Исследование влияния LINE1 элементов в интронах генов человека на их транскрипцию тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, кандидат биологических наук Устюгова, Светлана Викторовна

• Устюгова, Светлана Викторовна
• кандидат биологических наук
• 2007

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Устюгова, Светлана Викторовна

Список сокращений.

I. Введение.

II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. ТИПЫ РЕТРОЭЛЕМЕНТОВ И ИХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ С ГЕНОМОМ ЧЕЛОВЕКА.

I. Основные типы ретроэлементов генома человека.

1. Длинные диспергированные ядерные повторы (LINE).

1.1. Класс LINE 1.

1.1.1. Структура.

1.1.2. Классификация и номенклатура.

1.1.3. Размножение LINE 1 в геноме человека в процессе эволюции. 12 1.1.3.1 .Транскрипция и посттранскрипционые модификации РНК LINE1.

1.1.3.2.Трансляция ORF1 и ORF2 и функции ORF1 р и ORF2p.

1.1.3.3.Обратная транскрипция и интеграция в геном. 19 1.1.3.4.0бразование инвертированных и 5' укороченных копий L элементов.

1.2. Классы LINE2, LINE3, HAL1.

2. Короткие диспергированные ядерные повторы (SINE).

2.1. Alu элементы.

2.1.1. Структура.

2.1.2. Номенклатура.

2.1.3. Размножение Alu в геноме человека в процессе эволюции.

2.2. MIR элементы.

3. Ретроэлементы, содержащие длинные концевые повторы.

3.1. LTR-ретротранспозоны - MaLR.

3.2. HERV - эндогенные ретровирусы человека.

3.2.1.1.Структура.

3.2.1.2.Номенклатура.

3.2.1.3.Размножение HERV в геноме человека в процессе эволюции.

4. Химерные элементы.

4.1. SINE-R.

4.2. SVA. 32 II. Взаимодействие ретроэлементов с геномом человека.

5. Белки, кодируемые ретроэлементами, участвуют в некоторых клеточных процессах.

6. Последовательности ретроэлементов входят в состав регуляторных областей различных генов человека

7. Фрагменты последовательности ретроэлементов могут входить в кодирующую последовательность генов человека.

8. Геномные перестройки, ассоциированные с транспозиционной активностью ретроэлементов.

8.1. Инсерциоиный мутагенез.

8.2. Размножение неавтономных ретроэлементов и образование процессированпых псевдогенов.

8.3. L1-опосредованная трансдукция.

8.4. Гомологичная рекомбинация.

8.5. Генная конверсия

9. Инактивация X хромосомы.

10. Способы регуляции активности ретроэлементов в клетке. 47 Заключение.

III. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Материалы

Методы

IV. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Поиск видоспецифических и полиморфных интеграций L1 элементов и определение их локализации относительно генов человека.

2. Биоинформатический поиск полиморфных интеграций L1 элементов, расположенных в интронных областях генов человека.

3. Генотипирование серии опухолевых клеточных линий человека различного тканевого происхождения.

4. Определение уровней транскрипции аллельных вариантов генов, отличающихся полиморфными инсерциями ретроэлемента L1.

5. Создание набора рекомбинантных конструктов для функционального анализа интронных ретроэлементов в системе транзиентной экпрессии репортерного гена.

V. ВЫВОДЫ 94 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ млн - миллион(ы) н.т. - нуклеотид(ы) п.н. - пара нуклеотидов

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ОРФ - открытая рамка считывания

ОТ-ПЦР - полимеразная цепная реакция с обратной транскриптазой т.н. - тысяча нуклеотидов т.п.н. - тысяча пар нуклеотидов

EN (Endonuclease) - эндонуклеаза;

ERV (Endogenous Retrovirus) - эндогенный ретровирус

HERV (Human Endogenous Retrovirus) - эндогенный ретровирус человека

LINE (Long Interspersed Element) - длинный диспергированный повтор

LTR (Long Terminal Repeat) - длинный концевой повтор

MIR (Mammalian Interspersed Repeat) - одно из семейств SINE

ORF (Open Reading Frame) - открытая рамка считывания

PBS (Primer Binding Site) - сайт связывания тРНК-затравки

RT (Reverse transcriptase) - обратная транскриптаза;

SINE (Short Interspersed Element) - короткий диспергированный повтор

TSD (Target Site Duplication) - дупликация сайта интеграции ретроэлемента

U5 (5'Unique) - 5'-специфичный район ретровирусной геномной РНК

U3 (3' Unique) - 3 '-специфичный район ретровирусной геномной РНК

5'UTR (5' UnTranslated Region) - 5' нетранслируемая область

3'UTR (3' UnTranslated Region) - 3' нетранслируемая область

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Исследование влияния LINE1 элементов в интронах генов человека на их транскрипцию»

Одной из фундаментальных задач молекулярной биологии является изучение регуляторных систем, определяющих транскрипционную активность различных генов. Как один из факторов, способных изменять регуляцию экспрессии генов, современная геномика рассматривает размножение в геноме мобильных элементов, в первую очередь ретропозонов. Внедрение мобильного элемента в последовательность гена может изменить его транскрипционную активность, в зависимости от структурных и функциональных особенностей элемента. Анализ данных, полученных в ходе работы по определению нуклеотидной последовательности генома человека, выявил тот факт, что около 42% генома человека представлено ретроэлементами и одной из наиболее широко представленных в геноме человека групп ретроэлементов являются длинные диспергированные ядерные повторы LINE, и самый многочисленный класс среди них LINE1 или L1 [1]. Среди L1 ретроэлементов есть несколько эволюционно молодых и, по-видимому, транскрипционно активных семейств, характеризующихся довольно высокой частотой инсерционного полиморфизма. Опубликованные данные о распространенности инсерционных полиморфизмов позволяют предполагать, что ретропозиция L1 ретроэлементов происходит и в наше время, внося существенный вклад в формирование вариабельности генома человека современного вида. Считается, что геном каждого 50-ого новорожденного имеет новую копию L1 элемента [2, 3]. Кроме того, известен ряд de novo инсерций L1, ассоциированных с отдельными генетическими заболеваниями человека [4].

Таким образом, изучение роли ретроэлементов, включая L1 повторы, в эволюции и функционировании генома приматов относится к числу наиболее важных проблем современной молекулярной биологии. Опубликованные данные о количестве, распределении в геноме видоспецифических и полиморфных инсерций L1 и их возможном взаимодействии с генами получепы либо с использованием биоинформатических подходов и методов анализа, либо па модельных объектах. В связи с этим проведение полногеномного поиска видоспецифических и полиморфных инсерций L1 ретроэлемента и исследование их влияния на экспрессию генов человека является актуальной задачей функциональной геномики.

Цели и задачи работы.

Целью данной работы является изучение влияния полиморфных интронных интеграций

L1 элементов на экспрессию генов человека.

Были поставлены следующие экспериментальные задачи:

- с использованием оригинальных экспериментальных подходов, а также методов биоинформационного анализа, провести полногеномный поиск видоспецифических и полиморфных интеграций L1 элементов и определить их локализацию относительно генов человека;

- на основе идентифицированных полиморфных интеграций L1 с интронной локализацией, сконструировать информативный набор генетических маркеров и провести генотипирование серии опухолевых клеточных линий различного тканевого происхождения;

- провести сравнительный анализ экспрессии аллельных пар генов человека в клеточных линиях, гетерозиготных по интронным инсерциям L1 элементов.

I. ОСНОВНЫЕ ТИПЫ РЕТРОЭЛЕМЕНТОВ ГЕНОМА ЧЕЛОВЕКА.

Ретроэлементы представляют собой мобильные элементы генома, увеличение числа копий которых происходит в процессе ретротранспозиции, включающей транскрипцию ДНК ретроэлемента, обратную траспкрипцию и встраивание кДНК копии в новое место генома. Ретроэлементы делятся на две группы: неавтономные и автономные ретроэлементы. Неавтономные ретроэлементы или ретропозоны не содержат гены, кодирующие ретропозиционный аппарат, и перемещаются по геному пассивно (к этой группе относятся короткие диспергированные повторы - SINE и процессировапные псевдогены). Автономные ретроэлементы или ретротранспозоны кодируют собственный ретропозиционный аппарат и перемещаются по геному активно (в эту группу входят длинные диспергированные ядерные элементы - LINE и ретроэлементы, содержащие длинные концевые повторы, - LTR-элементы). Представленность различных ретроэлементов в геноме человека показана в Таблице 1.

Таблица 1. Представленность ретроэлементов в геноме человека (цитируется по [1]).

Тип ретроэлемента Число копий в суммарная длина Число в геноме (в % от семейств хЮОО) сиквенированной части генома) (подсемейств)

SINEs 1,558 13,14

Alu 1,090 10,60 1(«20)

MIR 393 2,20 1(1)

MIR3 75 0,34 1(1)

LINEs 868 20,42

LIN EI 516 16,89 1(«55)

LINE2 315 3,22 1(2)

LINE3 37 0,31 1(2)

LTI^eMeHTbi 443 8,29

ERVioiaccl 112 2,89 72(132)

ERVioiacc2 8 0,31 10(20)

ERVioiacc3 83 1,44 21(42)

MaLR 240 3,65 1(31)

ДНК-элементы 294 2,84

Общее количество 44,83 повторов

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Устюгова, Светлана Викторовна

выводы.

1) Проведен полномасштабный скрининг уникальных клонотек геномной ДНК человека, обогащенных участками видоспецифических инсерций L1 ретроэлементов. Впервые выявлено 18 L1 инсерций, специфичных для генома человека, и охарактеризовано их генное окружение. Для четырех из 18 вновь идентифицированных L1 элементов показано явление инсерционного полиморфизма.

2) Обнаружен и структурно охарактеризован новый химерный ретроэлемент, ограниченный короткими прямыми повторами, характерными для L1 интеграции, и включающий З'-концевой фрагмент L1 элемента.

3) Проведен исчерпывающий анализ геномных баз данных и составлен каталог полиморфных интеграций L1 элементов, локализованных в интронах известных и предсказанных генов человека. Создана серия новых генетических маркеров, включающая набор из 26 пар уникальных олигонуклеотидных праймеров, которые соответствуют участкам интеграции выявленных полиморфных интеграций L1.

4) Разработан оригинальный метод генотипирования клеточных линий, основанный на параллельной ПЦР амплификации 38 локусов генома человека, содержащих полиморфные интеграции ретроэлементов.

5) Предложен новый подход к изучению воздействия ретроэлементов на экспрессию генов человека. Проведен сравнительный анализ содержания первичных транскриптов пар аллельных вариантов генов в 10 клеточных линиях человека, гетерозиготных по 14-ти интронным инсерциям L1 элементов. Показано, что интеграция L1 элемента снижает уровень транскрипции соответствующего аллеля гена примерно на 2 порядка. Обнаруженный ингибиторный эффект характеризует полноразмерные L1 элементы и имеет выраженный тканеспецифический характер.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Устюгова, Светлана Викторовна, 2007 год

1. Lander, E.S., et al. (2001) Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature. 409(6822): p. 860-921.

2. Ostertag, E.M., et al. (2002) A mouse model of human LI retrotransposition. Nat Genet. 32(4): p. 655-60.

3. Prak, E.T., et al. (2003) Tracking an embryonic LI retrotransposition event Proc Natl Acad Sci USA. 100(4): p. 1832-7.

4. Chen, J.M., Ferec, C., and Cooper, D.N. (2006) LINE-1 Endonuclease-Dependent Retrotranspositional Events Causing Human Genetic Disease: Mutation Detection Bias and Multiple Mechanisms of Target Gene Disruption. J Biomed Biotechnol. 2006(1): p. 56182.

5. Burton, F.H., et al. (1986) Conservation throughout mammalia and extensive protein-encoding capacity of the highly repeated DNA long interspersed sequence one. J Mol Biol. 187(2): p. 291-304.

6. Smit, A.F. (1996) The origin of interspersed repeats in the human genome. Curr Opin Genet Dev. 6(6): p. 743-8.

7. Scott, A.F., et al. (1987) Origin of the human LI elements: proposed progenitor genes deduced from a consensus DNA sequence. Genomics. 1(2): p. 113-25.

8. Smit, A.F., et al. (1995) Ancestral, mammalian-wide subfamilies of LINE-1 repetitive sequences. J Mol Biol. 246(3): p. 401-417.

9. Khan, H., Smit, A., and Boissinot, S. (2006) Molecular evolution and tempo of amplification of human LINE-1 retrotransposons since the origin of primates. Genome Res. 16(1): p. 78-87.

10. Goodier, J.L., et al. (2001) A novel active LI retrotransposon subfamily in the mouse. Genome Res. 11(10): p. 1677-85.

11. Mears, M.L. and Hutchison, C.A., 3rd. (2001) The evolution of modern lineages of mouse LI elements. JMolEvol. 52(1): p. 51-62.

12. Boissinot, S. and Furano, A.V. (2001) Adaptive evolution in LINE-1 retrotransposons. Mol Biol Evol. 18(12): p. 2186-94.

13. Skowronski, J. and Singer, M.F. (1986) The abundant LINE-1 family of repeated DNA sequences in mammals: genes and pseudogenes. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 51 Pt 1: p. 457-64.

14. Boissinot, S., Chevret, P., and Furano, A.V. (2000) LI (LINE-1) retrotransposon evolution and amplification in recent human history. Mol Biol Evol. 17(6): p. 915-28.

15. Myers, J.S., et al. (2002) A comprehensive analysis of recently integrated human Та LI elements. Am J Hum Genet. 71(2): p. 312-26.

16. Konkel, M.K., et al. (2007) Identification and characterization of novel polymorphic LINE-1 insertions through comparison of two human genome sequence assemblies. Gene. 390(1-2): p. 28-38.

17. Salem, A.H., et al. (2003) LINE-1 preTa elements in the human genome. J Mol Biol. 326(4): p. 1127-46.

18. Swergold, G.D. (1990) Identification, characterization, and cell specificity of a human LINE-1 promoter. Mol Cell Biol. 10(12): p. 6718-29.

19. Singer, M.F., et al. (1993) LINE-1: a human transposable element Gene. 135(1-2): p. 183-8.

20. Lavie, L., et al. (2004) The human LI promoter: variable transcription initiation sites and a major impact of upstream flanking sequence on promoter activity. Genome Res. 14(11): p. 2253-60.

21. Geiduschek, E.P. and Kassavetis, G.A. (2001) The RNA polymerase III transcription apparatus. J Mol Biol. 310(1): p. 1-26.

22. Kurose, K., et al. (1995) RNA polymerase III dependence of the human LI promoter and possible participation of the RNA polymerase II factor YY1 in the RNA polymerase III transcription system. Nucleic Acids Res. 23(18): p. 3704-9.

23. Weis, L. and Reinberg, D. (1992) Transcription by RNA polymerase II: initiator-directed formation of transcription-competent complexes. FasebJ. 6(14): p. 3300-9.

24. Minchiotti, G., Contursi, C., and Di Nocera, P.P. (1997) Multiple downstream promoter modules regulate the transcription of the Drosophila melanogaster I, Doc and F elements. J Mol Biol. 267(1): p. 37-46.25.