Исследование изменения количества копий и формирования делеций митохондриальной ДНК в клетках тканей мышей после воздействия ионизирующей радиации тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.02, кандидат биологических наук Антипова, Валерия Николаевна

• Антипова, Валерия Николаевна
• кандидат биологических наук
• 2011

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Антипова, Валерия Николаевна

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Глава 1. Особенности митохондриального генома.

1.1. Структура митохондриальной ДНК.

1.2. Восприимчивость мтДНК к повреждению.

1.3. Материнская наследственность.

1.4. Гетероплазмия.

1.5. Митотическая сегрегация.

1.6. Пороговый эффект доли мутантных копий мтДНК.

Глава 2. Компенсаторная репликация'мтДНК.

Глава 3. Факторы регуляции активации репликации мтДНК и биогенеза митохондрий.

Глава 4. Делеции мтДНК.

4.1. Делеции мтДНК - возможная причина митохондриальных заболеваний и старения организма.

4.2. Общие особенности делеций мтДНК.

4.3. Механизм формирования делеций мтДНК.

4.4. Делеции как маркер поврежденности митохондриального генома.

Глава 5. Некоторые методы, применяемые для анализа количества копий и выявления делеций мтДНК.

5.1. Полимеразная цепная реакция.

5.2. Полимеразная цепная реакция протяженных фрагментов.

5.3. Полимеразная цепная реакция в реальном времени.

5.4. Саузерн-блот.

5.5. Локус-специфическая ПЦР.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Оборудование.

Компьютерные программы.

Маркеры.

Наборы реагентов.

Химические реактивы.

Ферменты.

Лабораторные животные.

Радиационная обработка.

Выделение ДНК.

Определение концентрации ДНК.

Праймеры и условия ГТЦР.

Электрофорез в агарозном геле.

Определение интенсивности флуоресценции.

Очистка фрагментов ДНК.

Секвенирование ДНК.

Статистическая обработка данных.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Исследование изменения общего количества копий мтДНК в клетках тканей селезенки и мозга мышей, подвергшихся воздействию ионизирующей радиации.

2. Определение уровня копийности мтДНК с большими делециями в клетках тканей мышей в пострадиационный период.

3. Изучение динамики изменения содержания копий внеклеточных мтДНК с делециями в плазме крови мышей в пострадиационный период.

4. Исследование изменения количества копий и формирования делеций мтДНК в клетках крови онкологических пациентов в процессе РХТ.

ВЫВОДЫ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Исследование изменения количества копий и формирования делеций митохондриальной ДНК в клетках тканей мышей после воздействия ионизирующей радиации»

Известно, что воздействие физических и химических факторов окружающей среды на организмы животных и человека в малых и умеренных дозах могут быть причиной изменений в геноме соматических клеток тканей, которые приводят к мутационным и канцерогенным нарушениям. В связи с тем, что в настоящее время широкое использование источников ионизирующих излучений и ядерных технологий в различных областях производственной деятельности человека приводит к облучению в низких дозах существенной доли популяции, людей, изучение молекулярных механизмов формирования последствий действия* ионизирующей радиации (ИР) на организм млекопитающих и создание методов биомониторинга эффектов радиации является одной из актуальных задач радиационной^ биофизики.

Подавляющее большинство исследований радиационно-индуцированных изменений в генетическом материале клетки основаны на анализе изменений параметров ядерной ДНК. Но, благодаря развитию методической базы исследований в области молекулярной биологии и радиационной биофизики, сформировалось общее теоретическое представление, что для процессов пострадиационного восстановления клеточного ядра и других компонентов клетки чрезвычайно значимы процессы, контролируемые митохондриями. Функционирование этих органелл обеспечивает основную часть энергопотребления клеток в виде АТФ. Нуклеотидная последовательность митохондриалыгой ДНК кодирует полипептиды системы «дыхательной цепи» митохондрий.

Некоторые особенности делают митохондриальный геном более чувствительной мишенью не только для активных форм кислорода (АФК), генерируемых в самих митохондриях, но и для внешних повреждающих агентов. Все это способствует формированию в мтДНК нарушений с более высокой частотой, чем в яДНК. Когда количество мутантных молекул мтДНК превышает определенный- порог, это влечет за собой нарушение множества энергозависимых путей клеточного метаболизма. Возникает состояние «митохондриальной дисфункции», с которой связаны активация клеточной гибели и ослабление функций тканей, развитие дегенеративных процессов, «митохондриальных» патологий, включая нейродегенеративные, нейромышечные и ишемические заболевания [из обзора Газиев, Шайхаев, 2008]. Как показывают результаты исследований [Murphy et al., 2005; Lee et.al., 2000], в культивируемых клетках после воздействия окислительных агентов, наряду с повреждением мтДНК наблюдается активация биогенеза митохондрий и увеличение числа копии мтДНК. Возможно, с репликацией копий мтДНК, содержащих повреждения, связано возникновение в митохондриальном геноме делеций разного размера и закрепление в нем точечных мутаций. Формирование больших делеций приводит к утрате некоторых генов и, как следствие, к определенному дефициту белков цепи переноса электронов. Вместе с тем сведения о формировании таких нарушений мтДНК как делеции в клетках тканей человека или животных, подвергшихся радиационному воздействию на уровне целого организма, в литературных источниках ограничены, хотя проблема является чрезвычайно актуальной.

Цель и основные задачи исследования.

В связи с вышеизложенным, целью настоящей работы являлось исследование изменения общего количества копий и содержания копий мтДНК с делециями в клетках тканей и плазме крови мышей после воздействия ионизирующей радиации.

Были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать изменение общего количества копий митохондриальной ДНК (мтДНК) в клетках митотически активной ткани (селезенки) и постмитотической ткани (головного мозга) мышей, подвергшихся воздействию ионизирующей радиации.

2. Определить уровень копийности мтДНК с большими делециями в клетках тканей мышей в пострадиационный период.

3. Изучить динамику изменения содержания копий внеклеточных мтДНК с делециями в плазме крови мышей в пострадиационный период.

Обзор литературы.