Исследование невирусных способов доставки генных конструкций для генотерапии миодистрофии Дюшенна тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.15, кандидат биологических наук Баранов, Александр Николаевич

  • Баранов, Александр Николаевич
  • кандидат биологических науккандидат биологических наук
  • 2000, Санкт-Петербург
  • Специальность ВАК РФ03.00.15
  • Количество страниц 111
Баранов, Александр Николаевич. Исследование невирусных способов доставки генных конструкций для генотерапии миодистрофии Дюшенна: дис. кандидат биологических наук: 03.00.15 - Генетика. Санкт-Петербург. 2000. 111 с.

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Баранов, Александр Николаевич

ОГЛАВЛЕНИЕ.

Список сокращений.

1. ВВЕДЕНИЕ.'.::.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.:.

2.1. Локализация и клонирование гена дистрофина.

2.2. Мутации в гене дистрофина.

2.3. Белковый продукт гена дистрофина.

2.3.1. Локализация, структура и функция мышечного дистрофина.

2.3.2. Изоформы дистрофина.

2.4. Аутосомный гомолог дистрофина-утрофин.

2.5. Молекулярные основы патогенеза МДД/Б.

2.5.1. «Мембранная теория» патогенеза МДД/Б.

2.5.2. Дистрофии опосредованный каскад процессов дегенерации мышц.

2.5.2.1. Нарушения в сборке 'д'истрбфин ассоциированного глюкопротеинового комплекса.

2.5.2.2. Аномалии- ионного баланса.г.

2.5.2.3. Нарушения мембранно ассоциированных сигнальных процессов.

2.5.2.4. Особенности патофизиологических процессов приМДД.

2.5.2.5. Двухфазная модель патогенеза МДД/Б.

2.6. Исследования по генотерапии мышечной дистрофии Дюшенна.

2.6.1. Генотерапия - новое направление медицины.

2.6.2. Способы доставки генных конструкций в клетки эукариот.

2.6.3. Основные направления исследований по генотерапии МДД/Б.

2.6.3.1. Вирусные способы доставки кДНК гена дистрофина.'.

2.6.3.2. Невирусные способы доставки кДНК гена дистрофина.

2.6.3.3. Заместительная генокоррекция МДД/Б.

2.6.3.4. Активизация экспрессии гена утрофина.

2.6.4. Клинические испытания по генотерапии МДД.

3. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ.

3.1. Материал.

3.1.1. Экспериментальные животные.

3.1.2. Клеточные линии. j. 1.3.

3.1.3.1.

3.1.3.2.

3.1.4.

3.1.4.1.

3.1.4.2.

3.1.4.3.

3.1.4.4.

3.1.5.

3.1.6.

3.1.7. 3.2.

3.2.1.

3.2.2.

3.2.2.1.

3.2.2.2.

3.2.2.3.

3.2.2.4. 3.2.2.

3.2.3.1.

3.2.3.2.

3.2.4.

3.2.5.

3.2.6.

3.2.7.

3.2.8.

3.2.9.

3.2.10.

3.2.10.

3.2.10.

Генетические конструкции.

Конструкции с маркерным геном LacZ.

Конструкции с кДНК гена дистрофина человека.

Носители и способы трансфекции.

Генное ружье.,.

Аналоги вирусных олигопептидов.

Липофектамин.

Синтетические полимерное микросферы MF2 .'.

Олигонуклеотидные праймеры.

Реактивы.-.—

Оборудование.

Методы.

Выделение плазмидной ДНК.

Сборка комплексов плазмидная ДНК носитель.

Баллистическая трансфекция.

Комплексы с аналогами вирусных олигопептидов. Катионные липосомы.

Синтетические полимерные микросферы MF

Проведение трансфекции in vivo.

Внутримышечные инъекции комплексов ДНК/нрситель.

Баллистическая трансфекция.

Забор материала для анализа результатов трансфекции.

Выявление экспрессии гена дистрофина иммуногистохимическим методом. Идентификация экспрессии маркерного гена LacZ на тотальных препаратах органов мышей.

Экстракция ДНК из тканей мышей mdx.:.

Проведение и анализ результатов ПЦР реакции.

Выделение тотальной РНК из тканей мышей и проведение обратнотранскрипционной полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР).

Анализ межтканевого распределения и внутриклетой локализации комплексов ДНК/носитель методом гибридизации in situ. Приготовление меченой ДНК пробы. Неизотопный вариант гибридизации in situ на гистологических препаратах.

Анализ препаратов.:.

Исследование внутриклеточной локализации комплексов МТ2/плазмидная

ДНК in vitro.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Анализ результатов трансфекции мышц мышей mdx кДНК гена дистрофина человека методом баллистической трансфекции.

Баллистическая трансфекция полноразмерной кДНК гена дистрофина.

Баллистическая трансфеция кДНК мини-гена дистрофина.

Анализ экспрессии кДНК гена дистрофина человека в мышцах мышей mdx после трансфекции с помощью липосом и синтетических олигопептидов.■.

Трансфекция комплексами ДНК-СОК с различными суммарными зарядами.

Анализ динамики и дозовой зависимости при .трансфекции с СОК.

Анализ межтканевого распределения комплексов плазмидная ДНК-СОК.

Трансфекция с использованием поликатионных липосом.

Изучение особенностей трансфекции и экспрессии кДНК гена дистрофина человека и маркерного гена LacZ , доставленных в мышцы мышей mdx с помощью синтетических микросфер MF-2.

Экспрессия дистрофина в мышцах мышей mdx после трансфекц] полноразмерной кДНК гена дистрофина в составе микросфер MF2.

Экспрессия дистрофина в мышцах мышей mdx после трансфекции кДНК мини гена дистрофина в составе микросфер MF2.;.

Экспрессия маркерного гена Lac Z, доставленного с помощью синтетических микросфер MF-2.

Анализ особенностей межтканевого распределения и внутриклеточной локализации ДНК полимерных комплексов MF2 в экспериментах in vivo и in vitro.

FISH анализ образцов органов мышей mdx после введения ДНК полимерных комплексов MF2.,.

Анализ внутриклеточной локализации полимерных микросфер MF2 в экспериментах in vitro.

ВЫВОДЫ.1.

Рекомендованный список диссертаций по специальности «Генетика», 03.00.15 шифр ВАК

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Исследование невирусных способов доставки генных конструкций для генотерапии миодистрофии Дюшенна»

Мышечная дистрофия Дюшенна/Беккера (МДД/Б) - является наиболее распространенным наследственным нервно-мышечным заболеванием человека. Частота встречаемости для мышечной дистрофии Дюшенна (МДД) составляет 1 на 3500 новорожденных мальчиков (Горбунова и др., 1998). Основным клиническим проявлением МДД/Б является прогрессирующая мышечная дистрофия. Симптомы миодистрофии Дюшенна (МДД) начинают в возрасте 3-5 лет. К 12-15 годам пациенты с МДД теряют способность передвигаться самостоятельно. Летальный исход, как правило, наступает из-за сердечной недостаточности либо отказа дыхательной мускулатуры в возрасте около 20 лет (Partridge, 1997). В случае более легкой формы миодистрофии - МДБ, симптомы заболевания начинают проявляться значительно позже, и больные часто доживают до 3 5-50 лет. f ■

Причиной заболевания являются мутации в гене дистрофина (Koenig et al., 1987; Hoffman et al., 1987). Основным продуктом гена в мышечных тканях является присарколеммный белок мышечный дистрофии, выполняющий функцию связующего звена между внутренним цитоскелетом миофибриллы и внеклеточным матриксом. Присутствие в мембране мышечного волокна аномального белка (МДБ) или же его полное отсутствие (МДД), индуцирует первичные нарушения в структурной организации и функции сарколеммы, что приводит к запуску каскадного процесса дегенерации мышц (Hoffman'et al. 1987).

Отсутствие эффективного медикаментозного лечения делает актуальной разработку новых - генотерапевтических подходов к лечению миодистрофии Дюшенна/Беккера. Суть метода, заключается во введении больному конструкций с нормальным геном дистрофина, обеспечивающим синтез полноценного белка и восстанавливающим структуру и функцию мышц. В экспериментах in vivo на биологических моделях МДД мышах mdx, была показана возмолшость возобновление синтеза дистрофина в скелетных и сердечной мышцах после внутривенного введения аденовирусного вектора с кДНК гена дистрофина человека. ( Stratford-Perricaudet et al., 1992). Кроме возобновления синтеза белка, было отмечено, что гиперэкспрессия человеческого дистрофина предотвращает 7 патологические и механические изменения поврежденных мышечных волокон без побочных эффектов.

К сожалению, кардинальных успехов в генотерапии МДД/Б пока не достигнуто (Баранов, 1999). Причиной этого являются, не только гигантские размеры гена и его мРНК, но и, главным образом, отсутствие . эффективных средств доставки гена в мышцы. Системы доставки генных конструкций, или носители, должны обеспечивать: компактизацию ДНК, проникновение в клетки мишени, предотвращать деградацию ДНК лизосомальными ферментами и обеспечивать ядерную транслокацию. При этом, система доставки должна быть не токсичной или иммуногенной, а входящие в ее состав компоненты быть биодеградируемыми (Wilson, 1998).

Считается, что достижение терапевтического эффекта возможно при успешной трансфекции не менее 20% , а, по последним данным, даже 30-40% мышечных волокон не только скелетной, мускулатуры, но так же мышц сердца и диафрагмы (Phelps et al., 1995). При этом Ьсновными критерйями эффективности трансфекции и терапевтического эффекта являются: появление дистрофии-положительных мышечных волокон (ДПМВ), нормализация уровня биохимических маркеров МДД/Б, изменения физиологических параметров мышц. Высокий уровень трансфекции пока достигнут только в нескольких опытах, где кДНК гена дистрофина вводили с помощью аденовирусного или ретровирусного векторов (Ascadi et al., 1995; Fassati et al., 1995). Использование вирусных носителей, однако, наталкивается на существенные методические трудности. Наибольшим препятствием к использованию вирусных векторов является выраженный иммунный ответ на вирусные антигены; Вышеперечисленных недостатков в 1 значительной мере лишены невирусные носители (липосомьг олигопептиды, полимеры и др.). Однако эффективность трансфекции при их использовании in vivo оказывалась очень низкой (Turner et al., 1997). Таким образом, проблема создания и испытаний новых средств доставки генных конструкций в мышцы продолжает оставаться актуальной проблемой генотерапии миодистрофии Дюшенна. 8

Данная работа является продолжением цикла проводимых лабораторией пренатальной диагностики ИАГ РАМН исследований, по разработке экспериментальных основ генотерапии МДД/Б и посвящена анализу результатов доставки кДНК гена дистрофина человека в мышцы мышей mdx при помощи различных типов невирусных носителей генов. .

Цели и задачи исследования. Целью работы является поиск оптимальных методов невирусной доставки гена дистрофина человека в мышцы mdx мышей и оценка I ■ эффекта генетической трансфекции.

Для реализации намеченной цели были поставлены следующие задачи:

1. Проанализировать эффективность экспрессии гена дистрофина человека в зависимости от типа генных конструкций и способов их доставки в пораженные мышцы мышей mdx

2. Иммуноцитохимическими и молекулярными методами изучить эффект генокоррекции;

3. Изучить возможность, системной коррекции дефекта скелетных мышц, диафрагмы и сердца мышей mdx в условиях внутримышечного введения генных конструкций;

Научная новизна и практическая значимость

• Исследованы особенности трех новых невирусных способов доставки кДНК гена дистрофина в мышцы биологических моделей МДД мышей mdx

• В экспериментах показано существование феномена "дистантной трансфекции" . Полученные данные об особенностях трансфекции органов и тканей модельных животных открывают перспективы для системной терапии миодистрофии Дюшенна путем местного введения генотерапевтических конструкций

• Показана возможность прохождения синтетических полимерных микросфер с "терапевтическими" генами через гематоэнцефалический барьер.

• Доказана высокая эффективность внутриядерной доставки генов с использованием полимерного носителя MF2

• Исследованы возможности системной терапии миодистрофии Дюшенна путем местного введения генотерапевтических конструкций;

Практическая значимость:

Полученные результаты могут быть использованы в качестве экспериментальной

• 1 • основой для разработки доклинических и первой клинической фаз испытаний геннотерапевтических конструкций для лечения миодистрофии Дюшенна.

Апробация работы

Представленные в диссертации результаты были доложены на VIII итоговой конференции «Геном человека-98» (Черноголовка, 1998), 30 ежегодном совещании Европейского общества по генетике человека (Лисабон, 1998), VI совещании Европейской рабочей Труппы по генной терапии человека (Иерусалим, 1998). V Российском Национальном Конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 1998), II Американском ежегодном совещании по генной терапии (Вашингтон, 1999). IX итоговой конференции «Геном человека-99» (Черноголовка, 1999), II съезде Всероссийского общества генетиков и селекционеров (С-Петербург, 2000), Ежегодном совещании по генетике человека (Канада, 2000), II Всероссийском съезде медицинских генетиков ( Курск, 2000).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 20 работ.

Структура и объем диссертации

Работа изложена на 111 страницах машинописного текста. Иллюстративный материал представлен 8 таблицами и 13 рисунками. Диссертация состоит из следующих разделов: Введение, Обзор литературы, Материалы и методы исследования, Результаты и обсуждение, Выводы. Список литературы насчитывает 165 наименований.

11

2.'Обзор литературы.

Миодистрофия Дюшенна/Беккера (МДД/Б) является наиболее частым среди сцепленных с полом наследственных заболеваний человека. Основным клиническим проявлением МДД/Б является прогрессирующая мышечная дистрофия. Миодистрофия Дюшенна встречается с частотой 1 на 3500 новорожденных мальчиков (Горбунова и др., 1998), характеризуется ранним, до 5 лет , проявлением симптомов и последующим тяжелым течением заболевания. Прогрессирующая мышечная дегенерация приводит к потере подвижности и летальному исходу из-за сердечной недостаточности либо отказа дыхательной мускулатуры в возрасте до '20 лет (Partridge, 1997). Миодистрофия Беккера 1

Похожие диссертационные работы по специальности «Генетика», 03.00.15 шифр ВАК

Заключение диссертации по теме «Генетика», Баранов, Александр Николаевич

ВЫВОДЫ

Эффект трансфекции (появление дистрофии положительных мышечных волокон - ДПМВ) показан при доставке гена дистрофина с помощью: аналогов вирусных олигопептидов, полимерных микросфер MF2 и генного ружья; трансфекция in vivo с использованием поликатионных липосом оказалась не эффективной .

Максимальное число дистрофии положительных мышечных волокон (до 20%) и отсутствие выраженных дегенеративных изменений мышц, отмечены при доставке плазмидных конструкций в , опытах in vivo с помощью микросфер MF2 и "генного ружья".

Высокий уровень ДПМВ (до 16%) при использовании в качестве носителя аналогов вирусных олигопептидов, сопровождался появлением волокон с аномальной, цитоплазматической локализацией дистрофина и дегенерацией миофибрилл, что делает эту систему мало пригодной для доставки кДНК гена дистрофина in vivo.

Методами FISH и электронной микроскопии, доказана высокая эффективность внутриядерной доставки генов с использованием полимерного носителя MF2 in vitro и in vivo.

Показана возможность преодоления гемато-энцефалического барьера экспрессирующими генными конструкциями в составе синтетических полимерных микросфер MF2.

• 1 ■

Внутримышечное и параэнтеральное введение генных конструкций при помощи аналогов вирусных олигопептидов , полимерных микросфер MF2 и "генного ружья" сопровождалось появлением ДПМВ в скелетных мышцах, удаленных от места введения, а так же в диафрагме и в сердце. Высказано предположение, что данный эффект, названный нами "феноменом дистантной трансфекции ", открывает реальные перспективы для разработки генотерапевтических подходов к системному лечению миодистрофии Дюшенна и других нервно-мышечных заболеваний.

96

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Баранов, Александр Николаевич, 2000 год

1. Баранов B.C. Генная терапия медицина XXI века // Соросовский образовательный журнал 1999 (а), 3, с.63-68

2. Баранов B.C. Отчет о IV рабочем совещании по генотерапии миодистрофии Дюшенна//Генетика 1999(6), 35, 12, с. 1724-1726

3. Баранов B.C., Баранов А'.Н. Генная тйрапия моногенных наследственных• I ■болезней. Миодистрофия Дюшенна. //Вопросы Мед. Хим., 2000, 46,3, с. 279293.

4. Горбунова В.Н., Баранов B.C. Введение в молекулярную диагностику и генотерапию наследственных заболеваний // С.-Петербург, Специальная литература. 1997.

5. Зеленин А.В. , Кайгородоц В.А., Прасолов В.С. Генная терапия сегодня и завтра II Молекулярная биология 1998 ( а), 32,2,с.219-228

6. Зеленин А.В. Некоторые современные тенденции развития работ по генной терапии // генная терапия- медицине будущего , ред. Зеленин , М, ВИНИТИ, 2000, с. 127-12997i«

7. И.Кузнецова Т.В., В.С.Баранов, Н.Ю.Швед, А.Н.Баранов. "Пренатальная диагностика хромосомных болезней плода". Методические рекомендации. Санкт-Петербург, 1995, 21 стр.

8. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование.// Перевод с англ., «Мир», Москва: 480с, 1984.

9. Михайлов В.М. , Зеленин А.В., Штейн Г.И. и др. Дифференцировка мышечных волокон мышей mdx после баллистической трансфекции кДНК гена дистрофина человека//Цитология 1998, 40, 5, 401-406

10. Acsadi G, Massie B, Jani A, Adenovirus-mediated gene transfer into striated muscles // J. Mol. Med. 1995, 73,4, P. 165-80.

11. Ahn AH, Kunkel LM. Syntrophin binds to an alternatively spliced exon of dystrophin // J. Cell. Biol. 1995, 128, 3, P. 363-71.

12. Anderson JE, Kakulas BA, Jacobsen PF, Johnsen Ш}, Kornegay JN, Grounds MD .Comparison of basic fibroblast growth factor in X-linked dystrophin-deficient myopathies of human, dog and mouse.// Growth Factors. 1993, 9,2, P. 107-21.

13. Anderson W. F. Human gene therapy // Nature 1998, Vol 392, Supp, P. 25-30

14. J ^ musclce fibers with dystrophin and LacZ genes delivered in vivo by syntheticй .microspheres // Gene Therapy, 1999, 6, P. 1406-1414.6

15. Baranov Y.S., Zelenin A., Baranov A.N. et al., Human dystrophin gene expression in mdx muscles after in vivo ballistic transfection, application of synthetic/1.olygopeptide complexes and cationic liposomes // NATO ASI Series, Subseries

16. Bashkin P., Razin E., Eldor A. et al ., Degranulating mast cells secrete an endoglucosidase thet degrades heparin sulfate in subendothelial extracellular matrix//Blood 1990,75, P. 2204-2212

17. Bernasconi P, Torchiana E, Confalonieri P, Brugnoni R, Barresi R, Mora M,

18. Cornelio F, Morandi L. Mantegazza R. Expression of transforming growth factor2j

19. Bieber F.R., Hoffman E.P., Amos J. Dystrophin analysis in Duchenne muscular dystrophy: use in fetal diagnosis and in genetic counseling Am.J.FIum.Genet.f 1989, 45, P. 362-367щ

20. Brennman J.A., Chao D.S., Xia H. et al., (1995) Nitric oxide synthase complexed with dystrophin and absent from skeletal muscle sarcolemma in Duchenne muscular dystrophy// Cell, 82, P. 743-752

21. Brown SC, Lucy JA. Functions of dystrophin.// In "Dystrophin. Gene, protein and cell biology". Edited by Brown S.& Lucy J. Cambrige Univ. Press. 1997, P. 162 -200.

22. Bulfield G, Siller WG, Wight PA, Moore KJ. X chromosome-linked muscular dystrophy (mdx) in the mouse //Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1984,81, 4, P. 1189-92.

23. Burke JF, Mogg AE. Suppression of a nonsense mutation in mammalian cells in vivo by the aminoglycoside antibiotics G-418 and paromomycin. // Nucleic Acids Res. 1985, 11, 13(17) , P.6265-72.

24. Burmeister M, Lehrach H. Long-range restriction map around the Duchenne muscular dystrophy gene // Nature. 1986. Vol. 324. P. 582-5.

25. Burmeister M, Monaco AP, Gillard EF, van Ommen GJ, Affara NA, Ferguson-Smith MA, Kunkel LM, Lehrach H. A 10-megabase physical map of human Xp21, including the Duchenne muscular dystrophy gene,// Genomics 1988, 2, 3. P. 189202.

26. Burton EA, Tinsley JM, Holzfeind PJ, Rodrigues NR, Davies KE. A secondi ■promoter provides an alternative target for therapeutic up-regulaticin of utrophin in Duchenne muscular dystrophy.// Proc Natl Acad Sci U S A. 1999, 23,96(24), P. 14025-30.

27. Campbell KP. Three muscular dystrophies: loss of cytoskeleton-extracellular matrix linkage // Cell. 1995 , 80, 5. P. 675-9.

28. Canki N, Dutrillaux B. Two cases of familial paracentric inversion in man associated with sex chromosome anomaly. 47,XXY,inv(5)(q21q32) and 45,X,inv(7)(qll.3q22.3)//Hum. Genet. 1979, 47/3, P. 261-8.

29. Carlson B.M.& Faulkner J.A. The regeneration of sceletal muscle fibers following injury : a reviev // Medicine & Science in Sports & Exercise 1983, 15, P. 187-1981001. Л 4li 1г•■4-I:

30. Carpenter S, Karpati G, Robitaille Y, Melmed C. Cylindrical spirals in human skeletal muscle // Muscle Nerve. 1979. Vol., 2, N4. P. 282-7.

31. Chang WJ, Iannaccone ST, tlau KS, Masters BS, McCabe TJ, McMillan K, Padre RC, Spencer MJ, Tidball JG, Stull JT. Neuronal nitric oxide synthase and dystrophin-deficient muscular dystrophy // Proc.'Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1996, 93, 17, P. 9142-7.

32. Chojkier J., Houglum K., Solis-Herruzo J., et al. Stimulation of collagen gene expression by ascorbic acid in cultured human fibroblasts. A role for lipid peroxodation ? //J.Biol. Chem. 1989 , 264, P. 16957-16962

33. Clemens P.R.,Kochanek S.,Sumada Y,S.Chan,H.H.Chen, K.P.Camp bell, C.T.Caskey. In vivo muscle gene transfer of full-length dystrophin withadenovirus vector that lacks all viral genes // Gene Therapy 1996,3,11, P. 965-972.i

34. Clemens PR, Kochanek S, Sunada Y, Chan S, Chen HH, Campbell KP, Caskey CT. In ■ vivo muscle gene transfer of full-length dystrophin with an adenoviral vector that lacks allviral genes // Gene Ttier. 1996,. 3, 11, P. 965-72.

35. Clemens PR, Krause TL, Chan S, Korb KE, Graham FL, Caskey CT. Recombinant truncated dystrophin minigenes: construction, expression, and adenoviral delivery. // Hum Gene Ther. 1995, 6(11), P. 1477-85.

36. Clerk A, Morris GE, Dubowitz V, Davies KE, Sewry CA. Dystrophin-related protein, utrophin, in normal and dystrophic human fetal skeletal muscle // Histochem. J. 1993, 25, 8, P. 554-61.

37. Coonrod A, Li FQ, Horwitz M. On the mechanism of DNA transfection: efficienti ■gene transfer without viruses.// Gene Ther. 1997, 4(12), P. 1313-21'.

38. Cooper BJ, Winand NJ, Stedman H, Valentine BA, Hoffman EP, Kunkel LM, Scott MO, Fischbeck KH, Kornegay JN, Avery RJ, et al. The homologue of the Duchenne locus is defective in X-linked muscular dystrophy of dogs // Nature 1988, 334, P. 154-6.

39. Cox GA, Cole NM, Matsumura K, Phelps SF, Hauschka SD, Campbell KP, Faulkner JA, Chamberlain JS. Overexpression of dystrophin in transgenic mdx mice eliminates dystrophic symptoms without toxicity //Nature. 1993, 364, P.725-9.•4

Обратите внимание, представленные выше научные тексты размещены для ознакомления и получены посредством распознавания оригинальных текстов диссертаций (OCR). В связи с чем, в них могут содержаться ошибки, связанные с несовершенством алгоритмов распознавания. В PDF файлах диссертаций и авторефератов, которые мы доставляем, подобных ошибок нет.