции, связанной с белками клеточной поверхности. Так как в качестве основного источника внеклеточной ДНК плода в крови матери рассматриваются клетки плаценты [В5апсЫ е1 а]., 2004], то, необходимо отметить, что концентрация фетальной ДНК, отображающая уровень пролнфератнвкых^апоптотнческих изменений, происходящих в плацентарной ткани, не может служить специфическим маркером нарушений развития плода. Однако было показано, что использование фетальной ДНК в сочетании с другими маркерами в программах массового скрининга беременных женщин, повышает информативность выявления синдрома Дауна у плода {Раппа в а>., 2003]. Таким образом, анализ уровня внеклеточной ДНК в крови беременных женщин, в том числе в сочетании с оценкой характера распределения ДНК между1 плазмой и поверхностью форменных элементов крови, может быть успешно использован в качестве дополнительного неннвазивного маркера пятологин внутриутробного развития плода и нарушений течения беременности,

Большинство первых работ по изучению ДНК плода в крови матери были направлены на обнаружение последовательностей Y-хромосомы как маркера плода мужского пола в крови беременных женщин с целью дородовой диагностики заболеваний, сцепленных с полом [Honda et al.» 2001, Sekizawa et al., 200Ja; Zololukhina et al., 2005]. Так. например, было показано, что чувствительность определения локусов Y-хромосомы в плазме матерн с помощью традиционной ПЦР варьирует от 50 до 95% в исследованиях разных авторов [Honda et al., 2002; Rijrvders et al„ 2004a], тогда как при применении более чувствительных методов анализа, таких как ПЦР в реальном времени, определение пола плода возможно со 100%-ной точностью [Honda et al., 2002]. В нашем исследований был поведен ПЦР-анализ (традиционная ПЦР и ПЦР в режиме реального времени) локуса SRY плода в материнской плазме и во фракции ДНК. связанной с поверхностью клеток крови. Также мы оценилн возможности использования связанной с клеточной поверхностью фетальной ДНК в качестве дополнительного источника биологического материала плода для ранней неннвазнвнон диагностики его пола. Было показано, что с помощью традиционной ПЦР. информативность определения локуса SRY плода с использованием всех фракций внеклеточной ДНК составила 82%, в то время как в плазме матерн данный показатель оказался равен 62%. Однако применение традиционного метода ПЦР в целях диагностики пола плода ограничено вследствие наличия ложноположительных случаев. Так, ложноположительные случаи среди женщин, вынашивающих плоды женского пола, были зарегистрированы в двух случаях в плазме матери и в трех случаях в элюатах с поверхности клеток. При анализе образцов крови беременных женщин, вынашивающих плоды мужского пола, с помощью ПЦР в режиме реального времени, локус SRY плода во всех фракциях материнской крови был обнаружен в 84% случаев в I триместре, в 85% - во II триместре и в 100% случаев в III триместре беременности. Информативность определения локуса 5ЯУ плода в крови женщин на разных сроках беременности варьировала от 23 до 100% а различных фракциях материнской крови. Важно отметить* что лож неположительных случаев среди женщин, вынашивающих плоды женского пола, зарегистрировано не было. Было показано, что использование суммарной фракции внеклеточной фегальной ДНК, связанной с поверхностью клеток, позволило заметно повысить частоту детекции последовательностей генома плода, особенно на ранних сроках беременности, Так, например, использование суммарной фракции внеклеточной ДНК, связанной с поверхностью клеток, позволила повысить информативность анализа локуса ЗЯТ плода на 26% в I триместре беременности, тогда как в группе женщин с невынашиванием беременности вследствие хромосомных аномалий у плода, информативность метода повышалась на 50%,

В заключение следует отметить, что оценка внеклеточной фетальной ДНК в материнской крови представляет собой перспективный неннвазивный подход для анализа локусов генома плода. Кроме того, использование фракций внеклеточной фетальной ДНК, связанных с поверхностью клеток крови матери, в качестве дополнительного биологического материала плода позволяет повысить информативность метода, особенно на ранних сроках беременности. Также необходимо подчеркнуть, что неннвазивный подход к анализу локусов фетального генома представляется особенно актуальным в случаях, когда имеются противопоказания для проведения инвазнвнон пренатальной диагностики,

85

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Токарева, Анастасия Григорьевна, 2006 год

1. Бочков Н П. Клиническая генетика. М: Медицина. 1997, 288 с,

2. Васюхин В.И., Липская Л.А., Цветков А,Г. и др. ДНК, выходящая из лимфоцитов человека, содержит последовательности, гомолошчные нммуноглобулиновому гену к И Молекулярная биология, 1991. Т. 25. Вып. 2, С. 405*412.

3. Золотухина Т.В. Шилова Н,В. Клетки плода в крови матери: новый неннвазнвный подход в преиаталыюй диагностике наследственных болезней // Вестник РАМН. 1999. Т. 12- С- 45-18.

4. Лебедев JUL, Островерхова Н.В., Никитина Т.В. и др. Молекулярно-интогенетнческая характеристика хромосомного дисбаланса в клетках спонтанных "абортусов человека с низкой пролнферативной активностью in vitro и Генетика, 2003. Т, 39. 8. С. 1111-1122.

5. Суханова H.H. Лебедев ИЛ., Никитина Т.В. и др. Структура хромосомных нарушений у 552 спонтанных аборту сов томской популяции // Мед, генетике. 2002. Т.1. № 6. С, 271-276,

6. Тамкоаич СЛ., Брызгунова O.E., Рыкова Е.Ю. и др. Циркулирующие нуклеиновые кислоты в крови больных раком желудка н толстой кишки // Бномедниинекая химия. 2005а. Т. 51, С. 321-328.

7. Тамкович С.Н., Лактионов ПЛ. Брызгунова O.E. и др. Уровень внеклеточных нуклеиновых кислот, связанных с поверхностью клеток крови, в диагностике рака молочной железы // Мол. медицина, 20056, Т, 2, С. 46-50.

8. Шилова HB. Клетки плода в кров» матери // Мед, генетика, 2002, Т. Í С. 57-64.

9. Ai-Yamata М.К., Mustafa A,S.t Abraham S. et at. Detection of Y-chromosome-specific DNA in the plasma and urine of pregnant women using nested polymerase chain reaction // PrenaL Diagrt, 2001. V,21. P. 399-402.

10. Aminucci P„ Gcnarcllv M., Novell i G„ Datlapiecola B. Prenatal diagnosis of myotonic dystrophy using fetal DNA obtained from maternal plasma // Clin Chem. 2000. V 46. P. 301-302.

11. Anker P., Lyautey J., Lefort F. et al. Transformation of NIH/3T3 celts and S W 480 cells displaying a K-ras mutation // C.R. Acad- Sci. Paris. 1994. V. 317. p. 869-874.

12. Anker P. Mulcahy H.« Chen X.Q. et al, Detection of circulating human DNA in the blood (plasma/serum) of cancer patients // Cancer Met. Rev 1999. V. 18. P 65-73.

13. Anker P. Stroun M„ Maurice P.A. Spontaneous release of DNA by human blood lymphocytes as shown in an in vitro system // Cancer Res. 1975. V. 35. P. 2375-2382.

14. Artga fr, Ohio H. Busch M.P. et al. Kinetics of fetal cellular and cell-free DNA in the maternal circulation during and after pregnancy: implications for noninvasive prenatal diagnosis//Transfusion. 2001. V, 41. P, 1524-1530,

15. Benachi A„ StefTann J,, Gautier E, et al, Fetal DNA in maternal serum: does it persist after pregnancy? // Hum. Genet. 2003. V. 113. P. 76-79.

16. Benachi A., Yamgnane A. Olivi M. et al. Impact of formaldehyde on the in vitro proportion of fetal DNA in maternal plasma and serum // Clin. Chem. 2005. V. 51, P. 242-244

17. Bennett R.M. Gabor G.T., Merritl M.M. DNA binding to human leukocytes. Evidence for a receptor-mediated association, internalization, and degradation of DNA //J. CHn. Invest. 1985. V. 76. P. 2182-2190.

18. Bianchi D.W. Fetal cells in the maternal circulation: feasibility for prenatal diagnosis // Br. J. Hematol. 1999. V. 105. P. 574-583.

19. Bianchi D.W. Circulating fetal DNA: its origin and diagnostic potential a review // Placenta. 2004. V. 25. P. 93-101.

20. Btanchi D,W. Fetal DNA in maternal plasma: the plot thickens and the placental barrier thins // Am. J. Hum. Genet. 1998. V. 62. P. 763-764.

21. Bianchi D.W. Prenatal exclusion of recessively inherited disorders: should maternal plasma analysis precede invasive techniques? it Clin, Chcm. 2002, V, 48. P. 689-690.

22. Bianchi D.W. LeShane E.S. Cowan J.M. Large amounts of cell-free fetal DNA arc prevnt in amniotic fluid // Clin. Chem. 200L V.47. P. 1867-1869

23. Bianchi D.W.T Zickwolf G.K., Weil GJ. et al. Male fetal progenitor cells persist in maternal blood for as long as 27 years postpartum U Proc. Natl. Acad- Sci, USA. 1996. V. 93. P. 705-708

24. Birch L., English C, O'Donoghue K. et al. Accurate and robust quantification of circulating fetal and total DNA in maternal plasma from 5 to 41 weeks of gestation If Clin. Chem. 2005. V. 51. P. 312-320.

25. Bischoff F,Z„ Lewis D.E., Simpson XL. Cell-free fetal DNA in maternal blood; kinetics, source and structure ft Hum, Reprod. Update. 2005, V. IIP. 5967,

26. Bischoff F.Z., Sinacori M.K., Dang D.D. et al. Ceil-free fetal DNA and intact fetal cells in maternal blood circulation: implications for first and second trimester prenatal diagnosis // Hum. Reprod. Update. 2002. V. 8. P. 493-500.

27. Chan M.H., Chow K M-, Chan A-T. el al. Quantitative analysis of plural fluid cell-free DNA as a tool for the classifications of pleural effusions // Clin. Chem, 2003a- V, 49. P, 740-745.

28. Chan L.Y.S., Leung T.N., Allen Chan K.C. et af. Serial analysis of fetaf DNA concentrations in maternal plasma in late pregnancy it Clin. Chcm. 2003b. V. 49. P. 678-680.

29. Chan K.C A., Zhang J., Hui A.B.Y. ci al. Size distributions of maternal and fetal DNA in maternal plasma // Clin. Chem. 2004. V. 50. P. 88-92.

30. Chang C P-, Chia R-H-. Wu T.L ct al. Elevated ccll-free scrum DNA detected in patients with myocardiac infarction // Clrn, Chem. Acta, 2003, V. 327. P. 95-101.

31. Chen X., Bonncfoi H-. Diebold-Berger S- el al. Detecting tumor-related alterations in plasma or serum DNA of patients diagnosed with breast cancer it Clin. Cancer Res I 999 V. 5. P. 2297-2303.

32. Chen C P., Chem S.R., Wang W, Fetal DNA in maternal plasma: the prenatal detection of a paternally inherited fetal aneuploidy // Prenat Diagn. 2000. V. 20. P. 353-357,

33. Chen X.Q., Stroun M., Magnenat J.L. et al. Microsatellite alterations in plasma DNA of small cell lung canccr patients ft Nat. Med- 1996. V. 9. P. 10331035.

34. Chili R.WJL, Poon L.L.M.* Lau T.K., Leung T.N. et al. Effects of blood processing protocols on fetal and total DNA quantification in maternal plasma // Clin. Chem 2003 . V. 47. P. 1607-1613.

35. Costa J.M., Benachi A., Gautier E. et al. First-trimester fetal sex determination in maternal scrum using real-time PCR // Prenat. Diagn. 2001. V. 2t. P. 1070-1074.

36. Dhallan R. Au W.C, Mattagajasingh S. et al. Methods to increase the percentage of free fetal DNA recovered from the maternal circulation H JAMA-2004 V. 291 P- 1114-1119.

37. Ding C.» Chiu R,, Lau T. et a!. MS analysis of single-nucleotide differences in circulating nucleic acids; application to noninvasive prenatal diagnosis H PNAS. 2004. V. 101. P 10762-10767.

38. Distelhorst C. W.„ Cramer K,t Rogers J,C. Selective release of excreted DNA sequences from phytohemagglutinin stimulated human peripheral blood lymphocytes. Effects of trypsin and divalent cations // J. Clin. Invest 1978. V. 61. P. 1204-1217.

39. F,mlen W., Mannik M. Kinetics and mechanisms for removal of circulating single-stranded DNA in mice Hi. Exp. Med. 1978. V. 147, P. 684-699.

40. Farina A., Caramelti E., Concu M. el al. Testing normality of fetal DNA concentration in maternal plasma at 10-12 completed weeks gestation: aprelim ¡nary approach to a new marker for genetic screening // Prenat. Diagn. 2002, V. 22. P. 148-152,

41. Farina A., LeShane E.S. Lambert-Messerlian G.M„ et al, Evaluation of cellfree DNA as a second-trimester maternal serum marker of Down syndrome pregnancy // Clin. Cbem. 2003 V. 49. P. 239-242.

42. Farina A., LeShane E.S., Romero R. et al. High levels oi fetal cell-free DNA in maternal serum: a risk factor for spontaneous preterm delivery it Am. J- Obstet Gynecol, 2005. V. 193, P. 421-425,

43. Farina A., Sekizawa A., Sugito Y, et aL Fetal DNA in maternal plasma as a screening variable for preeclampsia. A preliminary nonparametric analysis of detection rate in low-risk non&ymptomatic patients H Prenat. Diagn, 2004, V, 30, P 83-86.

44. Foumie GJ., Courtin J,P„ Laval F. Plasma DNA as a marker of cancerous cell death investigation in patients suffering from lung cancer and in nude mice bearing human tumor// Cancer Lett. 1995. V. 2, P. 221-227.

45. Fuji warn Y^ Chi D.DJ,, Wang J. et al, Plasma DNA microsatellites as a tumor-specific markers and indicators of tumor progression in melanoma patients // Cancer Res. 1999. V. 59. P. 1567-1571.

46. Galbiati S., Smid M„ Gambini D. et al. Fetal DNA detection in maternal plasma throghout gestation // Hum, Genet 2005, Vr 117, P, 243-248,

47. Ganshirt D., Ganisien H„ Miny P,, Holzgreve W, Fetal celts in maternal circulation throughout gestation//Lancet. 1994. V. 343. P, 1038-1039,

48. Gartia-OJroo D„ Garcia-Oimo D.C. Functionality of circulating DNA: the hypothesis of genometastasis // Ann. N.Y. Acad. Sci. 2001. V. 945. P. 265-275.

49. Garcia-Olmo D., Garcia-Olmo D.C-, Ontanon J. et al. Horizontal transfer of DNA and the "genomctastasis hypothesis" // Blood. 2000. V. 95. P. 724-725.

50. Garcia-Olmo Garcia^CHmo D.G* Ontanon J, E, et aL Tumor DNA circulating in the plasma might play a role in metastasis. The hypotesis of the genometastasisH HistoL HistopathoL 1999a, V, 14. P. 1159-1164,

51. Garcia-Ülmo D. Ontanon J„ Garcia-Olmo D.C. el a! Detection of genomicaily lagged cancer cells in different tissues at different stages of tumor development: lack of correlation with the formation of metastasis // Cancer Lett. 1999b. V. NO. P. 11-20.

52. Goessl C„ Heicappell R. Munker R. et al. Microsatelliles analysis of plasma DNA from patients with clear cell renal carcinoma // Cancer Res. 1998. V. 58. P. 4728-4732.

53. Guibcrt J„ Benachi A. Grebille A.-G. ei al. Kinetics of SRY gene appearance in maternal serum: detection by real-time PCR in early pregnancy after assisted reproductive technique // Hum, Reprod, 2003. V.18. P. 1733-1736.

54. Hahn S„ Holtgreve W. Fetal cells and eelt-frce fcial DNA in maternal blood: new icwights inlo prc-cclampsia if Hum. Reprod. Update, 2002. V. g, P 501-508.

55. Hahn S. Zhong X.Y., Burk M. et al. Both maternal and fetal cell-free DNA in plasma fluctuate//Ann. N. Y. Acad. Sei. 2001a. V. 945, P, 141-144.

56. Hahn S. Zhong X.Y., Burk M.R. et al. Multiplex and real-time quantitative PCR on fetal DNA in maternal plasma. A comparisiom with fetal cells isolated from maternal blood // Ann, N.Y. Acad. Sei. 2000a. V. 906. P. 148-152.

57. Hitoglou S,, Zournatzi V,, Gougoustamou D, et a!. Adenosine desaminase activity and its isoenzyme pattern in women with recurrent spontaneous abortions It Gynecol. Obstec. Invest. 2004, V 58, P, 126-129,

58. Holdenrieder S.+ Stieber P. Bodenmuller H. et al. Circulating nucteosomes in scrum // Ann. N Y. Acad. Sci. 2001. V. 945. P. 93-102.

59. Holmgren L,. Szctes A,. Rajnavolgyi E, ct al. Horiifontal transfer of DNA by the uptake of apoptotic bodies // Blood, 1999, V, 93, P. 3956-3963.

60. Holzgreve W., Ghezzi F., DiNaro E, et al. Disturbed fetomatemal cell traffic in preeclampsia //Obstet. Gynecol. 1998. V, 91, P. 669-672.

61. Hohtgreve W., Hahn S. Fetal cells In cervical mucus and maternal blood U Bail Clin. Obstet. Gynecol. 2000. V. 14. P. 709-722.

62. Honda H. Miharu N-, Obashi Y. el al. Fetal gender determination in early pregnancy through qualitative and quantitative analysis of fetal DNA in maternal serum // Hum Genet. 2002. V. 110. P. 75-79.

63. Honda R, Miharu N. Ohashi Y., Ohama It, Successful diagnosis of fetal gender using conventional PCR analysis of maternal serum H Clin. Chem, 2001. V. 47, P. 41-46.

64. Hristoskova S„ Holzgreve W., Hahn S. More than one-half of the erythroblasts in the fetal circulation and cord blood are TUNNEL positive // Clin. Chem. 2001 V 47. P. 1870-1871.

65. Hromadmkova 1-. Houbova B., Hridclova D. et al- Quantitative analysis of fetal DNA levels in maternal plasma in normal and Down syndrom prcgnancics // BMC Pregn, Child. 2002. V. 2.

66. Jahr S,, Hentze H., Engliscb S. et at. DNA fragments in the blood plasma of cancer patients: quantitations and evidence for their origin from apoptotic and necrotic cells // Cancer Res. 2001. V. 61 P. 1659-1665,

67. Johnson K.K. Dukes K.A. Vidaver J. et al. Interlaboraiory comparison of fetal male DNA detection from common maternal plasma samples by real-time PCR //Clin. Chem. 2004. V. 50. P. 536-521.

68. Jones CJ., Fox H, An ultrasmictural and ultrahystochemical study of the human placenta in maternal preeclampsia// Placenta- 1980. V. I. P. 61-76.

69. Katsikis I. Rousso D., Farmakiotis D. Hi al- Creatine phosphokinase in ectopic pregnancy revisited: significant diagnostic value of its MB and MM isoenzyme fractions// Am. J. Obstet. Gynecol. 2006, V. 194. P. 86-91.

70. Kltmek M., Wicherek L., Popiela TJ. el al. Changes of maternal ACTH and oxytocinasc plasma concentrations during (he first trimester of spontaneous abortion // Neuro. Endocrinol. Lett. 2005- V. 26. P. 342-346.

71. Laktionov P.P., Tamkovich S.N. Rykova E-Y. el aL Free and cell-surface-bound nucleic acids in blood of healthy donors and breast canccr patients // Ann. N. Y. Acad. ScL 2004. V. 1022, P. 221-227.

72. Lam N.Y.L-, Rainer T.H., Chan L.Y.S. et at. Time course of early and late changes in plasma DNA in trauma patients // Clin. Chem. 2003. V. 49. P. 12861291.

73. Larrabee P,B„ Johnson K.L. Pcstova E. et al. Microarray analysis of ceil-free fetal DNA in amniotic fluid: a prenatal molecular karyotype II Am. J. Hum. Genet, 2004. V. 75. P. 485-491.

74. Lebedev LN„ Ostroverkhova N.V., Nikitina T.V. et at. Features of chromosomal abnormalities in spontaneous abortion cell culture failures detected by interphase FISH analysis II Eur. J. Hum. Genet. 2004, V. 12. P. 513-520.

75. Leon S.A., Shapiro B., Sklaroff D.M. er al. Free DNA in the serum of cancer patients and the effect of therapy II Cancer Res. 1977. V. 37. P. 646-650.

76. Leung T.N.» Zhang J., Lau T.K. et al. Increased maternal plasma fetal DNA concentrations in women who eventually develop preeclampsia // Clin. Cbem. 2001. V- 47. P. 137-139.

77. Leung T.N^ Zhang J., I.au T.iC et al. Maternal plasma fetal DNA as a marker for preterm labor // Lancet. 1998. V. 352. P. 1904-1905.

78. Li Y,, Di Naro E. Vitucci A. et al. Detection of paternally inherited fetal point mutations for ß-thalassernia using size-fractionated cell-free DNA in maternal plasma U JAMA. 2005. V. 293. P. 843-850.

79. Li Y., Zimmerman B. Rusterholtz C. et al. Size separation of circulator}' DNA in maternal plasma permits ready detection of fetal DNA polymorphisms // Clin. Chem. 2004 V. 50. P. 1002-1011.

80. Lo Y.M.D. Molecular testing of urine; catching DNA on the way out // Clin, Chem, 2000b. V. 46, P, 1039-1040.91, Lo Y.MJ)„ Corbetta N„ Chamberlain PJ. et al. Presence of fetal DNA in maternal plasma and senim if Lancet. 1997. V. 350. P. 485-487.

81. Lo Y.MJ3., Leung T,N.t Tein M.S.C. et al. Quantitative abnormalities of fetal DNA hi 'maternal serum in preeclampsia // Clin. Chem. 1999b. V. 45. P. 184188.

82. Lo Y.M.D., Rainer TJ-L. Chan L.Y.S. et al. Pla$ma DNA as a prognostic marker in trauma patients // Clin. Chem. 2000c. V. 46- P- 319-323,

83. Lo Y.M.D., Tein M.S.C., Lau TJt. et al. Quantitative analysis of fetal DNA in maternal plasma and serum: implications for noninvasive prenatal diagnosis // Am. J. Hum. Genet. 1998b. V. 62. P. 768-775.

84. Lo Y.M.D., Zhang L, Leung T.N. et al. Rapid clearance of fetal DNA from maternal plasma // Am. J. Hum, Genet. 1999c. V. 64. P. 218-224.

85. Lui Y.Y.N. Chlk K-W., Chiu R.W.K. et al. Predominant hematopetic origin of cell-free DNA in plasma and serum after sex-mismatched bone marrow transplantation U Clin. Chem, 2002a. V. 48. P. 421-427.

86. Lui Y.Y.N., Chik K.W., Lo Y.M.D, Does centrifiigaticm cause the ex vivo release of DNA from blood cells? // Clin. Chem. 2002b. V. 48 P. 2074-2076.

87. Masuzaki H.> Miura K,, Yoshiura K. et al. Detection of cell-free placental DNA in maternal plasma: direct evidence from three cases of confined placental mosaicism H 3. Med. Genet, 2004, V. 41. P. 289-292,

88. Matrisian L.M., Sledge G.W., Mohla S. Extracellular proteolysis and cancer: meeting summary and future directions // Cancer Res. 2003. V. 63. P. 6105-6109.

89. Morozkin E.SM Lakiionov P,P,t Rykova E.Y. et al, Extracellular nucleic acids in cultures of long-term cultivated eukaryotic cells It Ann, N.Y. Acad. Set. 2004. V. 1022. P. 244-249.

90. Mulcaliy H, Anker P., Lyautey J. el al. K-ras gene mutations in the plasma of pancreatic patients // Clin. Cancer. 1998. V. 4. P. 271-275.

91. Nasis O-. Thompson S.» Hong T. et al. Improvement in sensitivity of allele-specific PCR facilitates reliable noninvasive prenatal detection of cystic fibrosis H Clin. Chem. 2004. V. 4. P. 694-70L

92. Nawroz H,, Koch W,, Anker P. et al. Microsatellite alterations in serum DNA of head and neck cancer patients // Nat. Med. 1996. V. 2. P. 1035-1037.

93. Nelson M-, Eagle C-, Langshaw M. el al. Genoiyping fetal DNA by noninvasive means: extraction from maternal plasma // Vox. Sang. 2001. V. 80, P, 112-116.

94. Ng E.K., Leung T.N., Tsui N.B. et al, The concentration of circulating cortieotrophin-releasing homnone mRNA in maternal plasma is increased in preeclampsia //Clin. Chem. 2003. V, 49. P. 727-731.

95. Ohashi Y., Mihara N. Honda H. et al. Correlation of fetal DNA and human chorionic gonadotropin concentrations in second-trimester maternal serum // Clin. Chem, 2002, V, 48, P, 386-388,

96. Omoy A-, Salamon-Amon J„ Ben-Zur Z, et al, Placental findings m spontaneous abortions and stillbirths //Teratology. 1981. V. 24. P. 243-252.

97. Oudejans C,B., Go A.T., Visser A et al. Detection of ehromosome 21-encoded mRNA of placental origin in maternal plasma // Clin. Chem. 2003- V. 49. P. 1445-1449.

98. Pertl B., Sekizawa A., Samura O. et al. Detection of male and female fetal DNA in maternal plasma by multiplex fluorescent polymerase chain reaction amplification of short tandem repeats H Hum, Genet. 2000, V. 106. P. 45-49.

99. Qureshi F., Jacques S.M., Johnson M.P. et al. Trysomy 21 placentas: histopaihological and immunohistochemical findings using proliferating cell nuclear antigan // Fetal Diagn. Ther. 1997. V. ! 2. P. 210-215

100. Raptis L., Menard HA. Quantitation and characterization of plasma DN A in normals and patients with systemic lupus erythematosus // J. Clin, Invest, 1980. V, 66 P. ¡391-1399.

101. Rehder H,, Coerdt W„ Eggers R. et at. Is there a correlation between morphological and cytogenetic findings in placental tissue from early missed abortions? // Hum. Genet, 1989. V. 82. P. 377-385.

102. Rijnders R.J., Chrisiiaens G.C. Bossers B. et al. Clinical applications of cell-free fetal DNA from maternal plasma // Obstct. Gynecol. 2004a- V, 103. P 157-164.

103. Rijnders RJ„ Christiaens G.C. Soussan A. et al, Cell-free fetal DNA is not present in ptesma of nonpregnant mothers U Clin. Chem. 2004b. V. 50. P. 679-681

104. Roberts L„ Sebire NJ., Fowler D. et al. Histomorphological features of chorionic villi at 10-14 weeks of gestation in trisomic and chromosomal ly normal pregnancies // Placenta 2000- V. 21- P. 678-683.

105. Rogers J.C. Identification of an intracellular precursor to DNA excreted by human lymphocytes // Proc. Natl. Acad, Sci, USA 1976. V. 73. P. 3211-3215,

106. Rosi A,, Guidoni L. Luciani A.M., Mariutti G. et al. RNA-lipid complexes released from the plasma membrane of human colon carcinoma cells H Cancer Lett. 1988. V. 39. P. 29-30.

107. Rykova E.Y., Laklionov P.P., Skvonsova T.E, Ceil-surface-bound. tumor-derived extracellular DNA in blood of patients with breast cancer and nonmalignanUumore H Ann, N, Y. Acad, Set. 2004. V. 1022, P, 217-220.

108. Saiio H. Sekizawa A. Morimoto T. et al, Prenatal DNA diagnosis of a single gene disorder from maternal plasma H Lancet. 2000, V. 356. P. 310-311.

109. Sanchcz-Cespedes M., Monzo M. Rosell R, et al. Detection of chromosome 3p alterations in serum DNA of non-small-cell lug cancer patients II Ami. Oncol. 1998. V.9. P. 113-116,

110. Schmidt B„ Carstcrisen T„ Engct E, ct al, Detection of cell-free nucleic acids in bronchial lavage fluid supernatant« from patients with lung cancer // Eur, J. Cancer. 2004, V, 40. P. 452-460,

111. Sekizawa A., Farina A. Koide K. el al. Beta-glohin DNA in maternal plasma as a molecular marker of pre-eclamsia // PrenaL Diugn 2004. V. 24. P 697-700.

112. Sekizawa A-, Jimbo M-. Saito H. el al. Increased cell-free fetal DNA in plasma of two women with invasive placenta // Clin. Chem. 2002. V. 48. P 353354.

113. Sekizawa A. Kondo T., Iwasaki M. et al. Accuracy of fetal gender determination by analysis of DNA in maternal plasma II Clin. Chem. 2001a. V. 47. P. 1856-1858.

114. Sekizawa A„ Samura (X, Then D.K. et al. Apoptosis in fetal nucleated erythrocytes circulating in maternal blood II Prenat, Diagn. 2000. V, 20, P. 886889.

115. Sekizawa A. Sugito Y., Iwasaki M. et al Cell-free fetal DNA is increased in plasma of women with hyperemesis gravidarum U Clin, Chem. 2001b, V, 47. P 2164-2165,

116. Semenov D,V„ Kuligina E.V., Shevirina O.N, et at. Extracellular ribonucleic acids of human milk II Ann. N. Y. Acad, Sri. 2004. V. 1022. P. 190194.

117. Shapiro B., Chakraborty M., Coch E.M. et al. Determination of circulating DNA levels in patients with benign or malignant gastrointestinal disease II Cancer 1983. V. 51. P. 2116-2120.

118. Sitva J,M„ Domínguez G,, Garcia J.M. et al, Presence of tumor DNA in plasma of breast cancer patients: clinicopalhological correlations II Cancer Res. 1999. V. 59. P. 3251-3256.

119. Simpson J.L., BishofT F. Cell-free fetal DNA in maternal blood: evolving clinical applications U JAMA. 2004. V. 291. № 9. P. II35-1137,

120. Sisco KX, Is RNA 1 serum bound to nucleoprotein complexes? It Clin. Chem. 2001. V, 47, P. 1744-1745.

121. Skvortsova T.E., Rykova E.Y., Tamkovich S.N. et al. Ceil-free and cell-bound circulating DNA in breast tumors: DNA quantification and analysis of tumor-related gene methylation it Br, J. Cancer. 2006. V. 22. P. 1492-1495.

122. Smid M., Galbiali S„ Vassalo A. Et al. No evidence of fetal DNA persistence in maternal plasma after pregnancy // Hum, Genet. 2003, V. 112, P. 637-618.

123. Smid M. Lagona F,, Papaserigo N. et al. Influence of gestational age on fetal deoxyribonucleic acids retrieval in maternal peripheral blood II Am. J. Obstet. Gynecol. 1997. V. (77. P- 1517-1522.

124. Smid M, Vassalo A., Lagona F. el al. Quantitative analysis of fetal DNA in maternal plasma in pathological conditions associated with placental abnormalities it Ann. N. Y. Acad, Sci. 2001. V. 945. P. 132-137.

125. Smith S.C., Baker P.N., Symonds E.M. Placental apoptosis in normal human pregnancy // Am, J. Obstet. Gynecol. 1997, V. 177. P. 57-65.

126. Sorenson G.D., Porter D.M., Barth R.J. et al. Detection of mutated kRAS2 sequences in plasma from patients with pancreatic carcinoma in comparison with the Cat9-9 assay // J, Int. Soc. Oncodev, Biol. Med, 1997. V. 18. P. 66.

127. Spcnccr K., de Kok J.B., Swinkels D.W. Increased total cell-free DNA in the serum of "pregnant women carrying a fetus affected by trisomy 21 it PrenaL Diagn. 2003. V. 23, P 580-583.

128. Stroun M., Anker P., Maurice P. et al. Neoplastic characteristics of the DNA in the plasma of cancer patients //Oncology. 1989. V. 46. P. 318-322.

129. Stroun M, Lyautey J., Lcdeucy C. <l al. Alu repeat sequences are present tn increased proportions compared to a unique gene in plasma/scrum DNA: evidence for a preferential release from viable celts? // Ann, N. Y. Acad. Sci, 200!. V. 945. P. 258-264.

130. Stroun M,. Maurice P., Vasioukhin V. et al. The origin and mechanism of circulating DNA //Ann. N. Y. Acad. Sci. 2000. V. 906. P. 161-168.

131. Tamkovich S.N. Bryzgunova O.E. Rykova E.Y. el al. Circulating nucleic acids in blood of healthy male and female donors H Clin. Chem. 2005- V. 5t. p. 1317-1319.

132. Tang N.L.S., Leung T.N., Zhang J. et al. Detection of fetal-derived paternally inherited X-chromosome polymorphisms in maternal plasma H Clin. Chem. 1999. V. 45. P. 2033-2035.

133. Thijssen M.A., Swinkels D.W., Ruers T.J. Kok J.B. Difference between free circulating plasma and serum DNA in patients with colorectal liver metastases // Anticancer Res. 2002. V. 22. P. 421-425.

134. Tsatsaris Vr, Goffin F., Munaut C. et al. Ovcrcxpression of the soluble vascular endothelial growth factor receptor in preeclamtic patients: pathophysiological consequences ti j. Clin, Endocrinol, Metab. 2003. V 88. P. 5555-5563,

135. Tsui N.B.Y., Ng E.K.O., Lo Y.M.D. Stability of endogenous and added RNA in blood specimens, serum, and plasma // Ctin. Chem. 2002- V. 48. P. 16471653,

136. Wataganara T. LeShane E.S., Farina A. et al. Maternal serum cell-free fetal DNA levels ore increased in cases of trisomy 13 but not trisomy 18 H Hum. Genet. 2003. V. 112. P, 204-208.

137. Wataganara T„ Peter 1., Messerlian G. et al. Inverse correlation between maternal weight and second trimester circulating cell-free fetal DNA levels // Obstet. Gynecol. 2004. V. 104. P. 545-550.

138. Wei C., Sailer D.N., Sutherland J.W.H. Detection and quantification by homogenous PCR of cell-free feiaJ DNA in maternal scrum U Clin, Chem. 2001. V. 47 P. 336-338,

139. Xu M., Kumar D., Srinivas S. Prenatal gene therapy with p53 inhibits human breast tumors in vivo through a bystander mechanism without evidence of toxicity ii Hum. Gen. Thcr. 1997. V. 8 P. 177-185.

140. Zhong X,Y„ Burk MR., Troeger C. et al. Fetal DNA in maternal plasma is elevated in pregnancies with aneuploid fetuses // Prenat, Diagn, 2000a. . 20. P. 795-798.

141. Zhong X.Y., Holzgreve W., Hahn S. Cell-free fetal DNA in armicrnal circulation does not stem from transplacental passage of fetal erythroblasts // Mol. Hum. Reprod. 2002a V. 8. P. 864-870.

142. Zhong X-Y-, Holzgreve W., Hahn S. Risk free simultaneous prenatal identification of fetal Rhesus D status and sex by multiplex real-time PCR using cell-free fetal DNA in maternal plasma // Swiss, Med, Wkly, 2001a. V. 13 1 . P. 7074.

143. Zhong X.Y., Holzgreve W., Hahn S The levels of circulatory cell- free fetal DNA in maternal plasma are elevated prior to the onset of preeclajnpsia ft Hypertens. Pregnancy. 2002b V. 21. P. 77-83.

144. Zhong X.Y., Holzgreve W. Li J.C. et al. High levels of fetal crytt-» rob lasts and fetal extracellular DNA in the peripheral blood of a pregnant woman with idiopathic polyhydramnios; case report // Prenat- Diagn, 2000b, V. 20, P, S3 8-841.

145. Zhong X.Y, Laivuon H., Livingston J.C. ct al. Elevation of both maternal and fetal extracellular circulating deoxyribonucleic acid concentrations in the plasma of pregnant women with preeclampsia // Am j. Obstet. Gynecol. 2001b V. 184. P. 414-419.

146. Zimmermann B.t Holzgreve W.„ Wenzel F., Hahn S. Novel real-time quantitative PGR test for trisomy 21 // Clin. Chem. 2002. V. 48. P. 362-363.

147. Zolotukhina T.V., Shilova N.V., Voskobocva E-Y. Analysis of cell-free fetal DNA in plasrv.3 and serum of pregnant women // J. Histochem, Cytochem. 2005. V. 53 P. 297-299.

148. Zaragoza M.V., Millie E.t Redline R.W. Hassold TJ. Studies of nondisjunction in trisomies 2, 7, 15 and 22: does the parental origin of trisomy influence placental morphology? Hi. Med. GeneL 1998. V. 35. P. 924-931.