Исследование структурной организации хроматина в ядре биологической клетки методами малоуглового рассеяния нейтронов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 01.04.07, кандидат наук Яшина Екатерина Геннадьевна

• Яшина Екатерина Геннадьевна
• кандидат наук
• 2020

Оглавление диссертации кандидат наук Яшина Екатерина Геннадьевна

2.1 Приготовление образцов

2.2 Метод проточной цитометрии

2.3 Метод малоуглового рассеяния нейтронов

2.4 Метод ультрамалоуглового рассеяния нейтронов

2.5 Метод спин-эхо малоуглового рассеяния нейтронов

2.6 Комплементарность методов МУРН и СЭМУРН

3 Малоугловое рассеяние нейтронов на фрактальных объектах

3.1 Понятие фрактала

3.2 Концепция малоуглового рассеяния на фрактальных объектах и её противоречия

3.2.1 Нефрактальный объект

3.2.2 Объемные фракталы

3.2.3 Поверхностные фракталы

3.2.4 Сечение рассеяния на фрактальных объектах

3.3 Спин-эхо малоугловое рассеяние нейтронов и корреляционная функция на фрактальных объектах

3.3.1 Функция СЭМУРН

3.3.2 Приближение О(г) элементарной функцией

3.3.3 Корреляционная функция фрактального объекта

3.4 Вид корреляционной функции

3.5 Заключение

4 Аддитивный закон масштабирования структурной организации хроматина в ядрах куриных эритроцитов

4.1 Изучение наднуклеосомной организации хроматина в ядрах куриных эритроцитов

4.1.1 Аттестация методом проточной цитометрии

4.1.2 Результаты исследования методом малоуглового рассеяния нейтронов

4.1.3 Результаты исследования методом спин-эхо малоуглового рассеяния нейтронов

4.1.4 Протокол измерения биологических ядер методом СЭМУРН

4.2 Модель крупномассштабной фрактальной организации хроматина в интерфазном ядре

4.3 Заключение

5 Двухуровневая фрактальная организация хроматина в ядрах клеток ЫеЬа

5.1 Изучение наднуклеосомной организации хроматина в ядрах ЫеЬа

5.1.1 Аттестация методом проточной цитометрии

5.1.2 Результаты исследования методом конфокальной микроскопии

5.1.3 Результаты исследования методом малоуглового рассеяния нейтронов

5.1.4 Спин-Эхо малоугловое рассеяние нейтронов на изолированных ядрах ЫеЬа

5.1.5 Описание структурной организации хроматина в клетках ЫеЬа в рамках концепции рассеяния на фрактальных объектах

5.2 Исследование процесса агломерации ядер ЫеЬа

5.2.1 Аттестация методом конфокальной микроскопии

5.2.2 Результаты исследования агломерированных ядер ЫеЬа методом малоуглового рассеяния нейтронов

5.2.3 Спин-Эхо малоугловое рассеяние нейтронов

5.3 Извлечение сигнала, характеризующего взаимопроникновение ядер ЫеЬа из данных МУРН и СЭМУРН

5.4 Сравнение структурной организации ядер куриных эритроцитов и ядер ЫеЬа

6 Крупномасштабная структура хроматина: логарифмиче-

ский фрактал или фрактальная глобула?

6.1 Обсуждение

6.2 Заключение

Основные результаты и выводы

Благодарности

Литература

Введение

При всех впечатляющих успехах биологии и генетики за последние десятилетия, корректное описание структурной организации хроматина в ядре эукариотической клетки остается вопросом, до конца нерешенным. Дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) — это невероятно длинная полимерная молекула, находящаяся в относительно небольшом ядре клетки. Многократное сокращение линейных размеров ДНК обеспечивается её упаковкой в хроматин с помощью специальных архитектурных белков. Например, если распаковать геном человека, то его длина составит 2 метра, в то время как диаметр ядра меньше 10 микрон, а самый большой, известный на данный момент, геном в 200 раз больше, чем у человека (Amoeba dubia). Кроме хранения генетической информации, в период интерфазы в ядре клетки осуществляются сложные процессы биосинтеза ДНК, а также считывание информации о структуре белка. Жизненно важные функции осуществляются за рекордно короткое время. Нить ДНК должна очень быстро распаковываться, чтобы нужный участок гена мог быть считан. С другой стороны макромолекула ДНК уложена в очень небольшом объеме. Предполагается, что особенности структурной укладки хроматина определяют принципы внутриядерного транспорта. Удивительно, что понимая, как работают, те или иные гены в составе ДНК, мы все еще не знаем всех принципов упаковки хроматина в ядре.

С одной стороны, структурная организация хроматина приводит в

высшей степени его компактности, а с другой, к способности быстрой распаковки ДНК. Предполагается, что именно эти два фактора формируют структурный и функциональный дизайн организмов. Первый из них - это стремление к максимальной метаболической способности, поскольку он производит энергию и вещества, необходимые для поддержания и воспроизведения жизни. Достигается это за счет увеличения площади поверхности, через которую происходит обмен ресурсами с окружающей средой. Второй фактор - увеличение внутренней эффективности метаболизма за счет уменьшения расстояния, на которое транспортируются материалы, и, следовательно, время, необходимое для транспорта [1]. Эта тенденция к уменьшению приводит к компактизации живой системы, иными словами, к минимизации объема. Эти два фактора являются противоположными друг другу, и морфология живого организма, формирующегося под влиянием двух противоборствующих факторов и принимает наиболее выгодную для выживания форму. Кроме того, простота реализации законов воспроизведения является третьим, не менее важным свойством, к которому стремится жизнь. В природе структуры зачастую генерируются многократным повторением одного и того же морфогенетического механизма, например, ветвления. Наиболее наглядной реализацией этого принципа являться дерево. Дерево старается занять как можно больше пространства для получения максимума воды и света, при этом его ресурсы, поступающие из земли ограничены. В результате оно растет таким образом, что на каждом следующем уровне ветвления, сумма квадратов радиусов веток равна квадрату радиуса ветви из которой произошло ветвление. Рекуррентное свойство, описывающие рост дерева было замечено еще Леонардо Да Винчи [2].

В настоящее время для сопоставления взаимодействия хроматина в интересующих областях ДНК и по всему геному широко используется методология захвата конформации хромосом (3С) [3]. Полученные данные взаимодействия генов в хроматине (например, наличие хроматиновых петель и хромосомных доменов) можно использовать для построения модели пространственной организации хроматина. В отличие от микроскопических методик метод 3С и другие методы (4С, 5С, НьС), разработанные на его основе, не фиксируют конкретное событие взаимодействия в пределах одной клетки, а измеряют вероятность взаимодействия двух областей генома в большой (105 —106) популяции клеток [4]. Эти методы позволяют изучить взаимодействие удаленных друг от друга участков ДНК в трехмерном пространстве. Метод 3С показывает взаимодействуют ли друг с другом определенные участки генома. Метод 4С характеризует взаимодействия одного участка со всеми остальными. Наконец, метод 5С дает возможность изучить взаимодействия "всех со всемирна небольшом участке генома, а НьС - на всем геноме, с разрешением до 1000 пар нуклиотидов.

Однако, у методов захвата конформации хромосом есть свои недостатки. После сопоставления, фильтрации и коррекции данных НьС составляется матрица взаимодействия генома, в которой каждая ячейка отражает частоту взаимодействия между двумя генами. Извлечение соответствующих биологических знаний из этой матрицы взаимодействия является одной из основных проблем анализа данных НьС. Оно включает в себя дифференциацию полезного сигнала от шума, идентификацию моделей взаимодействия и интерпретацию полученных закономерностей. Существует ряд факторов, которые усложняют этот анализ. Во-первых, нужно

учитывать тот факт, что измеряются частоты взаимодействия в популяции клеток. Это имеет решающее значение с точки зрения интерпретации данных, поскольку, когда мы рассматриваем шаблон взаимодействия, состоящий из нескольких пар генов, мы не можем различать сценарии, в которых взаимодействия могут происходить одновременно в одной ячейке, являются взаимоисключающими или где-то между ними. Соответственно, наблюдение за усредненной матрицей взаимодействия, которая показывает небольшую позиционно-специфическую структуру, не исключает существования структуры в нижележащих геномах. Это просто означает, что если такие структуры существуют, они не согласуются между клетками. Во-вторых, ограничение сегодняшних методов анализа состоит в том, что часто шаблоны определяются не явно, а косвенно. Другими словами, вместо того, чтобы формально определять, как выглядит конкретный шаблон взаимодействия, и искать его в матрице взаимодействия, шаблоны взаимодействия определяются как выходные данные некоторого метода. Например, геномные компартменты (области хроматина, в которых происходят различные процессы, связанные с активностью генома) отображаются в виде шахматного шаблона взаимодействия, но они идентифицируются с помощью метода, который явно не ищет этот шаблон. В результате трудно оценить обоснованность метода или сравнить методы, направленные на выявление однотипного шаблона взаимодействия. В-третьих, различные типы моделей взаимодействия сосуществуют и перекрывают друг друга. Трудно разделить различные типы шаблонов взаимодействия, учитывая, что во многих случаях нам не хватает явного определения этих шаблонов. В-четвертых, важно помнить, что ЫьС измеряет частоту взаимодействия

между генами, а не расстояние. Формальдегидные сшивки будут только между генами, которые физически взаимодействуют. Таким образом, слабый сигнал Ш-С между двумя генами указывает на то, что взаимодействие произошло в небольшой части популяции, но мы не можем определить расстояние между ними, не делая некоторые упрощающие предположения о том, как частоты взаимодействия связаны с физическими расстояниями. Наконец, нельзя предполагать эргодичность частот взаимодействия. Другими словами, частоты в клеточной популяции не обязательно должны интерпретироваться как частоты во времени. Например, взаимодействие, которое происходит в небольшом объеме клеток и, таким образом, производит слабый сигнал в Ш-С, не значит, что оно обязательно является неустойчивым взаимодействием [5].

Упаковка ДНК происходит в несколько этапов. Наиболее изученной считается нуклеосомная структура интерфазного хроматина, в то время как его крупномасштабная структура на сегодняшний момент достоверно неизвестна. Точно известно, что двуспиральная нить ДНК наматывается на специальные белки гистоны, тем самым компактизуясь в 7 раз, образуя нуклеосомы. Что касается следующих масштабных уровней, то принципы их пространственной организации активно обсуждаются на сегодняшний день. Одним из наиболее достоверных и информативных методов исследования субмикронных объектов является малоугловое рассеяние нейтронов (МУРН), характеризующее структуру объекта в диапазоне размеров от 1 нм до 1 мкм. С помощью МУРН можно узнать размер, форму и внутреннюю структуру нанообъектов. В отличие от микроскопии, методы рассеяния дают информацию от всего объема образца, что делает их совершен-

но необходимыми для изучения трехмерных объектов. Высокое разрешение этих методов достигается коллимацией падающего на образец пучка и большим расстоянием от образца до детектора, обеспечивающее высокое угловое разрешение установки. В результате, системой коллиматоров и монохроматором вырезается до 99 % интенсивности нейтронного пучка, испускаемого источником, а сами установки могут достигать в длину 40 метров. Эти особенности малоугловых нейтронных установок налагают высокие требования на нейтронные источники и оборудование, такие как высокая интенсивность нейтронных пучков и большие размеры ней-троноводных залов. Использование нейтронного спинового эха в малоугловом рассеянии нейтронов обеспечивает высокое разрешения без коллимации падающего пучка и дает информацию о малых углах рассеяния на фоне прямого пучка, прошедшего через образец. Этот метод получил название спин-эхо малоуглового рассеяния нейтронов (СЭМУРН) и дал возможность исследовать материалы в широком диапазоне масштабов - от 20 нм до 20 мкм [6,7]. Техника СЭМУРН является одной из самых изящных реализаций метода ультрамалоуглового (УМУРН) рассеяния нейтронов и оказалась комплементарной методу МУРН поскольку она, во-первых, расширяет пространственный диапазон исследования и, во-вторых, позволяет исследовать аналог корреляционной функции рассеивающего объекта в реальном пространстве, которая является преобразованием Ханкеля от сечения рассеяния. Метод СЭМУРН дает информацию о корреляционной длине исследуемого объекта, которую не всегда удается определить из классического МУРН. В этой работе метод СЭМУРН был использован для исследования структуры хроматина на масштабах порядка размера само-

го ядра. С помощью методов СЭМУРН и МУРН получена структурная информация об общих принципах организации хроматина на всех уровнях организации.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Исследование структурной организации хроматина в ядре биологической клетки методами малоуглового рассеяния нейтронов»

Актуальность

Результаты, полученные в диссертации, несомненно актуальны, поскольку при том, что мелкомасштабная структура хроматина (1 — 100 нм) хорошо изучена, крупномасштабная структура (102 — 104 нм) до сих пор является загадкой и вызывает дискуссии и споры среди специалистов. Диссертационная работа направлена на разрешение вопроса о структурной организации (укладке) хроматина в ядре живой клетки в диапазоне масштабов (102 — 104 нм). Метод малоуглового рассеяния нейтронов МУРН до недавнего времени был ограничен как раз областью относительно больших углов и использовался для исследования мелкомасштабной структуры (1 —100 нм). Только на высокопоточных реакторах нейтронов возникла возможность улучшить разрешение МУРН установок, настолько чтобы доказать факт бифрактальности укладки хроматина. Метод СЭМУРН, развитый в последние 20 лет, еще в большей степени расширяет возможности этого исследования. Эти, недавно возникшие и впервые применяемые в диссертации, возможности экспериментальной техники привели к принципиально новым результатам, актуальным для исследования биологической клетки.

Научная и практическая значимость работы Установленные в результате выполнения данной работы закономерности вносят значительный вклад в современные сведения о фрактальной организации хроматина в интерфазном ядре биологической клетки. Полученные эксперименталь-

ные результаты могут быть востребованы в научных лабораториях, занимающихся проблемами генетики и клеточной биологии, и в будущем могут быть полезны при разработке лекарств против онкологии.

Целью работы является исследование структурной организации хроматина в ядре биологической клетки методами малоуглового рассеяния нейтронов.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

• Провести классификацию фрактальных объектов конечных размеров с помощью метода малоуглового рассеяния нейтронов.

• Исследовать структурную организацию хроматина в ядрах куриных эритроцитов и в ядрах клеток ЫеЬа методами МУРН и спин-эхо МУРН.

• Провести сравнение структурной организации хроматина в делящихся и неделящихся эукариотических клетках, обнаружить общие и различающиеся характеристики.

Личный вклад автора Все представленные результаты получены автором работы или при его непосредственном участии. Автор разработал и расширил классификацию фрактальных объектов основанную на результатах метода малоуглового рассеяния нейтронов, провел все эксперименты по МУРН и принимал активное участие в экспериментах по СЭМУРН, обработал, проанализировал и интерпретировал все приведенные данные, а также подготовил научные публикации и доклады.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Пограничный случай перехода от объемного к поверхностному фракталу, характеризующийся зависимостью интенсивности рассеяния от переданного импульса I(Q) ~ (1 + (Q)2)-3/2, соответствует СЭМУРН функции G(z) равной убывающей экспоненте exp(-z/£), а корреляционная функция в области фрактального поведения в этом случае пропорциональна ln(£/r) и имеет необычное масштабное свойство y(r/a) = y(r) + ln(a), т. е. уменьшение масштаба дает аддитивную добавку к корреляционной функции, а не мультипликативную, как в случае объемного фрактала.

2. Наднуклеосомная организация хроматина в ядрах куриных эритроцитов и ядрах HeLa представляет собой двухуровневую фрактальную структуру. Мелкомасштабный фрактальный уровень описывается моделью объемного фрактала с размерностью Dp = 2.46 ± 0.01 в ядрах куриных эритроцитов и Dp = 2.41 ± 0.01 в ядрах HeLa. Крупномасштабный фрактальный уровень описывается моделью логарифмического фрактала.

3. Структура логарифмического фрактала в ядрах HeLa простирается на две декады по шкале размеров, в то время как объемный фрактал распространяется только на одну. В ядрах куриных эритроцитов - наоборот: логарифмический фрактал существует в пределах одной декады, а объемный фрактал распространен на две. В отличии от ядер куриных эритроцитов, ядра HeLa имеют тенденцию агломерировать со временем. При этом ядра HeLa глубоко на 1-2 микрона проникают в соседнее ядро в процессе агломерации.

4. Показано, что модель фрактальной глобулы, пространственная структура которой описывается трехмерной кривой Гильберта (Пе-ано или другой заполняющей пространство кривой) не удовлетворяет экспериментальным данным малоуглового рассеяния нейтронов на ядрах биологических клеток. Напротив, модель логарифмического фрактала хорошо описывает экспериментальные данные МУРН, а, следовательно, и является хорошим приближением для описания крупномасштабной организации хроматина в ядре биологической клетки, находящейся в интерфазном состоянии.

Научная новизна.

1) Впервые методом СЭМУРН была исследована структурная организация хроматина в ядре живой клетки на масштабах порядка микрона. Разработана методика исследования ядра клетки методом СЭМУРН. Эта методика в будущем может быть применена к изучению бесконечного многообразия биологических клеток и их возможному изменению под влиянием внешних факторов.

2) Для описания крупномасштабной организации хроматина в ядрах куриных эритроцитов и клеток ЫеЬа разработана модель логарифмического фрактала, характеризующегося мерой д(г) = тВ/ 1пА(1/г) с Df = 3 и А = -1, который, по видимому, является отличительной характеристикой живых систем.

3) Впервые показано, что модель фрактальной глобулы не удовлетворяет экспериментальным данным малоуглового рассеяния нейтронов на ядрах биологических клеток, в то время как, модель логарифмического фрактала хорошо описывает экспериментальные данные МУРН, а, следователь-

но, и является хорошим приближением для описания крупномасштабной структуры хроматина.

4) Впервые методами МУРН и СЭМУРН показано, что структурная организация хроматина в ядрах клетки HeLa, аналогична двухуровневой фрактальной организации хроматина в ядрах куриных эритроцитов.

Апробация работы. Основные результаты работы докладывались на ряде конфкркнций, совещаний и семинаров:

• на научных семинарах кафедры ядерно-физических методов исследования СПбГУ;

• на научных семинарах отдела Исследования Конденсированного Состояния ОНИ ПИЯФ НИЦ КИ;

• на теоретическом семинаре по Физике Конденсированного Состояния ПИЯФ НИЦ КИ;

• на двух конференциях по использованию рассеяния нейтронов и син-хротронного излучения в конденсированных средах "РНИКС"(2014, 2018);

• на четырех совещаниях по малоугловому рассеянию нейтронов "МУ-Ромец"(2014, 2015, 2016, 2017);

• на пяти школах ПИЯФ НИЦ КИ по физике конденсированного состояния "ФКС"(2015, 2016, 2017, 2018, 2019);

• на IV ежегодном молодежном научном форуме "Open Science 2017";

• на двух международных научных школах "RACIRI Summer School"(2015, 2016);

• на европейской научной школе "HERCULES Europen School 2016";

• на Международной конференции "PNCMI 2016"по рассеянию поляризованных нейтронов в конденсированных средах;

• на трех школах ПИЯФ НИЦ КИ по физике поляризованных нейтронов "ФПН"(2015, 2016, 2018);

• на Европейской конференции по нейтронному рассеянию "ECNS 2019".

Основные результаты по теме диссертации опубликованы в 5 работах в изданиях, рекомендованных ВАК (4 из которых индексируются международными системами цитирования Web of Science и Scopus [8-11], и 1 индексируются национальной библиографической базой данных научного цитирования РИНЦ [12].

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, пяти глав, заключения. Полный объём диссертации составляет 120 страниц с 32 рисунками и 1 таблицей. Список литературы содержит 76 наименований.

1. Современные представления об организации хроматина в ядре клети

1.1. Мелкомасштабная организация хроматина в ядре биологической клетки

Укладка ДНК в хроматине на нанометровом масштабе обеспечивается нуклеосомами. Они представляют собой, состоящий из 8 гистонов, белковый комплекс округлой формы диаметром в 15 нм. Нуклеосомы связаны между собой линкерными участками ДНК длиной приблизительно 20 нм. Существование в хроматине дискретных повторяющихся единиц было открыто с помощью электронной микроскопии. Было показано, что хро-матиновые нити несут на себе образования типа бусин [13, 14]. Каждая такая «бусина» содержит отрезок ДНК длиной 150-200 пар нуклеотидов и 8 молекул гистонов разных типов [15]. Отдельная нуклеосома состоит из белковой сердцевины, на которую накручена молекула ДНК. Молекула ДНК совершает 1.67 оборота вокруг сердцевины нуклеосомы Рис. 1.1.

Нуклеосомы укорачивают молекулу ДНК примерно в 7 раз. Они обнаружены во всех эукариотических клетках и даже у ДНК-содержащих вирусов. Способы укладки нуклеосом в плотную 30-ти нанометровую хро-матиновую фибриллу широко обсуждались с момента получения первых изображений с помощью метода сканирующей электронной микроскопии [16-23]. Было предложено несколько моделей. В модели "соленоид"цепочка

Рис. 1.1. Модель мелкомасштабной структуры хроматина (http://humbio.ru/).

нуклеосом закручена в суперспираль, на один виток которой приходится 6 нуклеосом, при этом шаг спирали составляет 11 нм (Рис. 1.2 А). В модели "зигзаг"входящие и выходящие нити ДНК образуют контакт, в результате чего получается плотная спиралеобразная упаковка, характеризующаяся большим расстоянием между соседними по цепи нуклеосомами по сравнению с расстояниями между нуклеосомами, разделенными одной (или более) нуклеосомой (Рис. 1.2 В).

Однако на сегодняшний момент само существование 30-ти фибриллы находится под вопросом. Появляется все больше доказательств того, что ее наблюдение в электронном микроскопе является экспериментальным арте-

Рис. 1.2. Модели упаковки хроматина в хроматиновую фибриллу А - модель "соленоид В - модель "зигзаг"(https://www.mechanobio.info/genome-regulation/what-are-nucleosomes/).

фактом [24]. Эксперименты по малоугловому рассеянию синхротронного излучения высокого разрешения и крио-микроскопии продемонстрировали ее отсутствие в естественных условиях [25,26].

1.2. Крупномасштабная организация хроматина в ядре биологической клетки

Хроматин в клеточном ядре образует сложные пространственные структуры с несколькими уровнями организации и его крупномасштабная организация принципиально отличается от его мелкомасштабной структуры [27-32]. На сегодняшний момент наиболее популярная модель, описы-

вающая трехмерную конфигурацию упаковки хроматина в ядре клетки — модель складчатой или фрактальной глобулы (Рис. 1.3). Складчатая глобу-

The unfolded DNA strand

Рис. 1.3. Справа - модель фрактальной глобулы, слева - модель равновесной глобулы [4].

ла — это незамкнутая макромолекула с иерархически самоподобной укладкой полимерной цепи. Укладка полимерной цепи во фрактальной глобуле подобна траектории ультраметрического случайного блуждания [33]. Модель складчатой глобулы объясняет, каким образом довольно длинный участок ДНК может обратимо и быстро складываться и распаковываться при считывании генетической информации. Данная модель предполагает, что хроматиновая фибрила укладывается самоподобным образом, напоминая известную в теории фракталов кривую Гильберта (Рис. 1.4), которая имеет размерность 3 и полностью заполняет трехмерное пространство [?,4,34]. В недавно опубликованной работе [35] представлено компьютерное моделирование динамики теплового движения мономеров, формирующих фрактальную глобулу. Самодиффузия фрактальной глобулы происходит намного

folds into this (FRACTAL GLOBULE)

rather than this (EQUILIBRIUM GLOBULE)

Рис. 1.4. Кривая Гильберта (https://elementy.ru/posters/fractals/H-fractal).

быстрее, чем в равновесной запутанной глобуле, так называемом гауссовом клубке.

Эксперименты по малоугловому рассеянию нейтронов на ядрах куриных эритроцитов демонстрируют би-фрактальную структуру хроматина [29,30]. Было установлено, что показатель степенной функции в сечении малоуглового рассеяния нейтронов О равен 2.46 на масштабах 30 нм — 600 нм, а на масштабах от 600 нм до 1500 мкм близок к 3 [29]. В рамках фрактальной концепции О = 2.46 соответствует объемному (массовому) фракталу с размерностью От = 2.46.

Показатель степени, близкий к 3 до недавнего времени интерпретировали, как не представляющий сам по себе интереса, промежуточный случай перехода от объемного к поверхностному фракталу. В Главе 3 и Главе 4 мы продемонстрируем, что кубическая зависимость в сечении ма-

лоуглового рассеяния нейтронов соответствует очень специальному виду фрактальной организации вещества — логарифмическому фракталу, поскольку она характеризуется логарифмической корреляционной функцией 7(г) ~ 1п(£/г), где £ — корреляционная длина ядра, что в свою очередь значит, что крупноммасштабная организация хроматина имеет иерархически разветвленную структуру, что обеспечивает доступность ферментов к нужным участкам генов [8]. Последняя глава диссертационной работы посвящена сравнению модели фрактальной глобулы и модели логарифмического фрактала. Будет показано, что модель фрактальной глобулы не удовлетворяет экспериментальным данным малоуглового рассеяния нейтронов на ядрах биологических клеток. Напротив, модель логарифмического фрактала хорошо описывает экспериментальные данные МУРН, а, следовательно, и является хорошим приближением для описания крупномасштабной структуры хроматина.

2. Образцы и основные методы исследования

2.1. Приготовление образцов

Эритроциты кур были получены из куриной крови, многократно промыты с помощью центрифугирования в изотоническом фосфатном буферном растворе (pH = 7.8), содержащем 10 мМ ЭДТА для удаления белков плазмы крови. Цитоплазматическая мембрана эритроцитов растворялась детергентом Тритон X-100 (0.2 % в фосфатном буфере, pH = 7.8). Клеточные ядра фиксировались 0.05% глутаровым альдегидом в концентрации около 10 мг/мл в течение 10 минут и последовательно отмывались с помощью центрифугирования для удаления фиксирующего агента.

Клетки HeLa выращивались во флаконах Карреля (Orange Scientific) при 37С в ДМЕМ/П2 среде (Биолот, Россия), содержащей 10 % сыворотки эмбрионов коров (Биолот, Россия). Клетки снимали с подложки раствором Версен/трипсин 1:1 (Биолот, Россия) в течение 10 мин., переносили в центрифужную пробирку и осаждали 5 мин. при 1000 об/мин. Осадок клеток ресуспендировали в 10 мл раствора Версена и центрифугировали 5 мин. Далее осадок ресуспендировали в питательной среде ДМЕМ/П2 c HEPES (15 mM/L) и добавляли Triton X100 до конечной концентрации 0,1%. Ли-зировали клетки 3-5 мин. при комнатной температуре, периодически мягко перемешивая суспензию. Процесс вскрытия клеток и образования ядер контролировали под микроскопом. Фиксировали ядра глутаровым альдегидом

в течение 10 мин. Конечная концентрация фиксирующего раствора составляла 0,5%. После фиксации ядер глутаровый альдегид удаляли из раствора серией (3 раза) центрифугирований в растворе Версена по 10 мин. при 1000 об/мин.

Качество и однородность приготовленных клеточных ядер контролировались флуоресцентной проточной цитометрией. Согласно данным проточной цитометрии, отклонения по содержанию ДНК в клеточном ядре не превышали 2%. Фиксированные клеточные ядра хранились в фосфатном буферном растворе при рН = 7.4 с добавлением 20 мМ ЭДТА для защиты ДНК от деградации эндонулеазами. Для нейтронных исследований клеточные ядра были перенесены в Натрий-фосфатный буферный раствор, содержащий более 99.5% тяжелой воды.

2.2. Метод проточной цитометрии

Проточная цитометрия является современной технологией быстрого измерения характеристик клеток и их органелл. Принцип проточной цитометрии заключается в следующем: через проточную ячейку движется постоянный ток изотонического раствора под определенным давлением, который называется «обжимающим», внутри проточной ячейки находится зонд, из которого подается образец, содержащий клетки. Условия подобраны таким образом, что за счет разницы давления в зонде и «обжимающей» жидкости происходит гидродинамическое фокусирование струи в струе, и клетки за счет этого выстраиваются друг за другом. Клетки одна за другой проходят через лазерный луч, а высокочувствительные детекторы, расположенные вокруг проточной ячейки регистрируют флюоресценцию и рас-

сеяное лазерное излучение каждой клетки.

В стандартный проточный цитометр заложено три основных опции. Во-первых, это рассеяние света под малыми углами, который используется для определения размеров клеток. Детектор малоуглового светорассеяния располагается по ходу лазерного луча за проточной ячейкой и регистрирует излучение лазера, которое рассеивается под углами 1 — 100 градусов. Интенсивность рассеянного под малым углом света пропорциональна размеру клетки. Более крупные клетки рассеивают свет сильнее мелких. Во-вторых, рассеянние света под углом 900 (боковое светорассеяние), использование которого характеризует соотношение размеров ядра и цитоплазмы, а также неоднородность или гранулярность цитоплазмы. Внутреннее содержимое клеток оптически неоднородно. Луч лазера, проходя сквозь клетку, многократно преломляется и рассеивается во все стороны. Регистрация этого излучения показывает сложности внутреннего строения клетки (соотношение ядро-цитоплазма, наличие гранул, других внутриклеточных включений). Комбинация малоуглого и бокового светорассеяния дает информацию о морфологии клетки в целом и выделяет различные популяции клеток (лимфоциты, моноциты, гранулоциты) для дальнейшего анализа. И наконец, третий режим - это измерение интенсивности флуоресценции изучаемого объекта. Современные цитометры, как правило, оборудованы несколькими фотоэлектронными умножителями (ФЭУ), для одновременной регистрира-ции нескольких типов флуоресценции. Система для регистрации свечения флюоресцентных меток состоит из комплекса светофильтров и фотоумножителей, каждый из которых регистрирует излучение в диапазоне длин волн, соответствующих флуорохрому. Выбор типа и количества флуорес-

центных красителей определяется поставленной задачей.

Метод проточной цитометрии был использован для аттестации целостности ядер и установления их однофазного состояния.

2.3. Метод малоуглового рассеяния нейтронов.

Интерес к наноструктурам, возникший в последние 20 лет продиктован потребностями промышленности и запросом на сознание материалов с заранее заданными свойствами. Нанотехнологии, т.е. создание материалов из наночастиц, открыло широкое поле деятельности для физиков, химиков, биологов и материаловедов. Развитие технологии электронной микроскопии, позволяющей визуализовать поверхность объектов с атомарным разрешением, дает технологам возможность увидеть в реальном пространстве результаты своего труда. Однако, когда речь заходит о наноструктурах, о морфологии наночастиц, о фрактальности материала, то нейтронная и рентгеновская малоугловая дифракции и малоугловое рассеяние становятся совершенно незаменимыми. На сегодняшний день малоугловое рассеяние стало наиболее востребованным методом среди пользователей мировых нейтронных и синхротронных центров.

Малоугловое рассеяние нейтронов (МУРН) является одним из наиболее информативных методов изучения строения вещества на надатомных масштабах от единиц нанометров до десятков микрометров. Из-за отсутствия у нейтрона электрического заряда, метод МУРН является нераз-рушающим и глубокопроникающим. Исследования с применением МУРН охватывают чрезвычайно широкий класс объектов от структуры белков и вирусов в биологии, медицине и фармакологии до полимерных нано-

композитных материалов, эмульсий и микроэмульсий в химии, от несоразмерных магнитных структур и критических флуктуаций при фазовых превращениях в физике конденсированных сред до фрактальных структур гранулированных материалов и минералов в материаловедении, металлургии и геологии.

Основы метода малоуглового рассеяния (МУР), заложенные в начале 40-х годов XX столетия для МУР рентгеновского излучения, с появлением достаточно мощных источников нейтронов, получили дальнейшее развитие для МУР нейтронов в начале 60-70-х годов, и в дальнейшем, для МУР синхротронного излучения. Благодаря высокой степени востребованности, многочисленные экспериментальные станции МУРН составляют в настоящее время основу приборного парка существующих и планируемых международных и национальных нейтронных центров.

Рассеяние нейтронов происходит главным образом на атомном ядре, лишь в магнитных материалах рассеяние на электронах достигает заметной величины [36]. Основная идея описания взаимодействия нейтрона с немагнитной средой заключается в следующем. Сначала рассматривается взаимодействие с отдельным ядром, описываемое как процесс рассеяния, а затем производится суммирование рассеянных волн по всем частицам среды. Поэтому элементарной величиной, характеризующей взаимодействие нейтрона с веществом, является амплитуда рассеяния нейтрона частицей среды . Как и любой процесс рассеяния, рассеяние нейтронов описывается следующим образом. В начало координат (г = 0) помещается силовой центр (ядро), на который падает плоская волна ехр(гкг), где к — волновой вектор падающего нейтрона. В результате взаимодействия центр ста-

новится источником вторичной волны, которая на больших расстояниях от источника имеет вид расходящейся сферической волны. В результате асимптотический вид волновой функции нейтрона при г ^ 0 имеет вид

фк (r) = exp(ikr) +—— exp(ik'r),

г

(2.1)

где к' — волновой вектор рассеянного нейтрона. В рассматриваемом нами случае упругого рассеяния |kT'| = |k|, а функция fg — это амплитуда рассеяния. Если длина волны нейтрона велика по сравнению с размером рассеивателя (Л = 2п/к ^ а0), то амплитуда рассеяния не зависит от угла рассеяния fg = const = f .В случае рассеяния нейтрона на атомном ядре, а также для малоуглового рассеяния это приближение справедливо.

Я-т

Рис. 2.1. Кинематика малоуглового рассеяния.

Принципиальная схема кинематики типичного эксперимента по МУР представлена на Рис. 2.1, согласно которому нейтроны с начальным вол-

новым вектором к и длиной волны Л = 2п/|к| рассеиваются в образце, переходя в состояние с волновым вектором к'. При этом процесс упругого рассеяния сопровождается передачей импульса с абсолютной величиной Q = 4п вт(в)/Л, где в - угол между векторами к и к' , так называемый угол рассеяния. Поскольку величина Q определяется размером рассеива-телей или расстоянием между ними ё, а длина волны Л обычно составляет от 0.1 до 1 нм, то при рассеянии на нанообъектах углы рассеяния в малы. Например, для объектов с размерами порядка 100 нм характерные углы рассеяния составляют несколько мрад. Измерение распределения рассеянной интенсивности в столь малых углах требует большой коллимационной базы МУРН инструментов, длина которых обычно достигает нескольких десятков метров.

В малоугловом рассеянии нейтронов чаще всего используется бор-новское приближение, при котором амплитуда рассеяния на флуктуациях рассеивающей плотности р(г) зависит только от переданного импульса ( и является её преобразованием Фурье

1 Гж

А(() = р(г) ехр(г(-г)ёг (2.2)

л/2п }о

Кроме того, в случае изотропного рассеяния амплитуда рассеяния зависит только модуля вектора рассеяния ( [36] (далее везде рассматривается только изотропный рассеиватель). Измеряемая в эксперименте величина — интенсивность (сечение рассеяния) малоуглового рассеяния является квадратом модуля амплитуды, которая в общем случае имеет комплексное значение

I (() = А(()А*((). (2.3)

В свою очередь, интенсивность МУРН является преобразованием Фурье корреляционной функции рассеивающего объекта 7(г) = (/м3 р(г )р(т + т)(т') (угловые скобки — усреднение по угловым компонентам радиус-вектора в прямом пространстве) [36]:

I(Я) = Г^(г)г2(г, (2.4)

где г — расстояние в прямом пространстве. Установка для измерения ма-

1 2 4 6

1 г \ —- )

7 Щ

2 3 5

Рис. 2.2. Схематичное изображение малоугловой нейтронной станции D11, ILL, Франция, Гренобль (https :

//www.ill.eu/users/instruments/instruments — list/d11). На рисунке: 1 - селектор скоростей, 2 - коллимационная труба, 3 - система диафрагм 4- узел образца, 5 - детекторная труба, в которой размещен позиционно-чувствительный детектор - 6.

лоуглового рассеяния нейтронов на стационарных источниках нейтронов состоит из нескольких элементов и изображена на Рис. 2.2. Селектор скоростей, выделяющет определенную длину волны из падающего пучка нейтронов. Далее профиль монохроматизированного нейтронного пучка формируется в коллимационной трубе с помощью системы диафрагм. Затем нейтроны попадают в узел образца, где взаимодействуют с объектом иссле-

дования, и, наконец, рассеянные нейтроны попадают в детекторную трубу, в которой находится двумерный позиционно-чувствительный детектор.

2.4. Метод ультрамалоуглового рассеяния нейтронов

Для исследования структур методом МУРН на микронном масштабе и масштабах, его превосходящих, требуется высокое угловое разрешение нейтронной установки, которое обеспечивается большим расстоянием от образца до детектора и высокой коллимацией падающего на образец пучка. В результате, системой коллиматоров и монохроматором вырезается до 99 % интенсивности нейтронного пучка, испускаемого источником, а сами установки могут достигать в длину 40 метров. Эти особенности малоугловых нейтронных установок налагают высокие требования на нейтронные источники и оборудование, такие как высокая интенсивность нейтронных пучков и большие размеры нейтроноводных залов. Использование фокусирующего тороидального зеркала для малоуглового рассеяния нейтронов сохраняет высокий поток нейтронов, не смотря на коллимацию падающего пучка. Тем самым можно добиться высокого разрешения установки и регистрировать интенсивность рассеянных нейтронов при очень малых углах рассеяния. На сегодняшний момент такой тип ультрамалоугловой установки реализован в уникальном инструменте К^Б-З нейтронного центра MLZ, Германия, Гархинг. Схема установки KWS-3 изображена на Рис. 2.3. Сначала нейтронный пучок монохроматизируется селектором скоростей и коллимируется диафрагмами, далее фокусируется тороидальным нейтронным зеркалом, попадает на образец, рассеивается и регистрируется двумерным позиционно-чувствительным детектором. Используя при измерениях

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Яшина Екатерина Геннадьевна, 2020 год

Литература

1. West G. B., Brown J. H., Enquist B. J. The fourth dimension of life: fractal geometry and allometric scaling of organisms //science. - 1999. - Т. 284. -№. 5420. - С. 1677-1679.

2. Eloy C. Leonardo's rule, self-similarity, and wind-induced stresses in trees //Physical review letters. - 2011. - Т. 107. - №. 25. - С. 258101.

3. Lieberman-Aiden E. et al. Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome //science. - 2009. - Т. 326. - №. 5950. - С. 289-293.

4. Mirny L. A. The fractal globule as a model of chromatin architecture in the cell //Chromosome research. - 2011. - Т. 19. - №. 1. - С. 37-51.

5. Lajoie B. R., Dekker J., Kaplan N. The Hitchhiker's guide to Hi-C analysis: practical guidelines //Methods. - 2015. - Т. 72. - С. 65-75.

6. Rekveldt M. T. Novel SANS instrument using neutron spin echo //Nuclear Instruments and Methods in Physics Research Section B: Beam Interactions with Materials and Atoms. - 1996. - Т. 114. - №. 3-4. - С. 366-370.

7. Krouglov T. et al. Real-space interpretation of spin-echo small-angle neutron scattering //Journal of applied crystallography. - 2003. - Т. 36. - №. 1. - С. 117-124.

8. Iashina E. G. et al. Additive scaling law for structural organization of chromatin in chicken erythrocyte nuclei //Physical Review E. - 2017. - Т. 96. - №. 1. - С. 012411.

9. Iashina E. G. et al. Spin-echo small-angle neutron scattering study of the structure organization of the chromatin in biological cell //Journal of Physics: Conference Series. - IOP Publishing, 2017. - Т. 862. - №. 1. - С. 012010.

10. Iashina E. G. et al. Small-angle neutron scattering (SANS) and spinecho SANS measurements reveal the logarithmic fractal structure of the large-scale chromatin organization in HeLa nuclei //Journal of Applied Crystallography. - 2019. - Т. 52. - №. 4. - С. 844-853.

11. Яшина Е. Г., Григорьев С. В. Крупномасштабная структура хроматина: фрактальная глобула или логарифмический фрактал? //Журнал экспериментальной и теоретической физики. - 2019. - Т. 156 - №. 3 (9). - С. 540-544.

12. Яшина Е. Г., Григорьев С. В. Малоугловое рассеяние нейтронов на фрактальных объектах //Поверхность. Рентгеновские, синхротронные и нейтронные исследования. - 2017. - №. 9. - С. 5-16.

13. Hewish D. R., Burgoyne L. A. Chromatin sub-structure. The digestion of chromatin DNA at regularly spaced sites by a nuclear deoxyribonuclease //Biochemical and biophysical research communications. - 1973. - Т. 52. -№. 2. - С. 504-510.

14. Olins A. L., Olins D. E. Spheroid chromatin units (? bodies) //Science. -1974. - T. 183. - №. 4122. - C. 330-332.

15. Kornberg R. D. Chromatin structure: a repeating unit of histones and DNA //Science. - 1974. - T. 184. - №. 4139. - C. 868-871.

16. Finch J. T., Klug A. Solenoidal model for superstructure in chromatin //Proceedings of the National Academy of Sciences. - 1976. - T. 73. - №. 6.

- C. 1897-1901.

17. Thoma F., Koller T. Influence of histone H1 on chromatin structure //Cell.

- 1977. - T. 12. - №. 1. - C. 101-107.

18. Woodcock C. L., Frado L. L. Y., Rattner J. B. The higher-order structure of chromatin: evidence for a helical ribbon arrangement //The Journal of cell biology. - 1984. - T. 99. - №. 1. - C. 42-52. Woodcock C., Frado L.-L., Rattner J., J. Cell Biol. 99, 42-52 (1984).

19. Bednar J. et al. Chromatin conformation and salt-induced compaction: three-dimensional structural information from cryoelectron microscopy //The Journal of cell biology. - 1995. - T. 131. - №. 6. - C. 1365-1376.

20. Bednar J. et al. Nucleosomes, linker DNA, and linker histone form a unique structural motif that directs the higher-order folding and compaction of chromatin //Proceedings of the National Academy of Sciences. - 1998. -T. 95. - №. 24. - C. 14173-14178.

21. Robinson P. J. J., Rhodes D. Structure of the '30 nm'chromatin fibre: a key role for the linker histone //Current opinion in structural biology. - 2006. -T. 16. - №. 3. - C. 336-343.

22. Woodcock C. L., Ghosh R. P. Chromatin higher-order structure and dynamics //Cold Spring Harbor perspectives in biology. - 2010. - T. 2. - №. 5. - C. a000596.

23. Fussner E., Ching R. W., Bazett-Jones D. P. Living without 30 nm chromatin fibers //Trends in biochemical sciences. - 2011. - T. 36. - №. 1. - C. 1-6.

24. Ou H. D. et al. ChromEMT: Visualizing 3D chromatin structure and compaction in interphase and mitotic cells //Science. - 2017. - T. 357. -№. 6349. - C. eaag0025.

25. Joti Y. et al. Chromosomes without a 30-nm chromatin fiber //Nucleus. -2012. - T. 3. - №. 5. - C. 404-410.

26. Nishino Y. et al. Human mitotic chromosomes consist predominantly of irregularly folded nucleosome fibres without a 30?nm chromatin structure //The EMBO journal. - 2012. - T. 31. - № 7. - C. 1644-1653.

27. Gerlich D., Ellenberg J. Dynamics of chromosome positioning during the cell cycle //Current opinion in cell biology. - 2003. - T. 15. - №. 6. - C. 664-671.

28. Belmont A. Dynamics of chromatin, proteins, and bodies within the cell nucleus //Current opinion in cell biology. - 2003. - T. 15. - №. 3. - C. 304-310.

29. Lebedev D. V. et al. Fractal nature of chromatin organization in interphase chicken erythrocyte nuclei: DNA structure exhibits biphasic fractal properties //FEBS letters. - 2005. - T. 579. - №. 6. - C. 1465-1468.

30. Ilatovskiy A. V. et al. SANS spectra of the fractal supernucleosomal chromatin structure models //Journal of Physics: Conference Series. - IOP Publishing, 2012. - Т. 351. - №. 1. - С. 012007.

31. Metze K. Fractal dimension of chromatin: potential molecular diagnostic applications for cancer prognosis //Expert review of molecular diagnostics. - 2013. - Т. 13. - №. 7. - С. 719-735.

32. Misteli T. Protein dynamics: implications for nuclear architecture and gene expression //Science. - 2001. - Т. 291. - №. 5505. - С. 843-847.

33. Аветисов В. А. и др. Фрактальная глобула как молекулярная машина //Письма в Журнал экспериментальной и теоретической физики. -2013. - Т. 98. - №. 4. - С. 270-274.

34. Мешков Д. А., Аветисов В. А. СКЛАДЧАТЫЕ ПОЛИМЕРНЫЕ ГЛОБУЛЫ КАК МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МАШИНЫ: ДИЗАЙН И ИССЛЕДОВАНИЕ СТРУКТУРНО-ДИНАМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ МЕТОДАМИ КОМПЬЮТЕРНОГО МОДЕЛИРОВАНИЯ //Наноструктуры. Математическая физика и моделирование. - 2015. - Т. 13. - №. 1. - С. 5-98.

35. Tamm M. V. et al. Anomalous diffusion in fractal globules //Physical review letters. - 2015. - Т. 114. - №. 17. - С. 178102.

36. Свергун Д. И., Фейгин Л. А. Рентгеновское и нейтронное малоугловое рассеяние. - Наука. Гл. ред. физ.-мат. лит., 1986. - С. 280.

37. Andersson R. A. Microstructure in powders: Spin-echo small-angle neutron scattering measurements. - IOS Press, 2008.

38. Grigoriev S. V. et al. Spin-echo small-angle neutron scattering for magnetic samples //Journal of applied crystallography. - 2006. - T. 39. - №. 2. - C. 252-258.

39. Mandelbrot B. B. The fractal geometry of nature. - New York : WH freeman, 1983. - T. 173. - C. 51.

40. McCarthy D. W., Mark J. E., Schaefer D. W. Synthesis, structure, and properties of hybrid organic-inorganic composites based on polysiloxanes. I. Poly (dimethylsiloxane) elastomers containing silica //Journal of Polymer Science Part B: Polymer Physics. - 1998. - T. 36. - №. 7. - C. 1167-1189.

41. Schaefer D. W., Justice R. S. How nano are nanocomposites? //Macromolecules. - 2007. - T. 40. - №. 24. - C. 8501-8517.

42. Roe R. J., Roe R. J. Methods of X-ray and neutron scattering in polymer science. - New York : Oxford University Press, 2000. - T. 739.

43. Schmidt P. W. Small-angle scattering studies of disordered, porous and fractal systems //Journal of Applied Crystallography. - 1991. - T. 24. - №. 5. - C. 414-435.

44. Hurd A. J., Schaefer D. W., Martin J. E. Surface and mass fractals in vapor-phase aggregates //Physical Review A. - 1987. - T. 35. - №. 5. - C. 2361.

45. Ilatovskiy A. V. et al. SANS spectra of the fractal supernucleosomal chromatin structure models //Journal of Physics: Conference Series. - IOP Publishing, 2012. - T. 351. - №. 1. - C. 012007.

46. Bancaud A. et al. A fractal model for nuclear organization: current evidence and biological implications //Nucleic acids research. - 2012. - T. 40. - №. 18. - C. 8783-8792.

47. Avnir D. Fractal approach to heterogeneous chemistry. - Wiley, 1989.

48. Lebedev D. V. et al. Fractal nature of chromatin organization in interphase chicken erythrocyte nuclei: DNA structure exhibits biphasic fractal properties //FEBS letters. - 2005. - T. 579. - №. 6. - C. 1465-1468.

49. Elias-Kohav T., Moshe S., Avnir D. Steady-state diffusion and reactions in catalytic fractal porous media //Chemical engineering science. - 1991. - T. 46. - №. 11. - C. 2787-2798.

50. Johnson C. P., Li X., Logan B. E. Settling velocities of fractal aggregates //Environmental science and technology. - 1996. - T. 30. - №. 6. - C. 19111918.

51. Suslick K. S., Price G. J. Applications of ultrasound to materials chemistry //Annual Review of Materials Science. - 1999. - T. 29. - №. 1. - C. 295-326.

52. Xu H., Zeiger B. W., Suslick K. S. Sonochemical synthesis of nanomaterials //Chemical Society Reviews. - 2013. - T. 42. - №. 7. - C. 2555-2567.

53. Saez V., Mason T. J. Sonoelectrochemical synthesis of nanoparticles //Molecules. - 2009. - T. 14. - №. 10. - C. 4284-4299.

54. Bang J. H., Suslick K. S. Applications of ultrasound to the synthesis of nanostructured materials //Advanced materials. - 2010. - T. 22. - №. 10. -C. 1039-1059.

55. Meskin P. E. et al. Ultrasonically assisted hydrothermal synthesis of nanocrystalline ZrO2, TiO2, NiFe2O4 and Ni0. 5Zn0. 5Fe2O4 powders //Ultrasonics sonochemistry. - 2006. - Т. 13. - №. 1. - С. 47-53.

56. Debye P., Bueche A. M. Scattering by an inhomogeneous solid //Journal of Applied Physics. - 1949. - Т. 20. - №. 6. - С. 518-525.

57. Debye P., Anderson Jr H. R., Brumberger H. Scattering by an inhomogeneous solid. II. The correlation function and its application //Journal of applied Physics. - 1957. - Т. 28. - №. 6. - С. 679-683.

58. Паташинский А. З., Покровский В. Л. Флуктуационная теория фазовых переходов. - "Наука,"Глав. ред. физико-математической лит-ры, 1982.

59. Stanley H. E. Phase transitions and critical phenomena. - Clarendon Press, Oxford, 1971. - С. 7.

60. Growth O. Form, edited by HE Stanley and N. Ostrowsky. - 1986.

61. Teixeira J. Small-angle scattering by fractal systems //Journal of Applied Crystallography. - 1988. - Т. 21. - №. 6. - С. 781-785.

62. Wong P., Cao Q. Correlation function and structure factor for a mass fractal bounded by a surface fractal //Physical Review B. - 1992. - Т. 45. - №. 14. - С. 7627.

63. Sinha S. K. Scattering from fractal structures //Physica D: Nonlinear Phenomena. - 1989. - Т. 38. - №. 1-3. - С. 310-314.

64. Freltoft T., Kjems J. K., Sinha S. K. Power-law correlations and finite-size effects in silica particle aggregates studied by small-angle neutron scattering //Physical Review B. - 1986. - Т. 33. - №. 1. - С. 269.

65. Kjems J. K. et al. Neutron scattering from fractals //Physica B+ C. - 1986.

- Т. 136. - №. 1-3. - С. 285-290.

66. Pfeifer P., Schmidt P. W. Pfeifer and Schmidt reply //Physical review letters. - 1988. - Т. 60. - №. 13. - С. 1345.

67. Wong P., Bray A. J. Porod scattering from fractal surfaces //Physical review letters. - 1988. - Т. 60. - №. 13. - С. 1344.

68. Bale H. D., Schmidt P. W. Small-angle X-ray-scattering investigation of submicroscopic porosity with fractal properties //Physical Review Letters.

- 1984. - Т. 53. - №. 6. - С. 596.

69. Федотов Г. Н. и др. Влияние влажности на фрактальные свойства почвенных коллоидов //Доклады Академии наук. - Федеральное государственное унитарное предприятие Академический научно-издательский, производственно-полиграфический и книгораспространительский центр Наука, 2006. - Т. 409. - №. 2. - С. 199-201.

70. Федотов Г. Н. и др. Механизм возникновения фрактальной организации у почвенных коллоидов //Доклады Академии наук. - Федеральное государственное унитарное предприятие Академический научно-издательский, производственно-полиграфический и книгораспространи-тельский центр Наука, 2007. - Т. 412. - №. 6. - С. 772-775.

71. Федотов Г. Н. и др. Фрактальные структуры коллоидных образований в почвах //Доклады Академии наук. - Федеральное государственное унитарное предприятие Академический научно-издательский, производственно-полиграфический и книгораспространительский центр Наука, 2005. - Т. 404. - №. 5. - С. 638-641.

72. Hammermann M. et al. Salt-dependent compaction of di-and trinucleosomes studied by small-angle neutron scattering //Biophysical journal. - 2000. - Т. 79. - №. 1. - С. 584-594.

73. Indekeu J. O., Fleerackers G. Logarithmic fractals and hierarchical deposition of debris //Physica A: Statistical Mechanics and its Applications.

- 1998. - Т. 261. - №. 3-4. - С. 294-308.

74. Grosberg A. Y., Nechaev S. K., Shakhnovich E. I. The role of topological constraints in the kinetics of collapse of macromolecules //Journal de physique. - 1988. - Т. 49. - №. 12. - С. 2095-2100.

75. Grosberg A. et al. Crumpled globule model of the three-dimensional structure of DNA //EPL (Europhysics Letters). - 1993. - Т. 23. - №. 5.

- С. 373.

76. West G. B., Brown J. H., Enquist B. J. The fourth dimension of life: fractal geometry and allometric scaling of organisms //science. - 1999. - Т. 284. -№. 5420. - С. 1677-1679.