Исследование механизма действия тетраалкиаммониевого производного 6-метилурацила в синапсах дыхательной и локомоторных мышц крысы тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.13, кандидат биологических наук Петров, Константин Александрович

• Петров, Константин Александрович
• кандидат биологических наук
• 2006

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Петров, Константин Александрович

Список сокращений

Введение

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Функциональная организация нервно-мышечного синапса

1.1.1. Пресинаптические структуры и секреция ацетилхолина

1.1.2. Постсинаптические структуры и действие ацетилхолина

1.1.3. Синаптическая щель и завершение действия ацетилхолина

1.1.3.1. Ацетилхолинэстераза в области синаптического контакта

1.1.3.2. Особенности функционирования нервно-мышечных синапсов при недостатке активности ацетилхолинэстеразы

1.2. Общая характеристика и классификации ингибиторов 25 холинэстераз

1.3. Фармакологическая безопасность или широта эффективного действия ингибиторов холинэстераз

1.4. Новый класс ингибиторов холинэстераз: тетраалкил-аммониевые производные 6-метилурацила и аллоксазина

1.4.1. Эффекты тетраалкиламмониевых производных 6-метилурацила in vitro

1.4.2. Эффекты тетраалкиламмониевых производных 6-метилурацила in vivo

1.5. Неоднородность свойств различных типов 37 двигательных единиц

1.6. Ацетилхолинэстераза в «быстрых» и «медленных» мышцах

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Влияние соединения № 547 на амплитудно-временные

3.2. Влияние соединения № 547 на амплитудно-временные параметры МТКП

3.3. Исследование механизма холиноблокирующего действия соединения №

3.4. Влияние фосфорорганического ингибитора АХЭ армина на амплитудно-временные параметры МТКП

3.5. Влияние соединения № 547 на амплитудно-временные параметры МТКП пластинки в т. ркгешсш при избирательном ингибировании бутирилхолинэстеразы

3.6. Влияние соединения № 547 на амплитуду и постоянную времени спада МТКП на фоне предварительной обработки прозерином

3.7. Влияние соединения № 547 на интенсивность спонтанной и вызванной секреции ацетилхолина из двигательных нервных окончаний

3.8. Влияние соединения № 547 на амплитуду потенциалов концевой пластинки в условиях высокочастотной стимуляции нерва

3.9. Влияние прозерина на амплитуду потенциалов концевой пластинки в условиях высокочастотной стимуляции нерва

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Исследование механизма действия тетраалкиаммониевого производного 6-метилурацила в синапсах дыхательной и локомоторных мышц крысы»

Актуальность исследования. Ацетилхолинэстераза (АХЭ) - один из ключевых ферментов, обеспечивающих нормальное функционирование холинергических синапсов за счет ограничения действия ацетилхолина (АХ), освобождающегося из нервного окончания. Хорошо известно, что ингибирование этого фермента приводит к накоплению АХ в синаптической щели, вызывая при ритмической стимуляции стойкую деполяризацию постсинаптической мембраны и быстрое снижение амплитуд потенциалов концевой пластинки (ПКП) что, в конечном счете, нарушает генерацию потенциала действия мышечного волокна (Кривой и др., 1987). При отравлении антиАХЭ веществами эти явления приводят к гибели человека и животных, прежде всего, из-за нарушения работы дыхательной мускулатуры (Pope et al., 2005). В то же время, ингибиторы АХЭ, традиционно применяются в медицинской практике при заболеваниях, для лечения которых требуется продление действия АХ в синаптической щели (глаукома, миастения Гравис, болезнь Альцгеймера). В последнее время антиАХЭ препараты рассматриваются как потенциальные лекарственные средства при лечении болезни Паркинсона, черепно-мозговых травмах, алкоголизме, маниакально-депрессивных психозах, шизофрении, аутизме, расстройствах сна (Jeffrey, Cummings, 2000). Для расширения области применения ингибиторов АХЭ в медицинской практике актуальной является разработка новых соединений, характеризующихся высокой антиАХЭ активностью и фармакологической безопасностью (Eddelston et al. 2005). Перспективным, в этой связи, представляется синтезированный в Институте органической и физической химии им. А.Е. Арбузова новый класс ингибиторов АХЭ - тетраалкиламмониевых производных 6-метилурацила, характеризующихся высокой избирательностью в отношении коммерческих препаратов АХЭ млекопитающих (к°=7.6-108-3.5-109 моль^мин"1) (Резник,1998; Аникиенко, 2001). Существенной особенностью действия этих соединений у млекопитающих in vivo, по сравнению с традиционными антиАХЭ средствами из классов фосфорорганических ингибиторов, карбаматов и ониевых солей, является большой диапазон между дозами, в которых они парализуют мышцы конечностей при функциональной нагрузке, и летальными дозами, в которых они блокируют дыхательные мышцы (ЛД50/ЭД50>50) (Зобов и др., 2004, 2005). Среди тетраалкиламмониевых производных 6-метилурацила наиболее эффективным является 1,3-бис[5(диэтил-о-нитробензиламмонио)пентил]-6метилурацилдибромид (соединение № 547), имеющий коэффициент фармакологической безопасности (ЛД50/ЭД50) до 300, в зависимости от вида животного (Зобов и др., 2004, 2005).

Так как ингибиторы АХЭ, содержащие катионные группировки, практически не проникают через гематоэнцефалический барьер, и основной их мишенью является нервно-мышечный синапс, важно установить причину различий в эффективности действия данного представителя ряда тетраалкиламмониевых производных 6-метилурацила на состояние функциональной синаптической АХЭ в нервно-мышечных соединениях локомоторных и дыхательных мышц, которое оценивается по амплитудно-временным параметрам поетеинаптических ответов. Необходимо выяснить связан ли отказ от выполнения функциональной нагрузки без угнетения дыхания, в присутствии соединения № 547 с его способностью в различной степени ингибировать АХЭ в синапсах локомоторных мышц и диафрагме - основной мышце, обеспечивающей дыхание у млекопитающих, либо с другими, несвязанными с ингибированием АХЭ, эффектами соединений данного класса. Поскольку в настоящее время неизвестны ингибиторы АХЭ, обладающие специфичностью по отношению к синапсам мышц разного функционального профиля, то представители ряда тетраалкиламмониевых производных 6-метилурацила могут служить основой для синтеза новых, более безопасных ингибиторов АХЭ.

Цель и основные задачи исследования:

Исследование действия одного из наиболее эффективных представителей ряда тетраалкиламмониевых производных 6-метилурацила - соединения № 547 на синаптическую передачу возбуждения в мышцах крысы разного функционального профиля: локомоторных («быстрой» - т. extensor digitorum longus (т. EDL) и «медленной» - т. soleus,) и диафрагмы («смешанной» - т. phrenicus).

В соответствии с этой целью были поставлены следующие задачи:

1. На основании анализа амплитудно-временных характеристик спонтанных постсинаптических ответов исследовать влияние разных концентраций соединения № 547 на состояние функциональной синаптической АХЭ в синапсах локомоторных и дыхательной мышц.

2. Выявить наличие и исследовать механизм, несвязанного с ингибированием АХЭ, холиноблокирующего действия соединения № 547 в синапсах мышц разного функционального профиля.

3. Сопоставить эффекты соединения № 547 и известных ингибиторов АХЭ других классов (армина и прозерина) в синапсах мышц разного функционального профиля.

4. Изучить роль бутирилхолинэстеразы в развитии эффектов соединения № 547 в синапсах дыхательной и локомоторных мышц.

5. Изучить влияние соединения № 547 на интенсивность спонтанной секреции квантов ацетилхолина в синапсах мышц разного функционального профиля.

6. Исследовать влияние соединения № 547 на вызванное квантовое освобождение медиатора в синапсах дыхательной и локомоторных мышц при различных режимах высокочастотной стимуляции двигательного нерва.

Положения, выносимые на защиту:

1. Тетраалкиламмониевое производное 6-метилурацила - 3-бис[5(диэтил-о-нитробензиламмонио)пентил]-6-метилурацилдибромид (соединение № 547) является специфическим необратимым ингибитором функциональной синаптической ацетилхолинэстеразы (АХЭ) в нервно-мышечных соединениях теплокровных.

2. Особенности влияния соединения № 547 на синаптическую передачу в функционально различных (локомоторных и дыхательных) мышцах обусловлены значительно более низкой (в 100 раз) эффективностью препарата по отношению к АХЭ синапсов дыхательной мышцы.

Научная новизна.

Впервые выполнено исследование влияния нового ингибитора АХЭ из класса тетраалкиламмониевых производных 6-метилурацила (соединение № 547) на проведение возбуждения в синапсах локомоторных и дыхательных мышц. Установлено, что синапсы локомоторных мышц имеют более высокую чувствительность к ингибированию АХЭ соединением № 547 по сравнению с дыхательной мышцей. Эти различия не проявляются при действии классических ингибиторов АХЭ, относящихся к фосфорорганическим - армина и карбаматным -прозерина. Выявленные различия могут обусловливать 300-кратное превышение летальной дозы препарата, вызывающей блокирование дыхательной мускулатуры, над эффективной дозой, приводящей к параличу мышц конечностей в условиях функциональной нагрузки in vivo.

Научно-практическая ценность.

Основное значение результатов проведенного исследования состоит в выявлении механизмов действия на процесс синаптической передачи представителя нового класса ингибиторов АХЭ - тетраалкиламмониевого производного 6-метилурацила, которое в экспериментах in vivo проявляет разную способность оказывать миорелаксантное действие на работу дыхательной и локомоторной мускулатуры. Полученные данные о различиях в чувствительности синапсов мышц разного функционального профиля к ингибированию фермента соединением № 547 свидетельствуют об особенностях АХЭ в мышцах, обеспечивающих выполнение различных функций, и дают основания для разработки новых ингибиторов АХЭ, имеющих высокий коэффициент фармакологической безопасности и широту терапевтического действия, избирательно действующих на мышцы определенного функционального профиля.

Апробация работы. Основные результаты работы доложены на II Съезде токсикологов России (Москва, 2003), Международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2003), XIX Всероссийском съезде физиологического общества им. И.П. Павлова (Екатеринбург, 2004), III съезде биофизиков России (Воронеж, 2004), Всероссийской конференции «Нейрогуморальные механизмы регуляции сердца», КГПУ (Казань, 2004), IX Всероссийской школе молодых ученых «Актуальные проблемы нейробиологии» (Казань, 2005), I Съезде физиологов СНГ (Сочи, 2005), межлабораторном семинаре Института эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова (г. С.Петербург; 24.01.2006 г.) в рамках проведения XIII Международного совещания и VI школы по эволюционной физиологии 23-28 января 2006 г., итоговых научных конференциях КазНЦ РАН (2004-2006).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 14 работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация объемом 116 страниц состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов, списка цитируемой литературы и сокращений. Список цитируемой литературы включает 144 наименований, из них 21 отечественных и 123 иностранных авторов. Диссертация содержит 34 рисунка и 2 таблицы.

Заключение диссертации по теме «Физиология», Петров, Константин Александрович

ВЫВОДЫ

1. Соединение № 547 в диапазоне концентраций 10"9 - 10"5 моль/л оказывает необратимое доза-зависимое ингибирующее действие на функциональную синаптическую АХЭ, о чем свидетельствует увеличение амплитуды и длительности постсинаптических ответов в синапсах локомоторных и дыхательной мышц.

2. Концентрация соединения №547, вызывающая изменения амплитудно-временных параметров синаптических ответов, характерные для практически полного ингибирования АХЭ, в синапсах дыхательной мышцы в 100 раз больше, чем в синапсах локомоторных мышц.

3. Соединение № 547 в концентрациях более 10"6 моль/л, помимо необратимого антиАХЭ действия, проявляет обратимое холиноблокирующее действие, связанное с блокадой ионных каналов холинорецепторного комплекса мембраны мышечного волокна.

4. Различия в эффективных концентрациях соединения № 547, вызывающих изменения амплитудно-временных параметров постсинаптических ответов в синапсах дыхательной и локомоторных мышц, не связаны с разной выраженностью его холиноблокирующего действия.

5. Концентрации соединения № 547, при которых наблюдались изменения интенсивности спонтанной квантовой секреции и квантового состава потенциалов концевой пластинки, в синапсах дыхательной мышцы были в 10 раз выше, чем в синапсах локомоторных мышц.

6. При ритмической стимуляции двигательного нерва с частотой, соответствующей физиологической для каждого типа мышц, эффективность влияния соединения № 547 на амплитуду постсинаптических ответов в локомоторных мышцах в 100 раз выше, чем в дыхательной мышце.

7. Полное блокирование проведения возбуждения при различных режимах частотной стимуляции в дыхательной мышце в присутствии соединения № 547 наблюдалось в концентрации в 20 раз выше, чем в локомоторных мышцах.

100

8. Эффекты фосфорорганического ингибитора АХЭ армина и карбаматного -прозерина на процессы синаптической передачи, в отличие от действия соединения № 547, не различались в дыхательной и локомоторных мышцах.

9. Избирательное и необратимое ингибирование бутирилхолинэстеразы не влияло на эффективность соединения 547 в синапсах дыхательной мышцы и не устраняло различий в проявлении антиАХЭ действия по сравнению с синапсами локомоторных мышц.

10.Большой диапазон между летальной дозой соединения № 547, вызывающей паралич дыхательной мускулатуры и дозой, парализующей локомоторные мышцы, в условиях функциональной нагрузки в экспериментах in vivo может объясняться разной эффективностью препарата по отношению к ацетилхолинэстеразе локомоторных и диафрагмальной мышц.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Синтезированные в Институте органической и физической химии им. А.Е. Арбузова тетраалкиламмониевые производные 6-метилурацила (среди которых одним из наиболее эффективных является соединение № 547) , выделены в новый класс ингибиторов АХЭ и проявляют особые свойства в экспериментах на целом животном (Резник,1998; Аникиенко, 2001). В опытах in vivo были выявлены определенные видовые различия в реакции животных на соединение № 547: собаки оказались наиболее уязвимыми к его токсическому действию (ЛД50=0,51 мкМ/кг), нежели мыши (ЛД50=1,17 мкМ/кг) и крысы (ЛД50=2,91 мкМ/кг). При этом именно в опытах на крысах для соединения № 547 было получено наиболее оптимальное сочетание параметров токсичности, миорелаксантной активности и фармакологической безопасности: ЛД5о=2,91 (2,29+3,57) мкМ/кг, ЭД5о=0,009 (0,008-0,01) мкМ/кг, ЛД5о/ЭД5о=323,3 (257,30-390,05), длительность миорелаксантного действия (7-8 суток), уникальное для класса ингибиторов холинэстераз (Зобов и др., 2004; Зобов и др., 2005). В связи с этим, в данной работе была предпринята попытка выяснить, обусловлены ли особенности действия тетраалкиламмониевых производных 6-метилурацила (в частности, соединения № 547) их способностью в различной степени ингибировать АХЭ в синапсах локомоторных мышц и диафрагме, либо другими, несвязанными с ингибированием

АХЭ, эффектами соединений данного класса.

В гидролизе АХ, освобождаемого нервным окончанием, участвует практически только синаптическая, или функциональная, АХЭ. В свою очередь, именно эта локализованная экстраклеточно АХЭ, является доступной для ингибиторов, содержащих четвертичные аммониевые группировки, к которым относится исследуемое нами соединение №547.

Существует несколько методов определения активности АХЭ в тканях. Наиболее часто используется метод определения активности АХЭ в гомогенатах. Однако известно, что только 20-30 % от общей активности АХЭ в гомогенатах мышц приходится на АХЭ, локализованную экстраклеточно (Younkin, 1982;

Кривой, 1987). Поэтому методы, основанные на определении активности АХЭ в гомогенатах мышц, малопригодны для определения активности собственно синаптической АХЭ. При определении активности АХЭ в интактном (не гомогенизированном) препарате измеряется только активность фермента, локализованного экстраклеточно. Но Miledi et al (1984) показали, что при таком способе оценки измеряется только малая часть активности фермента локализованного в синапсе (около 5% для портняжной мышцы лягушки), а основная часть активности приходится на долю более доступной внесинаптической экстраклеточной АХЭ, поэтому данный метод также не отражает адекватно изменение активности фракции АХЭ, ответственной за формирование амплитудно-временных параметров сигналов в процессе нервно-мышечной передачи возбуждения.

Хорошо известно, что при угнетении синаптической АХЭ происходит увеличение амплитуды и длительности постсинаптических потенциалов и токов, что объясняется увеличением вероятности связывания молекул АХ с рецепторами (Katz, Miledi, 1973). В ряде работ, в том числе с применением методов математического моделирования, анализировалась корреляция между степенью активности АХЭ и относительным изменением параметров МТКП. В частности, Anglister et al.(1994) было показано, что только при практически полном (более чем на 90%) угнетении АХЭ происходит увеличение длительности заднего фронта постсинаптических ответов, в то время как амплитуда сигналов зависит от плотности активных центров АХЭ почти линейно. Таким образом, параметры МТКП могут служить адекватным показателем активности функциональной АХЭ (Кривой, 1987).

В наших экспериментах было установлено, что во всех исследуемых мышцах (т. phrenicus, т. EDI, т. soleus) в присутствии соединения № 547 характерным для ингибирования АХЭ образом увеличивались амплитуда и постоянная времени спада постсинаптических ответов. Однако концентрационные зависимости изменений параметров МПКП были различны для исследованных мышц. В m.soleus и m.EDL соединение № 547 уже в концентрации 1х10"9 моль/л вызывало достоверное увеличение спада МПКП, тогда как в т. phrenicus влияние на спад ответов наблюдалось только при концентрации соединения № 547 на два порядка выше.

Антихолинэстеразное действие соединения № 547 было необратимым в синапсах всех исследуемых мышц, на что указывает отсутствие уменьшения амплитудно-временных параметров МПКП после удаления соединения № 547 из перфузионного раствора. Кроме того, этого вещество вызывало дополнительный эффект на амплитудно-временные параметры постсинаптических ответов, проявляющийся в присутствии больших концентраций соединения (>1x10"6 моль/л) и выражающийся в снижении амплитуды и укорочении длительности заднего фронта МТКП. Как показал анализ механизма этого холиноблокирующего эффекта, в основе его лежит блокада открытого канала холинорецептора высокими концентрациями соединения № 547.

Полученные данные свидетельствуют о том, что соединение № 547 в нервно-мышечных синапсах крысы уже в наномолярных концентрациях необратимо ингибирует синаптическую АХЭ, причем эффективность этого действия существенно различается в локомоторных и дыхательной мышцах. Характерные для практически полного ингибирования фермента изменения амплитудно-временных параметров постсинаптических ответов наблюдаются в диафрагме в концентрации в 100 раз большей, чем в локомоторных мышцах.

Чтобы оценить, могут ли данные различия объяснить невозможность выполнения функциональной нагрузки животными в тестах in vivo, что характерно для влияния тетраалкиламмониевых производных 6-метилурацила, были проведены эксперименты по регистрации многоквантовых ПКП в условиях ритмической стимуляции нерва. Было установлено, что в присутствии соединения № 547 возникает явление стойкой деполяризации мембраны мышечного волокна, характерное для снижения активности синаптической АХЭ, переходящее в пресинаптический блок. Предполагается, что причиной блока проведения при высокочастотном раздражении нерва при инактивированной АХЭ может быть аккумуляция в синаптической щели К+, выходящих из мышечного волокна в результате постсинаптического действия избыточного АХ. Другая гипотеза связывает пресинаптический блок с активацией избыточным влиянием накапливаемого АХ на ауторецепторы на мембране нервного окончания, участвующие в регуляции экзоцитоза синаптических везикул (Кривой, 1987).

При ритмической стимуляции двигательного нерва с частотой, соответствующей физиологической для каждого типа исследуемых мышц, эффективность влияния соединения № 547 на амплитуду постсинаптических ответов в локомоторных мышцах оказалась в 100 раз выше, чем в дыхательной мышце, а концентрации соединения, вызывающие полную блокаду синаптического проведения в локомоторных мышц и дыхательной мышцах, отличались, как минимум в 20 раз.

Для объяснения различия в чувствительности мышц разного функционального профиля к соединению № 547 было выдвинуто несколько гипотез.

Известно, что синапсы мышц разного типа имеют морфологические особенности, которые могут сказываться на состоянии процессов, определяющих амплитудно-временные параметры постсинаптических ответов. Так, например, в медленных мышцах первичная синаптическая щель шире и постсинаптические складки менее глубокие, чем в быстрых мышцах (ЕШэтап е1 а1., 1976). Кроме того, в синапсах медленных мышц меньше плотность АХЭ и рецепторов на постсинаптической мембране (Федоров, 1980). В наших экспериментах амплитуда и длительность ответов, зарегистрированных в синапсах медленной мышцы т. яоЫт были также достоверно больше по сравнению с т. ЕЭЬ и т. ркгетст. что может объясняться упомянутыми выше особенностями синаптических контактов мышц разного типа. Но, если бы обнаруженное нами различие в чувствительности синапсов мышц разного профиля к соединению № 547 объяснялось лишь морфологическими особенностями диафрагмы и локомоторных мышц, то это различие наблюдалось бы и в присутствии других антиАХЭ препаратов. Однако, в наших экспериментах с инактивированием АХЭ фосфорорганическим ингибитором армином и четвертичным аммониевым производным - прозерином минимальные концентрации, вызывающие достоверное изменение анализируемых параметров не различались для всех исследованных мышц.

Наличие в нервно-мышечных синапсах скелетных мышц мышей и других млекопитающих, помимо АХЭ, бутирилхолинэстеразы (БуХЭ) (Silver, 1963), количество и активность которой может различаться в синапсах разных мышц, позволяет предположить, что в диафрагме крысы активность БуХЭ может быть большей, чем в локомоторных мышцах и, тем самым, компенсировать последствия ингибирования АХЭ, вызванные соединением № 547. Основанием для такого предположения могут быть также и данные о том, что ингибиторы БуХЭ способны потенцировать токсичность соединения № 547 в 300 раз, уменьшая, таким образом, различия между летальной и эффективной дозами до нуля (Отчет НИР ИОФХ, 1990). Для проверки этой гипотезы были исследованы эффекты соединения № 547 в синапсах диафрагмы в присутствии специфического необратимого ингибитора БуХЭ - iso-OMPA. Ингибирование БуХЭ на фоне соединения № 547 в концентрации, вызвающей изменения амплитудно-временных параметров ответов в локомоторных мышцах, не оказывало влияние на параметры ответов в диафрагмальной мышце. При более высоких концентрациях соединения № 547 ингибирование БуХЭ приводило к увеличению параметров ответов, которое, однако, было существенно меньше изменений, наблюдаемых в интактном препарате дыхательной мышцы. Таким образом, избирательное и необратимое ингибирование БуХЭ с помощью изо-ОМРА не приводило к значимому снижению эффективной концентрации соединения 547 в т. phrenicus до уровня таковых в локомоторных мышц и к соответствующему нивелированию различий между ними.

В проведенных экспериментах было установлено, что кроме антихолинэстеразного, в механизме действия соединения № 547 присутствует противоположно направленное холиноблокирующее действие, связанное с блокадой АХР. Можно предположить, что в низких концентрациях (менее 1х10"7 моль/л), когда в дыхательной мышце не наблюдалось характерного для ингибирования АХЭ увеличения амплитудно-временных параметров постсинаптических ответов, холиноблокирующий компонент действия соединения № 547 в ней более выражен, чем в локомоторных мышцах. Снижение амплитуды и укорочение длительности МТКП, проявляющееся при развитии холиноблокирующего эффекта могло бы компенсировать рост амплитудно-временных параметров вследствие ингибирования АХЭ, обусловливая, таким образом, различие между чувствительностью к ингибитору локомоторных и дыхательной мышц. Для проверки этой гипотезы регистрировали амплитуду и длительность МТКП в т. ЕИЬ и т. ркгетсш в присутствии соединения № 547 на фоне предварительного ингибирования АХЭ прозерином. Проявление антиАХЭ действия прозерина в этой концентрации не сопровождалось различиями в чувствительности к ингибитору в синапсах локомоторных и дыхательной мышц.

Холиноблокирующий эффект соединения № 547 на фоне предварительного ингибирования АХЭ должен проявиться в падении амплитуды и укорочении постоянной времени спада МТКП относительно зарегистрированных в присутствии прозерина без соединения №547. Действительно, добавление к мышцам, обработанным прозерином, соединения № 547 в концентрации 1х10"7 моль/л, одинаково эффективной в дыхательной и локомоторной мышцах, вызывало укорочение спада МТКП и в т. рЪгетсш, и в т. ЕОЬ на 29% и 30%, соответственно, т.е. выраженность холинолитического эффекта соединения № 547 была одинакова. Добавление более низкой концентрации соединения № 547 не приводило ни в дыхательной, ни в локомоторной мышцах к достоверным изменениям амплитуды и постоянной времени спада МТКП, по сравнению с параметрами сигналов, зарегистрированными в прозерине. Полученные данные свидетельствуют о том, что различия в эффективности холиноблокирующего действия соединения № 547 не проявляются в дыхательной и локомоторной мышцах, и, следовательно, не могут объяснять 100-кратную разницу в эффективности соединения № 547.

Таким образом, проведенные исследования показали, что ни морфологические особенности синапсов мышц разного функционального профиля, ни возможно разная активность бутирилхолинэстеразы, ни особенности проявления холиноблокирующего эффекта соединения № 547 в синапсах дыхательной и локомоторных мышц не могут лежать в основе различий действия этого соединения в исследуемых мышцах. По-видимому, большой диапазон между летальной дозой соединения № 547, вызывающей паралич дыхательной мускулатуры и дозой, парализующей локомоторные мышцы, в условиях функциональной нагрузки в экспериментах ш vivo может объясняться разной эффективностью препарата по отношению к ацетилхолинэстеразам локомоторных и диафрагмальной мышц. Известно, что АХЭ существует в виде множественных молекулярных форм, имеющих одинаковые каталитические свойства, но значительно различающихся характером сборки субъединиц, скоростью седиментации, а также типом ассоциации с клеточной мембраной (Кривой, Драбкина, 2004). Каталитические субъединицы АХЭ могут различаться по степени гликозолирования, могут олигомеризоваться в димеры и тетрамеры, образуя глобулярные формы (G): Gl, G2, G4. Присоединение коллаген-подобного хвоста (Col Q) к одному, двум или трем каталитическим тетрамерам дает ассиметричные формы (А): А4, А8, А12. У разных животных и в разных мышцах соотношение ассиметричных и глобулярных форм АХЭ существенно различается (Yonkin, 1982). В то же время, о физиологической роли отдельных изоформ АХЭ известно очень мало. Установлено, например, что за поддержание нормальной нервно-мышечной передачи возбуждения в скелетных мышцах крысы ответственны формы G4 и Al2 (Hall, 1973). Предполагается, в частности, что ассиметричная изоформа А12, локализованная на базальной мембране, ответственна за гидролиз АХ, диффундирующего через синаптическую щель. Она контролирует количество медиатора, достигающего поверхности мышцы и диффундирующего в синаптическую щель после взаимодействия с рецепторами. Глобулярная форма G4 предположительно локализована на постсинаптической мембране и ответственна

98 за гидролиз молекул АХ, находящихся в непосредственной близости от рецепторов. Синтез отдельных изоформ АХЭ регулируется разными факторами. Например, синтез изоформы G4 инициируется повышением частоты взаимодействия медиатора с холинорецепторами. Уровень изоформы А12 определяется комбинацией эффектов взаимодействия АХ и некоей нейрональной субстанции (Fernandez, Donoso, 1988; Fernandez, Hodges-Savola, 1992). Это также может служить доказательством того, что функции отдельных изоформ различны. Известно, что в диафрагме преобладает А12 (Yonkin et al, 1982), в m. EDL - G4, (Boudreau-Lariviere et al., 2000). В настоящее время в литературе есть данные об ингибиторах АХЭ, обладающих специфичностью по отношению к изоформам АХЭ. Так, для некоторых ингибиторов АХЭ, применяемых при лечении болезни Альцгеймера (донепезил, такрин, ривастигмин, гиперзин А) была показана способность преимущественно ингибировать либо G4, либо Gl изоформы АХЭ (Zhao, Tang, 2002). Вполне вероятно, что соединение № 547 обладает специфичностью по отношению к какой-либо из этих форм, например к изоформе G4. В связи с этим можно предположить, что исследуемое производное 6-метилурацила может быть «инструментом» для выявления особенностей и физиологической роли изоформного состава АХЭ в синапсах мышц разного функционального профиля.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Петров, Константин Александрович, 2006 год

1. Зобов В.В. Биологическая активность фосфорилированных производных 6-метилурацила / В.В. Зобов, Л.А. Березинский, B.C. Резник, В.Д. Акамсин // Хим,-фарм. журнал. -2002. -Т. 36, № 11. -С. 21-22.

2. Зобов В.В. Отсроченные последствия интоксикации дафний селективным и неселективным ингибитором ацетилхолинэстеразы /В.В. Зобов, Л.А. Березинский, A.A. Аслямова, B.C. Резник // Бюлл. экспер. биол. и мед. -2005а. -Т 139, № 1. -С. 77-78.

3. Кочетков М.А. Синтез избирательных ингибиторов бутирилхолинэстеразы -потенциальных антиатерогенных веществ: автореф. дис. . канд. хим. наук / М.А. Кочетков, ГосНИИОХТ. Москва, 1998. - 26 с.

4. Кривой И.И. Нервно-мышечный синапс и антихолинэстеразные вещества / И.И. Кривой, В.И. Кулешов, Д.Л. Матюшин. Л.: изд-во ЛГУ им. A.A. Жданова, -1987. -238 с.

5. Михельсон М.Я. Э.В. Ацетилхолин: О молекулярном механизме действия / М.Я. Михельсон, Э.В. Зеймаль. Л.: Наука, 1970. 279 с.

6. Моралев С.М. Современные представления о структуре и каталитических свойствах холинэстераз позвоночных и беспозвоночных (обзор) / С.М. Моралев, Е.В. Розенгарт // Журнал эволюционной биохимии и физиологии. 1999. - Т.35,1,-С. 3-14.

7. Моралев С.Н. «Каталитическая машина» холинэстераз разных животных устроена одинаково / С.Н. Моралев, Е.В. Розенгарт, A.A. Суворов // ДАН. 2001. -Т. 381, № 1.-С. 123-125

8. Отчет о НИР ИОФХ им. А.Е. Арбузова КазНЦ РАН, инв. № 431. Казань, 1990. - 434 с.

9. Прозоровский В.Б. Неантихолинэстеразные механизмы действия антихолинэстеразных средств / В.Б. Прозоровский, Н.В. Саватеев. -Л.: Медицина, 1976.- 160 с.

10. Резник B.C. Новый класс ингибиторов холинэстераз: тетраалкиламмониевые производные 6-метилурацила и аллоксазина /B.C. Резник, К.А. Аникиенко, В.К. Курочкин, В.Д. Акамсин, И.В. Галяметдинова, Е.А. Бычихин // ДАН. 1998. -Т.362, №1. - С.68-70.

11. Федоров В.В. Особенности постсинаптических потенциалов и ионных токов в синапсах быстрых и медленных мышечных волокон крысы / В.В. Федоров // Нейрофизиология. 1980. -Т.11, № 6. - С. 627-636.

12. Харкевич Д.А. Фармакология / Д.А. Харкевич. -М.: Медицина, 1980. С. 85-101.

13. Холинэстеразы наземных животных и гидробионтов / Бресткин А.П. и др.. -Владивосток: Тихоокеанский научно-исследовательский рыбохозяйственный центр (ТИНРО центр), 1997. -466 с.

14. Яковлев В.А. Кинетика ферментативного катализа / В.А. Яковлев М.: Наука, 1965.-248 с.

15. Adler М. Role of butyrylcholinesterase in canine tracheal smooth muscle function / M. Adler, M.G. Filbert // FEBS Lett. -1990. -V. 267. -P. 107-110.

16. Anderson C.R. Voltage clamp analysis of acetylcholine produced end-plate current fluctuations at frog neuromuscular junction /C.R. Anderson, C.F. Stevens // J.Physiol. (London). 1973. - V.235. - P. 655-691.

17. Anglister L. Acetylcholinesterase density and turnover number at frog neuromuscular junctions, with modeling of their role in synaptic function / L. Anglister, J.R. Stiles, M.M. Salpeter//Neuron. -1994. -V. 12, No.4. -P. 783-794

18. Arpagaus M. Structure of the gene for human butyrylcholinesterase. Evidence for a single copy / M. Arpagaus, M. Kott, K.P. Yatsis, C.F. Bartels, B.N. La Du, O. Lockridge // Biochemistry. 1990. - V.29. - P. 124-131.

19. Bacou F. Acetylcholinesterase forms in fast and slow rabbit muscle / F. Bacou, P. Vigneron, J. Massoulie // Nature. 1982. - V.296. - P.661-664.

20. Barnard E.A. Cholinergic receptor molecules and cholinesterase molecules at mouse skeletal muscle junctions / E.A. Barnard, J. Wieckowsky, Т.Н. Chiu // Nature. 1971. -V. 234. - P. 207-209.

21. Bon S. The dependence of Acetylcholinesterase aggregation at low ionic strength upon a polyanionic component / S. Bon, J. Cartaud, J. Massouli // Eur. J. Biochem. -1978.-V.85.-P.1-14.

22. Botti S.A. A Modular Treatment of Molecular Traffic Through the Active Site of Cholinesterase / S.A. Botti, C.E. Felder, S. Lifson, J.L. Sussman, I.A Silman // Biophys J. -1999, -V. 77, N. 5. P. 2430-2450.

23. Boudreau-Lariviere C. Fast and slow skeletal muscles express a common basic profile of acetylcholinesterase molecular forms / C. Boudreau-Lariviere, V. Gisiger, R.N. Michel, D.A. Hubatsch, B.J. Jasmin // Am. J. Physiol. 1997. - V.272, N.l. - P. 68-76.

24. Boudreau-Lariviere C. Myotubes originating from single fast and slow satellite cells display similar patterns of AChE expression / C. Boudreau-Lariviere, D. Parry, B. Jasmin // Am. J. Physiol. Regulatory Iniegrative Comp. Physiol. 2000. - V. 278.

25. Bourne Y. Acetylcholinesterase inhibition by fasciculin: crystal structure of the complex/ Y. Bourne, P. Taylor, P. Marchot // Cell. -1995. -V. 83. -P. 503-512.

26. Bourne Y. Structural insights into ligand interactions at the acetylcholinesterase peripheral anionic site / Y. Bourne, P. Taylor, Z. Radic, P. Marchot // EMBO J. -2003. -V 22, No. l.-P. 1-12.

27. Burke R Physiological types and histochemical profiles in motor units of the cat gastrocnemius / R Burke, D Levine, P Tsairis, F Zajac // J Physiol. 1973. - V. 234: - P. 723-748.

28. Changeux J.-P. Studies on the molecular mechanism of the response of the excitable membrane to cholinergic agents / J.-P. Changeux // Chem. Phys. Lip. 1972. - V. 8. - P. 355-365.

29. Collins P.L. Effect of denervation on the molecular forms of acetylcholinesterase in rat diaphragm / P.L. Collins, S.G. Younkin // J Biol Chem. 1982. - V.257. - P. 1363813644.

30. Cresnar B. Neural regulation of muscle acetylcholinesterase is exerted on the level of its mRNA / B. Cresnar, N. Crne-Finderle, K. Breskvar, J. Sketelj // J Neurosci Res. -1994. V.38. - V.294-299.

31. Dudai Y. Molecular structure of acetylcholinesterase from electric organ tissue of the electric eel / Y. Dudai, M. Herzberg, I. Silman // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 1973. -V. 70.-P. 2473-2476.

32. Duval N. Site-directed mutagenesis of active-site-related residues in Torpedo acetylcholinesterase / N. Duval, S. Bon, I. Silman, J. Sussman , J. Massoulie // FEBS Lett. 1992. - V. 309. - P. 421-423.

33. Fahim M.A. Topographic comparison of neuromuscular junctions in mouse slow and fast twitch muscles / M.A. Fahim, J.A. Holley, N.Robbins // Neuroscience.- 1984.-V. 13.-P. 227-235.

34. Ekstrom T.J. Promoter elements and transcriptional regulation of the acetylcholinesterase gene / T.J. Ekstrom, W. M. Klump, D. Getman, M. Karin, P. Taylor // DNA Cell Biol. 1993. - V.12. - P.63-72.

35. Engel AG, Lambert EH, Gomez MR. A new myasthenic syndrome with end-plate acetylcholinesterase deficiency, small nerve terminals, and reduced acetylcholine release / A.G. Engel, E.H. Lambert, M.R. Gomez//Ann Neurol. 1977. - VI. -P. 315-330.

36. Feng. G. Genetic analysis of collagen Q: Roles in acetylcholinesterase and butyrylcholinesterase assembly and in synaptic structure and function / G. Feng, E.

37. Krejci, J. Molgo, J.M. Cunningham, J. Massouli, J.R. Sanes // J. Cell Biol. 1999. -V.144. - P.1349-1360.

38. Fernandez H.L. Exercise selectively increases G4 AChE activity in fast-twitch muscle / H.L. Fernandez, J.A. Donoso // J Appl Physiol. 1988. - V.65. -P.2245-2252.

39. Fernandez H.L. Physiological regulation of G4 AChe in fast-twitch muscle: effects of exercise and CGRP / H.L. Fernandez, C.A. Hodges-Savola // J Appl Physiol. 1996. -V.80. -P.357-362.

40. Fernandez-Valle C. Regulation of acetylcholinesterase synthesis and assembly by muscle activity / C. Fernandez-Valle, R.L. Rotundo // J. Biol. Chem. 1989. - P. 1-7.

41. Fournier M Mechanical properties of muscle units in the cat diaphragm / M. Fournier, G.C. Sieck // J Neurophysiol. 1988. - V.59: - P. 1055-1066.

42. Giniatullin R.A. Desensitization shortens the high-quantal-content endplate current time course in frog muscle with intact cholinesterase / R.A. Giniatullin, M. Talantova, F.Vyskocil // J. Physiol. 1997. - P. 641-8.

43. Gisiger V. Acetylcholinesterase adaptation to voluntary wheel running is proportional to the volume of activity in fast, but not slow, rat hindlimb muscles / V. Gisiger, M. Belisle, P.F. Gardiner // Eur J Neurosci. 1994. - V.6, N.5. - P.673-680.

44. Gisiger V. Correlation between the acetylcholinesterase content in motor nerves and their muscles / V. Gisiger, H. Stephens // J Physiol. 1982. - V.78, N.8. - P.720-728.

45. Grassi J. Molecular forms of acetylcholinesterase in bovine caudate nucleus and superior cervical ganglion: solubility properties and hydrophobic character / J. Grassi, M. Vigny, J. Massouli // J Neurochem. 1982. - V.38. - P.457-469.

46. Grisaru D. Structural roles of acetylcholinesterase variants in biology and pathology / D. Grisaru, M. Sternfeld, A. Eldor, D. Glick, H. Soreq // Eur. J. Biochem. -1999. -V. 264.-P. 672-686

47. Hall Z.W. Multiple forms of acetylcholinesterase and their distribution in endplate and non-endplate regions of rat diaphragm muscle/ Z.W. Hall // J Neurol. 1973. - V.4. -P.343-361.

48. Harel M. Conversion of acetylcholinesterase to butyrylcholinesterase: modeling and mutagenesis / M. Harel, J.L. Sussman, E. Krejci, S. Bon, P. Chanal, J. Massoulie, I. Silman // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992. - V. 89. - P. 10821-10831.

49. Hennig R. Firing pattern of motor units in normal rats / R. Hennig, T. Lomo // Nature. 1985.-V. 214.-P. 297-299.

50. Hobbiger F. Pharmacology of anticholinesterase drugs / F. Hobbiger // Handbook of exp. pharmacol. / Ed. E.Zaimis / Springer-Verlag Berlin, Heidelberg, N.Y., -1976. -v. 42. ch. 4.-P. 486-581.

51. Inestrosa N.C. Association of the synaptic forms of acetylcholinesterase with extracellar matrix in cultured mouse muscle cells / N.C. Inestrosa, L. Silberstien, Z.W. Hall // Cell. 1982. - V.29. - P.71-79.

52. Jasmin B.J. Regulation by exercise of the pool of G4 acetylcholinesterase characterizing fast muscles: opposite effects of running training in antagonist muscles / B.J. Jasmin, V. Gisiger // J Neurosci. 1990. - V.10. - P. 1444-1454.

53. Jeffrey L. Cholinesterase inhibitors: A new class of psychotropic compounds./ L. Jeffrey, M.D. Cummings // Am. J. Psychiatry 2000. -V.157. -P. 4-15.

54. Jeyarasasignam G. Nitric oxid is involved in acetylcholinesterase inhibitor-induced miopathy in rats / G. Jeyarasasignam, M. Yeluashvili, M. Quik // JPET. 2000. - V. 295. -P. 314-320.

55. Johnson B.D. Differential susceptibility of diaphragm muscle fibers to neuromuscular transmission failure / B.D. Johnson, G.C.Sieck // J Appl Physiol. 1993. - V.75. - P. 341-348.

56. Katz B. The binding of acetylcholine to receptors and its removal from the synaptic cleft /B. Katz, R. Miledi // J.Physiol. 1973. - V. 231. - P. 549-574.

57. Katz L.S. Modulation of central muscarinic receptor binding in vivo by organophosphate paraoxon / L.S. Katz, J.K. Marquis // Toxicol.Appl. Pharmacol. 1989. -V.101.-P. 114-123.

58. Karczmar A.G. Invited review: anticholinesterases: dramatic aspects of their use and misuse / A. Karczmar // Neurochem. Int. -1998. V. 32, No. 5-6. - P. 401-411.

59. Kasprzak H. Recovery of acetylcholinesterase at intact neuromuscular junctions after in vivo inactivation with diisopropylfluorophoosphate / H. Kasprzak, M.M. Salpeter // J. Neurosc.- 1985.- V.5.-P.951-955.

60. Koelle G.B. Cytological distribution and physiological functions of cholinesterases / G.B. Koelle // Cholinesterases and anticholinesterase agents: Handbuch der experimentallen Pharmakologie. Bd 15. Berlin: Springer, 1963. - P. 187-299.

61. Koelle G.B. The histochemical differentiation of types of cholinesterases and their localizations in tissues of the cat / G.B. Koelle // J. Pharmacol, Exp. Ther. 1950. -V. 100.-P.158-179.

62. Kong F. Firing properties and hypercapnic responses of single phrenic motor axons in the rat / F. Kong, A. Berger // J. Appl. Physiol. 1986. - V. 61. - P. 1999-2004.

63. Lee S. Characterization of a hydrophobic, dimeric form of acetylcholinesterase from Torpedo / S. Lee, S.J. Camp, P.B. Taylor // J. Biol. Chem. 1982a. - V.257. - P. 1230212309.

64. Lee S. Structural characterization of the asymmetric (17 + 13) forms of acetylcholinesterase from Torpedo: Analysis of subunit composition / S. Lee, S. Heinemann, P.B. Taylor // J. Biol. Chem. 1982b. - V.257. - P. 12283-12291.

65. Legay C. Developmental regulation of acetylcholinesterase transcripts in the mouse diaphragm: alternative splicing and localization / C. Legay, M. Huchet, J. Massoulie', J.P. Changeux // Eur J Neurosci. 1995. -V.7. -P.1803-1809.

66. Legay C. Why So many forms of acetylcholinesterase? / C. Legay // Microscopy research and technique. -2000. -V. 49. P. 56-72

67. Li Y. Gene structure of mammalian acetylcholinesterase. Alternative exons dictate tissue-specific expression / Y. Li, S. Camp, T.L. Rachinsky, D. Getman, P. Taylor // J. Biol. Chem. 1991. - V.266. - P.23083-23090.

68. Li Y. Promoter elements and transcriptional control of the mouse acetylcholinesterase gene / Y. Li, S. Camp, T.L. Rachinsky, C. Bongorno, P. Taylor // J. Biol. Chem. 1993a. - V.268. - P.3563-3572.

69. Li Y. Tissue-specific expression and alternate mRNA processing of the mammalian acetylcholinesterase gene / Y. Li, S. Camp, P. Taylor // The Journal of Bio. Chem. -1993b. V.268. - P.5790-5797.

70. Lockridge O. Complete amino acid sequence of human serum cholinesterase /0. Lockridge, C.F. Bartles, T.A. Vaughan, C.K. Wong, S.E. Norton, L.L. Johnson // J. Biol. Chem. 1987. -V.262. - P.549-557.

71. Lockridge O. Interchain disulfide bonds and subunit organization in human serum cholinesterase /0. Lockridge, H.W. Eckerson, B.N. La Du. // J. Biol. Chem. 1979. -V.254. - P.8324-8330.

72. Lockridge O. Loss of the interchain disulfide peptide and dissociation of the tetramer following limited proteolysis of native human serum cholinesterase /0. Lockridge, B.N. La Du. // J. Biol. Chem. 1982. -V.257. -P.12012-12018.

73. Lockridge O. Structure of human serum cholinesterase / O. Lockridge // BioEssays. -1988. -V.9, N.4. P.125-128.

74. Lomo T. Stimulation of denervated rat soleus muscle with fast and slow activity patterns induces different expression of acetylcholinesterase molecular forms / T. Lomo, J. Massoulye, M. Vigny // J. Neurosci. 1985. - V.5. - P. 1180-1187.

75. Lwebuga-Mukasa J.S. Molecular forms of acetylcholinesterase from Torpedo californica: Their relationship to synaptic membranes / J.S. Lwebuga-Mukasa, S. Lappy, P. Taylor// Biochemistry. 1976. -V.15. - P. 1425-1434.

76. Mantilla C. Mechanisms underlying motor unit plasticity in the respiratory system / C. Mantilla, C. Sieck. //J. Appl. Physiol. 2003. -V. 94. - P. 1230-1241.

77. Massoulie J. Molecular and cellular biology of cholinesterases / J. Massouli, L. Pessementi, S. Bon, E. Krejci, F.M. Yallette // Progress in Neurobiology. 1993.- V.41. -P. 31-91.

78. Massoulie J. Recommendations for nomenclature in cholinesterases / J. Massoulie, J.L. Sussman, B.P. Doctor // Multidisciplinary approaches to Cholinesterase Functions / Eds. A. Schafferman, B. Velan. New York: Plenum Press, 1992. - p. 285-288.

79. Maulet Y. Single gene encodes glycophospholipid-anchored and asymmetric acetylcholinesterase forms: Alternate coding exons contain inverted repeat sequences / Y.

80. Maulet, S. Camp, G. Gibney, T.L. Rachinsky, T.J. Ekstrom, P. Taylor // Neuron. 1990.- V.4. -P.289-301.

81. Mays C. Characterization of pepsin-resistant collagen-like tail subunit fragments of 18S and 14S acetylcholinesterase from Electrophoras electricus / C. Mays, T.L. Rosenberry//Biochemistry. 1981.-V.20. -P.2810-2817.

82. Michel R.N. Neural regulation of acetylcholinesterase mRNAs at mammalian neuromuscvular synapses / R.N. Michel, C.Q. Vu, W. Tetzlaff, B.J. Jasmin // J Cell Biol.- 1994. V.127. -P.1061-1069.

83. Miledi R. Acetylcholinesterase activity in intact and homogenized skeletal muscle in the frog / R. Miledi, P.C. Molenar, R.L. Polak // J/ Physiol. 1984. - V.349. - P.663-686.

84. Moore D.H. Acetylcholinesterase-catalyzed hydrolysis of an amide / D.H. Moore, G.P. Hess // Biochemistry. 1975. - V.14, N.l 1. - P.2386-2396.

85. Morrison I.E. Approaches to the study and analyses of the inhibition of enzymes by slow and tight binding inhibitors / I.E. Morrison, S.R. Stone // Comments Mol. Cell. Biophys. - 1985. - V.2. - P.347-368.

86. Mover M. Effect of phasic activation on endplate potential in rat diaphragm / M. Mover, E. van Lunteren // J. Neurophystol. 1999. -V. 82. -P. 3030-3040

87. Nachmansohn D. Studies on cholinesterase: I. On the specificity of the enzyme in nerve tissue. / D. Nachmansohn, M.A. Rothenberg // J. Biol. Chem. 1992. - ch.9 -P.306-309.

88. Nichols J. Termination of the transmitter action/ J Nichols, A Martin, B Wallace //From neuron to brain. 1976. -v. 42. ch. 4. - C. 486-581.

89. Norel X. Degradation of acetylcholine in human airways: role of butyrylcholinesterase / X. Norel, M. Angrisani, C. Labat, L. Gorenne, F. Dulmet, F. Rossi, C. Brink//Br. J. Pharmacol. -1993. -V. 108. -P. 914-919.

90. Peng H.B. Acetylcholinesterase clustering at the neuromuscular junction involves perlecan and dystroglycan / H.B. Peng, H. Xie, S.G. Rossi, R.L. Rotundo // J. Cell Biol. -1999. V.145. - P.911-921.

91. Peng H.B. Development of acetylcholinesterase induced by basic polypeptide-coated latex beads in cultured xenopus muscle cells / H.B. Peng, K.-X. Gao, M.-Z. Xie,

92. D.-Y. Zhao // Develop. Biol. -1988. V.127. - P. 452-455.

93. Pope C. Pharmacology and toxicology of cholinesterase inhibitors: uses and misuses of a common mechanism of action / C. Pope, S. Karanth, J. Liu // Environmental toxicology and pharmacology. 2005. - V. 19. - P. 433-446.

94. Radic Z. Site of fasciculin interaction with acetylcholinesterase / Z. Radic, R. Duran, D.C. Vellom, Y. Li, C. Cervenansky, P. Taylor // J. Biol. Chem. 1994. - V.269. -P.11233-11239.

95. Rakonczay Z. Heterogeneity of rat brain acetylcholinesterase: a study by gel filtration and gradient centrifugation / Z. Rakonczay, G. Vincendon, J.P. Zanetta // J Neurochem. 1981. - V.37. - P.662-669.

96. Reznik V.S. New type of cholinesterase inhibitors: methylphosphonic derivatives, containing 6-methyluracil group in thioesteric radical / V.S. Reznik, V.D. Akamsin, G.I. Podzigun, L.N. Shitov, Gordybaev, E.V. Tungusova, K.A. Anikienko, E.A. Bychikhin,

97. E.V. Guskova, S.P. Mamontov, Yu.L. Kruglyak // Chemistry of phosphorus compound: XI Internat. conf. Kazan, 1996. - 80 p.

98. Rosenberry T.L. Acetylcholinesterase. / T.L. Rosenberry // Advances in Enzymology and Related Areas of Molecular Biology // edited by MEISTER A. / John Wiley & Sons Inc. Publishers, 1975. - Vol. 43. - P. 103-218.

99. Rosenberry T.L. Structure of 18S and 14S acetylcholinesterase. Identification of collagen-like subunits that are linked by disulfide bonds to catalytic subunits / T.L. Rosenberry, J.M. Richardson // Biochem. 1977. - V.16. - P.3550-3558.

100. Rossi S.G. Cell surface acetylcholinesterase molecules on multinucleated myotubes are clustered over the nucleus of origin / S.G. Rossi, R.L. Rotundo // J. Cell Biol. 1992.-V.l 19.-P.1657-1667.

101. Rossi S.G. Localization of "non-extractible" acetylcholinesterase to the vertebrate neuromuscular junctions / S.G. Rossi, R.L. Rotundo // J Biol Chem. 1993. - V.268. -P.19152—19159.

102. Rotundo R.L. Expression and localization of acetylcholinesterase at the neuromuscular junction / R.L. Rotundo // J. of Neurocytology. 2003. -V. 32. - p. 743766.

103. Rotundo R.L. Function and molecular structure of acetylcholinesterase/ R.L. Rotundo // Myology / edited by Engel A. G., Franziniarmstrong C. New York: McGraw-Hill, 1994.

104. Santi D.V. Approaches to the rational design of enzyme inhibitors / D.V. Santi, G.L. Kenyon // Burger's medicinal chemistry / Ed. M.E. Wolff. N.Y. etc..: Willey, 1980.-P. 349-391.

105. Schumacher M. Primary structure of Torpedo californica acetylcholinesterase deduced from its cDNA sequence / M. Schumacher, S. Camp, Y. Maulet, M. Newton, K. MacPhee-Quigley, S.S. Taylor, T. Friedmann, P.Taylor // Nature. 1986. - V.319. -P.407-409.

106. Schwarz M. Engineering of human cholinesterases explains and predicts diverse consequences of administration of various drugs and poisons / M. Schwarz, D. Glick, Y. Loewenstein, H. Soreq // Pharmacol, and Ther. 1995. - N.2. - P.283-322.

107. Silver A. A histochemical investigation of cholinesterases at neuromuscular junctions in mammalian and avian muscle / A. Silver // J. Physiol. -1963. V. 169. - P. 386-393.

108. Sketelj J. Influence of denervation on the molecular forms of junctional and extrajunctional acetylcholinesterase in fast and slow muscles of the rat / J. Sketelj, N. Crne-Finderle, M. Brzin // Neurochem Int. 1992. - V. 21. - P.415-421.

109. Sketelj J. Neural regulation of acetylcholinesterase in skeletal muscles / J. Sketelj //BAM. 1994.-V.4.-P.281-291

110. Sketelj J. Specific impulse patterns regulate acetylcholinesterase activity in skeletal muscles of rats and rabbits / J. Sketelj, E. Leisner, B. Gohlsch, D. Skorjanc, D. Pette // J Neurosci Res. 1997. - V.47, N. 1. - P.49-57.

111. Sussman J.L. Atomic structure of acetylcholinesterase from Torpedo californica: a prototypic acetylcholine binding protein / J.L. Sussman, M. Harel, F. Frolow // Science. -1991. V.253, N.5022. - P.872-879.

112. Sussman J.L. Three-dimensional structure of acetylcholinesterase and of its complexes with anticholinesterase drugs / J.L. Sussman, M. Harel, I. Silman // Chem. Biol. Interact. 1993. - V.87. - P. 187-197.

113. Taylor J.L. Conformers of acetylcholinesterase: a mechanism of allosteric control / J.L. Taylor, R.T. Mayer, C.M. Himel // Mol. Pharmacol. 1994. - V.45. - P.74-83.

114. Ting A.L. Transcriptional regulation of acetylcholinesterase-associated collagen ColQ in fast- and slow-twich muscle fibers / A.L. Ting, N.L. Siow, L.W. Kong, W.K. Tsim // Chem.Bbiol. Interact. 2005. - V. 15. - P. 157-158.

115. Vellom D.C. Amino acid residues controlling acetylcholinesterase and butyrylcholinesterase specificity / D.C. Vellom, Z. Radic, Y. Li, N.A. Pickering, S. Camp, P. Taylor // Biochemistry. 1993. - V.32. - P.12-17.

116. Vigny M. The motor end-plate specific form of acetylcholinesterase: appearance during embryogenesis and reinnervation of rat muscle / M. Vigny, J. Koenig, F. Rieger // J Neurochem. 1976. - V.27. - P.1347-1353.

117. Wood S.J. Safety factor at the neuromuscular junction / S.J. Wood, C.R. Slater // Progress in Neurobiology. 2001. - V.64. -P.393-429.

118. Younkin S. Cellular localizatijn of the molecular forms of acetylcholinesterase in rat diaphragm / S. Younkin, C. Rosenstein, P. Collins, T. Rosenberry // J. Biol. Chem. -1982.-V. 257. P. 13630-13637.

119. Zengel J.E. Membrane electrical properties and prediction of motor-unit type of medial gastrocnemius motoneurons in the cat / J.E Zengel, S.A Reid, G.W Sypert, J.B Munson // JNeurophysiol. 1985. - V. 53. -P. 1323-1344.

120. Zhao Q. Effects of huperzine A on acetylcholinesterase isoforms in vitro: comparison with tacrine, donepezil, rivastigmine and physostigmine / Q. Zhao, X.C. Tang //Eur J Pharmacol. -2002. -V. 455, N. 2-3. -P. 101-107.

121. Zwart R. Competitive potentiation of acetylcholine effects on neuronal nicotinic receptors by acetylcholmesterase-inhibiting drugs / R. Zwart, R. van Kleef, C. Gotti, C.J. Srnulders, H. Vijverberg // J.Neuchem. 2000. -V. 75. -P. 2492-2500.

122. Выражаю сердечную благодарность моим научным руководителям доктору биологических наук Бухараевой Элле Ахметовне и кандидату биологических наук Зобову Владимиру Васильевичу за помощь в выполнении и оформлении данной работы.