Исследование роли ионов Ca2+ и Ca2+-зависимых систем внутриклеточной сигнализации в эффектах электромагнитного излучения крайне высокой частоты на респираторный взрыв нейтрофилов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.02, кандидат биологических наук Аловская, Алла Анатольевна

• Аловская, Алла Анатольевна
• кандидат биологических наук
• 1998

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Аловская, Алла Анатольевна

Глава 1. Литературный обзор.

1.1. Биологические эффекты ЭМИ КВЧ низкой интенсивности.

1.1.1 Воздействие ЭМИ низкой интенсивности на целый организм.

1.1.2 Воздействие ЭМИ КВЧ И СВЧ на клетки иммунной системы.

1.1.3 Участие систем внутриклеточной сигнализации в перестройке метаболизма клеток при действии ЭМИ КВЧ и СВЧ.

1.1.4. Действие ЭМИ КВЧ и СВЧ на цитоплазматическую мембрану клетки.

1.1.5. Механизмы первичного взаимодействия ЭМИ низкой интенсивности с биологическими объектами.

1.2. Структурно-функциональные особенности нейтрофилов.

1.2.1. Общая характеристика нейтрофилов.

1.2.2. Функциональные особенности нейтрофилов.

1.3. Функциональная пластичность нейтрофилов.

1.3.1. Покоящиеся нейтрофилы.

1.3.2. Праймированное состояние нейтрофилов.1.

1.3.3. Активированное состояние нейтрофилов.

Глава 2. Материалы и методы.

Глава 3. Результаты исследований.

3.1. Активация респираторного взрыва нейтрофилов кальциевыми ионофорами и форболовым эфиром.

3.2. Эффект ЭМИ КВЧ на нейтрофилы в различном функциональном состоянии.

3.3. Исследование механизмов активации респираторного взрыва нейтрофилов кальциевыми ионофорами и фордоловым эфиром.

3.3.1. Особенности совместной активации респираторного взрыва нейтрофилов кальциевыми ионофорами и ФМА.!.

3.3.2. Измерение цитоплазматического кальция при действии кальциевых ионофоров.

3.3.3. Взаимосвязь увеличения [Са2+]цит и изменения продукции АФК нейтрофилов в ответ на ФМА при совместной активации с кальциевыми ионофорами.

3.3.4. Участие ФЛА? в регуляции респираторного взрыва нейтрофилов.

3.3.5. Оценка функционального статуса нейтрофилов на модели активации респираторного взрыва кальциевым ионофором А23187 и ФМА.

3.4. Исследование биологического действия ЭМИ КВЧ на модели активации респираторного взрыва нейтрофилов кальциевым ионофором и ФМА.

3.4.1. Роль внешнего кальция в реализации эффектов

ЭМИ КВЧ на нейтрофилах.

3.4.2. Роль фосфолипазы А2 в эффекте ингибирования.

ЭМИ КВЧ продукции АФК нейтрофилов, активированных кальциевым ионофором А23187 и ФМА.

3.4.2. Модификация эффекта ЭМИ КВЧ при облучении нейтрофилов в присутствии проадифена, блокатора цитохрома Р-450.

Глава 4. Обсуждение.

Выводы.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Исследование роли ионов Ca2+ и Ca2+-зависимых систем внутриклеточной сигнализации в эффектах электромагнитного излучения крайне высокой частоты на респираторный взрыв нейтрофилов»

А) Спонтанная ХЛ нейтрофилов (1) и ХЛ при активации клеток кальциевым ионофором А23187 в концентрациях: 0.1 ц.М (2); 0.5 цМ (3); 1 цМ (4); 5 цМ (5). ХЛ регистрировали в среде, содержащей 1 мМ Са2+ при 20 °С.

Б) ХЛ интактных нейтрофилов (1) и нейтрофилов, активированных А23187 в концентрации 5 цМ (2), ФМА в концентрации 1 цМ (3), последовательно А23187 (5 цМ) и ФМА (1 цМ) (4).

Так как величина коэффициента К зависит от концентрации ионофора (рис. 4А), то, возможно, предварительная обработка клеток кальциевыми ионофорами в разных концентрациях изменяет их функциональное состояние, что и проявляется в ответе на ФМА.

3.2. Эффект ЭМИ КВЧ на нейтрофилы в различном функциональном состоянии.

Облучение ЭМИ КВЧ интактных нейтрофилов не приводило к изменениям их реакции на активирующие воздействия: ответы облученных нейтрофилов на ФМА в концентрации 1 |лМ (п=15) и 0.1 цМ (п=15), на кальциевый ионофор А23187 в диапазоне концентраций от 0.01-10 цМ (п=50 для всех концентраций) или на их совместное действие (п=10) достоверно не отличались от ответов необлученных клеток. Существует предположение, что эффект облучения электромагнитными полями крайне низкой частоты либо магнитными полями зависит от "степени клеточной активации" [12]. Такая постановка вопроса предполагает, что ферменты в облучаемой клетке находятся в активированном состоянии, которого можно достигнуть, например, повышением [Са2"1"]^. Возможно, ЭМИ КВЧ также модулирует Са2+-зависимые процессы в клетке, меняя сродство ферментов к Са2+ [42] или сдвигая уровень [Са2+]цит [25].

В следующей серии экспериментов мы обрабатывали нейтрофилы кальциевыми ионофорами: А23187, А23187-4Вг, иономицином, чтобы создать повышенный уровень [Са2"1"]^, а затем воздействовали ЭМИ КВЧ. Однако, и в этом случае мы не наблюдали достоверных различий в уровне ХЛ облученных и необлученных клеток (п=10).

150

1 2

3 4

Рис. 3. Ингибирование продукции АФК нейтрофилов при действии ЭМИ КВЧ.

Нейтрофилы облучали ЭМИ КВЧ (41.95 ГГц, непрерывная генерация, 150 мкВт/см^) на фоне кальциевых ионофоров: А23187 в концентрации 2 мкМ (2), п=12; и 20 мкМ (4), п=13; иономицина в концентрациях

0.5 мкМ (1) и 0.8 мкМ (3), п=10 при t=20-22°C. (1,2) ^=3.0, (3,4) Ж—1.0. После прекращения облучения клетки помещали в хемилюминометр и регистрировали ХЛ в ответ на ФМА (1 мкМ) при 37°С.

Эффект рассчитывали как процент от контроля, указана средняя квадратичная ошибка * - достоверное отличие от контроля по 95% уровню.

В следующей серии экспериментов после прекращения облучения на фоне кальциевых ионофоров мы использовали ФМА для выявления действия поля.

В присутствии иономицина в разных концентрациях не зарегистрировано достоверного изменения XJI нейтрофилов в ответ на ФМА после облучения, однако тенденция к ингибированию наблюдалась при концентрации иономицина 0.8 |лМ (рис. 3), в то время как при облучении клеток в присутствии А23187 в концентрации 20 цМ мы получили ингибирование продукции АФК на 60±10%, при Xравном 1.

При облучении нейтрофилов в присутствии А23187-4Вг и последующем действии ФМА также не получено достоверных различий между облученными и необлученными клетками. По нашим результатам, ответ на ФМА модифицируется ЭМИ КВЧ только в случае предобработки клеток А23187, но не иономицином или А23187-4Вг.

Из литературы известно, что каждый из ионофоров не является высокоселективным по отношению к ионам Са2+ [91, 92, 94]. Наибольшей селективностью к ионам Са2+ обладает иономицин, А23187-4Вг более селективен к Zn2+ и Мп2+, чем к Са2+. Это справедливо и для А23187, но он менее селективен к Zn2+ и Мп2+ по сравнению с А23187-4Вг. Кроме того, иономицин представляет собой Са2+/Н+-обменник, а А23187 - Ca2+/Mg2+-обменник [95]. Поэтому мы предположили, что механизмы активации НАДФН-оксидазы нейтрофилов кальциевыми ионофорами: А23187, А23187-4Вг, иономицином имеют специфические различия, которые определяют характер ответа на последующую активацию ФМА. Возможно, что при совместной активации клеток разными кальциевыми ионофорами и ФМА активируются альтернативные системы внутриклеточной сигнализации, что и проявляется в особенностях действия ЭМИ КВЧ.

3.3. Исследование механизмов активации респираторного взрыва нейтрофилов кальциевыми ионофорами и форболовым эфиром.

3.3.1. Особенности совместной активации респираторного взрыва нейтрофилов кальциевыми ионофорами и ФМА.

Для определения механизмов активации респираторного взрыва нейтрофилов кальциевым ионофором и ФМА мы исследовали зависимость коэффициента К от концентрации каждого из трех ионофоров при 1 и 10 минутах инкубации в среде с 1 мМ Са2+ (среда 1) и в бескальциевой среде с добавлением 2 мМ ЭГТА (среда 2).

ИГ1 10-' 10° 101 Концентрация ионофора, мкМ н Я

N « и я

Я < 5 и в 2

10"4 10-3 10 10-' 10° 101 102 Концентрация ионофора, мкМ

10"3 10'2 Ю-1 10° ю1 Концентрация ионофора, мкМ н л -Г" гч (в и Я я м л

8 2 и X в 2

1000

750

500

250

10-г 10"1 10» 10" Концентрация ионофора, мкМ

Рис. 4. Изменение продукции АФК нейтрофилов при совместном действии кальциевых ионофоров и ФМА и максимального уровня [Са2+]цит в зависимости от концентрации кальциевого ионофора.

Клетки инкубировали в течение 1 мин (время соответствует времени достижения максимальной амплитуды Са2+-сигнала при активации клеток одним из ионофоров) при 37°С с одним из кальциевых ионофоров в среде, содержащей 1 мМ Са2+ (А), либо в бескальциевой среде с добавлением 2 мМ ЭГТА (В), затем регистрировали изменение продукции АФК в ответ на добавление ФМА в концентрации 1 цМ и рассчитывали К как указано выше (пункт 3.1.). Концентрацию [Са2+]шгг измеряли по флуоресценции Рига-2АМ при добавлении различных концентраций кальциевого ионофора в среде, содержащей 1 мМ Са2+ (Б), и в бескальциевой среде с добавлением 2 мМ ЭГТА (Г). Для каждой точки усреднены результаты 10 и более независимых экспериментов, указана средняя квадратичная ошибка. # - иономицин, В - А23187, ,

Одна минута инкубации соответствует времени достижения максимального уровня [Са2+]цш., а 10 минут - времени достижения стационарного уровня [Са2+]цит в клетке при добавлении кальциевого ионофора. Мы проводили параллельное измерение [Са2+]цит и интенсивности ХЛ, так как оба параметра отражают сложную картину активации Са2+ - зависимых систем в клетке.

Клетки предварительно инкубировали с кальциевыми ионофорами А23187, А23187-4Вг, иономицином в течение 1 минуты при 37°С, затем добавляли ФМА в концентрации 1 дМ и регистрировали изменение продукции АФК (рис. 4). Показано, что зависимость коэффициента К от концентрации А23187 и иономицина в среде, содержащей 1 мМ Са2+ (рис. 4А) имеет колоколообразный характер: в области концентраций от 0.01 дМ до 0.5 дМ А23187 и от 0.05 дМ до 0.5 дМ иономииина происходит постепенное усиление продукции АФК; в области концентраций от 0.5 дМ до 10 дМ А23187 и от 0.5 дМ до 5 дМ иономицина - уменьшение над контролем продукции АФК. Максимальные значения: ^=4.1+0.1 при концентрации 0.5 дМ иономицина и А==2.9±0.1 при концентрации 0.5 дМ А23187, что соответствует приблизительно трех-четырехкратному превышению продукции АФК в ответ на ФМА нейтрофилами, предварительно обработанными А23187 или иономицином. На фоне иономицина угнетение продукции АФК происходит в более узкой области высоких концентраций ионофора по сравнению с А23187. А23187-4Вг практически во всем диапазоне концентраций не обеспечивал усиление ответа нейтрофилов на ФМА, а при концентрациях выше 1 дМ подавляет ответ нейтрофилов на ФМА. Таким образом, развитие усиленного ответа клетки на последующее добавление ФМА обеспечивают А23187 и иономицин при инкубации в течение 1 минуты. На фоне иономицина усиленный ответ клетки на ФМА развивается в более узкой области концентраций кальциевого ионофора. Максимальная продукция АФК нейтрофилами на фоне иономицина в 1.3 раза больше, чем на фоне А23187. На фоне А23187-4Вг с увеличением концентрации наблюдалось достоверное снижение продукции АФК, которое не зависело от наличия ионов Са2+ в среде инкубации и времени инкубации (рис.

4А, В). К

0.001 0.01 0.1 1 10 Концентрация ионофора, мкМ 5 а ч Н а

KS (Я Ьшт* Л Я в о а. а 3 о а я л н Ü

900 800 700 600 500 400 300 200 100 0

0.001 0.01 0.1 1 10 Концентрация ионофора, мкМ

Рис. 5. Изменение продукции АФК нейтрофилов при совместном действии кальциевых ионофоров и ФМА и стационарного уровня ]цит в зависимости от концентрации кальциевого ионофора.

Клетки инкубировали в течение 10 мин (время соответствует стационарному уровню [Са2 ]шгг при активации клеток одним из кальциевых ионофоров) при 37°С с одним из кальциевых ионофоров в среде, содержащей 1 мМ Са~+(А), либо в бескальциевой среде с добавлением 2 мМ ЭГТА (В), затем регистрировали изменение продукции АФК в ответ на добавление ФМА (1 мкМ) и рассчитывали К как указано в пункте 3.1. Концентрацию [Са2+]ц1гг измеряли по флуоресценции Fura-2AM при добавлении различных концентраций Концентрация ионофора, мкМ ионофора в среде, С0ДеРжашей 1 мМ Са2'(Б). Ц.я каждой точки усреднено 10 и более значений, указана средняя квадратичная ошибка. А23187 ■ А23187-4Вг А иономицин

При предварительной инкубации клеток с каждым из трех кальциевых ионофоров в течении 10 минут при 37° С мы также получили колоколообразную зависимость коэффициента К от концентрации кальциевого ионофора. Однако усиленный ответ нейтрофилов на ФМА после предварительной инкубации с

А23187 или иономицином развивается в более узком диапазоне концентраций ионофоров по сравнению с ответом через 1 минуту (рис. 4, 5). Для А23187 интервал составляет 0.1-2 |лМ с максимальным значением Я=2.3±0Л при концентрации 1 дМ, для иономицина - 0.5-1 дМ с максимальным значением К= 3.67±0.1 при концентрации 0.5 р,М. Инкубация нейтрофилов в течение 10 минут с А23187-4Вг ведет к тому, что ответ на ФМА не изменяется в присутствии ионофора, а начиная с концентрации 0.1 цМ происходит уменьшение продукции АФК.

Таким образом, развитие усиленного ответа на ФМА при инкубации с кальциевыми ионофорами в течение 10 минут также обеспечивают только иономицин и А23187, но в более узкой области концентраций ионофора по сравнению с 1 минутой инкубации. При этом максимальная продукция АФК активированными нейтрофилами на фоне иономицина в 2 раза больше, чем на фоне А23187. Эффективные концентрации, при которых развивается усиленный ответ на ФМА для иономицина на порядок ниже по сравнению с концентрациями для А23187 при десяти минутах инкубации. Максимальная продукция АФК на фоне иономицина остается практически неизменной как при одной, так и при 10 минутах инкубции и соответствует значениям ЛГ=4.1±0.35 (при 1 минуте инкубации); К=3.в1±0.2 (при 10 минутах инкубации). На фоне А23187 максимальная продукция АФК при 10 минутах инкубации немного уменьшается по сравнению с 1 минутой инкубации, при этом Х=2.9±0.2 и А=2.3±0Л, соответственно.

Показано, что в бескальциевой среде кальциевые ионофоры могут увеличивать [Са2+]цит, поэтому мы решили посмотреть сохранится ли усиленный ответ клетки на ФМА при инкубации в бескальциевой среде в течение 1 и 10 минут с каждым из трех ионофоров.

Предварительная инкубация с кальциевыми ионофорами как в течение 1 минуты, так и в течение 10 во всем диапазоне концентраций ионофоров в бескальциевой среде не обеспечивает усиление ответа нейтрофилов на ФМА (рис. 4, 5).

При 1 минуте инкубации с ионофорами ответ неигрофилов на фоне А23187 и иономицина в концентрациях до 0.5 дМ не отличается от контрольного, выше 0.5 - слабо усиливается. А23187-4Вг в исследованном диапазоне концентраций значительно подавляет ответ клеток на ФМА.

При 10 минутах инкубации с ионофорами в среде 2 ответ нейтрофилов на фоне А23187 и иономицина, А23187-4Вг в концентрациях до 0.1 цМ не отличается от контрольного. С повышением концентрации иономицина и А23187-4Вг происходит подавление продукции АФК, на фоне А23187 наблюдается слабая активация.

Из приведенных результатов видно: во-первых, что для развития усиленного ответа необходимо наличие внешнего кальция; во-вторых, при инкубации клеток с иономицином в среде без Са2+ реакция клеток зависит от времени инкубации с ионофором; в-третьих, на фоне А23187-4Вг происходит уменьшение генерации АФК, начиная с концентрации 0.1 цМ, реакция не зависит от времени инкубации клеток с данным ионофором и содержания ионов кальция в среде инкубации.

Для того, чтобы показать, что вход ионов кальция играет критическую роль в регуляции [Са2+]цит при использовании кальциевых ионофоров в качестве праймирующих агентов и последующей активации респираторного взрыва с помощью ФМА ,, мы провели еще одну серию экспериментов. Для этого в бескальциевой среде, содержащей 0.5 мМ ЭГТА, истощали Са2+ -запасы клеток добавлением 100 нМ иономицина в комбинации с 50 нМ тапсигаргина в течение 15 минут. Затем в инкубационную среду добавляли различные концентрации СаСЬ. Об истощении клеток можно судить по отсутствию ответа на добавление тапсиргаргина (таблица 1). Видно, что добавление возрастающих концентраций СаСЬ приводит как к увеличению входа кальция, так и к усилению ФМА-индуцированного респираторного взрыва.

Таким образом, сравнивая эффект каждого из ионофоров А23187, иономицина, А23187-4Вг в активации респираторного взрыва нейтрофилов при добавлении ФМА мы обнаружили:

Таблица 1. Изменение продукции АФК и [Са2+]чит в "истощенных" клетках в зависимости от концентрации добавленного СаС12•

Концентрация добавленного СаОг, мМ Коэффициент К Изменение [Са2+]цих

0.5 1.2±0.2

1.0 1.5±0.2 934±250

1.5 2.0±0.2 1291±402

2.0 2.3±0.2 1393±330

3.0 2.7+0.2 2246±943

1) усиление продукции АФК в ответ на ФМА в среде, содержащей кальций обеспечивают только А23187 и иономицин;

2) уменьшение продукции АФК на фоне А23187-4Вг не зависело от наличия ионов Са2+ в среде и времени инкубации;

3) на фоне иономицина уменьшение продукции АФК происходит в более узкой области высоких концентраций ионофора по сравнению с А23187;

4) развитие усиленного ответа зависит от времени инкубации с кальциевыми ионофорами А23187 и иономицином, а так же наличия ионов кальция во внешней среде.

Исходя из полученных результатов, мы предположили, что каждый из ионофоров может активировать альтернативные пути внутриклеточной сигнализации, участвующие в активации респираторного взрыва совместно с ФМА, что возможно связано с особенностями механизмов повышения [Са2"1"]^-^.

3.3.2. Измерение концентрации внутриклеточного свободного кальция при действии кальциевых ионофоров.

Обнаруженные различия в активации респираторного взрыва нейтрофилов кальциевыми ионофорами совместно с ФМА, скорее всего, связаны с различными механизмами увеличения [Са2+]цш.

Время, мин Время, мин

Рис. б. Изменение [Са2+]щит в нейтрофилах при добавлении кальциевых ионофоров.

Са2+]шт рассчитывали по изменению интенсивности флуоресценции Рига-2АМ при 1=37°С в среде, содержащей 1 мМ Са2+ (+Са2+), и в бескальциевой среде, содержащей 2 мМ ЭГТА (-Са2+) при добавлении иономицина в концентрациях 0.1 цМ (А), 0.01 цМ (Б); А23187 в концентрациях 1 цМ (В), 0.5 цМ (Г); А23187-4Вг в концентрациях 10 цМ (Д), 2 цМ (Е).

Для изучения механизмов увеличения [Са24"]^ в нейтрофилах мы провели измерение [Са2+]Ц1ГГ с использованием трех ионофоров: А23187, иономицина и А23187-4Вг. На рисунке 6 показано изменение уровня [Са2+]цит, рассчитанного по изменению интенсивности флуоресценции Рига-2АМ в зависимости от времени при различных концентрациях кальциевых ионофоров. Исходный уровень [Са2+]ц,гг неактивированных нейтрофилов составляет 120±6 нМ (п=20). Добавление к суспензии нейтрофилов кальциевого ионофора приводит к быстрому (в течение 30-60 с) повышению [Са2+]цих. Затем происходит постепенное снижение [Са2+1цда. и через 6-10 мин устанавливается квазистационарный уровень. Видно, что обе фазы (быстрое увеличение [Са2+]цит и установившийся уровень [Са2+]цит) зависят от концентрации ионофора и наличия ионов Са2+ в среде инкубации.

Поскольку, в среде, не содержащей ионов кальция, зависимость К от концентрации ионофора на 1 и 10 минутах отличалась от таковой в среде, содержащей ионы кальция, то следовало ожидать иной динамики изменения [Са2+]цит в среде 2. Действительно, из рисунка 6 видно, что кальциевый ионофор так же увеличивает [Са2+]цит в течение 30-60 с, но апмлитуда ответа нейтрофилов меньше по сравнению с средой 1. Затем происходит постепенное снижение [Са2+]цих, но квазистационарный уровень не устанавливается. Амплитуда ответа нейтрофилов также зависит от концентрации кальциевого ионофора в среде 2.

Итак, также как изменение продукции АФК, изменение максимального (или пикового) и квазистационарного уровнней [Са2+]цит зависит от концентрации ионофора. Изменение [Са2+]цит является сложным процессом, в котором принимают участие несколько Са2+-транспортирующих систем в клетке.

Мы провели более подробное исследование характера зависимости | [Са2+]цит от концентрации ионофора и проанализировали различия в механизмах изменения [Са2+]цит.

Как видно из рисунков 4Б и 5Б максимальный и квазистационарный уровни [Са2+]щгг зависят от концентрации и типа кальциевого ионофора в среде 1.

По мере увеличения концентрации ионофора происходит повышение максимального и квазистационарного уровней [Са2+]цит: в диапазоне концентраций от 0.1-0.5 цМ А23187 вызывает увеличение [Са2+]цит от 208±8 нМ до 248+5 нМ, в диапазоне конценраций от 1-5 цМ -увеличение [Са2"]иит от 710±60 до 1089±100 нМ, максимальное значение, которого можно достигнуть при добавлении кальциевого ионофора А23187 в концентрации 10 цМ, в 20 раз выше исходного.

Иономицин в концентрациях от 0.1 нМ до 0.01 ц.М увеличивает уровень [Са24"]^ к от 132±6 нМ до 377±7 нМ, для концентраций ионофора от 0.1-1 ¡аМ -от 648±39 нМ до 923±48 нМ, добавление иономицина в концентрации 2 цМ вызывает резкое повышение [Са2+]цих до 1665±15 нМ.

Для А23187-4Вг обнаружен несколько иной характер повышения [Са2+]щгг- в концентрациях от 0.1-10 цМ данный ионофор повышает [Са2+]цит: от 174 нМ до 468 нМ, а высокая концентрация А23187-4Вг 20 цМ также вызывает резкое повышение [Са2+]цит до 1722±66 нМ (рис. 4Б)

Поддерживаемый уровень [Са2+]цит при добавлении иономицина в диапазоне концентраций от 0.1 нМ до 0.1 цМ не отличается от уровня [Са2+]шгг интактных клеток; в диапазоне концентраций от 0.01-2 цМ возрастает от 110±5 нМ до 792±84 нМ.

Для А23187 и А23187-4Вг получены подобные зависимости: в диапазоне концентраций 0.01-0.1 дМ кальциевого ионофора А23187 наблюдается слабое изменение [Са2"1"]^ от 148±1 нМ до 154±52 нМ, в диапазоне концентраций 0.15 цМ резкое увеличение стационарного уровня [Са2+]цит - от 154±52 нМ до 609±96 нМ. Для А23187-4Вг в диапазоне концентраций от 0.1-2 цМ поддерживаемый уровень [Са2+]щгг увеличивается от 117±1 нМ до 147±3 нМ в диапазоне концентраций 2-20 цМ более плавное изменение [Са2^]^ от 147+3 нМ до 401±50 нМ по сравнению с иономицином и А23187 (рис. 5).

Таким образом, в среде 1 низкие концентрации ионофоров вызывает только кратковременное повышение [Са2+]иит, в то время как высокие, наряду с быстрым кратковременным подъемом обеспечивают высокий поддерживаемый уровень [Са^цда.

Измерение [Са2+]цит в среде, из которой был исключен кальций и добавлено 2 мМ ЭГТА (среда 2), показало, что характер зависимости [Са^цщ, изменяется по сравнению с средой 1 для А23187 и иономицина. Для иономицина зависимость имеет сложную форму: в диапазоне концентраций 0.01-1 цМ происходит постепенное увеличение [Са2+]цит от 118±7 нМ до 391±47 нМ; в диапазоне концентраций 3-5 цМ наблюдали уменьшение [Са2+]цит до 275 ± 47 нМ, в диапазоне концентраций 5-10 ц.М иономицина уровень [Са2+]цит резко увеличивается от 284±35 нМ до 692±82 нМ. Для А23187 зависимость [Са2+]цит от концентрации ионофора в среде 2 имеет колоколообразную форму. В диапазоне концентраций А23187 0.1-0.5 \хМ уровень [Са24"]^ не отличается от контрольного (120±6 нМ); в диапазоне концентраций 0.5-2 мкМ происходит увеличение [Са2"1"]^ от 122 до 392 нМ; в диапазоне 2-10 ¡.iM наблюдали спад-от 392 до 155 нМ. При одинаковых концентрациях кальциевых ионофоров в среде 2 наблюдаются более низкие пиковые значения [Са2+]цит, чем в среде 1. Для А23187-4Вг зависимость [Са2+]цит от концентрации ионофора аналогична зависимости в среде 1, этот ионофор практически не изменял пиковое значение [Са2+]цит за исключением одной концентрации 10 дМ. При продолжительной инкубации (10 мин) с иономицином в среде 2 концентрация внутриклеточного кальция достоверно не отличалась от контроля. При инкубации с А23187 в течение 10 минут в среде 2 [Са2+]цит была ниже контрольного уровня и снижалась тем больше, чем больше была концентрация ионофора. Таким образом, сравнивая характер зависимости [Са2+]цит в среде 2, можно видеть, что все три ионофора повышают концентрацию свободного кальция в цитоплазме, максимальное увеличение [Са2+]цит практически одинаково для всех ионофоров: для иономицина (1 ц.М) это значение соответствует 391±47, для А23187 (2 цМ) -392±50 нМ, для А23187-4Вг (10 цМ) - 336±45 нМ, различаются только эффективные концентрации ионофоров. Так как максимальный уровень [Са2+]щгг в среде 2 ниже чем в среде 1, при инкубации с иономицином и А23187, то увеличение [Са2+]цтг в среде 2 происходит при мобилизации кальция из внутриклеточных депо, а в среде 1 за счет ионофорного переноса и мобилизации кальция из внутриклеточных депо. При инкубации клеток с А23187-4Вг характер зависимости в среде 2 такой же как в среде 1, максимальный уровень [Са2+]ци:т мало меняется в среде 2 по сравнению со средой 1, то есть данный ионофор увеличивает [Са2+]щгг в основном за счет мобилизации кальция из внутриклеточных депо. Этот вывод подтверждается изменением динамики Са2+-сигнала в зависимости от наличия ионов Са2+ во внешней среде (рис. 6). На рисунке 6 показано изменение уровня флуоресценции Рига-2АМ в зависимости от времени при добавлении высоких и низких концентраций кальциевых ионофоров в средах 1 и 2. Из рисунка видно, что разница максимальных значений уровня [Са2+]цих в средах с различным содержанием ионов кальция составляет 900 нМ и 400 нМ, для иономицина (0.1 р. ) и А23187 (1 цМ), соответственно. Причем эти концентрации соответствуют максимальному усилению продукции АФК при совместной активации нейтрофилов кальциевым ионофором и ФМА.

При инкубации с низкими концентрациями иономицина (0.1 рМ) и А23187 (0.5 цМ) в среде 2 максимальный уровень [Са2+]цит не отличался от контроля. Разница максимальных значений уровня [Са2+]цит в средах с различным содержанием ионов кальция составляет 330 нМ и 280 нМ для иономицина (0.01 рМ ) и А23187 (0.5 рМ), соответственно.

Для А23187-4Вг существует иная картина: низкие концентрации ионофора (2 цМ) слегка повышают максимальный уровень [Са2+]цит до 200 нМ в среде 2. Разница максимальных значений уровня [Са2+]цит в средах с различным содержанием ионов кальция составляет 80 нМ для А23187-4Вг (10 рМ).

Таким образом, низкие концентрации иономицина И А23187 в первой фазе Са2+-сигнала не вызывают мобилизацию ионов кальция из внутриклеточных депо, а увеличение [Са2+]цит происходит за счет ионофорного переноса в среде с 1 мМ Са2+. При высоких концентрациях данных ионофоров максимальный уровень Са2+-сигнала достигается за счет ионофорного переноса и мобилизации внутриклеточных запасов Са2+.

А23187-4Вг увеличивает [Са^Зщ^ в клетке, в основном, за счет мобилизации кальция из внутриклеточных депо и, возможно, обеспечивает вход Са2+ в клетку из внешней среды за счет опустошения кальциевых депо в первой фазе Са2+-сигнала.

Анализ результатов, показал, что все ионофоры повышают концентрацию свободного кальция в цитозоле, но с разной эффективностью: она падает в ряду-иономицин, А23187, А23187-4Вг.

Анализ динамики изменения [Ca2+jUHT среде с 1 мМ Са2+ и в бескальциевой среде, показал, что первая фаза Са2+- сигнала, вызванного А23187 и иономицином, связана с ионофорным переносом и мобилизацией Са2+ из внутриклеточных депо, А23187-4Вг увеличивает [Са2+]цит мобилизацией Са2+ из внутриклеточных депо. Природа Са2+- сигнала отличается в случае использования высоких и низких концентраций А23187 и иономицина: при низких концентрациях [Са2+]цит увеличивается в основном за счет ионофорного переноса, тогда как, высокие концентрации увеличивают [Са24"]^ как за счет ионофорного переноса, так и за счет мобилизации из внутриклеточных депо.

3.3.3. Взаимосвязь увеличения [Са2+]цит и изменения продукции АФК нейтрофилов в ответ на ФМА при совместной активации с кальциевыми ионофорами.

Сопоставляя изменение коэффициента К и изменение [Са2+]цит при варьировании концентраций кальциевых ионофоров, мы обнаружили существование взаимосвязи между Жи [Са2+]цит. По нашим данным (рис. 4, 5) для иономицина и А23187 при увеличении [Са2"1"]^ значение К постепенно увеличивается, достигает максимума, а затем уменьшается. Для А23187-4Вг значение К монотонно уменьшается во всем диапазоне концентраций кальциевого ионофора, тогда как наблюдается увеличение уровня [Са^],^. Для количественной оценки степени взаимосвязи между увеличением [Са2+]щгг и изменением продукции АФК нейтрофилов в ответ на ФМА при совместной активации с кальциевыми ионофорами мы рассчитали коэффициент корреляции R для участков возрастания и спада зависимости коэфициента К от коцентрации кальциевого ионофора. В таблице 2 приведены коэффициенты корреляции между уровнем [Са2+]цит и коэффициентом К при активации нейтрофилов кальциевыми ионофороми и ФМА. Для каждого ионофора получен линейный коэффициент корреляции. Для А23187 и иономицина получены положительные

Я1=0.82±0.51 и 11]=0.98±0.32 соответственно при 1 мин инкубации в среде 1; 11=0.96+0.32 при 10 минутах инкубации в среде 1 для участка возрастания К. Эти значения коэффициента корреляции указывают на сильную связь между увеличением [Са2+]цит и увеличением коэффициента К. Для спадающей части кривой для А23187 и иономицина, соответственно, получены следующие коэффициенты: R2~0.76t0.51 и 112=-0.98±0.32 при 1 минуте инкубации в среде 1, а при 10 минутах 11з=-0.96±0.32 (иономицин). При 1 минуте инкубации в среде 1 значение коэффициента корреляции указывают на то, что для А23187 существует значительная отрицательная корреляция, то есть с постепенным увеличением [Са2"1"^ происходит уменьшение коэффициента К Для иономицина существует очень сильная, близкая к функциональной, связь: с увеличением [Са2+]цих - уменьшается коэффициент К. При 10 минутах инкубации в среде 1 для спадающй ветви как для А23187, так и для иономицина существует слабая отрицательная связь, то есть при медленном изменении [Са2+]цит происходит резкое уменьшение коэффициента К. Для А23187-4Вг существует только спадающая ветвь зависимости коэффициента К от концентрации ионофора независимо от времени и среды инкубации, поэтому для данного ионофора рассчитан отрицательный линейный коэффициент корреляции 112=-0.7±0.33 при 1 минуте инкубации в среде 1: при 10 минутах инкубации в среде 1 К4=-0.74±0.33. Эти значения коэффициента корреляции соответствуют сильной отрицательной связи, то есть с увеличением [Са2"1"]^ происходит уменьшение коэффициента К. В среде 2 значения коэффициента корреляции следующие: ]15=0.36±0.30, 115=-0.91±0.31 для иономицина, А23187, А23187-4Вг соответственно. Видно, что для иономицина существует слабая корреляция между изменением [Са2+]цит и коэффициентом Д, а для А23187-4Вг сильная отрицательная связь. С увеличением [Са^щ^ в среде 2 не происходит увеличение коэффициента К при инкубации клеток с кальциевыми ионофороми, то есть для развития усиленного ответа кальциевым ионофором и ФМА необходим вход ионов Са2+.

Таблица 2.

Коэффициент корреляции между [Са2+]цит и К при совместной активации нейтрофилов кальциевым ионофором и ФМА.

Ионофор к2 1*3 «4 »5

Иономицин 0.98+0.32 -0.98±0.32 0.96±0.32 -0.28±0.31 0.36Ю.30 0.8±0.15

А23187 0.82±0.51 -0.76±0.51 - - -

А23187-4Вг - -0.7±0.33 - -0.74Ю.ЗЗ 0.91±0.3

Яр коэффициент корреляции между максимальным уровнем [Са2"1"]^ и значениями К для участка возрастания на кривой зависимости К от концентрации ионофора (инкубация с ионофором 1 мин в среде с 1 мМ Са2+),

2- коэффициент корреляции между максимальным уровнем [Са2+]цит и значениями К для спадающей части зависимости от концентрации ионофора (инкубация с ионофором 1 мин в среде с 1 мМ Са2+),

Яз- коэффициент корреляции между стационарным уровнем [Са2*]^ и значениями К для участка возрастания на кривой зависимости К от концентрации ионофора (инкубация с ионофором 10 мин в среде с 1 мМ Са2+),

1*4- коэффициент корреляции между и стационарным уровнем [Са2+]цит и значениями К для спадающей части зависимости от концентрации ионофора (инкубация с ионофором 10 мин в среде с 1 мМ Са2+),

115- коэффициент корреляции между максимальным уровнем [Са2+]цш. и значениями К зависимости от концентрации (ионофора инкубация с ионофором 1 мин в бескальциевой среде с добавлением 2 мМ ЭГТА), коэффициент корреляции для участка возрастания зависимости К от концентрации ионофора и [Са2+]цит для "истощенных клеток".

Для истощенных по кальцию (пункт 3.3.1.) клеток получен 11=0.81+0.15, что говорит о положительной прямолинейной корреляции и подтверждает необходимость входа экстраклеточного кальция.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что существует зависимость между изменением [Са2"1"]^ и коэффициентом К, но увеличение [Са2+]щгг не всегда вызывает усиление продукции АФК при последующей активации ФМА, как это видно в случае использования А23187-4Вг. По-видимому, активация респираторного взрыва кальциевым ионофором и ФМА представляет сложный процесс, который нельзя формально формально описать только увеличением [Са2+]цит. Уровень и продолжительность изменения [Са2+]цит определяет уровень активности Са2+-зависимых ферментов и служит регулятором активности Са2+-зависимых ферментных систем, вклад которых изучали в следующей серии экспериментов.

3.3.4. Участие фосфолипазы А2 в регуляции респираторного взрыва нейтрофилов.

Известно, что для функциональной активности лейкоцитов большое значение имеет метаболизм арахидоновой кислоты (АК). Мы предположили, что в усилении ответа нейтрофила при совместном использовании кальциевого ионофора и ФМА должна участвовать ФЛА2, уникальной функцией которой является отщепление свободной АК из мембранных фосфолипидов. Для перитонеальных макрофагов мыши показана прямая корреляция между внеклеточной концентрацией Са2+, то есть возможностью входа Са2+ из наружной среды, и активацией фосфолипазы А2 (ФЛА2) [137]. Широко распространено мнение, что для активации ФЛА2 существенно увеличение [Са2+]цит после стимула агониста, то есть потенциальными активаторами ФЛА2 являются кальциевые ионофоры, например, А23187 или иономицин. С другой стороны, существуют доказательства участия ПКС в активации ФЛА2. Форболовый эфир вызывал выброс арахидоновой кислоты, иногда в синергизме с физиологическими агонистами. АК [83]. Поэтому, вероятнее всего, в механизм избыточной продукции АФК при активации нейтрофилов кальциевыми ионофорами и ФМА включена фосфолипаза А2 и ее продукт арахидоновая кислота.

Для проверки этого предположения мы использовали специфический ингибитор ФЛА2 с молекулярной массой 14 кДа 4-бромофенацил бромид (БФБ), ингибиторы ключевых ферментов трех известных путей окисления АК: циклооксигеназы (индометацин), липоксигеназы (нордигидрогуаретиковая кислота, хинакрин, кверцетин), эпоксигеназы - цигохрома Р-450 (проадифен), а также неомицин - ингибитор фосфолипазы С (ФЛС), которая может непрямым путем высвобождать АК из мембранных фосфолипидов.

Рис. 7. Влияние ингибиторов на продукцию АФК нейтрофилов, активированных кальциевыми ионофорами и ФМА:

Клетки инкубировали в течение 2 мин с блокаторами, затем добавляли кальциевые ионофоры А23187 в концентрации 0.5 мкМ (1) или иономицин в концентрации 0.1 мкМ (2 — 5) и через 1 мин регистрировали изменение продукции АФК в ответ на ФМА (1 мкМ) при 37°С. Выбранные концентрации ионофоров соответствуют максимальному значению коэффициента К.

1, 2 - 4 —бромофенацил бромид 10 мкМ, ингибитор ФЛА2;

3 — индометацин 10 мкМ, ингибитор циклооксигеназы;

4 — неомицин 10 мкМ, ингибитор фосфолипазы С;

5 — проадифен 10 мкМ, ингибитор цитохрома Р—450. достоверное отличие от контроля по 95% уровню диаграммы, демонстрирующие влияние ингибиторов ФЛА2, циклооксигеназы, эпоксигеназы - цитохрома Р-450, ФЛС на продукцию АФК при совместной активации нейтрофилов иономицином или А23187 и ФМА. На диаграммах 1 и 2 показано действие блокатора ФЛА2 4-бромофенацил бромида, который ингибировал продукцию АФК до 75+13% (диаграмма 2 ) при активации клеток иономицином и ФМА. По сравнению с А23187 (диаграмма 1) этот эффект в 2 раза меньше: для 0.5 цМ А23187 ингибирование составляет 40±10%.

Полученные результаты, а так же литературные данные [185] дают основание считать, что в активации нейтрофилов кальциевыми ионофорами А23187 или иономицином с последующим действием ФМА участвует система фосфолипазы А2, поэтому мы дополнительно проверили вклад основных продуктов метаболизма арахидоновой кислоты, таких как лейкотриены, простагландины и эйкозотетраеновые кислоты, которые участвуют в регуляции метаболизма при функционировании нейтрофила.

Вклад продуктов циклооксигеназы в активацию нейтрофилов кальциевым ионофором и форболовым эфирол1. Для исследования вклада продуктов циклооксигеназы в активацию кальциевым ионофором и ФМА. мы использовали блокатор циклооксигеназы - индометацин (10 цМ). Индометацин

1 2 3 4 5

На рисунке 7 приведены не изменял продукцию АФК нейтрофилов во всем диапазоне концентраций кальциевого ионофора А23187 (данные не приводятся). При активации нейтрофилов иономицином (0.1 дМ) и ФМА индометацин также не изменял продукцию АФК (рис. 7, столбик 3). Это дает основание считать, что продукты циклооксигеназы не влияют на продукцию АФК нейтрофилами при совместной активации кальциевым ионофором и ФМА.

Роль продуктов 5-липоксигеназы в активации респираторного взрыва нейтрофилов кальциевым ионофором и ФМА. Исследование роли 5-липоксигеназы было затруднено тем, что три примененных блокатора 5-липоксигеназы: хинакрин, кверцетин и нордигидрогуаретиковая кислота, по нашим результатам являются "ловушками" АФК и гасят ХЛ, хотя существуют работы, в которых они используются для исследования респираторного взрыва [186].

Роль продуктов эпоксигеназного пути окисления арахидоновой кислоты в совместной активации респираторного взрыва кальциевыми ионофорами и ФМА. Проадифен достоверно не менял продукцию АФК при активации нейтрофилов иономицином 0.1 цМ и ФМА, хотя наблюдась тенденция к усилению респираторного взрыва при данной концентрации кальциевого ионофора.

В присутствии низких концентраций А23187 (менее 1 цМ, что соответствует области нарастания коэффициента К при увеличении концентрации кальциевого ионофора) проадифен также достоверно не изменял продукцию АФК (рис. 9).

Участие фосфолипазы С в регуляции респираторного взрыва нейтрофилов при активации А23187и ФМА. Ингибирование с помощью неомицина ФЛС, широко представленной в нейтрофилах, также не давало значимого эффекта. На рисунке 7 приведено изменение продукции АФК на фоне блокатора фосфолипазы С неомицина (10 -цМ) при активации клеток иономицином (0.1 цМ) и ФМА (1 ¡аМ). На фоне неомицина наблюдается небольшое уменьшение продукции АФК, которое достоверно не отличалось от контроля. При активации нейтрофилов А23187 и ФМА блокатор фосфолипазы С не изменял продукцию АФК во всем диапазоне концентраций ионофора.

Измерение [Са2+]цит в присутствии 4-бромофенацил бромида. Так как величина коэффициента К зависит от изменения уровня [Са2+]цит (Таблица 2), то возможно, что ингибирование продукции АФК или уменьшение значения К при активации нейтрофилов кальциевыми ионофорами А23187 или иономицином в присутствии блокатора ФЛА2 - 4 бромофенацил бромида могли быть связаны с изменением уровня [Са2+]цигг. Исходный уровень [Са2+]Г№ГГ неактивированных нейтрофилов составляет 120±6 нМ. На фоне БФБ исходный уровень [Са2+]цит не изменялся.

2 а I У се В ■Л а

8 * я

0.0001 0.001 0.01 1

Концентрация иономицина, мкМ

0.01 0.1 1 10 Концентрация А23187, мкМ

Рис. 8. Изменение максимальной [Са2+]цит в нейтрофилах при добавлении кальциевых ионофоров в присутствии блокатора ФЛЛ2, 4-бромофенацил бромида.

А) Изменение максимального уровня [Са2+]цит в нейтрофилах, измеренное по флуоресценции Рига-2АМ, при добавлении иономицина в разных концентрациях на фоне блокатора ФЛА? БФБ в концентрации 10 цМ (■) и без него (•) при 37°С в среде с 1 мМ Са2+. Для каждой точки усреднены результаты 4-6 экспериментов, указана средняя квадратичная ошибка.

Б) Изменение максимального уровня [Са2+]цит в нейтрофилах, измеренное по флуоресценции Рига-2АМ, при добавлении А23187 в разных концентрациях на фоне блокатора БФБ в концентрации 10 цМ (М) и без него (•) при 37°С в среде с 1 мМ Са2+. Для каждой точки усреднены результаты 4-6 экспериментов, указана средняя квадратичная ошибка.

Мы исследовали действие блокатора ФЛА2 на изменение максимального уровня [Са2+]цит при активации клеток А23187 или иономицином. На рисунке 8 приведены графики изменения максимального уровня [Са2+]цит в зависимости от концентрации кальциевого ионофора А23187 в присутствии блокатора ФЛА2 или без него в среде, содержащей 1 мМ Са2+. Видно, что в диапазоне концентраций А23187 0.01-0.1 цМ различий в максимальном уровне [Са2+]цш, на фоне блокатора и без него нет. В то время как при действии более высоких концентраций А23187 на фоне 4-бромофенацил бромида происходит уменьшение уровня [Са2+]цит. В интактных клетках 4-бромофенацил бромид не изменял уровень [Са2+]цит.

Таким образом, блокатор ФЛА2 изменяет уровень [Са2Ь]цИТ в клетках, активированных высокими концентрациями кальциевых ионофоров, т.е. при повышенном стационарном уровне [Са2+]цит.

В случае активации клеток иономицином в диапазоне концентраций 0.1 нМ-0.05 ц.М на фоне блокатора ФЛА2 и без него достоверных различий в уровне [Са2+]цит не обнаружено; с увеличением концентрации иономицина (0.5-1 цМ) появляется тенденция к уменьшению уровня [Са2+]щгг на фоне 4-бромофенацил бромида. Достоверное ингибирование наблюдается при концентрации иономицина 0.1 цМ (рис. 8).

Таким образом, 4-бромофенацил бромид не изменял максимальный уровень [Са2+]цит на фоне низких концентраций кальциевых ионофоров, которые соответствуют нарастающей части зависимости коэффициента К, но рбнаружена тенденция к ингибированию максимального уровня [Са2^]^ при высоких концентрациях ионофора, где происходит уменьшение коэффициента К.

Из анализа полученных результатов видно, что значительный вклад в активацию респираторного взрыва кальциевым ионофором и ФМА вносит ФЛА2, но при различных концентрациях кальциевых ионофоров (высоких или низких) возможен неодинаковый вклад различных продуктов метаболизма АК в активационные и инактивационные процессы в регуляции респираторного взрыва.

3.3.5. Оценка функционального статуса нейтрофилов на модели активации респираторного взрыва кальциевым ионофором А23187и ФМА.

В организме нейтрофилы могут находиться в состоянии покоя, праймирования, активации и гиперактивации. В цитоплазме покоящихся клеток концентрация ионов Са2+ по разным оценкам варьирует от 50 до 200 нМ. Основной вклад в поддержание низкой концентрации цитоплазматического Са2+ вносят кальциевые АТФазы внутриклеточных мембран (гладкого и шероховатого эндоплазматического ретикулума) [64]. При праймировании клетки, предварительно обработанные "праймирующим" агентом, переходят из состояния покоя к состоянию готовности отвечать на последующий стимул изменением "оксидазной или клеточной активности" [75]. В настоящее время рассматривают несколько механизмов праймирования: синтез белков de novo, экспрессия рецепторов на поверхность клетки, изменение [Са2+]цигг, модуляция активности фосфолипазы Д, тирозиновое фосфорилирование [75]. Активация -это процесс, который приводит к "измеряемым" изменениям в клетке [76]. В экспериментальных условиях определенный уровень активности можно задавать, варьируя концентрации действующих агентов. Так, на кривой зависимости коэффициента К от концентрации А23187 можно выделить области концентраций ионофора, переводящих клетки в тот или иной функциональный статус (рис. 4А). Оценка уровня функциональной активности была проведена нами по изменению [Са2"1"]^, по эффектам БФБ (10 jiM), блокатора ФЛА2, и проадифена, блокатора цитохрома Р-450 (10 ¡iM) (рис. 9). Данная классификация носит условный характер и использована для удобства описания результатов.

Интактные клетки. [Са24"]^ в таких клетках составляет 120±6 нМ, при добавлении ФМА в концентрации 1 рМ наблюдается изменение XJI (рис 2). На таких клетках БФБ вызывал уменьшение продукции АФК до 0.34±0.02, на фоне проадифена продукция АФК не изменялась (рис. 9).

Праймированные клетки. Предварительная обработка клеток низкими концентрациями А23187 (0.1 цМ) приводила к кратковременному повышению [Са2+]цит, которая составляла 208±8 нМ (рис. 6). К 4

3 2 1 О

Рис. 9. Изменение продукции АФК нейтрофилов, активированных

Л23187и ФМА (1 мкМ) в присутствии блокаторов при ЗТС.

I 1 - без блокатора гд - на фоне бромофенацил бромида (10 мкМ), блокатора ФЛА2; - на фоне проадифена (10 мкМ), блокатора цитохрома Р-450

Для каждой концентрации усреднено 10 и более значений, указана средняя квадратичная ошибка,

Уровень спонтанной ХЛ в этом случае не менялся. Такое изменение [Са2+]цит может свидетельствовать о локальном изменении концентрации ионов кальция в клетке, в результате чего наблюдается изменение формы клетки в процессе адгезии или фагоцитоза, а так же усиление продукции АФК внутри клетки [75]. При последующем добавлении ФМА проявляется тенденция к увеличению коэффициента К. БФБ на таких клетках вызывал уменьшение продукции АФК почти в 2 раза; на фоне проадифена, блокатора цитохрома Р-450, продукция АФК не изменялась (рис. 9).

Активированные клетки. Обработка клеток А23187 в концентрациях 0.2-2 дМ вызывала кратковременное повышение [Са2+]цит от 230±5 нМ до 861±60 нМ и обеспечивала поддерживаемый уровень [Са2+]цит, который менялся от 200±10 нМ до 360+20 нМ. В этом случае уровень ХЛ, вызванной А23187, отличался от уровня ХЛ интактных клеток (рис. 2А), а в ответ на ФМА происходило усиление продукции АФК примерно вдвое (К=2.3±0.2). На фоне БФБ наблюдалось ингибирование продукции АФК приблизительно на 50% (рис. 4; 0.5 или 1 цМ); на фоне проадифена в указанном диапазоне концентраций А23187 изменения продукции АФК не зарегистрировано.

Гиперактивированные клетки. Обработка клеток А23187 в концентрациях 5-20 цМ также вызывала кратковременное повышение [Са2+]цит от 1090±100 нМ до 2403±200 нМ и обеспечивала поддерживаемый уровень [Са2+]11ИТ) который изменялся от 400±60 нМ до 609±96 нМ. При регистрации ХЛ в ответ на А23187 мы наблюдали изменение динамики продукции АФК (рис. 2А, кривая 5) по сравнению с более низкими концентрациями (рис. 2А, кривые 3, 4). Последующее добавление ФМА вызывало ослабление продукции АФК по сравнению с продукцией АФК, вызванной совместной активацией нейтрофилов ФМА и более низкими концентрациями А23187. В этом случае на фоне БФБ мы наблюдали ингибирование продукции АФК на 64±10%, т.е. эффект БФБ слабо зависел от концентрации ионофора. На фоне проадифена наблюдалось усиление продукции АФК на 187%, т.е. эффект зависел от концентрации кальциевого ионофора.

Таким образом, в механизме активации респираторного взрыва нейтрофилов кальциевым ионофором и форболовым эфиром участвует ФЛА2. Ингибирование проадифеном ключевого фермента этого пути - цитохрома Р-450 устраняет инактивацию респираторного взрыва в ответ на ФМА нейтрофилов, предварительно обработанных высокими концентрациями А23187.

3.4. Исследование биологического действия ЭМИ КВЧ на модели синергической активации респираторного взрыва с помощью кальциевого ионофора А23187и ФМА.

Детально разработанная модель активации респираторного взрыва А23187 и ФМА позволила нам исследовать эффекты ЭМИ КВЧ в зависимости от функционального состояния клеток. з 2

1

Время, мин

0.1 1 10

Концентрация А23187, мкМ

Рис. 10. Изменение продукции АФК нейтрофилов при облучении

ЭМИ КВЧ.

Клетки облучали ЭМИ КВЧ (41.95 ГГц, непрерывная генерация, 150 мкВт/см2) на фоне А23187 при г=20°С в течение 20 мин. После прекращения облучения регистрировали ХЛ нейтрофилов в ответ на ФМА (1 цМ) при 1=3 7°С. (А) Зависимость интенсивности ХЛ (Б) Изменение продукции АФК нейтрофилов от времени при активации в зависимости от концентрации интактных клеток ФМА в концентрации А23187 необлученных (•) и

1 рМ (1); при активации ФМА облученных (■) нейтрофилов. необлученных (2) и облученных ЭМИ Приведены усредненные результаты

КВЧ (3) клеток, предварительно для 10-12 независимых опытов, обработанных А23187 (5 рМ). указано среднее значение±средняя квадратичная ошибка.

На рисунке 10Б представлено изменение коэффициента Къ зависимости от концентрации кальциевого ионофора А23187 для необлученных (кривая 1) и облученных (кривая 2) клеток. При применении концентраций А23187 меньше 50 нМ не наблюдается усиления ответа на ФМА. В интервале концентраций ионофора 0.1-20 ¡нМ зависимость имеет колоколообразную форму с максимальным значением 3.0±0.1 при концентрации ионофора 2 цМ. Это соответствует примерно трехкратному превышению продукции АФК нейтрофилами предварительно активированными кальциевым ионофором, над контрольными в ответ на активацию ФМА 1 цМ

Для облученных клеток зависимость коэффициента К от концентрации ионофора имеет аналогичный характер с максимальным значением 2.8 ±0.1 при той же концентрации ионофора , что и для необлученных клеток. При облучении нейтрофилов в присутствии кальциевого ионофора в концентрациях от 0.5 - 3 цМ мы не обнаружили достоверных различий в изменении коэффициента К по сравнению с необлученными клетками. Начиная с концентрации 5 р.М до 20 ц.М коэффициент К облученных клеток достоверно ниже, чем необлученных, при тех же концентрациях ионофора. При оценке эффекта ЭМИ КВЧ по отношению продукции АФК облученных и необлученных клеток (рис. 10) видно, что в области концентраций ионофора от 50 нМ до 1 цМ (эта область соответствует прашнирванным и активированным клетка.м) отношение близко к 100% и практически не зависит от концентрации ионофора. Критическими концентрациями являются концентрации выше 2 цМ, при которых наблюдается резкое снижение величины отношения коэффициентов К облученных и необлученных клеток. Достоверное отличие от 1 получено для концентраций А23187 выше 4 цМ (рис. 10) (гиперактивированные клетки). При увеличении концентраций А23187 от 3 до 20 дМ происходит уменьшение коэффициента Хпри облучении клеток ЭМИ КВЧ. Максимальное зарегистрированное уменьшение коэффициента К при облучении ЭМИ КВЧ достигает 60% при концентрации А23187 20 цМ.

Таким образом, анализ полученных результатов подтверждает предположение о том, что эффект ЭМИ КВЧ зависит от "степени активации клетки", по крайней мере в данном случае, при ее активации возрастающими концентрациями А23187.

3.4.1. Роль внешнего кальция в реализации эффектов ЭМИ КВЧ на нейтрофилах.

Как показано в пункте 3.3.2, кальциевые ионофоры способствуют не только ионофорному входу Са2+ в клетку, но и его высвобождению из внутриклеточных депо, что является причиной повышения концентрации свободного кальция в цитоплазме при инкубации клеток в номинально бескальциевой среде в присутствии ионофора. 120

100 ч9 Ф

I 80 а к

8 бо

40

20

Рис. 11. Оценка эффективности ЭМИ КВЧ по отношению продукции АФК облученных и необлученных клеток, последовательно активированных А23187в разных концентрациях и ФМА.

Нейтрофилы облучали в среде, содержащей 1 мМ Са2+ (О), и в среде без Са2+ (ЦЩ), указано среднее значение±средняя квадратичная ошибка, приведены усредненные результаты 10-12 независимых экспериментов. * - достоверное отличие от контроля по 95% уровню.

Чтобы установить роль внеклеточного кальция в полученном эффекте ингибирования респираторного взрыва ЭМИ КВЧ была использована бескальциевая среда с добавлением 2 мМ ЭГТА. Можно было ожидать, что в этих условиях эффект ЭМИ КВЧ сохранится. Однако во всем диапазоне

Контроль

0.5 мкМ 5 мкМ 10 мкМ 20 мкМ

Концентрация, мкМ концентраций А23187 ответ на ФМА облученных и необлученных клеток не различался (рис. 11).

Таким образом, к воздействию ЭМИ КВЧ чувствительны клетки, обработанные высокими концентрациями кальциевого ионофора А23187, что соответствует повышенному уровню [Са2+]цит, эффект зависит от наличия Са2+ в среде инкубации. Это указывает на возможность участия ФЛАо в реализации полученного эффекта. Кратковременное значительное повышение [Са2+]цил: и далее высокий поддерживаемый уровень [Са2+]цит создают условия для активации сигнальных путей, в частности, связанных с ФЛА2 [137].

3.4.2. Роль фосфолипазы А2 в эффекте ингибирования ЭМИ КВЧ продукции АФКнейтрофилов, активированных кальциевым ионофором А23187и ФМА.

Для проверки предположения об участии ФЛА2 в реализации эффекта ингибирования ответа нейтрофилов ЭМИ КВЧ, клетки облучали в присутствии блокатора ФЛА2, 4-бромофенацил бромида (БФБ) (10 рМ). На рисунке 11 представлены диаграммы, на которых показано изменение К при последовательной активации нейтрофилов А23187 (5 рМ) и ФМА (1 рМ) на фоне БФБ (рис. 11А) и при действии ЭМИ КВЧ (рис. 11Б). Было обнаружено, что клетки, выделенные из разных животных, различаются по чувствительности к БФБ: 1) клетки с высокой чувствительностью, у которых происходило уменьшение К от 2.3±0.2 до 0.9±0.1 при действии блокатора; 2) клетки | с более низкой чувствительностью, К которых, уменьшался от 3.0±0.1 до 2.1±0.1. Клетки в выделенных группах обладали разной чувствительностью к ЭМИ КВЧ: в первой группе клеток наблюдалось ингибирование ХЛ при действии ЭМИ КВЧ до 75±6%, на фоне блокатора до - 93±7%, что достоверно не отличалось от контроля (N=10, п=20). Во второй группе клеток облучение не было эффективным и не наблюдалось достоверного снижения уровня ХЛ по отношению к контролю: до 90±6% на фоне А23187 и до 90±7% на фоне блокатора (N=11, п=26)

120

12 3 4

3 4

Рис. 12. Влияние ЭМИКВЧна респираторный взрыв нейтрофилов на фоне блокатора ФЛА2.

Клетки инкубировали с блокатором ФЛА2 4-бромофенацил бромидом (10 цМ) в течение 2 мин, затем добавляли А23187 (5-8 мкМ) и облучали ЭМИ КВЧ (41.95 ГГц, непрерывная генерация, 150 мкВт/см2) при t=20°C в течение 20 мин. После прекращения облучения клетки помещали в регистрирующее устройство и регистрировали изменение XJI в ответ на ФМА (1 |j,M) при 37°С. (А) Влияние БФБ на продукцию АФК при последовательной активации А23187 и ФМА: 1 и 3 - без блокатора, 2 и 4 - в присутствии БФБ. (Б) Эффект ЭМИ КВЧ на продукцию АФК нейтрофилов при последовательной активации А23187 и ФМА: 1 и 3 - без блокатора, 2 и 4 - в присутствии БФБ.

Указано среднее значение+средняя квдратичная ошибка, для каждого столбика усреднены результаты 10 и более независимых экспериментов. * - достоверное отличие от контроля по уровню 95%.

Таким образом, блокатор ФЛА2 уменьшал продукцию АФК при активации нейтрофилов кальциевым ионофором А23187 и ФМА, и эффект ЭМИ КВЧ отсутствовал на фоне БФБ, блокатора ФЛА2.

Полученные результаты указывают на то, что ФЛА2 участвует в реализации эффектов ЭМИ КВЧ. Причем, действие ЭМИ КВЧ скорее всего проявляется при активном статусе ФЛА2 и зависит от уровня начальной активации данного фермента в клетке.

3.4.2. Модификация эффекта ЭМИ КВЧ при облучении нейтрофилов в присутствии проадифена, блокатора цитохрома Р-450,

Исследуя механизмы активации респираторного взрыва в ответ на ФМА, нейтрофилов, предварительно обработанных А23187 в концентрациях 0.5-10 цМ, мы показали, что ингибирование респираторного взрыва связано с активацией эпоксигеназного пути окисления АК. Мы предположили, что блокирующее действие ЭМИ КВЧ на респираторный взрыв нейтрофилов, активированных А23187 и ФМА может быть опосредовано образованием продуктов метаболизма АК по эпоксигеназному пути. Для проверки этого предположения мы использовали блокатор цитохрома Р-450, проадифен (10 дМ).

На рисунке 13А приведены зависимости интенсивности ХЛ нейтрофилов от времени при активации кальциевым ионофором А23187 (8 дМ) и ФМА (1 дМ) в контроле и после облучения ЭМИ. Видно, что проадифен "нормализует" продукцию АФК, т.е. приближает к максимальному значению, при действии ЭМИ КВЧ на фоне проадифена между облученными и необлученными нейтрофилами отличия нет (рис. 13 А, кривые 3 и 6).

На рисунке 13Б представлены диаграммы, на которых показано изменение эффекта ЭМИ КВЧ при использовании проадифена: на фоне блокатора нет достоверного отличия между облученными и необлученными клетками. В то время как в отсутствии блокатора при действии ЭМИ КВЧ, наблюдается достоверное ингибирование продукции АФК в ответ на ФМА (1 дМ) до 74±10%.

Таким образом, из приведенных результатов видно, что на фоне проадифена, блокатора ключевого фермента эпоксигеназного пути, ЭМИ КВЧ не эффективно. Это говорит о том, что в рассматриваемых условиях эффект ЭМИ КВЧ, возможно, реализуется с участием продуктов метаболизма АК по эпоксигеназному пути.

Рис. 13. Влияние ЭМИКВЧна продукцию АФК нейтрофилов, активированных А23187и ФМА на фоне проадифена.

А) Зависимость интенсивности ХЛ от времени: при активации ФМА интактных (1) и облученных ЭМИ КВЧ (4) клеток (1 рМ), при активации ФМА (1 цМ); необлученных (2) и облученных (5) клеток, предварительно обработанных А23187 (5-8 рМ); при активации ФМА (1 цМ) необлученных (3) и облученных ЭМИ КВЧ (6) клеток, предварительно обработанных проадифеном (10 рМ) и А23187 (5-8 рМ).

Б) Эффект ЭМИ КВЧ при последовательной активации клеток А23187 (5-8) рМ и ФМА (1 рМ):

1) - sham - контроль

2) - без блокатора,

3) - на фоне проадифена (10 р.М).

Для каждого столбика усреднены результаты 10-15 независимых экспериментов, указана средняя квадратичная ошибка. * - достоверные отличия по 95 %уровню

Глава 4. Обсуждение результатов.

Эффект ЭМИ КВЧ на нейтрофилы, зарегистрированный нами, наблюдался, в условиях высокой концентрации свободного кальция в цитозоле, что соответствовало активированному статусу Са2+-зависимых ферментов, при этом эффект отсутствовал на интактных клетках (рис. 10). Подобная ситуация описана в работе [25] при действии не клетки ЭМИ крайне низкой частоты. Предложенная модель активации респираторного взрыва нейтрофилов кальциевым ионофором А23187 в разных концентрациях и ФМА оказалась удобной для исследования взаимосвязи биологического действия ЭМИ КВЧ и функционального состояния клеток. Однако, для выяснения механизма действия ЭМИ КВЧ она требовала глубокого анализа и четкого определения условий.

При сравнении кальциевых ионофоров А23187, иономицина, А23187-4Вг в активации нейтрофилов мы обнаружили, что развитие усиленного ответа в среде, содержащей кальций обеспечивают только А23187 и иономицин, хотя все у исследованные ионофоры повышают [Са2+][дгг. Соответственно, к облучению ЭМИ КВЧ в большей или меньшей степени чувствительны клетки, обработанные А23187 или иономицином (рис. 3). Мы предположили, что А23187 и иономицин проявляют определенное сходство в механизмах увеличения [Са2+]цих в клетке, а также активации респираторного взрыва. Эксперименты показали, что существует зависимость между изменением [Са2+]цит и коэффициентом К, который отражает во сколько раз изменяет ответ на ФМА присутствие ионофора за указанный промежуток времени (рис. 2). Но увеличение [Са2+]цит не всегда вызывает усиление продукции АФК при последующей активации ФМА, как это видно в случае использования А23187-4Вг (рис. 4, 5). Отсутствие корреляции между [Са2+]цит и величиной коэффициента К в бескальциевой среде говорит о том, что для развития усиленного ответа нейтрофилов на ФМА, предварительно обработанных кальциевыми ионофорами иономицином или А23187, необходим вход внешнего Са2+. Это подвтерждают опыты на клетках с истощенными запасами Са2 \ Существование положительной и прямолинейной корреляции (К=0.8±0.15) между увеличением [Са2+]цит и усилением ФМА-ндуцированного респираторного взрыва при добавлении СаС12 в инкубационную среду (таблица 1) дают основание считать, что вход ионов Са2+ играет критическую роль в регуляции [Са2+]цит при использовании кальциевых ионофоров в качестве праймирующих агентов и последующей активации респираторного взрыва ФМА.

Наряду с входом Са2+ из экстраклеточной среды вклад в создание высокого уровня [Са2"1"]^ в клетке вносит и мобилизация из внутриклеточных депо (рис. 5), в частности, из Ин-1,4,5-Фз-чувсвительных депо [97-99]. Скорее всего, высокие концентрации кальциевых ионофоров вызывают опустошение внутриклеточных запасов. Об этом свидетельствует: во-первых, уменьшение Са2+-сигнала в бескалыдаевой среде при тех же концентрациях А23187 и иономицина, при которых происходит ингибирование респираторного взрыва в ответ на ФМА в среде с 1 мМ Са2+; во-вторых, в том случае, если изменение максимального уровня [Са^щп связано только с мобилизацией из внутриклеточных депо (А23187-4Вг), также происходит ингибирование респираторного взрыва в ответ на ФМА; в-третьих, в «истощенных» клетках мы не наблюдали ингибирования респираторного взрыва в ответ на ФМА при высоком уровне [Са2+]цит, который достигал 2246±50 нМ. Таким образом, внутриклеточные депо могут контролировать процесс инактивации респираторного взрыва. Показано, что рецепторы к Ин-1,4,5,-Фз чувствительны к концентрации ионов Са2+, полумаксимальное ингибирование наблюдается в присутствии 300 нМ Са2+ [64]. Связь между входом Са2+ и опустошением внутриклеточных депо может контролировать цитохром Р-450, который является основным компонентом эпоксигеназного пути окиления АК [137, 187-189].

По-видимому, активация респираторного взрыва кальциевым ионофором и ФМА представляет сложный процесс, который нельзя формально описать только увеличением [Са2+]цит. Изменение [Са2+]цит с одной стороны говорит об активности Са2+-зависимых систем, а с другой стороны, изменение [Са24"]^ служит регулятором активности этих систем. Из литературы известно, что для функциональной активности лейкоцитов большое значение имеет метаболизм ФЛА2 и арахидоновой кислоты [137]. По результатам наших экспериментов в случае предобработки нейтрофилов иономицином и А23187 (рис. 7) в развитии ответа нейтрофилов на ФМА значительную роль играет ФЛА2 и продукты ее метаболизма. Причем, А23187 в большей степени активирует ФЛА2, чем иономицин (рис. 7, 8). Активация ФЛА2 обеспечивается следующими процессами: входом внешнего Са2+ в присутствии А23187, что создает повышенный уровень [Са2+]цит в клетке в течение длительного времени; активацией форболовым эфиром ПКС, которая осуществляет положительную обратную связь на ФЛА2; образованием эндогенного ЛТВ4, который может выходить из клетки и, связываясь со специфическим рецептором, запускать каскад реакций по типу положительной обратной связи. Изменение функционального статуса нейтрофилов при действии разных концентраций кальциевого ионофора А23187 может быть связано с уровнем активности ФЛА2. В праймированных клетках, где не наблюдается усиленного ответа на ФМА, ионофор вызывал только кратковременное увеличение [Са2+]щгг, что было недостаточным для активации ФЛА2 [127]; в активированных клетках кратковременное повышение [Са2+]цит от 300 до 800 нМ и стационарный повышенный уровень [Са2+]щгг создают условия для активации ФЛА2 и образования продуктов ее метаболизма; в гиперактивированных клетках максимальный уровень [Са2+]цит составлял от 800 до 2500 нМ, что приводило к активации механизмов, вызывающих инактивацию респираторного взрыва. По нашим результатам, в этом процессе участвует активированная эпоксигеназная система метаболизма АХ: ингибирование проадифеном ключевого фермента этого пути цитохрома Р-450 устраняет инактивацию респираторного взрыва в ответ на ФМА нейтрофилов, предварительно обработанных высокими концентрациями А23187 (рис. 10). При исследовании вклада продуктов циклооксигеназы в активацию респираторного взрыва кальциевым ионофором и ФМА мы обнаружили, что они не влияют на продукцию АФК нейтрофилами при активации кальциевым ионофором и ФМА (рис. 7). Возможно, это связано, с тем, что нейтрофилы практически не синтезируют простагландины, метаболизм АК идет в основном по липоксигеназному пути с образованием соответствующих продуктов [190]. По нашим результатам ФЛС не является определяющей в развитии усиленной реакции нейтрофилов активированных кальциевым ионофором и ФМА (рис. 7). Это может быть следствием того, что на фоне ионофора дополнительная активация ПКС с помощью ФМА, приводит к тому, что ПКС осуществляет отрицательную обратную связь на ФЛС [161]. Возможно, что таким образом происходит инактивация ФЛС.

Следовательно, основную роль в развитии усиленного ответа при активации нейтрофилов кальциевым ионофором вносит ФЛА2, инактивация респираторного взрыва осуществляется с участием активированной эпоксигеназной системы окисления арахидоновой кислоты.

Облучение ЭМИ КВЧ интактных нейтрофилов не приводило к изменениям их реакции на активирующие воздействия. Ответы облученных нейтрофилов при активации респираторного взрыва ФМА, кальциевым ионофором А23187 или при их совместном действии достоверно не отличались от ответов необлученных клеток. Возможно, что в этих случаях активность ферментов, формирующих респираторный взрыв, поддерживается близкой к уровню активности в покоящихся нейтрофилах в течение облучения. При исследовании действия ЭМИ КВЧ на нейтрофилы, предварительно активированные А23187 в разных концентрациях, была получена зависимость эффекта ЭМИ КВЧ от концентрации кальциевого ионофора: в области низких (праймированные клетки) и средних (активированные клетки) концентраций мы не наблюдали достоверных различий ответов облученных и необлученных клеток (рис. 10). Низкие концентрации кальциевого ионофора в среде, содержащей кальций, обеспечивают быструю и непродолжительную мобилизацию кальция из внутриклеточных депо и не создают стационарный повышенный уровень [Са24"]^^ (рис. 4, 5). При стационарном высоком [Са2+]11ИТ создаются условия для активации ФЛА2, которая играет основную роль в развитии усиленного ответа при активации клеток А23187 и в меньшей степени иономицином. Вероятно, что это не единственная причина, по которой мы не наблюдали действия поля в диапазоне указанных концентраций. Так как мы используем форболовый эфир в высокой концентрации, то, дополнительная активация ПКС активирует обратную отрицательную связь на ФЛС [161]. Если действие поля обусловлено изменением активности ПКС, возможно, в данном случае эффект поля зависит от баланса положительных и отрицательных связей в клетке. Начиная с концентрации 5 рМ А23187 (гиперактивированные клетки), когда усиливается активность процессов, инактивирующих респираторный взрыв, мы наблюдали ингибирование продукции АФК при действии ЭМИ КВЧ (рис. 10, 11). На фоне проадифена, блокатора ключевого фермента эпоксигеназного пути окисления арахидоновой кислот цитохрома Р-450, происходила "нормализация" продукции АФК (рис. 13). ЭМИ КВЧ не было эффективно на фоне проадифена, возможно, что ингибирующее действие ЭМИ КВЧ вызвано активацией эпоксигеназного пути окисления АК.

Из рассчитанных коэффициентов корреляции (таблица 2) следует, что существует взаимосвязь между коэффициентом 1и [Са2+]цит. Коэффициент К является отражением активности Са2+- и ПКС-зависимых процессов, ведущих к активации респираторного взрыва. Известно, что активация ПКС является результатом увеличения внутриклеточной концентрации ДАТ или совместного увеличения [Са2+1ЦИТ и концентрации ДАГ. При интенсивном гидролизе фосфолипидов требуются более низкие концентрации Са2+ для активации фермента [161]. Тот факт, что равные значения К облученных и необлученных клетках достигаются при разных концентрациях А23187 (рис. 10), т. е при разном уровне (Са2+]цит, может указывать, что клетки различаются по уровню гидролиза фосфолипидов.

Отсутствие эффекта ЭМИ КВЧ в бескальциевой среде, возможно, связано с тем, что мобилизация Са2~ из внутриклеточных депо происходит за очень короткий промежуток времени, следовательно, и активация систем внутриклеточной сигнализации происходит за очень короткий период, судя по времени развития^ Са2+-сигнала в бескальцивой среде это время составляет до 6 мин (рис. 6), то есть, возможно, в остальное время ферменты в клетке находятся в состоянии^ близком к состоянию ферментов в покоящейся клетке. Как было показано в работе Е1с\уаЫ С. & \Valleczeck I. [12] к ЭМИ крайне низких частот более чувствительны активированные, а не покоящиеся клетки. ЭМИ КВЧ не эффективно также в случае облучения интактных клеток (пункт 3.3.1), а так же при облучении клеток на фоне низких концентраций кальциевого ионофора (рис. 10). Таким образом, данное утверждение справедливо и для ЭМИ КВЧ. В то же время одной из особенностей действия электромагнитного излучения является то, что биологический эффект ЭМИ КВЧ проявляется спустя некоторое время после начала облучения. Оптимальное время составляет обычно 15-20 мин [4].

Необходимость входа внешнего Са2+ для проявления эффекта ЭМИ КВЧ и выявленная роль ФЛА2 в усиленном ответе нейтрофилов на ФМА на фоне А23187 навела нас на мысль, что в реализации полученного эффекта ингибирования продукции АФК в области высоких концентраций А23187 участвует ФЛАо. Действительно, эффект ЭМИ КВЧ отсутствовал на фоне БФБ, блокатора фосфолипазы А2, что указывает на ее участие в полученном эффекте. Помимо этого, было обнаружено, что клетки, выделенные из разных животных отличаются по чувствительности к БФБ: в одной из групп блокатор был менее эффективен (рис.12). Соответственно, в той группе клеток, где блокатор слабо менял продукцию АФК нейтрофилов, активированных кальциевым ионофором А23187 и ФМА, облучение не было эффективным, поэтому мы предположили, что действие ЭМИ КВЧ, скорее всего проявляется при активном статусе ФЛА2 и зависит от уровня активации данного фермента в клетке. Это предположение подтверждается наличием , тенденции к ингибированию продукции АФК при облучении ЭМИ КВЧ нейтрофилов, предварительно обработанных иономицином, который по нашим результатам в меньшей степени активирует ФЛА2 (рис. 7, 8). Эффект БФБ на продукцию АФК клеток, активированных иономицин|ом примерно такой же как и на продукцию АФК клеток, активированных А23187, но не чувствительных к действию ЭМИ КВЧ. Возможно, слабый эффект ЭМИ КВЧ на клетки, активированные иономицином, связан с тем, что иономицин слабо активирует ФЛА2. В случае облучения нейтрофилов ЭМИ КВЧ на фоне А23187-4Вг мы тоже не наблюдали действия поля. Возможно, вследствие того, что изменение максимального уровня [Са2+]цит в присутствии А23187-4Вг связано только с мобилизацией Са2+ из внутриклеточных депо, происходит их постепенное опустошение, в этом случае наблюдается ингибирование респираторного взрыва в ответ на ФМА, т. е., возможно, А23187-4Вг активирует эпоксигеназную систему окисления АК, которая каким то образом контролирует заполнение внутриклеточных депо [187189].

Существование групп клеток может быть также связано с проявлением функциональной гетерогенности нейтрофилов. Давно замечено, что не все клетки одинаково участвуют в фагоцитозе; наряду с высокоактивными есть клетки, которые даже при длительной экспозиции не поглощают бактерии и другие частицы. То же самое происходит при агрегации: даже при длительном контакте с раздражителем в реакцию вступает лишь часть нейтрофилов. Показана неоднородность нейтрофилов по количественным и функциональным провлениям рецепции [56].

Таким образом, эффект ЭМИ КВЧ проявляется при активном статусе ФЛА2, которая активируется в условиях высокого стационарного уровня [Са2+]Щ1Х. Эффект зависит от уровня начальной активации этого фермента в клетке.

Выводы.

1. Исследованные кальциевые ионофоры повышают [Са2+]Щ1Т, с разной эффективностью, которая падает в ряду: иономицин, А23187, А23187 -4Вг. Для развития усиленного ответа клетки при активации ее кальциевым ионофором и ФМА необходим как вход внешнего кальция, так и мобилизация кальция из внутриклеточных депо, что обеспечивают иономицин и А23187.

2. В механизме активации респираторного взрыва нейтрофилов кальциевым ионофором и форболовым эфиром участвует фосфолипаза А2. В области высоких концентраций кальциевый ионофор А23187 активирует эпоксигеназный путь окисления АК, что приводит к снижению ответа клетки на ФМА.

3. К воздействию ЭМИ КВЧ чувствительны клетки, обработанные высокими концентрациями А23187, но не иономицином или А23187-4 Вг.

4. Эффект ЭМИ КВЧ проявляется только при активном статусе ФЛА2 и зависит от уровня начальной активации этого фермента в клетке.

5. Ингибирование цитохрома Р-450, ключевого фермента эпоксигеназного пути окисления АК, предотвращает развитие блокирующего эффекта ЭМИ КВЧ.

Литература.

1. Применение миллиметрового излучения низкой интенсивности в биологии и медицине. Сборник статей под ред. Н. Д. Девяткова, Москва. 1985, 284 с

2. Медико-биологические аспекты миллиметрового излучения. Сборник статей под. ред. Н. Д. Девяткова. Москва. 1987, 280 с.

3. Fröhlich Н. Theoretical physics and biology. In: Fröhlich H. (ed.) Biological coherence and response to external stimuli. Springer, Berlin Heidelberg New York, 1988, 1-24.

4. Девятков Н.Д., Бецкий O.B. Особенности взаимодействия миллиметрового излучения низкой интенсивности с биологическими объектами. В сб. статей под ред. Н. Д. Девяткова: Применение миллиметрового излучения низкой интенсивности в биологии и медицине. Москва. 1985, 284 с

5. Девятков Н.Д., Голант М.Б., Бецкий О.В. Миллиметровые волны и их роль в процессах жизнедеятельности. М.: Радио и связь, 1991, 168 с.

6. Новскова Т.А., Гайдук В.И., Ченская Т.Б., Эльянов Б.С. Использование модели ограниченных ротаторов для предсказания диэлектрических свойств простых полярных жидкостей. В сб. статей под ред. Н. Д. Девяткова: Применение миллиметрового излучения низкой интенсивности в биологии и медицине. Москва. 1985, 262-277.

7. Lednyiczky G., Osadchaya О., Buzasi Т. Statistical analysis of the endogenous electromagnetic field effects on the respiratory burst. In Abstr. Book of the «Third International Congress of the ЕВЕА», Nancy, February 29-March 3, 1996, 150.

8. Lednyiczky G., Osadchaya O. and Sakharov D. Electromagnetic field effects on the respiratory burst. BEMS Seventeenth Annual Meeting, June 18-22, 1995, 146.

9. Хоменко А.Г., Новикова JI.H., Каминская Т.О., Ефимова JI.H., Голант М.Б., Балаьсгырева JI.3., Гедымин JI.E. Оценка функционального статуса фагоцитов при выборе оптимального режима КВЧ -терапии у больных туберкулезом легких. В сб. докладов 10 Российского симп. " Миллиметровые волны в медицине и биологии", 24-26 апреля 1995, ИРЭ РАН, 13-15.

10. Гапеев А.Б., Чемерис Н.К., Фесенко Е.Е., Храмов Р.Н. Резонансные эффекты модулированного КВЧ поля низкой интенсивности. Изменение двигательной активности одноклеточных простейших Paramecium Caudatum-Биофизика, 1994, 39:74-82.

11. Гапеев А.Б., Сафронова В.Г., Чемерис Н.К., Фесенко Е.Е. Модификация активности перитонеальных нейтрофилов мыши при воздействии миллиметровых волн в ближней и дальней зонах излучателя. Биофизика, 1996, 41:205-219.

12. Eichwald С., Walleczek J. Activation-Dependent and Biphasic Electromagnetic Field Effects: Model Based on Cooperative Enzyme Kinetics in Cellular Signaling. Bioelectromagnetics, 1996, 17: 427-435.

13. Голант М.Б. Биологические и физические факторы, обусловливающие влияние монохроматических электромагнитных излучений миллиметрового диапазона малой мощности на жизнедеятельнось. В сб. статей под ред. Н. Д. Девяткова: Применение миллиметрового излучения низкой интенсивности в биологии и медицине. Москва. 1985, 21-37.

14. Вялов А. М. Клинико-гигиенические и экспериментальные данные о воздействии магнитных полей в условиях производства. В сб.: Влияние магниных полей на биологические объекты. Наука. 1971, 165 С.

15. Садчикова М. Н., Глотова X. В. Клиника, патогенез и исходы радиоволновой болезни. В кн. Труды лаб. электромагнитных полей радиочастотного института гигиены труда и профессиональных заболеваний АМН СССР. В. 4 1973. 43-48.

16. Лобанова Е. А., Гончарова А. В. Влияние ЭМП радиочастотных диапазонов 191 и 155 МГц на условнорефлекторную деятельность животных. В кн.: О биологическом действии электромагнитных полей радиочастот М.: НИИ гигиены труда и профзаболеваний АМН СССР, 1986. Вып.З С. 76-78.

17. Электромагнитное загрязнение окружающей среды и здоровье населения России, под. ред. Демина, М. 1997. 91 с.

18. Марки Д., Эйди Р., Розенстейн JT. В кн. Материалы 2-гоитогового симпозиума по проблеме окружающей Среды. США, 1977, 97-104.

19. Гапеев А.Б. Якушина B.C., Чемерис Н.К., Фесенко Е.Е. Модулированное ЭМИ КВЧ низкой интенсивности активирует или ингибирует респираторный взрыв нейгрофилов в зависимости от частоты модуляции. -Биофизика, 1997 (в печати)

20. Гапеев А.Б., Якушина B.C., Чемерис Н. К., Фесенко Е.Е. Модулированное ЭМИ КВЧ низкой интенсивности модифицирует активность клеток иммунной системы -нейтрофилов. I Международный симпозиум " Фундаментальные науки и альтернативная медицина". Тезисы докладов, сентябрь, 1997, 54-55.]

21. Khizhnyak Е.Р., Ziskin М.С. Heating patterns in biological tissue phantoms caused by millimeter wave electromagnetic irradiation. IEEE Trans. Biomed. Eng., 1994, 39: 865-873.

22. Гордон Д.С., Меркулова JI.M., Бочкарева А.Г. КВЧ-воздействие на моноаминный статус структур белой пульпы селезенки крыс. I Международный конгресс "Слабые и Сверхслабые Поля и излучения в Биологии и Медицине". Санкт-Петербург, 1997, 69.

23. Нао G., Guo L. The antioxidant action of mw on human erythrocyte. BEMS Seventeenth Annual Meeting, June 18-22, 1995, 220.

24. Walleczek J, Electromagnetic field effects on the cells of the immune system: the role of the calcium signaling. FASEB J., 1992, 6:3177-3185.

25. Walleczek J., Budinger T.F. Pulsed magnetic field effects on calcium signaling in lymphocytes: Dependence on cell status and field intensity.- FEBS Lett, 1992, 314:351-355.

26. Byus C.V., Lundak R.L., Fletcher R.M., Adey W.R., Alteration in protein kinase activity following exposure of cultered human lymphocytes to modulated microwave fields. Bioelectromagnetics, 1984, 5:341-351=

27. Somosy Z., Takats A., Horvath Gy., Thuroczy G. Effects of modulated microwave irradiation in the amount of cAMP and activity of its generating enzyme system on myrine intestinal mucoza. BEMS Seventeenth Annual Meeting, Boston, June 18-22, 1995, 112.

28. Дадали B.A., Павлова P.H., Баигук C.B., Тимофеева В.Б., Соколова Е.А., Смертина М.Н., Резункова О.П., Ахтырский Е.И. Влияние КВЧ излучения на ферменты антиоксидантной и антитоксической системы крови.- I Международный конгресс "Слабые и Сверхслабые Поля и излучения в Биологии и Медицине". Санкт-Петербург, 1997, 56.

29. Лунева И.О., Щуб., Рубин В.И., Мельникова Г.Я. Изменение лекарственной устойчивости кишечной палочки и стафилококка под действием миллиметрового излучения. Медико-биологические аспекты миллиметрового излучения: Сб. научных трудов. Ред. Девятков Н.Д., ИРЭ АН СССР, 1987, 104109.

30. Манойлов С.Е., Конев Ю.Е., Кондратьева В.Ф., Липин А.Л., Еремеева Н.П., Ионова Л.А. Изучение циклов развития дрожжей при облучении ЭМИ ММ диапазона и о некоторых соображениях по их биологическому действию. Медико-биологические аспекты миллиметрового излучения: Сб. научных трудов. Ред. Девятков Н.Д., ИРЭ АН СССР, 1987, 116-120.

31. Казаринов. К.Д. Биологические эффекты КВЧ-излучения низкой интесивности. Итоги науки и техники, М.,1990, ВИНИТИ, серия Биофизика, 27, 101 с.

32. Motzkin S., Birenbaum L., Rosenthal S. Nation. Radio. Sei. Meet. Bioelectromagnetics Symp. Progr. and Abst., 1979, 460.

33. Ильина C.A. Влияние миллиметрового излучения низкой интенсивности на свойства мембран изолированных эритроцитов и гемоглобина крови человека. Медико-биологические аспекты миллиметрового излучения: Сб. научных трудов. Ред. Девятков Н.Д., ИРЭ АН СССР, 1987, 149-169.

34. Девятков Н.Д., Бецкий О.В., Ильина С.А., Путвинский A.B. Влияние мм излучения низкой интенсивности на ионную проницамость мембран эритроцитов. Сб. научных трудов: Эффекты нетеплового воздействия миллиметрового излучения на биологические объекты, 1983, 78-96.

35. Olsert R. В., Belman S., Eisenbud М., Mumford W.W., Rabinowots J.R., The incrseased passive efflux of sodium and rubidium from rabbit erythrocytes by microwave radiation. Radiat. Res., 1980, 82:244-256.

36. Fihser M. Effect of radiation (2450 MHz) on the active and passive components of 24Na+ efflux from human erythrocytes. Radiat. Res., 1982, 92:411-422.

37. Cleary S.F. Cellular effect of electromagnetic radiation. IEEE Engeneering in Medicine and Biology Magazin, 1987, 6:26-30.

38. Liburdy R.P., Penn A. Microwave bioeffects in the erythrocytes are temperature dependent. Bioelectromagnetics, 1984, 5:283-291.

39. Liburdy R.P., Vanek P.F. Microwave and the cell membrane II. Temperature plasma and oxygen mediate microwave-induced membrane permeability in the erythrocytes. Radiat. Res., 1985, 102:190-205.

40. Liburdy R.P., Penn A. Microwave and cell membrane transport occur at the phase transition temperature. Ann. N.Y. Acad.Sci, 1985, 435: 302-305.

41. Liburdy R.P., Vanek P.F. Microwave and the cell membrane III. Protein shedding is oxigen and temperature dependent: Evidence for cation bridge involvment. Radiat. Res., 1987, 109:382-395.

42. Geletyuk V.I., Kazachenko V.N., Chemeris N.K., Fesenko E.E. Dual effects of microwaves on single Ca2+ - activated K+ channels in cultured kidney cells Vero-FEBS Lett., 1995, 359:85-88.

43. Balcavage W.X., Alvager Т., Swez J., Goff C.W., Fox M.T., Abdullyava S., King M.W. A mechanism for action of extremely low frequency electromagnetic fields on biological systems. Biochem. Biophis. Res. Commun. 1996, 222:374-378.

44. Liburdy R.P., Rowe A.W., Vanek P.F. Microwave and the cell membrane IV. Protein shedding in the human erythrocyte: quantitative analusis by high performance liquid chromatography. Radiat. Res., 1988, 114:500-514.

45. Liburdy R.P., Manincor D., Fingadj B. The influence of oscillating electromagnetic field on membrane bilaer systems with direct application to the controlled delivary of chemical agents. Proc. Symposium Royal Swedish. Acad. Sci. Mechanism of low-level ELF, Stockholm, 1989, may 25-27, 233.

46. Allis J.W., Sinha-Robinson B.L. MW radietion induced inhibition Na+/Ca2+-ATP-ase activity of human red cell membranes. Presented at 6th Annual Meeting of the BEMS Soc, Atlanta, CA, June 15-19, 1984.

47. Allis J.W., Sinha-Robinson B.L. Temperature - specific inhibition on human red cell Na+/Ca2+-ATP-ase by 2450 MHz microwave radiation. Bioelectromagnetics, 1987, 8:203-212.

48. Исмаилов Э.Ш. О влиянии сверхвысокочастотного электромагнитного облучения на электрофоретическую подвижность эритроцитов. Биофизика, 1977, 22:493-498.

49. Сигал B.JL, Осадчий П.В., Гусев А.Н. О механизме изменений электрофоретической подвижности эритроцитов при С ВЧ-облучении. Биофизика, 1977, 29:852-856.

50. Фоменко Б.С., Ким Ю.А., Акоев И.Г. Влияние ЭМИ радиочастотного диапазона на структурную организацию эритроцитарных мембран. Тезисы докладов симпозиума: "Механизмы биологического действия электромагнитных излучений", 1987, Пущино, ОНТИ НЦБИ.

51. Allis J.W., Sinha-Robinson B.L. Fluorescence depolarization studies of red cell membrane fluidity. The effect of exposure to 1 GHz microwave radiation. Bioelectromagnetics, 1981, 2:13-22.

52. Давыдов A.C. Биология и квантовая механика. Киев, "Наукова думка", 1979, 296 с.

53. Синицин Н.И., Петросян В.И., Елкин В.А., Девятков Н.Д., Гуляев Ю.В., Бецкий О.В. Особая роль системы "миллиметровые волны - водная среда" в природе. Биомедицинская радиоэлектроника, 1998, 1:15-23.

54. Засецкий Ю.А., Лященко А.К. Диэлектрическая проницаемость и поглощение водных расвтворов солей в миллиметровой области длин волн. 11 Российский симпозиум "Миллиметровые волны в медицине и биологии", Москва, 1997, 200-202.

55. Fesenko E.E., Geletyuk V.I., Kazachenko V.N., Chemeris N.K. Preliminary microwave irradiation of water solutions changes their channel-modifying activity. FEBS Lett., 1995, 366:49-52.

56. Маянский A.H., Маянский Д.Н. Очерки о нейтрофиле и макрофаге. "Наука", Новосибирск, 1989, 339 с.

57. Meuret G., Flinder Т.М. Neutrophil and monocyte kinetics in case of cyclic neutropenia. Blood, 1974, 43:565-571.

58. Shhneir J., Gall J.A., Carpe A.I., Boggs D.R. Factors influencing neutrophils retention on glass beads column. Scand. J. Haematol, 1977, 19:435-442.

59. Pryzwansky K.B., Kidao S., Merricks E.P Compartmentalization of PDE-4 and cAMF-Dependent Protein Kinase in Neutrophils and Macrophages During Phagocytosis. Cell Bioch. Bioph., 1998, 28:251-275.

60. Hoffstein S.I. Intra and extracellular secretion from PMN. In: Cell Biology of Inflammation, ed by Weissman N., 1980, 387-430.

61. Keiser H.D. The effect of lysosomal enzyme on extracellular substrate. In Biology of Inflammation, ed. Weissman N., 1980, 163-188.

63. Boggolini M. The neutrophil. In: Cell Biology of Inflamation, ed. by Weissmann., Elsevier/North Holland, New York, 1980, 163-188.

64. Авдонин П.В., Ткачук B.A. Рецепторы и внутриклеточный кальций М., Наука, 1994, 285 с. (

65. Petroski R.J., Becker E.L., Sha'afi R.I. Effect of the chemotactic peptide and cytochalasin В on the cellular level of calcium in rabbit neutrophils. FEBS Lett., 1963, 100:161-165.

66. Hoffstein S.T. Ultrastructural demonstration of calcium loss from local regions of the plasma membrane of surface stimulated human granulocytes. J. Immunol., 1979, 123: 1359-1402.

67. Cramer E.B., Gallin J.I., Localization of submembranous cations to the leading edge of human neutrophils during chemotaxis. J. Cell. Biol. 1979, 82: 369-375.

68. Schmid-Schonbein G.W., Shih Y.Y., Chen S. Morphometry of the human leukocytes. Blood, 1980, 56: 866-878.

69. Campbell A.K. Intracellular calcium:its universal role as regulator. 1983, Wiley Press: Chichester, New York.

70. Jackowski S., Petro K., Sha'afi R.I. A Ca2+-stimulated ATPase activity in rabbit neutrophil membranes. Biophys. Acta, 1979, 558: 348-354.

71. Schneider C., Mottola C., Romeo D., Calcium dependent adenosine triphosphate activity and plasma membrane phosphorylation in the human neutrophil. Biochem. J., 1979, 182:655-660.

72. Volpi M., Naccache P.H., Sha'afi R.I. Preparation of inside out vesicles from neutrophils capable of actively transporting calcium. Biochem. Biophiys. Res. Commun., 1982, 106:123-130.

73. Rickard J.E., Sheterline P. E. Evidence that phorbol ester interferes with stimulated Ca+ redistribution by activating Ca2+ efflux in neutrophil leukocytes. Biochem. J., 1985, 231:623-628.

74. Volpi M., Naccache P.H., Sha'afi R.I. Calcium transport in inside-out membrane vesicles prepared from rabbit neutrophils. J. Biol. Chem., 1983, 258:41534158.

75. Hallet M.B., Lloyds D. The Molecular and Ionic Signaling of Neutrophils. Chapman & Hall, Austin, Texas, U.S.A., 1997, 21 lp.

76. Downey G. P. Fukushima T., Fialkow L., Waddell T.K. Intracellular signaling in neutrophil priming and activation. Cell Biol, 1995, 6:345-356.

77. Sha'afi R.I. and Molski T.F.P. Activation of the neutrophil. Prog. Allergy, 1988, 42: 1-64.

78. Schiffmann E., Corcoran B.A., Wahl S.M. N-formylmethionyl peptides as chemoattractants for leucocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72:1059-1062.

79. Fernandez H.N., Henson P.M., Otani A. Chemotactic response to human C3a and C5a anaphylatoxins. I. Evaluation of C3a and C5a Leukotaxis in vitro and under stimulated in vivo conditions. J. Immunol., 1978, 120:109-115.

80. Thelen M., Dewald B., Baggolini M. Netrophil Signal Transduction and Activation of the Respiratory Burst., Physiol. Rev., 1993, 73:797-821.

81. Badwey J.A., Karnovsky M.L. Production of Superoxide by Phagocytic Leukocytes: A Paradigm for stimulus-Response Phenomena.- Current topics in cellular regulation, 1986, 28,:183-207.

82. Farago A., Nishizuka Y. Protein kinase C in transmembrane signaling. FEBS Lett., 1990, 268:350-354.

83. Nishizuka Y. Intracellular signaling by hydrolysis of phospholipids and activation of protein kinase C. Science, 1992, 258:607-614.

84. Bocckino S.B., Blackmore P.F., Wilson P.B., Ezton J.H. Phosphatidate accumulation in hormone- treated hepatocytes via a PLD mechanism. J. Biol. Chem.

1987, 262: 15309-15315.

85. Dennis E.A., Rhee S.G., Billah M.M., Hanmnun Y.A. Role of phospholipases in generating lipid second messengers in signal transduction. FASEB J., 1991, 5:2068-2077.

86. Tscharner V., Prod'hom V.B., Baggiolini M., Reuter H. Ion channels in human neutrophils activated by rise in free cytosolic calcium concentration. Nature (L.), 1986, 324:369-372.

87. Dewald B., Thelen M., Wymann M.P., Baggiolini M. Two transduction sequences are necessary for neutrophil activation by receptor agonists. J. Biol. Chem.,

1988, 263:16179-16184.

88. Di Virgilio F., Lew D.P., Pozzan T. Proteiiji kinase C activation of physiological processes in human neutrophils at vanishingly small cytosolic Ca2+ levels. Nature (L.), 1984, 310:691-693.

89. Grzeskowiak M., Delia Bianca V., Cassatella M.A., Rossi F. Complete dissociation between the activation of phosphoinositide turnover and of NADPH oxidase by fMLP in human neutrophils depleted of Ca2+ and primed by subthreshold doses of PMA. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1986, 135:785-794.

90. Rossi F.M., Grzeskowiak M., Delia Bianca V. Double stimulation with fMLP and con A restores the activation of the respiratory burst but not of the phosphoinositide turnover in Ca2+-depleted human neutrophils. A futher example of dissociation between stimulation of the NADPH oxidase and phosphoinositide turnover. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1986, 140:1-11.

91. Erdahl W.L., Chapman C.J., Taylor R.W., Pfeiffer D.R. Effects of pH Conditions on Ca2+ Transport Catalyzed by Ionophores A23187, 4-BrA23187, and lonomycin Suggest Problems with Common Applications of These Compounds in Biological Systems. Biophys J., 1995, 69:2350-2363

92. Erdahl W.L, Chapman C.J., Taylor R.W., Wang E., Pfeiffer D.R. Ionophore 4-BrA23187 Transports Zn2+ and Mn2+ with High Selectivity Over Ca2+. Biochemistry, 1996, 35:13817-13825.

93. Fasolato C. and Pozan T. Effect of Membrane Potential on Divalent Cation Transport Catalyzed by the «Electroneutral» Ionophores A23187 and ionomycin. J.Biol. Chem., 1989, 264:19630-19636.

94. Erdahl W.L, Chapman C.J., Taylor R.W., Wang E., Pfeiffer D.R. Ca2+ Transport Properties of Ionophores A23187, Ionomycin, and 4-BrA23187 in a Well Defined Model System. Biophys J., 1994, 66:1678-1693.

95. Di Virgilio F., Gomperts B.D. Cytosol Mg2+ modulates Ca2+ ionophore induced secretion from rabbit neutrophils. FEBS Lett, 1983, 163, 315-318.

96. Berridge M.J. CIFting through the evidence. Biochem. J., 1996, 314:10551056.

97. Дедкова E.H., Сигова A.A., Зинченко В.П. Механизм активирующего действия Са2+-ионофоров на интакгные клетки. Ионофор-резистентные клетки. Биол. мембраны. 1998. (в печати).

98. Morgan A.J., Jacob R. Ionomycine enhances Ca2f - infflux by stimulating store-regulated cation entry and not by a direct action at the plasma membrane. Biochem. J. 1994, 300:665-672.

99. .Gukovskaya A.S., Arias P.H., Petrunyaka V.V., Zinchenko V.P., Bezuglov V.V. Lipoxygenase inhibitors supress intracellular calcium rise induced by ionomycin in rat thymocytes. Cell Calcium., 1990, 11:539-546.

100. Serio K.J., Bacer J.R., Ring W.L., Riddick C.A., Bigby T.D. Leukotriene B4 costimulates 5-lipoxygenase activity in neutrophils via increased 5-lipoxygenase translocation. Am. J. Physiol. (Cell Physiol.), 1997, 41: 1329-1334.

101. Pouliot M., McDonald P.P. Krump E. Mancini A.J., McColl S.R., Weech P.K., Borgeat P. Colocalization of cytosolic phospholipase A2, 5-lipoxygenase, and 5-lipoxygenase-activating protein at the nuclear membrane of A23187-stimulated human neutrophils.-Eur.J.Biochem., 1996, 238:250-258.

102. Billah M.M., Anthes J.C. The regulation and cellular functions of phosphatidylcholin hydrolysis. Biochem. J., 1990, 269: 15309-15315.

103. Exton J. H. Signaling through phosphatidylcholine break-down. J.Biol. Chem., 1990, 265:1-4.

104. Rhee S.G., Suh P.-G., Ryu S.-H., Lee Y.S. Studies of inositol phospholipid-specific phospholipase C. Science, 1989, 244:546-550.

105. Meldrum E., Parker P.J., Carozzi A. The Ptdlns-PLC superfamily and Signal transduction. Biochim. Biophys. Acta, 1991, 1092: 49-71.

106. Rhee S.G., Choi K.D. Multiple forms of phospholipase C isozymes and their activation mechanisms. Adv. Second Messenger Phosphoprotein Res. 1992, 26:35-61.

107. Rhee S.G., Kim H., Suh P.-G., Choi W.C., Multiple forms of phosphoinositide-specific phospholipase C and different modes of activation. Biochem. Soc. Trans., 1991:337-341. ,

108. Crooke S.T., Bennet C.F., . Mammalian phosphoinositide-specific phospholipase C isoenzymes. Cell Calcium, 1989, 10:309-323.

109. Bairoch A., Cox J.A., EF-hand motifs in inositol phospholipid-specific phospholipase C. FEBS Lett., 1990, 269:454-456.

110. Cockroft S., Comperts B.D. Role of guanine nucleotide binding protein in the activation of polyphosphoinositide phosphodiesterase. Nature, 1985, 314:534-536.

111. Sommermeyer H., Behl B., Oberdisse E., Resch K. Effect of nucleotides on the activity of phospholipase C in rabbit thymus lymphocytes. Differences in assay using endogenous [3H] inositolprelabeled membranes of exogenous [3H] polyphosphoinositol 4,5-bisphosphate as substrate. J. Biol. Chem., 1989, 264:906-909.

112. Kikuchi A., Kozawa O., Kaibuchi K., Katada T. Ui M., Takai Y. Direct evidence for involvement of a guanine nucleotide-binding protein in chemotactic peptide-stimulated formation of inositol bisphosphate and trisphosphate in differentiated human leukemic (HL-60) cells. Reconstitution with Gi or G0 of the plasma membranes ADP-ribosylated by pertussis toxin. J. Biol. Chem., 1986, 261:11558-11562.

113. Ueda h., Yoshihara Y.,Misawa H., Fukushima N., Katada T., Takagi H., Saton M. The kyotopin (tyrosine-arginine) receptor and selective reconstraction with purified Gj, measured with GTPase and phospholipase C assays. J. Biol. Chem., 1989, 264:3732-3741.

114. Moriarty T.M., Gillio B., Carty D.J., Premont R.T., Landau E.M., Lyengar R. Subunits of GTP-binding proteins inhibit muscatinic receptor stimulatin of phospholipase C. Proc. Nat. Sci. USA. 1988, 85:8865-8869.

115. Moriarty T.M., Padrell E., Carty D.J., Omri G., Landau E.M., Lyengar R. G0 protein as signal transducer in the pertussis toxin-sensitive phosphatidylinositol pathway. Nature, 1990, 343:79-82.

116. Clark J.D., Lin L-L., Kriz R.W., Ramesha S.R., Sultzman L.A., Lin A.Y., Milona N., Knopf J.L. A Novel Arachidonic Acid-Selective Cytosolic PLA2 contains a Ca2+-Dependent Translocation Domain with Homology to PKC and GAP. Cell, 1991, 85:1043-1051. |

117. Dennis E.A. Phospholipase A2 Mechanism: Inhibition and Role in Arachidonic Acid Release. Drug Dev. Res., 1987, 10:205-220.

118. Tishfield A.J. A Reassessment of the Low Molecular Weight Phospholipase A2 gene Family in Mammals. J. Biol. Chem., 1997, 272:17247-17250.

119. Leslie C.C., Voelker D.R., Channon J. Y., Wall M.M., Zelarney P.T. Properties and purification of an arachidonyl-hydrolyzing phospholipase A2 from a macrophage cell line, RAW 264.7.Biochim. biophys.acta.1988, 963:476-492.

120. Yoshihara Y., Watanabe Y. Translocation of phospholipase A2 from cytosol to membranes in rat brain induced by calcium ions. Bichem. Biphys. Res. Commun., 1990, 250:1560-1563.

121. Takayama K, Kudo I., Kim D.K., Nagata K., Nozawa Y., Inoue K. Purification and characterization of human platelet phospholipase A2 which preferentially hydrolyzes an arachidonoyl residue. FEBS Lett., 1991, 282:326-330.

122. Gronich J.H., Bonventre J.V., Nemonoff R.A Purification of a high-molecular-mass form of phospholipase A2 from rat kidney activated at physiological Ca2+ concentration. Biochem. J., 1990, 271: 37-43.

123. Kramer R.M., Checani G.C., Deykin D. Stimulation of Ca2+-activated human platelet phospholipase A2 by diacylglycerol. Biochem. J., 1987, 248:779-783.

124. Kramer R.M., Robert E.F., Manetta J., Putam J.E. The Ca2+-sensitive Cytosolyc phospholipase A2 is 100 kDa protein in human monoblast U937 cells. J. Biol. Chem., 1991, 66:155-160.

125. Wijkander J., Gewert K, Svensson U., Hoist E., Sundler R. Multiple C-tenninal serine phosphorylation accompanies both protein kinase C-dependent and -independent activation of cytosolic 85 kDa phospholipase A2 in macrophages. Biochem. J., 325: 405-410.

126. Gewert K., Simdler R. Dexamethasone down-regulates the 85 kDa phospholipase Ai in mouse macrophages and suppresses its activation. Biochem. J., 307: 499-504.

127. Clark J.D., Milona N., Knopf J.D. Purification of 100-kDa cytosolic phospholipase A2 from humaiji monocytic cell line U973. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, 87:7708-7712.

128. Jesus B., Dennis E.A. Distinct roles in signal transduction for each of the pospholipase A2 enzymes present in P388Di macrophages. J. Biol. Chem., 1996, 271:6758-6765.

129. Glaser K.B., Mobilio D.,Chang J.Y., Senko N., Phospholipase A2 ensymes: regulation and inhibition. Trends. Pharmacol.Sci.,1993, 14:92-98.

130. Bomalaski J.S., Lawton P., Browning J.L. J. Immunol., 1991, 146:3904-3910.

131. Elsbach P., Weiss J. The bactericidal/permeability-increasing protein (BPI), a potent element in host-defense against gram-negative bacteria and lipopolysaccharide. Imniunobiology, 1993, 187:417-429.

132. Могу Н., Нага S., Mizushima Н., Kudo I., Inoue К. Extracellular PLA2 detected at inflamed sites in rats does not originate from platelets. Agents Actions, 1991, 32:266-269.

133. Vadas P., and Pruzanski W. Induction of group II phospholipase A2 expression and pathogenesis of the sepsis syndrome. Circ.Shock., 1993, 39:160-167.

134. Buchler M., Deller A., Malfertheiner P., Kleine H.O., Wiedeck H.W., Samtner M., Friess H., Nevalainen Т., Beger H.G. Serum phospholipase Aj in intensive care patients with peritonitis, multiple injury, and necrotizing pancreatitis. Klin. Wochenschr., 1989, 67: 217-221.

135. Murakami M., Kudo I., Suwa Y., Inoue K. Release of 14-kDa group-II phospholipase Aj from activated mast cells and its possible involvment in the regulation og the degradation process. Eur. J. Biochem., 1992, 209:257-265.

135a. Asaoka Y., Yoshida K., Nishizuka Y., Murakami M., Kudo I., Inoue K. Possible role of mammalian secretory group II phospholipase Ai in T-lymphocyte activation: implication in propagation of inflammatory reaction. Proc. Natl. Acad.Sci. USA, 1993, 90:716-719.

136. Fedarko M.R., Deems R.A., Mincey T.C., Dennis E.A. Chemical Modification of the Histidine Residue in Phospholipase Aj (Naja naja naja). J. Biol. Chem., 1977, 252:2405-2411.

137. Крутецкая З.И., Лебедев O.E. Арахидоновая кислота и ее продукты: пути образования и метаболизм в клетках. Цитология. 1993. 35:3-36.

138. Потапнев М.П. Цитокиновая сеть нейтрофилов при воспалении. Иммунология, 1995, 4: 34-40.

139. Громыхина Н. Ю., Козлов В. А. Простагландинзависимые механизмы синтеза и действия иммунорегуляторных факторов макрофагального и немакрофагального происхождения. Иммунология, 1996, 5:29-34.

140. Abe М., Matsuki Н., Domae М., Kuwata Н., Kudo I., Nakanishi Y., Нага N., Mitsuyama Т., Furukawa Т. Lung cancer cell lines inhibit leukotriene B4 production by human polymorphonuclear leukocytes at the level of phosholipase Ai. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 1996, 15:65-573.

141. Baggiolini M., Dewald B., Thelen M. Effects of PAF on neutrophils and mononuclear phagocytes. Prog. Biochem. Pharmacol., 1988, 90-105.

142. Aderem A.A., Rosen A., Barker K.A. Modulation of prostaglandin and leukotriene biosynthesis. Curr.Opin.Immunol., 1988, 1: 56-62.

143. Dahinden C.A., Zingg J., Maly F.E., de Week A.L. Leukotriene production in human neutrophils primed by recombinant human granulocyte/macrophage colony-stimulating factor and stimulated with the complement component C5A and FMLP as second signals. J. Exp. Med. 1988, 167:1281-1295.

144. Dipersio J.F., Billing P., Williams R., Gasson J.C. Human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor and other cytokines prime human neutrophils for enhanced arachidonic acid release and leukotriene B4 synthesis. J. Immunol., 1988, 140: 4315-4322.

145. Powell W.S., Gravelle F. Metabolism of arachidonic acid by peripheral and elicited rat polymorphonuclear leukocytes. Formation of 18- and 19-oxygenated dihydro metabolites of leukotriene B4. J. Biol. Chem., 1990, 265:9131-9139.

146. Prescott S.M., Zimmerman G.A., Mclntyre T.M. Platelet-activating factor. J. Biol. Chem., 1990, 265:17381-17384.

147. Snyder F. Platelet-activating factor and related acetylated lipids as potent biologically active cellular mediators. Am. J. Physiol., 1990, 259:697-708.

148. Kownatiki E., S. Uhrich. Production of superoxide anion and hydrogen peroxide by human neutrophilic granulocytes during chemotactic migration toward f-Met-Leu-Phe, C5a, leukotriene B4, monocyte-derived chemotaxin/IL-8 and platelet activating factor. Int. Arch. Allergy Appl. Immunol, 1990, 93:344-349.

149. Verghese M.V. Chemoattractant-elicited alterations of cAMF levels in human polymorphonuclear leukocytes require a Ca2+-dependent mechanism which is in dependent of transmembrane activation of adenylate cyclase. J. Biol. Chem., 1985, 260:6769-6775.

150. Sherman J.W., Coetzl E.J., Koo C.H. Selective modulation by guanine nucleotides of the high affinity subset of plasma membrane rceptors for leukotriene B4, 011 human polymorphonuclear leukocytes. J. Immunol., 1988, 140:3900-3904.

151. Snyderman R., Pike M.C. Chemoattractant receptors on macrophages exists in two affinity states regulated by guanine nucleotides. J.Cell.Biol., 1984, 98: 444-448.

152. Balsinde J.E., Diez A., Fernandez B., Mollinedo F. Biochemical characterization of phospholipase D activity from human neutrophils. Eur. J. Biochem., 1989, 186:717-724.

153. Bonser R.W., Thompson N.T., Randal R.W., Garland L.G. Phospholipase D activation is functionally linked to superoxide generation in the human neutrophils. Biochem. J., 1989, 264: 617-620.

154. Reinhold S.L., Prescott S.M., Zimmerman G.A., Mclntyre T.M. Activation of human neutrophil phospholipase D by three separable mechanisms. FASEB J., 1990, 4: 208-214.

155. Bell R.M., Burns N.M. Lipid activation of proteinkinase C. J. Biol. Chem., 1991, 266:4661-4664.

156. Huang C.-K. Protein kinases in neutrophils: a review. Membr. Biochem., 1990, 8: 61-79.

157. Huang C.-K., Huang F.L., Nakebayshi H., Yoshida Y., Roles protein kinase C isozymes in cellular regulation. Adv. Exp. Biol., 1990, 255:431-436.

158. Tauber A.I., Protein kinase C and the activation of the human neutrophil NADPH-oxidase. Blood, 1987, 69:711-720.

159. ^saoka Y., Nakamura S., Yoshida K., Nishizuka Y. Protein kinase C and phospholipid degradation. TIBS, 268:1992, 414-417.

160. Farago A., Nishizuka Y. Protein kinase C in transmembrane signalling. FEBS Lett., 1990, 268:350-354.

161. Nishizuka Y. The role of protein kinase C in cell surface signal transduction and tumour promotion. Nature, 1984, 308:693-698.

162. Newton A.C. Protein kinase C: ports of anchor in the cell. Current Biology, 1996, 6:806-809.

163. Axelrod J. Receptor-mediated activation of phospholipase Ai and arachidonic acid release in signal transduction. Biochem. Soc.Trans., 1990, 18: 503-508.

164. Benna J.E., Labro M.T. Resolution of major protein kinase substrates in neutrophil cytosol in response to DAG/PS and arachidonic acid stimulation and the selective action of various protein kinase inhibitors. Cell Sign., 1994, 6: 167-171.

165. Rosen A.K., Keeman F., Thelen M., Narin A.C., Aderem A. Activation of protein kinase C results in the replacement of its myristoylated, alanin-rich substrate from punctate structures in macrophage philopodia. J. Exp. Med., 1990, 172:12111215.

166. Benna J.E., Faust L.P., Babior B.M. The phosphorylation of the respiratory burst oxidase component p47phox during neutrophil activation J. Biolog. Chem., 1994, 269: 13539-13545.

167. Nauseef W.M. Assembly of the neutrophil respiratory burst oxidase. J. Biol. Chem., 1991, 266: 5911-5917.

168. Ding J., Badney J.A. Stimulation of neutrophils with a chemoattractant activates several novel protein kinase that can catalaze the phosphorylation of peptides derived from the 47 kDa protein component of the phagocyte oxidase and MARCKS. J.Biol.Chem., 1993, 268:17326-17333.

169. Dewald B., Thelen M., Wymann M.P., Baggiolini M. Staurosporine inhibits the respiratory burst and induces the exocytosis in human neutrophils. Biochem. J., 1989, 264:879-884. 170. Fialkow L., Chan C.K. Regulation of tirosine phosphorylation in neutrophils by the NADPH oxidase. J. Biolog. Chem., 1993, 268:17131-17135.

171. Baldrige C.W., Gerard R.W. The extra respiration of phagocytosis. Am. J. Physiol, 1933, 103:235-236.

172. Gabid T:G. The 02-forming oxidaze responsible for the respiratory burst in human neutrophils. J. Biol. Chem., 1979, 254: 9070-9074.

173. McPhail L.C., Clayton C.C. The NADPH oxidase of human polymorphornuclear leukocytes. J.Biol.Chem., 1984, 259:5768-5775.

174. Woodman R.C., Ruedi J.M., Jesaitis A.J., Okamura N. Respiratory burst oxidase and three of four oxidase-related polypeptides are associated with the cytoskeleton of human neutrophils. J. Clin. Invest., 1991, 87:1345-1351.

175. Umeki S. Mechanism for the activation electron transfer of neutrophil NADPH oxidase complex and molecular pathology of chronic granulomotous disease. Ann. Hematol., 1994, 68: 267-277.

176. Arora D.J.S., Henrichon M. Superoxide anion production in influenza protein-activated NADPH oxidase of human polymorphonuclear leukocytes. J. Infect. Dis., 1994, 169: 1129-1133.

177. Ge Feng, Guillory R.J. Identification of the NADPH-binding protein of the neutrophil superoxide-generating oxidase of guinea pigs. Biotechnol. Appl. Biochem., 1994, 19: 111-128.

178. Powell W.S., Gravelle F., Gravelle S. Phorbol myristate acetate stimulates the formation of 5-oxo-6,8,ll,14-eicosatetraenoic acid by human neutrophils by activating NADPH oxidase. J. Biol. Chein., 1994, 269:25373-25380.

179. Umeki S. Activation factors of neutrophil NADPH* oxidase complex. Life Sci., 1994, 55:1-13.

180. Curnutte J.T. Activation of the respiratory burst oxidase in a fully soluble system from human neutrophils. J.Biol.Chem., 1987, 262: 6450-6452.

181. Castranova V., Van Scot M.R., Van Dyke K. Isolation and identification of phagocytic cells. In: Van Dyke K., Castranova V. (eds) Cellular chemiluminescence. Boca Ration, FL: CRC Press, 1987, 1: 25-38.

182. Kitchen E., Rossi A.G., Condliff A.M., Haslett C., Chilvers E.R. Demonstration of reversible priming of human neutrophils using platelet-activating factor. Blood, 1996, 88:4330-4337.

183. Grynkiewicz G., Poeni M., Tsien R.Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. J. Biol. Chem.,1985, 260:3440-3450.

184. Владимиров Ю.А., Шерстнев М.П. Хемилюминисценция клеток животных. Итоги науки и техникию М. .ВИНИТИ, 1989, 24, 176 с.

185. Lehmann В. Hubner С., Jacobi Н., Kampf A., Wozel G. Effects of dietary y-linolenic acid-enriched evening primrose seed oil on the 5-lipoxygenase pathway of neutrophil leukocytes in patients with atopic dermatitis. J. of Dermatological Treatments, 1995, 6:211-218.

186. Dana R., Malech H.L., Levy R. The requirement ror phospholipase A2 for activation of the assembled NADPH oxidase in human nutrophils. Biochem J., 1994, 297:217-223.

187. Alvares J., Montero M., Garcia-Sancho J. Cytichom P-450 may regulate plasma membrane Ca2+ permeability according to the filling state of the intracellular Ca2+ stores. FASEB J., 1992,6:786-792.

188. Montero M., Alvares J., Garcia-Sancho J. Control of the intracellular Ca2+ stores. Kinetic evidence for a short-lived mediator. Biochem J., 1992, 288: 519-525.

189. Montero M., Alvares J., Garcia-Sancho J. Agonist-induced Ca2+ influx in human neutrophils is the secondary to the empting of intracellular calcium stores. Biochem. J., 1991, 277: 73-79.

190. Долматова Jl.С., Ромашина В.В., Коновец М.О., Оксидантная и

Ц/ антиоксидантная системы нейтрофилов периферической крови человека при действии морфина in vitro. Иммунология, 1997, 5:30-32.

Я выражаю искреннюю благодарность "группе поддержки" в "марафонском беге", именуемом кандидатская диссертация:

Валентине Григорьевне Сафроновой - за чуткое, разумное, терпеливое руководство;

Николаю Константиновичу Чемерису - за ответственное отношение к своему делу;

Корневу Алексею Николаевичу - за моральную и "материальную" поддержку;

Санталову Борису Федоровичу - за техническую поддержку и ласковое отношение;

Аиде Габдулхаковой и Лене Дедковой - за добрую помощь, взаимовыручку и интересное сотруденичество;

Кириллу Кочеткову, Гапееву Андрею, Асланиди Олегу - за помощь в освоении компьютеров и технических знаний в целом;

Байдаровой Ирине - за внимательное отношение, а так же всем остальным участникам: Владимиру Николаевичу Казаченко, Екатерине Анатольевне Вульфиус, Игорю Викторовичу Кратцу, Валерию Петровичу Зинченко - за "углубление" и расширение научного кругозора, за внимание и помощь в любых стуациях.