Исследование роли рибосомных белков L5 и L25 в формировании функционально-активной бактериальной рибосомы тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.03, кандидат биологических наук Коробейникова, Анна Васильевна

• Коробейникова, Анна Васильевна
• кандидат биологических наук
• 2011

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Коробейникова, Анна Васильевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.Ю

1. Рибосомные белки: свойства, структура и эволюция.

1.1. Рибосомные белки трех доменов жизни: разнообразие, сходство и различия.

1.2. Структурные особенности рибосомных белков, отражающие их свойства.

2. Роль белков в сборке функционально-активной рибосомы.

2.1. Сборка малой субчастицы рибосомы.

2.2. Сборка большой субчастицы рибосомы.

2.3. Участие белков в ассоциации рибосомных субчастиц.

3. Участие белков в формировании функциональных центров рибосомы.

3.1. Элонгационный цикл и функциональные центры рибосомы.

3.2. Связывание мРНК.

3.3. Декодирующий центр.

3.4. Пептидилтрансферазный центр.

3.5. тРНК-связывагцие участки.

3.5.1. А-участок.

3.5.2. Р-участок.

3.2.3. Е-участок.

3. б. Участок связывания белковых факторов трансляции.

ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

1. Материалы и приборы.

1.1. Химические реактивы и ферменты.

1.2. Микробиологические среды.

1.3. Штаммы и плазмиды.

1.4. Буферы.

1.5. Принадлежности.

1.6. Приборы.<

2. Методы генной инженерии, молекулярной генетики и микробиологии.

2.1. Общие методы.

2.1.1. Выделение хромосомной ДНК.

2.1.2. Полимеразная цепная реакция.

2.1.3. Обработка ДНК сайт-специфическими эндонуклеазами.;.

2.1.4. Дотирование ДНК.

2.1.5. Получение компетентных клеток Е. coli и их трансформация методом теплового шока.

2.1.6. Анализ бактериальных колоний на наличие рекомбинантной плазмиды.

2.1.7. Выделение плазмидной ДНК.

2.1.8. Осуществление замен в хромосомной ДНК Е. coli с помощью метода «recombineering».

2.1.9. Общая трансдукция бактериофагом PI.

2.1.10. Определение времени удвоения клеток Е. coli.

2.1.11. ß-галактозидазный тест.

2.2. Клонирование и секвенирование генов исследуемых РНК, белков и их мутантных форм.76>

2.2.1. Секвенирование фрагмента хромосомной ДНК A. aeolicus.

2.2.2. Клонирование гена 5S рРНК и его фрагментов.

2.2.3. Клонирование генов белков СТС А. aeolicus, E.faecalis и Nostoc sp.

2.2.4. Направленный мутагенез N-концевого домена белка TL5 Т. thermophilic.

2.2.5. Направленный мутагенез белков L5 и L25 Е. coli.

2.3. Экспрессия генов исследуемых белков в клетках Е. coli.

2.4. Создание штаммов Е. coli для исследований и работа с ними.

2.4.1. Создание штаммов Е. coli, содержащих в хромосоме мутантную форму гена исследуемого белка.

2.4.2. Получение клеток Е. coli, дефицитных по рибосомному белку L5.

3. Биохимические методы.

3.1. Электрофоретические методы анализа нуклеиновых кислот, белков и РНКбелковых комплексов.

3.2. Выделение и очистка исследуемых белков из штаммов-продуцентов Е. coli.

3.3. Получение препаратов исследуемых РНК.

3.3.1. Выделение 5S рРНК Е. coli.

3.3.2. Синтез 5S рРНК и ее фрагментов транскрипцией in vitro и их очистка.

3.3.3. Подготовка образцов РНК к экспериментам.

3.3.4. Фракционирование клеточных РЕК Е. coli.

3.4. Методы исследования РНК-белковых комплексов.

3.5. Выделение и анализ препаратов рибосом и рибосомных субчастгщ.

3.5.1. Выделение рибосом и рибосомных субчастиц из клетбк Е. coli.

3.5.2. Анализ препаратов рибосом и рибосомных субчастиц центрифугированием в градиенте плотности сахарозы.

3.6. Методы исследования функциональной активности рибосом in vitro.

3.6.1. Получение тотальной ферментной фракции из клеток Е. coli.

3.6.2. Трансляция полиуридиловой матрицы.

3.6.3. Трансляция мРНК лзоциферазы в бесклеточной системе из Е. coli.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Изучение специфического взаимодействия рибосомного белка L25 Escherichia coli и его гомологов (белков семейства СТС) с 5S рРНК.

1.1. Белок СТС Aquifex aeolicus не является исключением среди белков семейства.

1.2. Роль отдельных аминокислотных остатков белков L25 и TL5 в формировании и стабилизации их комплекса с 5SpPHK.

1.3. РНК-связывающие свойства белков СТС с природными заменами в их 5SрРНКсвязывающем модуле.

2. Необходимость взаимодействия бежа L25 с 5S рРНК для его встраивания в рибосому in vivo.

3. Исследование роли рибосомного белка L5 в сборке и функционировании рибосомы Escherichia coli.

3.1. Получение и характеристика больших рибосомных субчастгщ, собранных in vivo в отсутствие белка L5.

3.2. Влияние мутаций в петле ß2-ß3 белка L5 на синтез рибосомами полипептида. in vivo и in vitro.

ВЫВОДЫ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Исследование роли рибосомных белков L5 и L25 в формировании функционально-активной бактериальной рибосомы»

В клетках всех живых организмов белки синтезируются на рибосоме. ' Исследование структуры, функции и эволюции рибосомы интенсивно ведутся с 50* гг. XX века. За этот период накоплен огромный экспериментальный материал о структуре рибосомы и ее компонентов, а также о принципах ее функционирования. Однако, несмотря на это, остается еще много нерешенньгс вопросов относительно деталей протекания отдельных стадий трансляции и роли компонентов рибосомы в этом процессе. Кроме того, несмотря на недавние успехи в определении пространственной структуры рибосомы, далеко не все ясно относительно принципов специфического взаимодействия РНК и белков, лежащих в основе ее структурной организации. Об этом свидетельствует то, что количество работ, посвященных рибосоме, только возрастает. Кроме того, большая часть имеющихся на сегодняшний день данных получена в экспериментах in vitro, которые далеко не всегда могут адекватно отражать процессы, происходящие в клетке.

Рибосомы ныне живущих организмов состоят из двух неравных субьединиц (малой и большой). Одной из самых характерных морфологических особенностей большой рибосомной субчастицы любого организма является центральный протуберанец. Известно, что центральный протуберанец участвует в ассоциации рибосомных субчастиц (Lake, 1976), а у его основания расположены пептидилтрансферазный центр и тРШС-связывающие участки рибосомы (Barta et al., 1984; Moazed & Noller, 1989; Yusupov et al., 2001; Nissen et al, 2000; Selmer et al., 2006). Большую часть этого структурного элемента рибосомы формирует комплекс 5S рРНК и нескольких специфически связывающихся с ней рибосомных белков. В экспериментах in vitro было показано, что в отсутствие 5S рРНК-белкового комплекса собирается функционально неактивная большая субчастица рибосомы (Erdmann et al., 1971; Dohtne & Nierhaus, 1976b). Однако прямых данных о том, для чего нужен этот комплекс в рибосоме, до сих пор нет. Количество белков, специфически связывающихся с 5S рРНК, варьирует в разных организмах. В Escherichia coli - это три белка, L5, L18 и L25. Белки L5 и L18 обнаружены в рибосомах представителей всех доменов жизни, Бактерий, Архей и Эукариот (Gasteiger et al., 2003; Benson et al., 2008). В то же время, рибосомный белок L25 является особенностью бактерий — ген этого белка не обнаружен в известных геномах архей и эукариот. Недавно было продемонстрировано, что белки L5 и LI8 строго необходимы для выживания бактериальной клетки Е. coli (Korepanov et al., 2007). В то же время, при нокауте гена белка L25 клетки выживали, но росли медленнее, чем клетки исходного штамма, а Ь25-дефицитные рибосомы отличались сниженной эффективностью в синтезе природных полипептидов. Таким образом, все имеющиеся данные указывали на то, что 5S рРНК-связывающиеся белки чрезвычайно важны для функционирования бактериальной рибосомы. Однако их конкретная роль в формировании рибосомы в клетке оставалась невыясненной. В связи с этим, в рамках данной работы были проведены исследования, посвященные выяснению роли рибосомных белков L5 и L25 в сборке и функционировании рибосомы Е. coli.

В первой части работы были проведены детальные исследования особенностей взаимодействия 5S рРНК с белком L25 Е. coli и его гомологом, рибосомным белком TL5 Thermus thermophilic. Для этого был осуществлен направленный мутагенез аминокислотных остатков этих белков, образующих водородные связи с РНК в комплексе. Было установлено, что пять идентичных остатков в белках L25 и TL5, формирующих их 5S рРНК-связывающий модуль, чрезвычайно важны для стабилизации уже сформированного РНК-белкового комплекса. Выявленные принципы взаимодействия этих белков с изолированной 5S рРНК позволили перейти к изучению данного взаимодействия в системе in vivo. Для этого был создан ряд штаммов Е. coli, содержащих мутантную форму белка L25, лишенную способности связываться с 5S рРНК in vitro. Были изучены ростовые характеристики клеток указанных штаммов, а также эффективность встраивания мутантной формы белка L25 в рибосому in vivo. Полученные данные впервые демонстрируют необходимость образования прочного контакта между белком L25 и 5S рРНК для удержания данного белка в рибосоме, а таюке для стабильной ассоциации рибосомных субчастиц.

Во второй части работы было проверено, какой эффект на сборку большой рибосомной субчастицы оказывает отсутствие жизненно важного рибосомного белка L5 в клетках Е. coli. Впервые были получены и охарактеризованы большие рибосомные субчастицы, собранные in vivo в отсутствие этого белка. Установлено, что такие субчастицы лишены большей части компонентов ее центрального протуберанца. Кроме того, в данной работе было исследовано влияние мутаций в контактирующей с тРНК в петле ß2-ß3 белка L5 на функциональные свойства рибосом. Было показано, что в отличие от замены отдельных аминокислотных остатков делеция сразу нескольких остатков в указанной петле белка приводит к снижению эффективности функционирования рибосомы Е. coli и, как следствие, замедлению роста клеток этой бактерии.

Полученные результаты и методы, изложенные в работе, могут быть использованы не только при изучении рибосомы и ее компонентов, но и в других областях молекулярной биологии при структурно-функциональных исследованиях комплексов нуклеиновых кислот с белками.

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Коробейникова, Анна Васильевна

ВЫВОДЫ

1. Из результатов комплексных исследований 5S рРНК-связывающих свойств рибосомного белка L25 Escherichia coli и его гомолога, белка TL5 Thermus thermophilus, следует, что:

• пять аминокислотных остатков - R10/9, R19/21, Y29/31, Н85/88, D87/90 в TL5/L25, формирующих РНК-связывающий модуль этих белков, чрезвычайно важны для стабилизации их комплекса с изолированной 5S рРНК;

• формирование прочного контакта между белком L25 и 5S рРНК не является обязательным условием для встраивания этого белка в рибосому in vivo. В то же время, этот межмолекулярный контакт необходим для прочного удержания белка L25 в рибосоме и стабильной ассоциации рибосомных субчастиц.

2. Доказано, что немногочисленные случаи одновременных природных изменений в контактирующих областях белка семейства СТС и 5S рРНК представителей класса Bacilli и типа Cyanobacteria имеют компенсаторный характер и направлены на сохранение этими молекулами способности формировать стабильный комплекс.

3. Установлено, что белок СТС Aquifex aeolicus обладает полноразмерным 5S рРНК-связывающим доменом и, таким образом, не является исключением среди белков данного семейства.

4. Впервые показано, что рибосомный белок L5 Е. coli строго необходим для встраивания 5S рРНК-белкового комплекса, а также белков L16, L27, L30 и L33 в большую субчастицу рибосомы in vivo. Из полученных данных следует, что белок L5 прямо или опосредованно влияет на формирование целого структурно-функционального домена (центрального протуберанца) бактериальной рибосомы.

5. Показано, что рибосомы Е. coli, содержащие белок L5 с укороченной петлей р2-рЗ, менее эффективно синтезируют природные полипептиды. Сниженная функциональная активность данных рибосом не связана с увеличением частоты ошибок трансляции.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Коробейникова, Анна Васильевна, 2011 год

1. Бушуев, В.Н., Окон, М.С., Гудков, А.Т., Туманова, Л.Г., Гонгадзе, Г.М. Спектры 'Н-ЯМР белков большой субчастицы рибосом Escherichia coli // Препринт. — Пущино. — 1982.-Р.1-39.

2. Гаврилова, Л.П., Смолянинов, В.В. Изучение механизма транслокации в рибосомах. I. Синтез полифенилаланина в рибосомах Escherichia coli без участия гуанозин-51-трифосфата и белковых факторов трансляции // Мол. Биология. — 1971. — Т. 5. — С.883-891.

3. Гонгадзе, Г.М. Исследование дефицитных по белкам рибосомных 50S субчастиц Escherichia coli. Роль белков и РНК в формировании рибосомной субчастицы // Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук. 1986. — Пущино.

4. Гонгадзе, Г.М., Корепанов, А.П., Коробейникова, А.В., Гарбер, М.Б. Бактериальные 5S рРНК-связывающие белки семейства СТС //Успехи Биолог. Химии. 2008. -Т.48.- С.105-132.

5. Корепанов, А.П., Гонгадзе, Г.М., Гарбер, М.Б. Основной стрессовый белок СТС Bacillus subtilis специфически связывается с рибосомной 5S РНК // Биохимия. — 2004.- Т.69. С.749-754.

6. Коробейникова, А.В., Гонгадзе, Г.М., Корепанов, А.П., Елисеев, Б.Д., Баженова, М.В., Гарбер М.Б. 5S рРНК-узнающий модуль белков семейства СТС и его эволюция // Биохимия. 2008. - Т.73. - С. 193-201.

7. Седельнпкова, С.Э. Рибосомные белки Thermus thermophilus. Выделение, физико-химические свойства и кристаллизация // Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук. — 1991. — Пущино.

8. Сердюк, И.Н., Агаларов, СЛ., Гонгадзе, Г.М., Гудков, А.Т., Седельникова, С.Э., Май, Р., Спирин, А.С. О форме и компактности рибосомных РНК и их комплексов с белками в растворе // Мол. Биология. — 1984. Т. 18. - С.244-261.

9. Abdurashidova, G.G., Tsvetkova, Е.А., Budowsky, E.I. Direct tRNA-protein interactions in ribosomal complexes // Nucl. Acids Res. 1991. - V. 19. - P. 1909-1915.

10. Adilakshmi, Т., Ramaswamy, P., Woodson, S.A. Protein-independent folding pathway of the 16S rRNA 5' domain // J. Mol. Biol. 2005. - V.351. - P.508-519.

11. Agrawal, R.K., Penczek, P., Grassucci, R.A. Frank, J. Visualization of elongation factor G on the Escherichia coli 70S ribosome: the mechanism of translocation // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. - V.95. - P.6134-6138.

12. Al-Karadaghi, S., Kristensen, O., Liljas, A. A decade of progress in understanding the structural basis of protein synthesis // Prog. Biophys. Mol. Biol. — 2000. V.73. - P.167-193.

13. Allers, J., Shamoo, Y. Structure-based analysis of protein-RNA interactions using the program ENTANGLE // J. Mol. Biol. 2001. - V.311. - P.75-86.

14. Ansley, S.B., Campbell, L.L., Sypherd, P.S. Isolation and amino acid composition of ribosomal proteins from Bacillus stearothermophilus // J. Bacteriol. 1969. - V.98. - P.568-572.

15. Arndt, E., Scholzen, T., Kromer, W., Hatakeyama, T., Kimura, M. Primary structures of ribosomal proteins from the archaebacterium Halobacterium marismortui and the eubacterium Bacillus stearothermophilus // Biochimie. — 1991. — V.73. P.657-668.

16. Arnold, R.J., Running, W., Reilly, J.P. Analysis of methylation, acetylation, and other modifications in bacterial ribosomal proteins // Methods Mol. Biol. 2008. - V.446. — P.151-161.

17. Arnold, R.J., Reilly, J.P. Observation of Escherichia coli ribosomal proteins and their posttranslational modifications by mass spectrometry // Anal. Biochem. 1999. - V.269. -P.105-112.

18. Bachniann, B.J. Pedigrees of some mutant strains of Escherichia coli K-12 // Bacteriol. Rev. 1972. - T.36. - P.525-557.

19. Ban, N., Nissen, P., Hansen, J., Moore, P.B., Steitz, T.A. The complete atomic structure of the large ribosomal subunit at 2.4 A resolution // Science. 2000. - V.289. - P.905-920.

20. Barta, A., Steiner, G., Brosius, J., Noller, H.F., Kuechler, E. Identification of a site on 23S ribosomal RNA located at the peptidyl transferase center. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1984. — V.81. — P.3607-3611.

21. Bear, D.G., Ng, R., Van Derveer, D., Johnson, N. P., Thomas, G., Schleich, T., Noller, H.F. Alteration of polynucleotide secondary structure by ribosomal protein SI // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1976. - V.73. - P. 1824-1828.

22. Beauclerk, A.A., Cundliffe, E., Dijk, J. The binding site for ribosomal protein complex L8 within 23 s ribosomal RNA of Escherichia coli // J. Biol. Chem. 1984. - V.259. - P.6559-6563.

23. Belitsina, N.V., Glukhova, M.A., Spirin, A.S. Translocation in ribosomes by attachment-detachment of elongation factor G without GTP cleavage: evidence from a column-bound ribosome system // FEBS Lett. 1975. - V.54. - P.35-38.

24. Belova, L., Tenson, T., Xiong, L., McNicholas, P.M., Mankin, A.S. A novel site of antibiotic action in the ribosome: interaction of everaimicin with the large ribosomal subunit //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -2001. -V.98. P.3726-3731.

25. Benson, D.A., Karsch-Mizrachi, I., Lipman, D.J., Ostell, J., Wheeler, D.L. GenBank. Nucl. Acids Res. 2008. - V.36. - D25-D30.29.