Изменение водного и ионного баланса клеток U937 при апоптозе, вызванном этопозидом и стауроспорином тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.25, кандидат биологических наук Широкова, Анна Вячеславовна

• Широкова, Анна Вячеславовна
• кандидат биологических наук
• 2008

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Широкова, Анна Вячеславовна

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Общая схема запуска и развития апоптоза

Дегидратация клеток при апоптозе

Изменение при апоптозе внутриклеточного содержания и концентрации К+

Изменение при апоптозе внутриклеточного содержания и концентрации

Изменение при апоптозе внутриклеточного содержания и концентрации С1 и Р.—

Изменение при апоптозе внутриклеточного рН

I Изменение при апоптозе разности электрических потенциалов на клеточной мембране

Механизмы изменения внутриклеточного ионного состава.

ЫсГ/ КГ насос.

КГ каналы

Ыа~ каналы.

Другие тракты.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Изменение водного и ионного баланса клеток U937 при апоптозе, вызванном этопозидом и стауроспорином»

Апоптоз - программируемая гибель клеток, естественный процесс, предназначенный для элиминации поврежденных клеток, либо клеток "не нужных" по программе индивидуального развития организма. Неспособность клеток подвергаться апоптозу одна из причин возникновения опухолей. Апоптоз может быть вызван как эндогенными, так и экзогенными факторами и отличается от некроза по ряду признаков. Важнейший из них в функциональном плане - отсутствие воспалительной реакции соседних клеток на продукты распада. Характерные признаки апоптоза: утрата межклеточных контактов, блеббинг, дегидратационное сжатие клеток, разрушение цитоскелета, фрагментация ядер, конденсация хроматина, деградация ДНК (см. обзоры: Hacker, 2000; Bortner, Cidlowski, 2002; Elmore, 2007).

Сокращение объема клеток исторически рассматривалось как главный признак апоптоза, отличающий его от некроза. Апоптоз определялся как "shrinkage necrosis" (Kerr, 1971). Заключение об уменьшении объема клеток ранее делали на основании микроскопии фиксированных гистологических препаратов. В настоящее время апоптоз изучают во многих случаях на живых клетках, и вывод о сокращении размеров клеток обычно основан на измерениях малоуглового светорассеяния при проточной цитометрии, хотя этот метод нельзя считать строгим. Апоптозное снижение объема клеток (Apoptotic Volume Decrease, AVD) связывают с их дегидратацией (Okada et al., 2001; Ernest et al., 2007). Интерес к исследованию роли моновалентных ионов в апоптозе в последние годы не ослабевает (Lang et al., 2005; 2006; 2007; 2008). Широко распространено представление, что выход внутриклеточного К+ является важным фактором, сопровождающим, а по мнению многих исследователей и обуславливающим апоптоз (см. обзоры: Bortner, Cidlowski, 2002; Park, Kim, 2002; Yu, 2003a; Bortner et al., 2008). Ряд исследователей считает, что изменение внутриклеточной концентрации К+ при апоптозе изменяет состояние каспаз и нуклеаз (Hughes et al., 1997; Hughes, Cidlowski, 1999). Тем не менее, работ, в которых ионный и водный баланс клеток при апоптозе измеряли бы параллельно и комплексно, мало и остается неясным, как изменение содержания К+ в клетках соотносится с изменением содержания внутриклеточной воды и, соответственно, с изменением концентрации К+ во внутриклеточной воде. Представлялось актуальным исследовать этот вопрос, используя наиболее чувствительный в настоящее время метод определения внутриклеточного содержания воды путем измерения плавучей плотности клеток в градиенте Перколла и технику эксперимента, позволяющую анализировать содержания ионов в отдельных плотно-стных фракциях. Такой подход ранее не применялся.

Актуальным представлялось также исследование изменений баланса моновалентных ионов при апоптозе, не сопровождающемся дегидратацией, то есть таком, который по нашим наблюдениям имеет место при апоптозе клеток и937, вызываемом этопозидом. Предполагалось, что изучение изменений ионного баланса, не сопровождающихся нарушением водного баланса, даст более широкую картину участия в апоптозе основных систем переноса моновалентных ионов через клеточную мембрану.

Цели и задачи исследования. Цель данной работы - сравнительное исследование изменения ионного и водного баланса клеток 11937 при апоптозе, вызванном стауроспорином, когда по предварительным наблюдениям имела место дегидратация клеток, и при апоптозе, вызванном этопозидом, когда водный баланс не изменялся. В связи с поставленной целью необходимо было провести следующие исследования:

1. Путем измерения плавучей плотности клеток 11937 определить наличие или отсутствие дегидратации при апоптозе, вызванном стауроспорином и этопозидом.

2. С помощью эмиссионного и радиоизотопного анализа определить внутриклеточное содержание К+, На+ и СГ и измерить потоки Шэ4* через клеточную мембрану клеток Ш37 при апоптозе, вызванном стауроспорином и этопозидом.

3. Для диагностики апоптоза провести проточную цитометрию и флуоресцентную микроскопию клеток.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Общая схема запуска и развития апоптоза. Главные сигнальные пути при запуске апоптоза схематически показаны на рис. 1. Апоптоз может быть вызван как внешними, так и эндогенными сигналами, к важнейшим из которых относится повреждение ДНК (см. обзоры: Ghobrial et al., 2005; Reed, 2000; Elmore, 2007). Апоптоз - сложный многостадийный процесс, в котором существенную роль играют каспазы - семейство эволюционно консервативных про-теаз (см. обзор: Earnshaw et al., 1999). В нормальном состоянии каспазы присутствуют в клетке в неактивной форме, как проензимы. Различают два вида каспаз: "инициирующие" и "эффекторные" (см. обзор: Kaufmann, Earnshaw,

2000). К первым относятся каспазы 8, 9, 10, 12 (см. обзоры: Но, Hawkins, 2005; Vermeiden et al., 2005), которые после активации действуют на эффекторные каспазы 3, 6, 7, 14. Каспаза 2 обладает как инициирующими, так и эффектор-ными функциями (см. обзор: Zhivotovsky, Orrenius, 2005). Мишени эффектор-ных каспаз многообразны. Так например, для каспазы 3 это может быть фактор фрагментации ДНК DFF-45, гельзолин, PARP-полимераза или РАК2-киназа (Janicke et al., 1998). Только на этапе активации инициирующих каспаз апоптоз обратим.

Механизмы активации инициирующих каспаз могут быть различными. Рецепторный путь запуска каспазного каскада начинается с активации одного из расположенных на клеточной мембране рецепторов, воспринимающих внешний сигнал, например, Fas/CD95, TNF, DR-4, DR-5 и т.п.( см. обзор: Kaufmann, Hengartner, 2001). В случае рецептора Fas §го активация одноименным лигандом либо антителами ведет к присоединению к рецептору адаптора FADD (Fas-associated protein with death domain). FADD, в свою очередь, связывается с прокаспазой 8, что приводит к активации каспазы 8, которая затем активирует прокаспазу 3 (рис. 1). Такой тип передачи сигнала имеет место, например, у лимфоидных клеток. У других клеток активации каспазы 8 недостаточно для активации прокаспазы 3 (см. обзор: Kaufmann, Hengartner,

2001).

В случае митохондриального пути запуска каспазного каскада ключевым звеном является изменение состояния митохондрий, при котором снижается мембранный потенциал на внутренней мембране, в ней образуются гигантские поры, матрикс набухает, разрывается наружная мембрана, из мито

Рецепторньш сигнал . >

Лиганд

Каспазный рецептор ный путь

V.

Гельзолин PARP-полимер аз а

КаспазаЗ

Апоптосома

Цитохром С

AIF

Каспаза • независимый путь

РАК2-киназа

Каспазный митохондриальный путь

Другие мишени

Расщепление ДНК

Эндогенные сигналы

Повреждение

Вс1-х

Вс1-2

Рис. 1. Схема передачи сигналов при апоптозе (по: Hengartner 2000 с дополнениями).

CD95 - рецептор, расположенный на клеточной мембране; FADD - (Fas associated protein with death domain), адаптор; Bid, Bcl-Xi. Bcl-2, Bax - белки семейства Bcl-2,p53 - белок-супрессор развития опухолей; Apaf- фактор активации протеаз, AIF - фактор индукции апоптоза; цитохром с -белок митохондриальной электрон-транспортной цепи. хондрий выходит ряд белков, в частности, цитохром с (см. обзор: Bernardi et al., 2001). Последний в комбинации с фактором Apaf-1 (apoptotic protease-activating factor-1) и прокаспазой 9 образует так называемый апоптосомный комплекс, в котором прокаспаза превращается в каспазу 9 (см. обзор: Green, Reed, 1998). Далее каспаза 9 активирует каспазу 3. Рецепторный и митохондриальный пути активации каспазного каскада сходятся на стадии активации какой-либо эф-фекторной каспазы. Так например, каспаза 3 или 7, действуя на комплекс ДНК-азы CAD (Caspase Activated DNase) с ингибитором DFF-45/ICAD, отщепляет и инактивирует последний. Свободная CAD вызывает межнуклеосомные разрывы ДНК и образование фрагментов в 180-200 пар оснований (Tang, Kidd, 1998; Nagata et al., 2003). Один из белков семейства Вс1-2, промотор апоптоза Bid также может связывать рецепторный и митохондриальный путь (см. обзор: Roy, Nicholson, 2000).

Митохондрии являются ключевым звеном в передаче сигнала во время апоптоза, связанного с повреждением ДНК и действием на клетку разного рода агентов, в частности, активных форм кислорода (Aoki et al., 2002), высокой температуры (Beere, 2004) и других факторов. Автономную самоликвидацию митохондрий в настоящее время называют митоптозом (Skulachev 2000). Важную роль при митохондриальном пути активации каспаз играет белок р53. Отсутствие или мутация гена р53 приводит к блокированию апоптоза и способствует развитию злокачественных новообразований из-за прекращения элиминации злокачественных клеток. При действии ультрафиолетового излучения, радиации, химиопрепаратов и других факторов, приводящих к нарушениям структуры ДНК, уровень р53 повышается (Chen et al.,1996; Bedner et al., 2000). Помимо передачи сигнала в митохондрии, р53 может участвовать в активации экспрессии проапоптозных генов и подавлении экспрессии антиапоп-тозных генов (см. обзор: Haupt et al, 2003).

На наружной мембране митохондрий локализована большая часть белков семейства Вс1-2, в состав которого входят промоторы (Вах, Bid, Bik) и ингибиторы (собственно Bcl-2, Bc1-Xl) апоптоза. От соотношения активности этих белков зависит, состоится или нет апоптоз (см. обзор: Hengartner, 2000).

Открытие AIF (apoptosis inducing factor) является важным этапом в развитии представлений о существующих в клетке сигнальных апоптозных каскадах. Этот митохондриаль-ный флавопротеин перемещается от митохондрий к ядру, где вызывает конденсацию хроматина на периферии ядра и разрыв ДНК на крупные фрагменты. В этом случае действует каспаза-независимый механизм (Susin et al., 2000; см. обзор: Cande et al., 2002). Таким образом, AIF и цитохром с выполняют важную роль проапоптозных факторов.

Дегидратация клеток при апоптозе. Уменьшение объема клетки исторически принято считать одним из важнейших признаков, отличающим апоп-тоз от некроза (Kerr, 1971). Первоначально заключение об уменьшении объема делали на основании микроскопии фиксированных гистологических препаратов. В настоящее время объектами исследований являются преимущественно живые клетки и вывод о сокращении размеров клеток при индукции апоптоза, чаще всего основан на измерениях малоуглового светорассеяния при проточной цитометрии, хотя этот метод нельзя считать строгим (см. обзор: Shapiro, 1988). В настоящее время апоптозное снижение объема клеток (apoptotic volume decrease, AVD) связывают с их дегидратацией (Okada et al., 2001; Ernest et al., 2007). Определение дегидратации клеток путем измерения их плавучей плотности давно используется для выделения апоптозных клеток, в частности, тимоцитов (Thomas, Bell, 1981; Wyllie, Morris,1982; Cohen et al.,1993; Dumont et al., 2000). Полагают, что механизм AVD аналогичен механизму реакции регу-ляторного снижения объема клеток после их первичного набухания в гипоос-мотической среде (regulatory volume decrease, RVD). По мнению ряда исследователей дегидратация клеток не только следствие апоптоза, но может быть и индуктором апоптоза. Показано, что апоптоз вызывается гипертоническим шоком (Morales et al., 2000; Michea et al., 2002; Rao et al., 2004). Сообщалось, что увеличение осмолярности до 687 мосмоль вызывает сжатие NIH ЗТЗ фиб-робластов, индуцирует активацию протеин киназы р38, ядерную транслокацию р53 и активацию каспазы 3 (Friis et al., 2005). В трактовке Маено (Маепо et al., 2006) при гипертоническом стрессе клетка подвергается дегидратации вследствие осмотического дисбаланса и изменение содержания воды является причиной изменения ионного состава и, далее, апоптоза, в то время как традиционные индукторы апоптоза вызывают уменьшение объема клетки в изото-ничной среде и первопричиной является выход моновалентных ионов.

Апоптозное сжатие клеток может наблюдаться как в течение первых десятков мин, так и в течение десятков часов (Benson et al., 1996; Chang et al., 2000). На клетках HL60, HeLa, и U937 показано, что уменьшение клеточного объема опережает такие проявления апоптоза, как выход фосфатидилсерина на поверхность плазматической мембраны, выявляемый по связыванию аннексина V (McCarthy, Cotter, 1997), выход цитохрома с из митохондрий, активация кас-пазы 3 и фрагментация ДНК (Maeno et al., 2000; Hessler et al., 2005).

Каким образом уменьшение объема клеток при апоптозе связано с кас-пазным каскадом? Данных на это тему мало. На клетках Jurkat показано, что каспазный ингибитор широкого спектра действия z-VAD, блокирует все основные проявления апоптоза, вызванного через Fas-рецептор, включая уменьшение объема, а при индукции апоптоза кальциевым ионофором А23187 или тапсигаргином этот ингибитор не отменяет уменьшения объема, что предполагает каспазный механизм в первом случае и некаспазный механизм во втором случае (Bortner, Cidlowski, 1999). Уменьшение клеточного объема и конденсацию хроматина при апоптозе активированных Т-лимфоцитов отмечали при каспаза-независимом механизме с участием AIF (Dumont et al., 2000). При апоптозе клеток Jurkat, индуцированном радиацией или через Fas-рецептор, уменьшение объема, регистрируемое по малоугловому светорасея-нню при проточной цитометрии, имело место в обоих случаях, хотя и регулировалось различными инициирующими каспазами - 8 и 9 (Vu et al., 2001). При апоптозе кортикальных нейронов AVD не предотвращалось в присутствии каспазного ингибитора широкого спектра действия z-VAD (Bossy-Wetzel et al., 2004). На клетках гепатомы при апоптозе, вызванном стауроспорином, каспазный ингибитор широкого спектра действия предотвращал активацию кас-паз, но не оказывал влияния на уменьшение клеточного объема (Krumschnabel et al., 2007). Из вышесказанного можно сделать вывод, что AVD может наблюдаться как при каспаза-зависимой (рецепторной, митохондриальной), так и при каспаза-независимой индукции апоптоза. На клетках Jurkat, апоптоз которых вызывали через Fas-рецептор, обнаружено, что стимуляция протеинкиназы С форболовым эфиром (РМА) и бриостатином-1 отменяет апоптозное снижение объема, а ингибирование протеинкиназы С индолкарбазолом G66976 способствует AVD (Gómez-Angelats et al., 2000).

Изменение при апоптозе внутриклеточного содержания и концентрации К*". Изменение содержания воды в клетке тесно сопряжено с изменением внутриклеточного ионного состава, "ионы идут с водой". Первопричиной является движение ионов (Веренинов, Марахова 1986). Широко распространено представление, что выход внутриклеточного К+ является важным процессом, сопровождающим, а по мнению многих исследователей, и обуславливающим AVD (см. обзоры: Bortner, Cidlowski, 2002, 2007; Park, Kim, 2002; Yu, 2003a). Тем не менее, работ, в которых ионный и водный баланс клеток при апоптозе измеряли бы параллельно, мало. Необходимо различать изменение концентрации катионов во внутриклеточной воде и изменение содержания катионов на единицу сухой массы. Показано, что вызванный дексаметазоном апоптоз лимфоидных клеток СЕМ не сопровождается существенным снижением концентрации К+ в то время как содержание К+, измеренное методом пламенной фотометрии, уменьшается на 15% (Benson et al., 1996). О снижении внутриклеточной концентрации К+ в клетках HL60 при апоптозе, вызванном ультрафиолетом, сообщают МакКарти и Коттер (McCarthy, Cotter, 1997). По другим данным, полученным на фибробластах мыши с помощью флуоресцентных зондов, концентрация К+ уменьшалась от 110 до 50 мМ (Barbiero et al., 1995). На начальной стадии AVD отмечали уменьшение концентрации К+ от 139.5 мМ до 30 мМ (Bortner et al., 2008). Приводимое в этой работе столь низкая концентрация К+ вызывает удивление. По данным рентгеновского микроанализа при апоптозе, вызванном ультрафиолетовым облучением, содержание К+ в клетках U937 снижается с 391 до 196 мкмоль на 1 г сухой массы (Fernández-Segura et al., 1999). Аналогичные данные получены на моноцитах человека при апоптозе, вызванном окисленными липопротеидами. В этом случае содержание К+ снижалось от 616 до 291 мкмоль на 1 г сухой массы (Skep-per et al ., 1999). Снижение содержания К+ от 416 до 216 мкмоль на 1 г сухой массы показано методом рентгеновского микроанализа при апоптозе клеток U937, вызванном стауроспорином (Arrebola et al., 2005b).

Ряд исследователей считает, что изменение концентрации К+ во внутриклеточной воде изменяет состояние каспаз при апоптозе (Hughes et al., 1997; Hughes, Cidlowski, 1999). Показано, что изменение ионного состава клеток с помощью ионофоров (валиномицина, нигерицина, амфотерицина В) индуцирует апоптоз у клеток разного типа (Inai et al., 1997; Oh et al., 1997; Furlong et al., 1998; Marklund et al., 2001). Единственное альтернативное мнение высказывается в работе, авторы которой исследовали вызванный гипертонией апоптоз клеток HL-60. Увеличение тоничности среды до 450-600 мосмоль индуцировало клеточную гибель при высоком уровне К+ в клетке (Ghosh et al., 2007).

Изменение при апоптозе внутриклеточного содержания и концентрации Na+. Рост концентрации Na+ во внутриклеточной воде от 15 до 30 мМ отмечали при апоптозе фибробластов мыши, индуцированном этопозидом. Измерения флуоресценции натриевого зонда (SBFI) в этой работе проводили в монослое клеток (Barbiero et al., 1995). Аналогичные данные получены тоже по флуоресценции, но методом проточной цитометрии на клетках Jurkat при апоптозе, индуцированном через Fas-рецептор (Bortner et al., 2001). На начальной стадии AVD Бортнер с соавторами отмечали увеличение концентрации Na+ от 12 мМ до 113.6 мМ (Bortner et al., 2008).

Увеличение содержания Na+ от 52 до 197 мкмоль на 1 г сухой массы при апоптозе клеток U937, вызванном ультрафиолетом, показано с помощью рентгеновского микроанализа (Fernández-Segura et al., 1999). Тем же методом нашли, что у моноцитов человека при апоптозе, вызванном окисленными ли-попротеинами, содержание натрия увеличивается от 42 до 103 мкмоль на 1 г сухой массы (Skepper et al ., 1999). Увеличение внутриклеточного содержания Na+ от 63 до 143 параллельно с уменьшением содержания К+ с 416 до 216 мкмоль на 1 г сухой массы показано с помощью рентгеновского микроанализа на клетках U937, апоптоз которых индуцировали стауроспорином (Arrebola et al., 2005b).

Изменение при апоптозе внутриклеточного содержания и концентрации CI и Р. Снижение содержания в клетке катионов должно сопровождаться снижением содержания анионов. Что это за анионы? На клетках U937, апоптоз которых был вызван стауроспорином, по данным рентгеновского микроанализа содержание С1 снижается от 143 до 103 мМ на 1 кг сухого веса, а содержание Р не изменяется (Arrebola et al., 2005b). При апоптозе этих клеток, вызванных ультрафиолетом по данным той же группы исследователей содержание CI уменьшалось от 156 до115 мкмоль, а содержание Р составляло 299 и 314 мкмоль на 1 г сухой массы (Fernández-Segura et al., 1999). При апоптозе, вызванном окисленными липопротеинами, на моноцитах человека методом рентгеновского микроанализа показано снижение содержания С1 от 152 до 58, а Р - от 672 до 465 мкмоль на 1 г сухой массы (Skepper et al., 1999).Содержание так называемых "непроникающих через клеточную мембрану" анионов, которое можно оценить по разности содержания в клетках катионов К+ и Na+ и "проникающих" анионов С1" и Н2РО4" , при апоптозе либо не изменяется (Arrebola et al., 2005b; Fernández-Segura et al., 1999), либо уменьшается (Skepper et al., 1999).

Помимо выхода моновалентных ионов, при апоптозе отмечали выход органических осмолитов. На клетках Jurkat стимуляция Fas-рецептора приводила к апоптозу, сопровождающемуся снижением содержания в клетке таури-на на 60 % (Lang et al., 1998). Выход таурина наблюдали и при апоптозе нейронов (Moran et al., 2000).

Изменение при апоптозе внутриклеточного рН. Большинство исследователей отмечает подкисление цитоплазмы при апоптозе примерно на 0.3-0.4 единицы рН. Впервые это было показано на клетках HL60 (Barry, Eastman, 1992). Сводку данных по изменению внутриклеточной величины рН (pH¡) при апоптозе можно найти в обзоре Лагадик-Госсманн с сотрудниками (см. обзор: Lagadic-Gossmann et al., 2004). По данным Ланга с сотрудниками в случае С095-индуцированного апоптоза клеток Jurkat закисление внутриклеточной среды связано с ингибированием Na+/H+обмена (Lang et al., 2000). Аналогичные результаты получены для клеток Molt4, СЕМ, К562 (Rich et al., 2000).

Связано ли изменение pH¡ при апоптозе с его сигнальными каскадами? Подкисление цитоплазмы наблюдали при рецепторной, митохондриальной и каспаза-независимой индукции апоптоза. При рецепторном запуске апоптоза снижение рН наблюдали после активации каспаз. При митохондриальном запуске апоптоза закисление по данным некоторых авторов предшествует активации каспаз (Furlong et al.,1998; Matsuyama, Reed, 2000). Обнаружена pH-чувствительная эндонуклеаза, играющая, как полагают, важную роль в ДНК-фрагментации (Barry, Eastman, 1993). С другой стороны, на клетках СЕМ было показано, что при апоптозе, вызванном дексаметазоном и этопозидом, под-кисление несущественно для эффекторной стадии развития апоптоза. Максимум активности каспазы 3 достигался в этом случае при нейтральном рН (Benson et al., 1999). Некоторые авторы сообщают о раннем внутриклеточном подщелачивавши, предшествующем активации каспаз и фрагментации ДНК, иногда с последующим подкислением (Belaud-Rotureau et al., 2000). Подводя итоги, отметим точку зрения, согласно которой изменения рН, не связаны с регуляцией апоптоза, а представляют собой сопутствующее явление (см. обзор: Shrode et al., 1997).

Изменение при апоптозе разности электрических потенциалов на клеточной мембране. Деполяризация клеток при апоптозе описана рядом авторов. Снижение мембранного потенциала при апоптозе тимоцитов, окрашенных потенциал-чувствительным красителем DiOCe, наблюдали после изменения митохондриального мембранного потенциала; деполяризация наступала в присутствии тетрапентиламмония - блокатора К+- каналов (Dallaporta et al.l999). Сообщалось об уменьшении потенциала на плазматической мембране клеток Jurkat при Fas-индуцированном апоптозе и апоптозе, вызванном тапси-гаргином (Bortner et al., 2001). Деполяризация, выявленная в этой работе по изменению флуоресценции DiBAC4 с помощью проточной цитометрии клеток, окрашенных красителем, предшествовала уменьшению объема клеток, оцененного по малоугловому светорассеянию. Деполяризация мембраны, связанная, как полагают, с деградацией натриевого насоса, обнаружена путем электрических измерений на тимоцитах крысы, апоптоз которых вызывали глюкокорти-коидами (Mann et al., 2001). Деполяризация в этом случае наступала одновременно с клеточным сжатием. Описана каспаза-зависимая деполяризация клеток MCF7 при апоптозе, индуцированном стауроспорином, которую авторы связывают с нарушением работы натриевого насоса (Dussmann et al., 2003). На клетках U937 при Fas- и АзчОз-индуцированном апоптозе также наблюдали деполяризацию плазматической мембраны, причем в случае Fas-индукции деполяризация была каспаза-зависимой. Авторы предполагают, что существуют различные механизмы деполяризации на одних и тех же клетках в зависимости от типа индуктора (Nolte et al., 2004). Возможные механизмы деполяризации при апоптозе рассматриваются в обзоре Франко с сотрудниками (см. обзор: Franco et al., 2006). Необходимо отметить и случай, когда наблюдали связанную с апоптозом гиперполяризацию клеток (Zurgil et al., 2000), которая имела место при дексаметазон-индуцированном апоптозе тимоцитов мыши. В этом случае гиперполяризация предшествовала выходу фосфатидил-серина на поверхность плазматической мембраны и коррелировала с изменением малоуглового светорассеяния.

Механизмы изменения внутриклеточного ионного состава. Два фактора обуславливают характерное для всех клеток асимметрич

7 Я

Рис. 2. Основные пути переноса однозарядных ионов через плазматическую мембрану (по: Hoffmann 1987, с изменениями). 1 - Ка+/Н+-обменник; 2 - СГ /НСОз'-обменник; 3 - Ыа+,К+-АТФазный насос; 4 -Ма+СГ-котранспортер; 5 -№7К+/2СГ-котранспортер; б - натриевые каналы; 7 - калиевые каналы; 8 -хлорные каналы. А" - анионы, непроникающие через мембрану. Стрелки вверх указывают на движение ионов против градиента, стрелки вниз - на движение по градиенту электрохимического потенциала. ное распределение однозарядных ионов между цитоплазмой и средой: (1) наличие в плазматической мембране транспортеров, способных переносить ионы через мембрану против градиента их электрохимического потенциала за счет гидролиза АТФ или за счет движения через мембрану по градиенту каких-либо других ионов или незаряженных молекул (рис. 2) и (2) наличие внутри клетки анионов, которые не способны выходить из нее в среду (см. обзоры: Верени-нов, 1978; Hoffmann, 1987; Macknight, 1987; Sperelakis, 1997).

На К+ приходится обычно около половины общей осмотической активности внутриклеточных компонентов. Содержание К+ в клетке зависит от содержания в ней непроникающих анионов и от состояния соответствующих трактов переноса К+ через клеточную мембрану. На распределение К+ влияет и распределение других ионов, в частности Na+ и СГ, которое в свою очередь зависит от состояния путей их переноса через мембрану. Каким образом при апоптозе изменяется работа вышеперечисленных трактов? Ниже приведены данные, характеризующие состояние основных из них, наиболее часто упоминающихся в связи с апоптозом.

Na+/K+ насос играет ключевую роль в поддержании низкой концентрации в клетке натрия и высокой концентрации К+. Ряд данных указывает на снижение активности насоса при апоптозе (см. обзор: Yu, 2003b). Деградация обеих субъединиц натриевого насоса при апоптозе тимоцитов, вызванном дек-саметазоном, показана методом иммуноблотинга (Mann et al., 2001). Деградация каталитической и регуляторной субъединиц Na+, К+-АТФазы, уменьшение входного уабаин-чувствительного потока Rb+, проапоптозное действие уабаина (ингибитора Na+, К+-АТФазы) при Fas-индукции показано на клетках Jurkat (Bortner et al., 2001). Деградация регуляторной субъединицы Na+, 'К+-АТФазного насоса показана при апоптозе клеток MCF7, индуцированном стауроспорином (Düssmann et al., 2003). Существенное уменьшение уабаин-чувствительного входного потока Rb+ наблюдали при апоптозе клеток Р31, вызванном амфотерицином В (Marklund et al., 2001). Рентгеновский микроанализ показал, что апоптоз клеток U937, вызванный стауроспорином, сопровождается снижением входного потока рубидия через натриевый насос (Arrebola et al., 2005а, 2005b). При С095-индуцированном апоптозе клеток Jurkat было отмечено уменьшение числа сайтов связывания уабаина и изменение константы связывания, что, по мнению авторов, указывает на конформационные изменения соответствующей субъединицы натриевого насоса (Nobel et al., 2000). Описано уменьшение общего уровня АТФ в апоптозных клетках, которое по мненшо некоторых авторов может быть причиной снижения активности насоса (Komatsu et al., 2000; Yang et al., 2002; Wang et al., 2003). В связи с этим необходимо отметить, что по другим данным на клетках HeLa, РС12 и Ш37.при апоптозе, вызванном стауроспорином, фактором TNF или этопозидом, уровень АТФ в цитозоле возрастает (Zamaraeva et al., 2005). Полагают, что на ранней стадии апоптоз может сопровождаться увеличением митохондриального мембранного потенциала и уровня АТФ, тогда как конечная стадия апоптоза сопровождается падением потенциала и уменьшением уровня АТФ (Skulachev 2006).

Большая группа работ посвящена исследованию влияния уабаина на апоптоз. Результаты этих работ противоречивы. На трансфицированных клетках PW с повышенной экспрессией Вс1-2 показано увеличение активности Na+ ,К+-АТФазы, сопряженное с увеличением устойчивости к апоптозу. Эффект снимался ингибитором натриевого насоса уабаином (Gilbert, Knox, 1997). Увеличение клеточного сжатия при действии уабаина наблюдали при CD95-индуцированном апоптозе клеток Jurkat. Авторы пришли к выводу, что инги-бирование На+,К+-АТФазы способствует апоптозному уменьшению объема клетки (Nobel et al., 2000). Усиление апоптоза активированных лимфоцитов уабаином наблюдали при Fas-индуцированном апоптозе (Esteves et al., 2005). Имеются сообщения, что уабаин усиливает апоптоз клеток РС-3 (Huang et al., 2004), клеток моноцитарной и лимфобластной лейкемии, и клеток аденокарци-номы (Kawazoe et al., 1999). При апоптозе тимоцитов крысы, вызванном глю-кокортикоидами, уабаин по данным Манна с соавторами увеличивает деполяризацию плазматической мембраны (Mann et al., 2001). Противоположный результат был получен при исследовании апоптоза, вызванного ультрафиолетом, на клетках HL60, в которых не обнаружили изменения содержания субъединиц Na+/K+ насоса. Инкубация клеток с уабаином приводила к снижению числа клеток с уменьшенным объемом и уменьшению числа апоптозных тел по результатам проточной цитометрии (McCarty, Cotter, 1997). Эти различия, возможно, обусловлены тем, что в одном случае имел место рецепторный, а в другом случае митохондриальный механизм индукции апоптоза. По данным Орлова с сотрудниками при апоптозе гладкомышечных клеток уабаин подавляет каспазную активность независимо от типа индуктора (Orlov et al., 1999).

К4" каналы. Насчитывают по крайней мере 14 разновидностей К+ каналов, так или иначе причастных к апоптозу (см. обзоры: Yu, 2003а; Remillard, Yuan, 2004; Burg et al., 2006). Показано, что апоптоз может быть предотвращен блокированием К+ каналов. Так, например, при апоптозе эозинофилов уменьшение размеров клеток ингибируется блокатором К+ каналов 4-аминопиридином (Beauvais et al.,1995).

При апоптозе, индуцированном через рецептор или действием стаурос-порина на клетках HeLa и U937 не наблюдали уменьшение клеточного объема в присутствии хинина и бария (Maeno et al., 2000). AVD лимфоцитов предотвращалось при блокировании кальций-чувствительных калиевых каналов хинином, клотримазолом или харибдотоксином (Elliot, Higgins, 2003). Имеются указания, что хинидин предотвращает AVD клеток гепатомы при апоптозе, вызванном стауроспорином (Krumschnabel et al., 2007).

Показано, что при апоптозе во многих случаях изменяется состояние К+ каналов (Lang et al., 2006). Увеличение интегральной проводимости калиевых каналов Ку наблюдали при индукции стауроспорином апоптоза гладкомышечных клеток (Ekhterae et al., 2001). Увеличение проводимости калиевых каналов maxi-K показано при апоптозе гладкомышечных клеток (Krick et al., 2001). На клетках Jurkat при Fas-индуцированном апоптозе наблюдали увеличение активности каналов Ку 1.3 (Storey et al., 2003). Противоположный результат был получен при исследовании Fas-индуцированного и апоптоза, вызванного кера-мидом на клетках Jurkat, когда обнаружили уменьшение интегральной проводимости каналов Kv 1.3 (Szabo et al.,1996; Gulbins et al.,1997). На основании компьютерного моделирования ионного и водного баланса клеток при апоптозе Верениновым с сотрудниками было сделано заключение, что существенное уменьшение объема по "канальному" механизму возможно лишь у клеток определенного типа и в ограниченных условиях (Веренинов и др., 2004).

Na+ каналы. Активацию потенциал-зависимых Na+ каналов отмечали при апоптозе нейронов, вызванном кислородным голоданием (Banasiak et al., 2004). Ингибитор Иа+-каналов сакситоксин предотвращал индуцированный через Fas-рецептор апоптоз клеток Jurkat (Bortner, Cidlowski, 2003). Показано влияние на уменьшение объема клеток при апоптозе активности Cl" к а н а л ов, играющих важную роль в реакции регуляторного изменения объема при гипотонии (Maeno et al., 2000). Выход СГ через каналы ORCC наблюдали при Fas-индуцированном апоптозе клеток Jurkat (Szabô et al., 1998). Активацию СГ каналов VSOR наблюдали при апоптозе клеток HeLa, индуцированном стаурос-порином, Fas или TNF (Shimizu et al., 2004). Активация тех же каналов отмечена при апоптозе кардиомиоцитов мыши (Wang et al., 2005; Okada et al., 2006). Блокаторы СГ каналов во многих случаях предотвращали развитие апоптоза (Porcelli et al., 2004; Takahashi et al., 2005; Tanabe et al., 2005; Krumschnabel et al., 2007).

Другие тракты. Имеются указания, что спонтанный апоптоз тимоцитов сопровождается активацией Na+/H+ обменника, Ма+/НСОз7СОз2" котран-спортера и СГ/НСОз" обменника (Tsao, Lei, 1996). Ингибирование Na+/H+o б м е н н и к а отмечено при апоптозе клеток Jurkat, Molt4, СЕМ, К562 (Lang et al., 2000; Rich et al., 2000). Ингибирование Na+/K+/2C1' котранспо ртера показано на клетках Р31, апоптоз которых индуцировали амфотери-цином В (Marklund et al., 2001). Подводя итог разделу о механизмах изменения ионного состава при апоптозе, следует отметить, что уже ясно, что все перечисленные тракты могут изменять свою активность, но в какой последовательности это происходит, и какова роль отдельных трактов в изменении ионного состава клеток при апоптозе, пока неясно.

Появляются работы, в которых исследуется динамика изменения ионного баланса, в частности, изменение во времени внутриклеточной концентрации и содержания К+, Na+ и СГ (Arrebola et al., 2006). По данным, полученным на клетках Jurkat, повышение внутриклеточной концентрации Na+ является ранним событием и опережает AVD (Bortner, Cidlowski, 2003). На клетках U937 показано, что после 30 мин действия стауроспорина имеет место существенное уменьшение внутриклеточного содержания К+, и СГ, а содержание Na+ не изменяется (Arrebola et al., 2005а). Через 2 ч на фоне продолжающегося уменьшения содержания К+ содержание Na+ и СГ увеличивается, причем содержание СГ остается ниже, чем в контрольных клетках. Через 3 ч действия стауроспорина содержание Na+ существенно увеличивалось, а содержание К+ в это время не изменялось; через 5 ч содержание К+ в клетках продолжало уменьшаться, a Na+ и СГ увеличивалось (Arrebola et al., 2005а).

Хотя сегодня еще трудно дать ответ на многие вопросы, касающиеся связи механизмов клеточного сжатия и индукции апоптоза, уже предпринимаются попытки обобщить имеющиеся данные в виде гипотетических схем (Krick et al., 2001; Platoshyn et al., 2002; см. обзоры: Yu, 2003a; Remillard,Yuan, 2004). Согласно одной из них (Yu, 2003а, рис. 3), индуктор апоптоза активирует К+ каналы. Открытие каналов приводит к гиперполяризации плазматической мембраны. Далее при участии факторов Bcl-2/Bid происходит набухание митохондрий, сопровождающееся их деполяризацией, снижением уровня АТФ и, как следствие, к изменению работы Na+/K+ насоса, затем происходит деполяриза

Индукция ^^ Активация ^ Гиперполяризация апоптоза ^^^ к+каналов плазматической > мембраны

Выход К+

Набухание митохондрий Ингибрование . Деполяризация " Na 7К" насоса

Снижение уровня АТФ

Bcl-2/Bid

Снижение Сжатие клетки Выход цитохрома с входа К* ^ ■ ^ Деполяризация Формирование ^' ^ плазматической апоптосомного мембраны комплекса

0 Деградация ДНК и ядерных белков

Рис. 3. Схема участия К+ каналов и Иа+/К+ насоса в механизме индукции апоптоза. По Yu, 2003 а (с изменениями), ция плазматической мембраны, сжатие клетки, выход цитохрома с, формирование апоптосомного комплекса и, наконец, деградация ДНК. Следует подчеркнуть разнообразие форм и проявлений апоптоза, связанное, по-видимому, с разнообразием клеток и типов индуктора.

Заключение. В существующих представлениях о механизме апоптоз-ной дегидратации клеток некоторые положения кажутся противоречивыми. Так, снижение активности Na+/K+ насоса должно приводить к набуханию клетки, однако характерным признаком апоптоза является дегидратация клеток. Открывание К+ каналов должно приводить к гиперполяризации клеточной мембраны, но большинство исследователей наблюдали при апоптозе деполяризацию. В одной из недавних работ на основе моделирования водного и ионного баланса клетки было высказано предположение, что дегидратация клеток при апоптозе, сопровождающаяся снижением внутриклеточного отношения K+/Na+, деполяризацией клеточной мембраны и уменьшением потоков К+ и Na+ обусловлена комбинацией снижения активности Na+/K+ насоса и сокращения Ка+/СГ-симпорта, либо открывания СГ-каналов (Веренинов и др., 2006). В более поздней работе те же авторы на основании прямых измерений входных и выходных потоков 22Na, Rb+ и Li+ у нормальных и апоптозных клеток U937 и математического моделирования баланса потоков пришли к заключению, что изменение ионного и водного баланса исследованных клеток обусловлено снижением активности Na+/K+- насоса, сокращением NaVCl'-симпорта и снижением интегральной проводимости Иа+-каналов (Vereninov A.A. et al., 2007).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Клеточные культуры. Исследование проводили на двух сублиниях культуры клеток гистиоцитарной лимфомы U937 (U937-160B2 и U937-9957), полученной из Российской коллекции клеточных культур Института цитологии РАН. Контрольные и опытные препараты инкубировали в атмосфере 5 % COi при 37 °С в течение 4-5 ч при концентрации клеток 0.7 - 1 млн/мл в среде RPMI 1640 (Биолот, Россия) с добавлением 10% фетальной сыворотки (FBS HyClone Standard). При длительном уравновешивании клеток с Rb+ они в течение суток инкубировались в среде, в которую дополнительно вводился RbCl в конечной концентрации 1 мМ.

Индукция апоптоза. При индукции апоптоза среда содержала стауроспо-рин (Sigma) в концентрации 0.2-1 мкМ или этопозид (Sigma) в концентрации 50 мкМ. Концентрированные растворы стауроспорина (2мМ) и этопозида (34 мМ) готовили на DMSO. Конечная концентрация DMSO составляла 0.1-0.5 %.

Определение внутриклеточного содержания воды по плавучей плотности клеток. Определение плавучей плотности клеток проводили в непрерывном градиенте Перколла (Pharmacia). Раствор Перколла готовили путем создания изоосмотичной среды к раствору Перколла добавляли Ю^кратный концентрат среды Хенкса. Формирование градиента плотности проводили центрифугированием полученного раствора в пробирках 90><8 мм в течение 40 мин при 2000 g в угловом роторе центрифуги К-23 (Janetzki, ГДР). Плотность контролировали маркерами 1.033, 1.049, 1.062 г/мл (Sigma). Содержание в клетке воды на 1 г белка (у) находили по формуле: v = (1 -р/р^У[0.65(/> 1)], где р -измеренная плавучая плотность клетки. В расчетах принимали, что плотность сухой массы Д]гу= 1-35 г/мл и что белок составляет 79 % сухой массы. Сконцентрированную суспензию клеток объемом 100 мкл (3-5 млн. клеток) наслаивали на поверхность раствора Перколла и центрифугировали в течение 10 мин при 400 g в бакет-роторе центрифуги MPW-340 (Польша). Фракции отбирали шприцем и после разбавления средой RPMI в 4-6 раз центрифугировали 5 'мин при 300 g. Осадок ресуспендировали в среде RPMI и использовали для определения ионного состава, микроскопирования и проточной цитометрии.

Определение внутриклеточного содержания К+, Na+ и Rb+. Клетки после осаждения центрифугированием 5 раз промывали раствором MgCb- (96 мМ) без ресуспендирования. Отмытый осадок заливали 1 мл 5 %-ным раствором трихлоруксусной кислоты. Концентрацию катионов в супернатанте определяли эмиссионным анализом в воздушно-пропановом пламени на атомно-абсорбционном спектрофотометре Perkin-Elmer АА-306. В качестве калибровочных растворов использовали растворы KCl, NaCl (10-100 мкМ) и RbCl (5-10 мкМ), приготовленные на 5 %-ной трихлоруксусной кислоте. Содержание ионов в клетке рассчитывали в миллимолях на 1 г белка. Количество белка в осадке определяли по Лоури с бычьим сывороточным альбумином в качестве стандарта.

Измерение потоков Rb+через насос и каналы. Для измерения входного потока Rb+ в нормальную инкубационную среду вводили 50 мМ раствор RbCl до получения концентрации 2.5 мМ. Поток Rb+ через Na+/K+ насос оценивали" по величине снижения потока при введении в среду уабаина (Sigma) в концентрации 0.1 мМ. Инкубация клеток с Rb+длилась 10 мин в среде без уабаина или с уабаином. Ранее было показано, что Rb+ является аналогом К+ и что уа-баин-чувствительный вход Rb+ должен измеряться в течение короткого временного интервала (5-10 мин), так как действие уабаина на более долгих сроках приводит к существенному увеличению внутриклеточного содержания Na+ (Vereninov et al., 2007). Поток через каналы оценивали по величине уабаин-резистентного входного потока Rb+.

Измерение скорости выхода Rb . Для определения константы скорости выхода Rb+ из клетки их инкубировали 24 часа в среде RPMI, к которой добавляли RbCl в концентрации 1 мМ. После быстрой отмывки клеточного осадка от среды с Rb+ клетки ресуспендировали в среде, не содержащей Rb+, и выдерживали в ней 30 мин. Дальнейший анализ клеток на содержание ионов проводился по стандартной схеме. Константу скорости выхода Rb+ (к) рассчитывали по формуле: к = - 1/30 1п(у/у0), где у/у0 отношение Rb+/K+ в клетках в момент / (30 мин) и в начальный момент.

Определение внутриклеточного содержания хлора. Для определения внутриклеточного содержания хлора клетки помещали на 90 мин в среду, содержащую изотоп С1 (12 мкКюри мл" , Изотоп, Россия). Радиоактивность С1 в экстракте, полученном добавлением к клеточному осадку 5 %-ного раствора трихлоруксусной кислоты, измерялась в сцинтилляционном счетчике (Beckman LS 6500). В 4 мл сцинтилляционной жидкости на основе диоксана вводили 0.2 мл экстракта.

Микроскопия, морфометрия и проточная цитометрия. Исследование флуоресценции нативных клеток, окрашенных акридиновым оранжевым (АО), измерение интенсивности малоуглового светорассеяния и определение содержания ДНК на фиксированных препаратах проводили на проточном цитофлуо-риметре (Розанов, 1988; Розанов и др., 1990). Для возбуждения флуоресценции использовали ртутную лампу ДРШ-250-2, а при измерении малоуглового светорассеяния - гелий-неоновый лазер (633 нм). Окрашивание клеток АО (5 мкг/мл ) проводили в течение 15-20 мин при комнатной температуре и концентрации клеток 1 млн/мл. Флуоресценцию возбуждали через интерференционный светофильтр с областью пропускания 450-490 нм; регистрацию флуоресценции проводили в спектральных участках X = 530 ± 5 нм и X > 620 нм. 'Для определения содержания ДНК клетки переводили в раствор, содержащий: ЭДТА 0.02 %, MgCl2 15 мМ, Тритон Х-100 0.1 %, бромистый этидий (БЭ) 20 мкг/мл п оливомицип 40 мкг/мл, pH 7.4. Окрашивание проводили при температуре 4-6 °С в течение 20-24 ч. Флуоресценцию возбуждали через фильтр СС-15 (380-470 нм), регистрацию проводили при Х> 600 нм.

Для прижизненного микроскопирования клеток U937 использовали флуоресцентный микроскоп МИКМЕД-2 (LUMAM PRO-11, JIOMO) или конфокальный сканирующий микроскоп Leica TCS SL. В первом случае клетки окрашивали в течение 5 мин смесью АО (10 мкг/мл) и БЭ (20 мкг/мл) или Hoechst 33342 (2 мкг/мл, 15 мин). Использовали блок фильтров «Зеленая», а в случае Hoechst 33342 - «Голубая». При работе с микроскопом Leica клетки окрашивали либо смесью АО и БЭ, либо сначала 10 мин мембранотропным зондом RH414, а затем 5 мин АО. Сканирование проводили в двух спектральных диапазонах: 500-550 нм и 600-700 нм, возбуждая флуоресценцию лазером 488 нм. На приведенных фотографиях оба изображения совмещены программой Zeiss

LSM image browser 3.2.0.70. Диаметр клеток измеряли по фотографиям, полученным на микроскопе Leica TCS-SL, с помощью программы Image J 1.29.

Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием i-теста Стьюдента. За порог достоверности различий принимали значение Р = 0.05. Приводимое ниже число п соответствует, как правило, числу опытов, поставленных в разные дни.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Апоптоз клеток, вызванный стауроспорином, сопровождается дегидратацией.

Плавучая плотность клеток при апоптозе, вызванном стауроспорином. Ключевую роль в нашей работе играло определение внутриклеточного содержания воды, которое проводили путем измерения плавучей плотности клеток в градиенте Перколла. С этой целью клетки наносили в верхнюю часть пробирки с градиентом и центрифугировали до изоплотностного распределения клеток в градиенте. Из слоя с известной плотностью клетки извлекали шприцехМ и подвергали анализу на содержание ионов и микроскопированию. Характерная картина распределения клеток Ш37-160В2 в градиенте Перколла в норме и при действии на них стауроспорина (БТБ) и этопозида (ЕЮ) представлена на рис. 4. При действии на клетки 1 мкМ ЗТБ вся популяция смещается в градиенте вниз, в сторону высокой плотности. В опытах, представленных на рис. 4, плавучая плотность клеток, инкубированных в среде с ЗТБ 1 мкМ в течение 4 ч, возрастала с 1.040-1.046 до 1.049-1.060 г/мл. Зона, занимаемая клетками в градиенте, составляла при этом 0.011 ± 0.001 г/мл (п =

1 и), 1 о ссть несколько расширялась по сравнению с контрольными клеткам! которых она равнялась 0.006 ± 0.001 г/мл (п = 16). В каждом отдельном опыте полоса смещалась обычно так, что нижняя граница у контрольных клеток располагалась Быше верхней границы у клеток, инкубированных со стауроспори

Е1о СопЬ-о!

1.030"

1.0351.0401.0451.050' 1.055"

1.060" 1.065

Рис. 4. Распределение клеток в градиенте плотности Перколла после инкубации 4 ч со стауроспорином (ЗТБ, 1 мкМ) или этопозидом (ЕЮ, 50 мкМ). Клетки Ш37-160В2. ном. Действие стауроспорина не приводило к возникновению в плотностнозч-х градиенте двух полос, как это мы наблюдали в аналогичных условиях при апоптозе тимоцитов, вызванном этопозидом или дексаметазоном (Веренинов а: др., 2003).

Плавучая плотность клеток определяется, главным образом, соотношением содержания в клетке воды, белка и нуклеиновых кислот, так как липидогв мало. Использованный нами метод определения внутриклеточного содержания воды существенно чувствительнее распространенного метода, основанного на сопоставлении содержания в клеточном осадке маркеров, проникающих и непроникающих в клетку. Так, изменение внутриклеточного содержания воды на 10 % соответствует изменению плавучей плотности клеток на 0.005 г/мл и приводит к легко регистрируемому в наших условиях смещению клеток в пробирке на 1 см.

Таблица 1

Зависимость расчетного содержания внутриклеточной воды от принятого значения плотности сухой массы клетки. Клетки 11937- 160В2.

Измеренная плотность клетки в целом, г/мл Принятое значение плотности сухой массы клетки, г/мл Расчетное содержание внутриклеточной воды

Вариант опыта мл на 1 г белка %

1.35 6.7 100

Контроль 1.043 1.45 8.3 100

1.55 9.6 100

1.35 5 75

Апоптоз 1.055 1.45 6.3 76

1.55 7.3 76

Приведены данные для клеток 11937-160В2, апоптоз которых вызывали 4-часовой инкубацией в среде с 1 мкМ БТЗ.

По известному значению плотности вычисляли содержание воды на основе принятого значения плотности сухой массы клетки. Это значение можно получить по известному содержанию в сухой массе клетки белка, ДНК и РНК. Однако имеющиеся в литературе данные по этому вопросу довольно пестры и не позволяют надежным образом определить точное значение необходимых величин. Мы проверяли принятое значение плотности сухой массы исследованных нами клеток оценивая получающиеся путем соответствующего расчета значения концентраций ионов во внутриклеточной воде по косвенным физиологическим критериям, таким как допустимая общая осмотическая активность внутриклеточной среды, допустимое значение мембранного потенциала и т.п. Следует отметить, что хотя абсолютное значение внутриклеточного содержания воды зависит от принятых значений плотности сухой массы клеток и удельного содержания в ней белка, относительное изменение содержания воды практически не зависит от принятых значений (табл. 1).

Увеличение плотности клеток после 4-часовой инкубации с 1 мкМ стауроспорина в опытах, результаты которых представлены на рис. 4, соответствует уменьшению содержания внутриклеточной воды, в среднем, на 25 %. В другой более поздней серии опытов было проведено определение плавучей плотности клеток 11937-160В2 при сильном и слабом апоптозе, то есть при действии 1 мкМ и 0.2 мкМ стауроспорина. соответственно. Существенное различие удельного содержания воды у клеток 1)937-160В2 уже в исходном состоянии (табл. 2, 3) обусловлено разным состоянием культуры.

Таб лица 2

Внутриклеточное содержание воды, К+и Ыа+ в норме-и при апоптозе, вызванном 1 мкМ стауроспорином (БТБ) и 50 мкМ этопозидом (Еш). Клетки Ш37-160В2.

Клетки Плавучая плотность, г/мл Вода, мл/г белка К+ ммоль/ г белка ммоль/ г белка [К+] мМ [№+ 1 . мМ" К+/

Контроль 1.04-1.046(16) 6.7 1.1±0.03 0.30±0.02 164 45 3.9±0.2 (35)

БТБ, 1 мкМ, 4 ч 1.049-1.06 (10) 5.0 0.78±0.03 0.34±0.02 156 68 2.7±0.2 (25)

Контроль 1.037-1.045 (7) 7.1 1.16±0.04 0.27±0.01 163 38 4.4±0.2 (20)

Ей), 50мкМ, 4 ч 1.036-1.045 (7) 7.1 1.02±0.03 0.35±0.02 143 49 3.0±0.2 (19)

Таблица 3

Изменение содержания воды и К+, Ж+и СГ у клеток и937-160В2 при апоптозе, вызванном стауроспорином (БТБ) в концентрации 0.2 и 1 мкМ.

Вода, К* N3"" СГ [К+] [На+] . К+/Ыа+

Клетки мл/г ммоль/ ммоль/ ммоль/г мМ мМ белка г белка г белка белка

5.64 0.59±0.01 0.138±0.003 0.225±0.007 105 24 4.4±0.1(34)

Контроль

БТБ, 0.2 мкМ, 4-5 ч 5.0 0.51±0.01 0.151±0.007 0.158±0.005 102 30 3.6±0.1(28)

Контроль 5.52 0.70±0.03 0.213±0.009 0.229±0.011 127 39 3.3±0.2(14)

БТБ, 1 мкМ, 4-5 ч 4.55 0.53±0.02 0.282±0.012 0.133±0.01 116 62 2.0±0.1(15)

Ионный состав клеток при апоптозе, вызванном стауроспорином. Внутриклеточное содержание К+ у клеток в апоптозной популяции сублинии Ш37-160В2 с увеличенной плавучей плотностью при действии 1 мкМ стауроспо-рина снижалось по сравнению с контрольными клетками на 24-29% в зависимости от серии опытов. Внутриклеточное содержание Ма+ увеличивалось на 1322 % (табл.2, 3). В результате суммарное содержание К+ и Ыа+ при действии 1 мкМ стауроспорина снижалось на 11-20%. Содержание СГ в серии опытов, результаты которых представлены в табл. 3, снижалось на 42 %. При суммарном снижении содержания К+ и Ка+ на 0.101 мэквив/г белка снижение содержания СГ составляло 0.096 мэквив/г белка, то есть достаточно хорошо компенсировало общее снижение содержания катионов. В более поздней серии опытов было проведено сравнение ионных показателей у клеток и937-160В2 при действии 1 мкМ и 0.2 мкМ стауроспорина. При слабом апоптозе, вызванном 0.2 мкМ стауроспорином, когда наблюдалась 11% дегидратация, внутриклеточное содержание К+ в апоптозной популяции клеток и937-160В2 снижалось меньше, чем при действии 1 мкМ стауроспорина, всего на 14%. Внутриклеточное содержание увеличивалось только на 9%. В этом случае снижение суммарного содержания К+ и Ыа" также достаточно хорошо компенсировалось снижением содержания СГ (таол.З).

Как показывает рис. 5, различия во внутриклеточном содержании воды в разных сериях опытов, обусловленные как состоянием культуры, так и переходом в апоптоз, хорошо коррелируют с изменением содержания К+ и в расчете на г белка. Следует отметить, что при отличающемся исходном содержании воды, К+ и Ка~ у клеток в разных сериях опытов относительные Изменения, связанные с апоптозом, оказываются близкими.

Рис. 5. Суммарное содержание К+ и Na+ и содержание внутриклеточной воды у клеток U937-160B2 в норме и при апоптозе, вызванном 1 мкМ стау-роспорином в разных сериях опытов (1 и 2).

Определение одновременно внутриклеточного содержания воды, К+, Na+ и СГ позволяют определить количественное соотношение между изменением внутриклеточного содержания воды, содержания мажорных моновал'ент-ных ионов и изменением их концентрации во внутриклеточной воде. Из условия осмотического баланса между клеткой и средой и электронейтральности внутриклеточной и внешней среды следуют два базовых уравнения, связывающих содержание воды в клетке (объем клетки, v), концентрацию однозарядных ионов в среде К0, Na0, Cl0, и клетке К„ Nait С/„ количество в клетке непроникающих осмотиков А и их средний заряд z (Boyle, Conway, 1941): К, +Na, -Cli+zA/v = 0 К, +Na, +CI, +A/v = Ka +Na0 +Cla

Эти уравнения должны выполняться независимо от того, каковы механизмы переноса ионов через клеточную мембрану.

В литературе давно обсуждается вопрос, в какой мере апоптозная дегидратация клеток обусловлена выходом из клетки К+, Na+ и СГ и в какой -выходом иных внутриклеточных осмолитов. По известному содержанию в клетке воды, К+, Na\ СГ можно вычислить содержание "непроникающих" внутриклеточных оемолитов и их средний электрический заряд. У клеток без жесткой оболочки расчетная внутриклеточная осмотическая активность составляет 310 мосмоль/л. С учетом найденного содержания внутриклеточной воды на г белка на К+, Иа+ и СГ у нормальных клеток приходится 1.14 ммоль/ г белка, то есть около 67 % общей внутриклеточной осмотической активности (табл. 4). Изменение при апоптозе суммарного содержания К+, Иа+ и СГ составляет 0.21 мосмоль/г белка, тогда как изменение "остальных" внутриклеточных оемолитов 0.1 мосмоль/г белка. Таким образом, изменение при апоптозе содержания К+, Иа+ и СГ в 1.5-2 раза превосходит изменение содержания остальных оемолитов. Иначе говоря, в апоптозной дегидратации решающее значение имеет выход именно моновалентных ионов - К+ и СГ. Значения "среднего" заряда остальных оемолитов, приведенные в последнем столбце таблицы, указывают на то, что среди выходящих оемолитов в некоторых случаях имеет место небольшое преобладание незаряженных компонентов. Чаще,

Таблица 4

Изменение содержания воды и оемолитов у клеток 11937 при апоптозе, вызванном стауроспорином (БТБ) в концентрации 0.2 и 1 мкМ.

Вода Внутриклеточные осмолиты Средний заряд

Клетки Общее содержание К+Ыа+С1 "Остальные" "Остальных" оемолитов, окв./осмоль мл/ г Сдвиг при мос-моль Сдвиг при ммоль наг Сдвиг при мос-моль Сдвиг при апоп- белка апоптозе % на г белка апоптозе % белка апоптозе % на г белка тозе % т

Контроль 5.52 1.71 1.14 . 0.57 -1.19

11937-160В2

1 мкМБТБ 4.50 -18 1.40 -18 0.93 -12 0.47 -6 -1.45

1)937-160В2

Контроль 5.76 1.79 1.04 0.75 -0.70

11937-Х9957

0.2 мкМ 4.96 -14 1.54 -14 0.86 -10 0.68 -0.71

1!937-\9957 однако, средний заряд при апоптозе изменяется мало, и это значит, что средний заряд выходящих осмолитов не отличается от' среднего заряда внутриклеточных осмолитов.

При известном значении содержания воды можно рассчитать внутриклеточные концентрации ионов (табл. 2, 3). Ряд исследователей считает, что изменение внутриклеточной концентрации К+ при апоптозе изменяет состояние каспаз и нуклеаз (Hughes et al., 1997; Hughes, Cidlowski, 1999). По нашим данным, в рассматриваемых опытах концентрация К+ в расчете на внутриклеточную воду при действии стауроспорина снижается всего лишь на 5-9% (табл. 2, 3). Вряд ли столь незначительное изменение при апоптозе внутриклеточной концентрации К+ может оказывать существенное влияние на состояние каспаз. Внутриклеточная концентрация Na+ увеличивается весьма существенно, на 51-59 % (табл. 2, 3). Однако изменение концентрации Na+ во внутриклеточной воде при апоптозе исследовали в немногих работах (Barbiero et al., 1995; Bortner et al., 2008), и мало, кто обсуждает функциональное значение этих изменения (Bortner, Cidlowski 2003; Akimova et al., 2008).

Уабаин-чувствителъный и уабаин-резистентный потоки Rb+ при апоптозе, вызванном стауроспорином. По каким причинам изменяется баланс К+, Na+ и СГ у исследованных клеток? О причинах изменения ионного баланса при апоптозе в литературе высказываются различные мнения. Некоторые исследователи сообщают о снижении активности, либо о деградации субъединиц Na+, К+- АТФазы при апоптозе (Nobel et al., 2000; Mann et al., 2001; Bortner et al., 2001; Düssmann et al., 2003; Blanco, Nguyen 2008). Другая группа исследователей считает, что ведущую роль при апоптозном изменении ионного баланса играют К+ каналы (Beauvais et al., 1995; Maeno et al., 2000; Elliot, Hig-gins, 2003).

Для выяснения этого вопроса мы сравнивали изменения ' потоков Rb+ через насос и каналы при относительно неглубоком апоптозе, вызываемом стауроспорином (0.2 мкМ, 4-5 ч) у двух сублиний клеток U937, и при апоптозе, вызываемом стауроспорином в концентрации 0.2 и 1 мкМ (4 -5 ч) у одной из сублиний.

Таблица 5

Сравнение потоков Шэ+ через насос и каналы при апоптозе, вызванном 0.2 мкМ ЭТБ, у двух сублиний клеток Ш37 и при апоптозе, вызванном 0.2 и 1 мкМ БТБ у сублинии 160-В2

Сублиния Клетки 0.2 мкМ БТБ 1 мкМ БТБ

Насос Каналы Насос/Каналы Насос Каналы Нарос/Каналы

160-В2 Контроль Апоптоз 14.1 ±0.6(28) 14.3 ±0.8 (28) 2.7 ±0.1 (28) 4.4 ±0.3 (28) 5.3 ± 0.3 (28) 3.4 ±0.1 (28) 13.6 ±0.8 (21) 6.0 ±0.6 (21) 4.1 ±0.2 (21)е 4.7 ±0.2(21)'' 3.5 ±0.2 (21) 1.3 ±0.1 (21)

N9957 Контроль Апоптоз 12.0 ±0.5 (24) 7.5 ± 0.6 (24) 6.9 ± 0.3 (24) 6.9 ± 0.5 (24) 1.8 ±0.1 (24) 1.2 ± 0.1 (24)

Приведено количество Шэ+, поступившего в клетки за 10 мин в мкмоль на г белка. Инкубационная среда содержала 2,5 мМ ШУ1". Поток через насос и каналы определяли как ингибируемый и, соответственно, не ингибируе-мый 0,1 мМ уабаином компонент. Клетки инкубировали в среде со стау-роспорином 4-5 ч.

Ингибируемый уабаином поток Шэ+ через №+/ К+ насос составлял в рассматриваемых опытах у сублинии 160-В2 в среднем 81 % общего входного потока, а у сублинии N9957 - 62 % (табл. 5). Остаточный компонент (уабаинг резистентный) можно рассматривать как поток ЯЬ+ через каналы, так как бу-метанид и БЮА (ингибиторы К+ трактов ИКС С и КСС) оказывают малое влияние на поток ЯЬ+ (табл. 6, 7).

При неглубоком апоптозе, вызываемом 0.2 мкМ, (4-5 ч), относительно небольшое уменьшение внутриклеточного содержания воды (на 10-13 %) у клеток Ш37-160В2 обусловлено увеличением уабаин-резистентного потока ЯЬ+(К+) через каналы в 1.4-1.5 раза при неизменяющемся уабаин-чувствительном потоке 11Ь+(К+) через К+ насос (рис. 6, 7; табл. 5). У клеток Ш37-Ы9957 при такой же дегидратации в строго аналогичных условиях уабаин-резистентный поток ЯЬ+(К+) через каналы не изменяется, но имеет место снижение потоков К+ и Ыа+ через насос в 1.6 раза, которое, как было показано в работе Веренинова и др. (Уегешпоу ег а1., 2007), не приводит к набуханию клеток из-за того, что параллельно уменьшается интегральная проницаемость каналов (в 1.8-2.3 раза). Это означает, что при слабом апоптозе клеток Ш37-160В2 основную роль в изменении ионного баланса играют К+ каналы, а при слабом апоптозе клеток и937-И9957 - насос. Следует отметить, что у клеток сублинии 160-В2 в нормальном состоянии входной поток ЯЬ+ в 5.3.

Рис. 6. Потоки ЯЬ+ через насос и каналы (мкмоль на г белка за 10 мин) и вну

Потоки В.Ь+

Внутриклеточное содержание К '.Иа*, СГ

18 16 14 12 1086 4 2 О

Насос

Насос д.

Каналы

Каналы

5п

0,70,6 0,5-| 0,4 0,3 0,20,1

0,0

N3*

С1"

N3 I

С1"

160в2 n9957 160в2 n9957 триклеточное содержание К+, Ыа+ и СГ (ммоль на г белка) в контроле (светлые столбики) и при 5-часовом апоптозе, вызванном 0.2 мкМ стауроспори-ном (темные столбики) у клеток Ш37-160В2 и и937-М9957.

18 16 14 12

10 8 б 4 2 О

Насос

Насос X

Каналы

Каналы этэ

0.2 мкМ этэ 1 мк!\Л

Рис. 7. Потоки Шэ+ через насос и каналы (мкмоль/г белка за 10 мин) в контроле (светлые стол би ки) и при апоптозе клеток 11937-160В2, выз званном стауроспорином в концентрации 0.2 и 1 мкМ. раза больше потока через каналы, тогда как у клеток N9957 только в 1.8 раза Столь различное поведение этих сублиний наблюдалась только в случае слабого апоптоза, вызванного 0.2 мкМ стауроспорином, когда имела место 10-13 %-ная дегидратация. Снижение активности насоса наблюдалось у всех исследованных линий при более глубоком апоптозе, вызванном 1 мкМ стауроспорином и сопровождающемся 18 %-ной дегидратацией (рис. 7, табл. 5). Уабаин-резистентный поток Шэ*, основную часть которого составляет поток через К+ каналы, при этом изменяется незначительно. Таким образом механизмы изменения ионного баланса могут быть разными в зависимости от глубины апоптоза и вида клеток.

Таблица 6

Влияние 0.1мМ уабаина и 0,05 мМ буметанида на поток Шэ+, мкмоль на г белка за 10 мин у клеток Ш37-160В2 в контроле и при апоптозе, вызванном 1мкМ БТЭ.

Опыты Поток Контроль БТБ

1 Без ингибиторов В присутствии уабаина Ингибируемый уабаином 18.2 ± 1.2(16) 4.0 ±0.3 (16) 14.2+1.0 (16) 11.3 ±0.8 (16) 4.6 ±0.3 (16) 6.7 ±0.8 (16)

2 Без ингибиторов В присутствии буметанида Ингибируемый буметанидом 24.7 ± 1.3 (22) а 21.3 ±1.1 (22)ь 3.4 ± 1.0(22) 16.6+1.6 (8) 15.1 ±2.1 (8) 1.4 ± 1.3 (8)

3 Без ингибиторов В присутствии уабаина В присутствии уабаина и буметанида Ингибируемый буметанидом 17.9 ±0.9 (6) 3.9 ± 0.2 (6) 2.4 ± 0.2 (6) 1.6 ±0.3 (6) *

Таблица 7

Влияние 0.1 мМ БЮА и 0.05 мМ буметанида на входной поток Шэ+ (мкмоль на г белка за 30 мин), отношение К+^а+, содержание катионов (ммоль на г белка) и константу скорости выходаШэ+у клеток Ш37-160В2.

Клетки Входной поток Ш>+ К7Ыа+ К+Иа+ЯЬ к, 10"3 шт1

Без ингибиторов + ЭЮА, 0.5 ч 62.3 ± 1.7 (8) 53.8 ±2.9 (8) 4.7 ±0.1 (8) 3.4 ±0.1 (8) 1.32 ±0.03 (8) 1.23 ±0.02 (8) 6.3 ±0.7 (12) 4.9 ±0.7 (12)

Без ингибиторов + БЮА, 4 ч 57.8 ±2.7 (12) 46.0 ± 2.2 (12) 4.1 ±0.3 (12) 3.3 ±0.1 (12) 1.37 ±0.03 (12) 1.23 ±0.03 (12) 5.8 ±0.7 (10) 4.9 ±0.6 (10)

Без ингибиторов + Буметанид 0.5 ч 54.3 ±2.8 (12) 50.5± 2.Т (12) 4.5 ±0.2 (12) 4.6 ± 0.2С(12) 1.32 ±0.03 (12) 1.29 ±0.03 (12) 6.1 ±0.6(14) 6.0 ±0.7 (14)

Без ингибиторов + Буметанид, 4 ч 55.8 ±2.8 (8) 49.6 ± 1.9* (8) 4.8 ±0.2 (8) 3.8 ±0.1 (8) 1.34 ±0.04 (8) 1.21 ±0.05 (8) 6.8 ± 0.9 (6) 8.0 ±0.3 (6)

Для определения константы скорости выхода Р1Ь+ (к) клетки инкубировали в среде ЯРМ1, содержащей 1 мМ ЯЬС1 24 часа а затем помещали на 30 мин. в среду, не содержащую ЯЬ+.

Апоптоз клеток, вызванный этопозидом, не сопровождается их дегидратацией

Плавучая плотность клеток при апоптозе, вызванном этопозидом.

Инкубация клеток в течение 4 ч с этопозидом в концентрации 50 мкМ не приводила к увеличению их плавучей плотности, несмотря на признаки апоптоза, о которых речь пойдет ниже (рис. 4, табл. 2). Иногда верхняя граница зоны, занимаемой клетками в градиенте, оказывалась даже выше, чем в контроле. В некоторых опытах наблюдалось небольшое уменьшение плавучей плотности после 2-часовой инкубации, когда

Рис. 4 (повторно)

Распределение клеток в градиенте плотности Перколла после инкубации 4 ч со стауроспорином (БТБ, 1 мкМ) или этопозидом (ЕЮ, 50 мкМ). Клетки 11937-160В2. ни микроскопия, ни цитометрия не позволяли еще заметить признаки апоптоза. Инкубация клеток в течение 18-24 ч при концентрации этопозида 0.84 мкМ, сопровождающаяся изменением ДНК-гистограммы, также не приводила к появлению клеток с увеличенной плавучей плотностью.

Ионный состав клеток при апоптозе, вызванном этопозидом. При апоптозе клеток и937, вызванном этопозидом, содержание К+ снижалось меньше, чем при действии стауроспорина (табл. 2). Увеличение содержания Ыа+ компенсировало уменьшение содержания К+ и суммарное содержание К+ и практически не изменялось. Это хорошо согласуется с отсутствием дегид

Е1о БТЭ Сопь-о!

1.0301

1.035" 1.0401.0451.050" 1.055 1

1.060" 1.065-1 ратации клеток при действии этопозида. Концентрация К+ во внутриклеточной воде при действии этопозида снижалась на 12%, а концентрация увеличивалась на 29%. Необходимо отметить, что при апоптозе клеток Ш37, вызванном этопозидом, несмотря на отсутствие дегидратации и изменения суммарного содержания К+ и Ыа+, а также содержания С1\ отношение К+/Ыа+ снижалось (табл. 3, рис. 10), что свидетельствует о перестройке ионного баланса и изменении работы основных трактов переноса ионов через плазматическую мембрану.

Таб лица 2 (повторно) Внутриклеточное содержание воды, К+ и в норме и при апоптозе, вызванном 1 мкМ стауроспорином (БТБ) и 50 мкМ этопозидом (Ею). Клетки Ш37-160В2.

Клетки Плавучая плотность, г/мл Вода, мл/г белка К+ ммоль/ г белка ммоль/ г белка РП мМ [Ка+] мМ К7Ш+

Контроль 1.04-1.046(16) 6.7 1.1±0.03 0.30±0.02 164 45 3.9±0.2.(35)

БТБ, 1 мкМ, 4 ч 1.049-1.06(10) 5.0 0.78±0.03 0.34±0.02 156 68 2.7±0.2 (25)

Контроль 1.037-1.045 (7) 7.1 1.16±0.04 0.27±0.01 163 38 4.4±0.2 (20)

Еи>, 50мкМ, 4 ч 1.036-1.045 (7) 7.1 1.02±0.03 0.35±0.02 143 49 3.0±0.2 (19)

Уабаин-чувствитвлъный и уабаин-резистентный потоки ЯЬ+ при апоптозе, вызванном этопозидом. Для того чтобы идентифицировать тракты переноса ионов через плазматическую мембрану, измеряли уабаин-чувствительный и уабаин-резистентный потоки Шз+. При апоптозе клеток 11937-160В2, вызванном 50 мкМ этопозидом, уабаин-чувствительный поток ЯЬ+ снижался в среднем на 43-54% в зависимости от серии опытов, а уабаин-резистентный поток возрастал на 30-37% (рис. 8, 9). Это означает, что ионные изменения при апоптозе этих клеток вызваны и деградацией насоса, и открыванием К+ каналов. Аналогичные изменения происходили и при апоптозе клеток линии Ш37-Ы9957.

На рис. 8 приведены результаты опытов, проведенных параллельно на клетках 11937-160В2 при апоптозе, вызванном стауроспорином (0.2 мкМ, 4-5 ч)

20-, 18 161412 1086

420

Насос

X,

Насос

Каналы X,

Каналы I т.

0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0 к*

N3* сг I

СГ

ЭТЭ 0.2мкМ ЕЮ 50мкМ

ЭТЭ 0.2мкМ ЕЮ 50 мкМ

Рис. 8. Потоки ШГ через насос и каналы (мкмоль/г белка за Юмин) и внутри клеточное содержание К+, Ыа+ и СГ (ммоль/г белка) в контроле (светлые столбики) и при 4-5 часовом апоптозе, вызванном 50 мкМ этопозидом или 0.2 мкМ стауроспорином (темные столбики). Клетки Ш37-160В2. Опыты 2007 г. и этопозидом 50 мкМ. При неглубоком апоптозе, вызываемом стауроспорином (0.2 мкМ, 4-5 ч) относительно небольшое уменьшение внутриклеточного содержания воды (на 10-13 %) у клеток Ш37-160В2 обусловлено увеличением интегральной проницаемости К^ каналов (в 1.4-1.5 раза) при неизменяющейся активности К+-АТФазного насоса. Ионные изменения клеток 11937-160В2 при апоптозе, вызванном этопозидом, вызваны и деградацией насоса, и открыванием К+ каналов. Отношение К+/Иа+ уменьшается (рис. 10). Суммарное содержание К+ и Ыа+ не изменяется, содержание СГ также не изменяется. Аналогичные изменения происходят и при апоптозе клеток линии 11937- N9957. о. I 5 ш

-*—'

2 о.

1,0

0,6

К* каналы и

А /\

1* 1 V »—• »

Насос \ •

• - 1- 1 л' / • • 1 ■ 1 ■ 1 ■ 1 ' 1 1 6

Опыты

10

12

Рис. 9. Отношение потока через насос и через каналы при апоптозе, вы званном этопозидом, к соответствующим потокам у контрольных кле ток в отдельных опытах. Клетки 11937-160В2. Опыты 2008 г. 100

90

80 i

40

300 2 4 6 8

10

12

Опыты

Рис. 10. Изменение отношения K+/Na+ при апоптозе, вызванном этопозидом, в отдельных опытах. Отношение K+/Na+ у контрольных клеток принято за 100 %. Клетки U937-160B2. Опыты 2008 г.

Морфологические изменения при апоптозе, вызванном стауроспорином и этопозидом

Микроскопия. Инкубация клеток со стауроспорином в течение 4 ч приводила к исчезновению ядрышек, хорошо видимых при прижизненной флуоресцентной микроскопии клеток, окрашенных АО, в контроле, и характерной конденсации хроматина с образованием как бы «*полой» сферы (рис.11, а ,Ь). На поздних стадиях образовывались серповидные структуры. Конденсация хроматина при апоптозе, вызванном стауроспорином, которую мы наблюдали на окрашенных АО живых клетках U937, в частности, образование серповидных хроматиновых структур, сходна с тем, что наблюдали другие авторы, изучавшие вызванный стауроспорином апоптоз различных клеток миелоидного и лимфоидного ряда с помощью электронной и световой микроскопии на фиксированных клетках (Falcieri et al., 1993; Sakahira et al., 1999; Johnson et al., 2000; Maeno et al., 2000). Действие стауроспорина проявля

Рис. 11. Морфология клеток U937 после 4-часовой инкубации с STS (Ъ) и этопозидом (с, d). а - контрольные клетки; d - примеры апоптозных телец, образующихся при инкубации клеток с этопозидом (выборка, передающая частоту встречаемости отдельных типов телец), а, b, d — окраска АО в сочетании с RH414, с — окраска только АО. Микроскоп Leica TCS SL . лось не только в конденсации хроматина, но и в изменении формы клеток, они округлялись, и их поверхность становилась более «гладкой». Особенно заметно это было при микроскопии в проходящем свете при опущенном конденсоре, когда клетки выглядели как блестящие шарики, и при флуоресцентной микроскопии клеток, окрашенных RH414. После 2-часовой инкубации клеток со стауроспорином описанные морфологические изменения можно было наблюдать у относительно немногих, а после 4-х часовой - у большинства клеток. Отметим, что плавучая плотность клеток, как правило, возрастала уже после

2-часовой инкубации с STS. Структуры, прокрашиваемые АО вне ядра - гранулы оранжевого или, реже, зеленого цвета, - при действии стауроспорина выглядели так же, как и в контроле, и располагались преимущественно по периферии клетки. Как и у контрольных клеток, в этом случае наблюдалась диффузная зеленая флуоресценция АО и в цитоплазме.

Действие этопозида в рассматриваемых условиях сопровождалось хорошо выраженной конденсацией хроматина. Характер конденсации при этом существенно отличался от наблюдаемого при действии стауроспорина. При действии этопозида у значительной части клеток хроматин группировался в виде небольшого числа шарообразных тел. Особенно хорошо это было видно при использовании сканирующего конфокального микроскопа (рис. 11, с). Наряду с клетками, содержащими хроматин в виде группы относительно крупных шаров близкого размера, популяция клеток инкубированных с этопозидом, содержала клетки, от которых отпочковывались небольшие круглые апоптозные тельца, тоже содержащие хроматин. Микроскопия клеток, окрашенных RH414 в комбинации с ДНК-тропными красителями АО или Hoechst 33342, показала, что степень заполнения хроматином апоптозного «пузырька» с мембраной; окрашенной RH414, может быть очень разной (рис. 11, d).

Краситель RH414, как правило, концентрировался в области плазматической мембраны. Только у некоторых клеток этот краситель интенсивно прокрашивал и цитоплазму. Количество таких клеток варьировало от опыта к опыту обычно в пределах 10-12 % и коррелировало с количеством клеток, прокрашивавшихся БЭ. При действии стауроспорина количество клеток, интенсивно окрашивающихся RH414 и БЭ, не возрастало, и даже несколько уменьшалось. Прокрашивание клеток БЭ принято считать признаком поздних стадий апоп-тоза, когда плазматическая мембрана становится проницаемой для БЭ и образуются комплексы БЭ с ДНК. Число клеток, прокрашивающихся БЭ, часто используют как меру апоптоза в популяции. Судя по этому признаку мы имели дело с "ранним" апоптозом. С чем связано сплошное прокрашивание некоторых клеток красителем RH414, пока неясно.

Морфометрия. Морфометрический анализ показал, что распределение клеток по размеру как в контроле, так и при действии стауроспорина, близко к нормальному (рис. 12). Диаметр клеток после инкубации с 1 мкМ стауроспо-рином 2-4 ч в среднем по 5 опытам, в которых проводился морфометрический анализ, был на 10 % меньше, чем в контроле. Во всех случаях различия были статистически достоверны.

Контроль

Диаметр клеток, мкм

Рис. 12. Распределение по размерам клеток U937 после инкубации с 1 мкМ STS и без него (Контроль). По горизонтали - диаметр клетки, мкм; по вертикали — количество клеток. Точки - экспериментальные значения, полученные в типичном опыте. Сплошными линиями показано распределение Гаусса с параметрами x2/DoF = 20.3, R2 = 0.982, хс = 10.7 ± 0.085 в случае STS и x2/DoF = 1.03, R2 = 0.999, хс - 11.4 ± 0.015 в контроле. Различия распределений достоверны при Р < 0.01. Диа-г метр клеток измеряли по фотографиям с микроскопа Leica TCS-SL. Клетки U937-160-B2.

U937 Etoposide (ao+be)

Control D= 1.037-44 d=12.2 мкм

Etoposide 50 дМ 2,5 h D= 1.025-33 d=12.4 мкм

Etoposide 50 дМ 4 h D=1.031-37 d=11.5 мкм 76%

Б 40

8 10 12 14 Днаыетр, мкм

Etoposide 50 дМ 4 h D= 1.037-44 d=11.5 мкм 30%

Рис. 13. Распределение по размерам клеток U937 после инкубации с это-позидом и без него (Control). Микроскоп LUMAM PRO-11.

Морфометрию клеток, апоптоз которых вызывали этопозидом, проводить было сложнее, чем при апоптозе, вызванном стауроспорином из-за неправильной формы клеток, образующих апоптозные тельца. На рис. 13 представлены результаты, которые были получены в типичном опыте. После инкубации клеток с этопозидом в течение 2.5 ч вид клеток и в проходящем свете и в режиме флуоресценции, как и гистограмма распределения клеток по размерам, не отличались от наблюдаемых в контроле. После 4-х часовой инкубации клеток с этопозидом вид их существенно изменялся и получить "гладкую" гистограмму распределенич клеток по размеру было трудно. В случае, приведенном на рис. 13, отбор клеток в группу со средним диаметром 11.5 мкм, гистограмма которой показана синим цветом, проводился на основании оценки вида той же клетки на флуоресцентом снимке (правый столбец). Как показывает приведенный пример, в субфракции клеток с плавучей плотностью 1.031-37 г/мл, доля "круглых" клеток составляет около 75 %, тогда как в более тяжелой фракции -около 30 %. Так что некоторая связь плотности клеток с глубиной апоптоза наблюдается и в случае апоптоза, вызываемого этопозидом. Вместе с тем, уменьшение среднего диаметра клеток инкубированных с этопозидом 4 ч (11.5 мкм) по сравнению с контролем (12.2 мкм) при сохранении той же плавучей плотности, по-видимому, связано с отделением апоптозных телец, а не дегидратацией клеток.

Проточная цитометрия. На исследованных нами клетках проводилась проточная цитофлуорометрия живых клеток, окрашенных АО и БЭ и ДНК цитометрия фиксированных препаратов для оценки распределения клеток в популяции по фазам клеточного цикла. На рис. 14 представлены результаты цитометрии в одном из типичных опытов. Поскольку суммарная флуоресцен

Control

STS

Рис. 14. Проточная цитометрия клеток U937 в норме и при апоптозе, вызванном 1 мкМ STS (а) и 50 мкМ этопозидом (б). Столбец I, DNA Histogram: по горизонтали - содержание ДНК на частицу, усл. ед.; по вертикали - количество частиц; Столбец Д Red/Green Histogram: по горизонтали — флуоресценция АО при 530 нм, усл. ед.; по вертикали — флуоресценция АО при 620 нм, усл. ед.; Столбец III, Green Histogram: по горизонтали — флуоресценция АО при 530 нм, усл. ед.; по вертикали — количество клеток; Столбец IV, Red Histogram: по горизонтали - флуоресценция АО при 620 нм, усл. ед.; по вертикали - количество клеток. В столбце / указаны доли клеток в различных фазах клеточного цикла (Gi, S и G2) и доля клеточных фрагментов (Fr). В столбцах Д /Д IV показаны доли клеток в субпопуляциях, различающихся по красной и зеленой флуоресценции АО. Приведены результаты типичного опыта ция АО, определяется связыванием не только с ДНК, но и с другими субстратами, гистограмма, полученная проточной цитометрией нативных клеток в зеленой области спектра (рис. 14, a, III, «Green Histogram»), отличается от обычной ДНК-гистограммы, полученной после обработки клеток детергентом и окрашивания ядер и их фрагментов БЭ (рис. 14 a, I, «DNA Histogram»). По той же причине не совпадают гистограммы, полученные на одних и тех же клетках в зеленой (рис. 14, a, III, «Green Histogram») и красной спектральных областях (рис. 14, а, IV, "Red Histogram"). Природа субстратов, связывающих АО в цитоплазме, у разных клеток может быть различной, и идентифицировать ее не

1» просто (Zelenin, 1999). Как бы то ни было, изменение двумерной диаграммы распределения флуоресценции нативных клеток, окрашенных АО, в красном и зеленом каналах (Red/Green) хорошо отражает переход клеток к апоптозу (Донская и др., 2001). Такое изменение диаграммы имеет место при апоптозе тимоцитов (Веренинов и др., 2003) и при действии на клетки U937 этопозида (рис. 14, б, II). При действии стауроспорина изменение двумерной диаграммы Red/Green наблюдалось не во всех опытах и было менее выражено, чем в других исследованных нами случаях апоптоза. В опыте, результаты которого приведены на рис. 14, а, появлялась субпопуляция клеток, у которых «красная» флуоресценция АО по отношению к «зеленой» усиливалась. Количество таких клеток составляло примерно треть популяции.

Анализ ДНК-гистограмм, полученных проточной цитометрией ядер и ядерных фрагментов, показал, что соотношение клеток, находящихся в разных фазах клеточного цикла, если и изменяется после действия стауроспорина, то незначительно (рис. 14, а). Различие средних значений как отношения S/G1, так и отношения G2/G1 при апоптозе, вызванном стауроспорином, недостоверно (табл. 8). Независимость индукции апоптоза стауроспорином от фазы клеточного цикла была показана на синхронизированной культуре клеток Jurkat (Than et al., 2001). Субдиплоидный пик на ДНК-гистограммах при действии стауроспорина на клетки U937 обычно отсутствовал, но появлялось много ядерных фрагментов. Отметим, что при апоптозе тимоцитов крысы, вызванном стауроспорином, субдиплоидный пик на аналогичных ДНК-гистограммах был всегда хорошо выражен (Веренинов и др., 2003). Несмотря на большое количество ядерных фрагментов на ДНК- гистограммах, цитометрия

Таблица 8

Распределение клеток U937 по фазам клеточного цикла при апоптозе, вызванном STS (1 мкМ, 4 ч) и этопозидом (50 мкМ, 4 ч)

Клетки S/Gi G2/GI Fr % п

Контроль 0.74±0.06 0.13±0.01 5.8±0.9 18

STS 0.76±0.1 0.19±0.03 34.7±5.б 14

Контроль 0.77±0.06 0.14±0.01 5±0.5 21

Этопозид 0.32±0.02 0.08±0.01 26.5±3.8 25

Примечание, п - число опытов, Б / - соотношение числа клеток в фазах клеточного цикла Б и йг / йг - то же в фазах вг и в). Бг -количество клеточных фрагментов, в % от общего числа проанализированных частиц. нативных клеток при действии стауроспорина не выявляла нарастания числа клеточных фрагментов, соответствующих апоптозным тельцам (рис. 14, а). Прямое микроскопирование также показало, что при действии стауроспорина свободных апоптозных телец в культуральной среда не больше, чем в контроле. Причина здесь, очевидно, в том, что при действии стауроспорина ядерные фрагменты остаются в клетке и освобождаются только при действии детергента в процессе приготовления препарата для проточной флуоро-метрии ДНК.

У клеток, инкубированных 4 ч с этопозидом в концентрации 50 мкМ, наблюдался целый комплекс изменений, характерных для апоптоза. К их числу относится, прежде всего, образование апоптозных тел (рис.11, d). На диаграммах, полученных проточной цитометрией препаратов, окрашенных АО, после 4-х часового действия этопозида возрастало количество «мелких» частиц (рис. 14, б, II-IV), отражающее увеличение количества апоптозных телец. Количество этих частиц по отношению к числу «целых» клеток после 4-х часового действия этопозида составляло в среднем 45.0 + 5.8 % (п = 9), тогда как у контрольных препаратов оно не превосходило 7.5 + 0.9 %. Отметим, что на аналогичных диаграммах, полученных при действии на клетки стауроспорина, области, соответствующей апоптозным тельцам, нет, а пик Fr на ДНК гистограммах отражает количество ядерных фрагментов, освобождающиеся при обработке клеток детергентом (сравни на рис. 14, а III-IVvl б III-IV).

На ДНК-гистограммах, полученных для клеток, инкубированных с этопозидом 4 ч, значительно уменьшалась доля клеток в S-фазе и увеличивалось количество ядерных фрагментов, хотя субдиплоидный пик не выделялся (рис. 14, б, I, табл. 8). Изменение количества апоптозных телец от опыта к опыту хорошо коррелировало с количеством S-фазных клеток в контроле (R = 0.92, Р < 0.001). После 2-часовой инкубации клеток с этопозидом изменений, подобных описанным выше, мы не наблюдали.

Уменьшение доли S-фазных клеток в опытах с этопозидом хорошо согласуется с данными других исследователей, указывающими на то, что при действии этопозида и других ингибиторов топоизомеразы 2 в течение 3-6 ч апоптозу подвергаются клетки, проходящие S-фазу (Barry et al., 1993; Kataoka et al., 1994; Endresen et al., 1995; Gorczyca et al., 1993; Than et al., 2001). Считается, что это связано с тем, что именно при репликации проявляется жесткость комплекса топоизомеразы II с этопозидом, которая приводит к повреждению ДНК (Hände, 1998).

В ряде опытов с градиента снимали отдельно верхнюю, более легкую, и нижнюю, более тяжелую, часть клеточной популяции, и проводили их раздельный анализ. Такие опыты показали, что апоптозных телец и мелких ядерных фрагментов на гистограммах, соответствующих легкой зоне, обычно меньше, чем в случае тяжелой. По ДНК-гистограммам количество мелких ядерных фрагментов в легкой зоне было всегда меньше, чем в тяжелой, и их отношение в среднем по 6 опытам составило 0.46 ± 0.06.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Нами исследовано действие двух индукторов апоптоза - стауроспорина - известного ингибитора протеинкиназ с широким спектром действия и этопо-зида, известного противоопухолевого препарата, оказывающего действие за счет ингибирования вхождения в профазу митоза опухолевых клеток, что связывают с воздействием на топоизомеразу II (Hande, 1998). В то время как первичной мишенью этопозида является ДНК, мишеней, на которые действует стауроспорин, может быть много и локализованы они в цитоплазме. Стауроспорин может активировать каспаза-независимый путь индукции апоптоза, не требует ядерного сигналинга и действует в безъядерных клетках. Апоптоз клеток U937, развивающийся в течение нескольких часов при действии как этопозида, так и стауроспорина, относится к числу наиболее разработанных лабораторных моделей апоптоза, которые широко используются в самых различных планах (Kataoka et al., 1994; Mashima et al., 1995; Endresen et al., 1995; Droin et al., 1998; Jarvis et al., 1999; Wen et al., 2000; Martinsson et al., 2001; Sordet et al., 2001; Troyano et al., 2001; Umeda et al., 2001; Pío et al., 2002; Saeki et al., 2002). Исследованные нами индукторы апоптоза, представляют определенный интерес и в прикладном плане. Стауроспорин привлекает внимание, в частности, как агент усиливающий действие некоторых противоопухолевых фармакологических препаратов (Stepczynska et al., 2001).

Исторически апоптоз определяли как "shrinkage necrosis" (Kerr, 1971). Сокращение объема клеток связанное с потерей воды до сих пор считается одним из наиболее характерных признаков апоптоза (Panayiotídis et al., 2006; Bortner, Cidlowski 2007; Bortner et al., 2008; Numata et al., 2008). Вывод о сокращении размеров клеток при индукции апоптоза этопозидом обычно основывается на уменьшении малоуглового светорассеяния при проточной цито-метрии. Известно, однако, что малоугловое светорассеяние определяется не только размерами клетки, но и рядом других ее свойств (Shapiro, 1988). Апоптоз действительно часто сопровождается изменением малоуглового светорассеяния, но это не следует трактовать безоговорочно как изменение размера клеток. Бортнер и Сидловский (Bortner, Cidlowski 2003) первыми обратили внимание на то, что апоптоз клеток Jurkat, индуцированный через Fas-рецептор, не сопровождается сокращением объема клеток. Заключение о размерах клеток авторы сделали на основании данных проточной цитометрии. Однако они исследовали апоптоза инкубируя клетки в безнатриевой среде; т.е. в условиях далеких от нормальных физиологических.

Водный и ионный баланс при апоптозе клеток U937, вызванном стау-роспорином и этопозидом, как и апоптоз, вызванный другими индукторами и на других клетках, до сих пор остается малоизученным прямыми методами. Полученные нами результаты показывают, что вызванный стауроспорином апоптоз клеток U937 сопровождается дегидратационным сокращением размеров клеток, в то время, как этопозид вызывает апоптоз клеток U937 без дегидратации, хотя совокупность изменений, наблюдавшихся нами у клеток U937 с помощью микроскопии и проточной цитометрии, отвечает общепризнанному набору критериев апоптоза (Wyllie, 1980; Saini, Walker, 1998; Hacker, 2000). Нам не известны работы других исследователей, в которых проводились определения внутриклеточного содержания воды при апоптозе, вызванном этопозидом. Наблюдавшиеся нами морфологические изменения у клеток U937 при апоптозе, вызванном этопозидом, соответствует изменениям, описанным для этой модели апоптоза другими исследователями, изучавшими кроме морфологических изменений также и весь комплекс биохимических маркеров апоптоза (Ghibelli et al., 1995; García-Bermejo et al., 1998; Martinsson et al., 2001; Umeda et al., 2001). Образование апоптозных тел, конденсация хроматина, выпадение из популяции S-фазных клеток дают основание утверждать, что при действии этопозида у исследованных нами клеток имел место апоптоз, который не сопровождался сокращением объема клеток, обусловленным снижением содержания воды. Некоторое уменьшение размеров клеток выявляемое морфометри-ей следует трактовать, по-видимому, как связанное с отделением апоптозных телец. Интенсивное образование апоптозных тел при индукции апоптоза этопозидом делает оценку размеров клеток по малоугловому светорассеянию ненадежной. Поскольку прямые определения внутриклеточного содержания воды на рассматриваемой модели до нас не проводили, отсутствие сокращения объема клеток, сопряженного с уменьшением содержания воды, при действии этопозида осталось незамеченным. У исследованных нами клеток при действии этопозида развивался типичный апоптоз, который мог бы считаться «классическим», если бы имело место и снижение внутриклеточного содержания воды. Совокупность полученных нами данных приводит к выводу, что апоптоз может быть и без уменьшения удельного содержания в клетках воды.

При апоптозе клеток 11937, вызванном этопозидом, когда нет дегидратации клеток, мы наблюдали снижение отношения К+/Ыа+ и изменения потоков Шэ+ через Иа+/К+ насос и каналы. Следовательно, при апоптозе даже при отсутствии дегидратации имеют место изменения ионного баланса.

При анализе связи между изменением ионного состава и изменением водного баланса клетки существенны изменения не концентрации К+ и Иа+ во внутриклеточной воде, а изменение их содержания. Решающую роль в том, состоится ли апоптозное сокращение объема клеток, связанное с их дегидратацией (АУБ), или нет, играет соотношение между убылью содержания К+ и ростом содержания Ыа+. Если уменьшение внутриклеточного содержания К+ при апоптозе не покрывается увеличением содержания то суммарное содержание К+ и Ыа+ уменьшается и можно ожидать уменьшение объема клетки. По нашим данным так происходит при апоптозе, вызванном стауроспорином. Апоптоз клеток 11937-160В2 при 4-часовом действии 1 мкМ стауроспорина сопровождается снижением внутриклеточного содержания К+ от 1.1 до 0.78 ммоль, ростом содержания Ыа+ от 0.3 до 0.34 ммоль на 1 г белка и снижением суммарного содержания этих катионов на 0,28 ммоль на 1 г белка. В этом случае наблюдается АУБ. В случае сильного апоптоза, вызванного 1 мкМ стауроспорином, в наших опытах выявлялась 18-25 %-ная дегидратация, а в случае слабого апоптоза, вызванного 0.2 мкМ стауроспорина - 10-13 %-ная дегидратация. В обоих случаях наблюдалось снижение суммарного содержания К+ и Ыа+ и отношения К+/Ыа+ (при несущественном изменении концентрация К+ во внутриклеточной воде !). Содержание СГ также уменьшалось на величину, эквивалентную убыли катионов. При апоптозе клеток 11937, вызванном этопозидом, уменьшение содержания К+ перекрывалось увеличением содержания Ыа+, суммарное содержание К+ и Иа+ и СГ не изменялось и апоптозной дегидратации клеток не было. Итак, уменьшение суммарного внутриклеточного содержания К+ и Na+ при действии стауроспорина и отсутствие изменения суммарного внутриклеточного содержания К+ и Na+ при действии этопозида приводит к дегидратации в первом случае и не сопровождается дегидратацией во втором случае. Мы полагаем, что полученные в настоящей работе результаты более строго, чем у предшественников, показывают на примере клеток U937, что в уменьшении размеров клеток при апоптозе действительно ключевую роль играет снижение внутриклеточного содержания К+.

Изменение при апоптозе содержания в клетках К+ и Na+ и С1~, наблюдавшееся в наших опытах, хорошо согласуется с современными данными, полученными с помощью рентгеновского микроанализа. Они показывают, что при апоптозе уменьшается суммарное содержание К+ и Na+ в клетках в расчете на сухую массу. К сожалению, при рентгеновском микроанализе всегда недостает данных по внутриклеточному содержанию воды. На клетках U937 при апоптозе, вызванном ультрафиолетовым облучением, содержание К+ по данным рентгеновского микроанализа снижается с391 до 196 мкмоль на 1 г сухой массы, а содержание Na+ увеличивается с 52 до 198 мкмоль на 1 г сухой массы, содержание СГ уменьшается от 156 до115 мкмоль, а содержание Р составляло 299 и 314 мкмоль на 1 г сухой массы (Fernández-Segura et al., 1999). Прямое сопоставление изменения содержания ионов с изменением содержания воды или объема клеток при этом виде анализа затруднительно, но обнаруженное уменьшение суммарного содержания К+ и Na+ с 443 до 394 мкмоль на 1 г сухой массы можно рассматривать как указание на снижение содержания воды и объема клеток. Снижение суммарного содержания К+ и Na+ при одновременном снижении отношения K+/Na+ в цитируемой работе хорошо согласуется с нашими результатами, полученными с помощью пламенно-эмиссионного анализа.

Похожие данные получены рентгеновским микроанализом на моноцитах человека, апоптоз которых был вызван окисленными липопротеинами низкой плотности (Skepper et al., 1999). На этом объекте через 6 ч концентрация К+ снижалась до 291 против 616 мкмоль на 1 г сухой массы в контроле, а концентрация Na+ увеличивалась до 103 против 42 мкмоль на 1 г. Эти изменения сопровождались снижением концентрации СГ со 152 до 58 мкмоль на 1 г, а фосфора с 672 до 465 мкмоль на 1 г. Снижение отношения K+/Na+, сопровождающееся снижением суммарного содержания К+ и Na+ и содержания СГ, показано рентгеновским микроанализом на линии клеток простаты РС-3 при апоптозе, вызванном этопозидом (Salido et al., 2001).

Наиболее близка к нашему исследованию по замыслу работа Арреболы и соавторов (Arrebola et al., 2005b). При апоптозе клеток U937, вызванном стауроспорином, внутриклеточное содержание К+ по данным этих исследователей уменьшается от 416±5 до 216± 10 мкмоль на 1 г сухой массы, внутриклеточное содержание Na+ увеличивается от 63±3 до 143±6 мкмоль на 1 г сухой массы, внутриклеточное содержание СГ уменьшается от 143±4 до 103± 6 мкмоль на 1 г сухой массы, внутриклеточное содержание Р не изменяется, а отношение K+/Na+ уменьшается весьма существенно - от 7,5±0,34 до 1,73±0,11.

Существует мнение, что изменение концентрации К+ во внутриклеточной воде играет важную роль в активации каспаз и нуклеаз при апоптозе. Имеющиеся в литературе данные недостаточны для доказательства этого положения. Об уменьшении внутриклеточной концентрации как К+, так и Na+ в клетках HL-60 при ультрафиолетовом облучении сообщают МакКарти и Кот-тер (McCarthy, Cotter, 1997), использовавшие для определения концентрации катионов К+- и №+-чувствительные флуоресцентные зонды. Прямые анализы внутриклеточного содержания К+ и Na+ в этой работе не проводили. За апоп-тозные клетки принимали тимоциты с уменьшенным малоугловым светорассеянием, то есть уменьшенного, по мнению МакКарти и Коттера, размера. В этом случае трудно определить, с чем связано уменьшение флуоресцентного сигнала при проточной цитометрии, с уменьшением концентрации катиона или уменьшением размера клетки. Хьюджес с соавторами (Hughes et al., 1997) исследовали изменение внутриклеточной концентрации К+ в тимоцитах при действии дексаметазона (1 мкМ, 2-8 ч) с помощью К+-чувствительного флуоресцентного зонда в проточном цитометре и прямого масс-спектрометрического анализа. Они сообщают об уменьшении интенсивности флуоресценции зонда на 95% (!) в апоптозной субпопуляции, отсортированной по малоугловому и боковому светорассеянию. Концентрация К+ в расчете на внутриклеточную воду по данным масс-спектрометрии в течение первых двух часов оставалась по данным этих авторов как и у контрольных клеток на уровне 140 мМ. К сожалению, авторы не указывают, каким образом они оценивали содержание внутриклеточной воды и не приводят данные по Na+. Барбиеро с соавторами (Ваг-biero et al., 1995) исследовали апоптоз фибробластов мыши линии L, вызванный этопозидом, а измерение флуоресценции калиевого (PBFI) и натриевого (SBFI) зондов проводили в монослое. Они пришли к выводу, что на третьи сутки действия этопозида концентрация К+ у "апоптозных" клеток становится ниже 50 мМ (18 % клеток), а концентрация Na+ выше 30 мМ (6 % клеток). В контрольных клетках по данным этой работы концентрация К+ в расчете на воду составляла 110, а Na+ - 15 мМ. Трудно сказать, обусловлены ли приводимые в литературе столь значительные изменения при апоптозе концентрации К+ и Na" во внутриклеточной воде, полученные с помощью флуоресцентных зондов, ошибками метода, или глубиной апоптоза и особенностями клеток. Клетки, у которых внутриклеточная концентрация Na+ 30 мМ, а концентрация К+ 50 мМ, очень отличаются от нормальных и от тех, на которых проводилась наша работа.

В наших опытах дегидратация клеток при апоптозе, вызванном стаурос-порином, сопровождалась изменением ионного баланса. При апоптозе клеток U937, вызванном этопозидом, дегидратации не было, но изменения ионного баланса имели место, поскольку снижалось отношение K /Na . В обоих случаях изменялось состояние трактов переноса ионов через плазматическую мембрану и необходимо было выяснить каковы механизмы изменения ионного баланса у двух изученных моделей апоптоза. Так как К+ является основным клеточным осмолитом, то предметом исследования стало изучение работы важнейших трактов переноса К+. Для этой цели были измерены уабаин-чувствительный и уабаин-резистентный потоки Rb+, физиологического аналога К+, Оказалось, что ионные изменения при слабом апоптозе, вызванном стау-роспорином, у сублинии U937-160B2 связаны, преимущественно, с увеличением потока Rb+(K+) через каналы, а у сублинии U937-N9957 - только с уменьшением потока Rb +(К+) через насос. Столь различные механизмы изменения ионного баланса при действии стауроспорина у этих сублиний наблюдались только в случае слабого апоптоза, вызванного 0.2 /хМ стауроспорином, когда наблюдалась 10-13 % дегидратация. Изменения ионного баланса при сильном апоптозе, вызванном 1 мкМ стауроспорином у сублинии U937-160B2, так же, как и у сублинии U937-DSZM, связаны, преимущественно, с уменьшением потока Rb+(K+) через насос. Ионные изменения при апоптозе, вызванном у клеток U937 этопозидом, обусловлены уменьшением потока Rb+(K+) через насос и увеличением потока Rb+(K+) через каналы.

У исследованных нами двух моделей апоптоза различие проявляется не только в том, что в одном случае содержание воды в клетках уменьшается, а в другом не изменяется. Различие состоит также в характере конденсации хроматина, и в том, что при апоптозе, вызванном этопозидом, образуется много апоптозных телец, тогда как при апоптозе, вызванном стауроспорином, их почти не бывает. Отсутствие апоптозных телец при действии стауроспорина, некоторые исследователи объясняют влиянием STS на цитоскелет, блокирующем образование телец (Cotter et al., 1992; Mills et al., 1998). Альтернативное объяснение состоит в том, что при действии STS «не запускается» образование апоптозных телец. В пользу второго предположения свидетельствует наблюдавшееся нами интенсивное образование апоптозных телец при действии на клетки стауроспорина в комбинации с этопозидом, указывающее на то, что, по крайней мере, в этом случае, STS не блокирует образование апоптозных телец.

Следует отметить, что при действии на клетки этопозида вместе с STS содержание воды уменьшается в отличие от действия одного этопозида. По-видимому, здесь дело не в каком-то негативном влиянии этопозида на апоп-тозное снижение внутриклеточного содержания воды. Более естественным представляется предположение, что апоптоз может быть «неполным», а в тех случаях, когда он полный, работают относительно независимые параллельные сигнальные пути. В аналогичном эксперименте Локк с соавторами (Lock et al., 1997) на клетках HeLa наблюдали, что стауроспорин усиливал действие этопозида в 2-3 раза, действуя на мишени после вызванного этопозидом повреждения ДНК.

В заключение следует подчеркнуть, что отсутствие сокращения объема клетки, связанного с уменьшением удельного содержания воды при апоптозе клеток U937, вызванном этопозидом, не особенность индуктора и не особенность клеток U937. Этопозид вызывает апоптоз с потерей воды у тимоцитов крысы (Веренинов и др., 2003) и у клеток ML-1 (Morana et al., 1996), а клетки U937 способны к апоптозу с потерей воды под действием стауроспорина. Апоптоз без потери воды возникает при сочетании вида клеток и типа индуктора.

В свете полученных нами результатов обязательным признаком апопто-за, отличающим его от некроза, следует считать не клеточное сжатие, а отсутствие набухания вследствие сохранения достаточно низкого уровня проницаемости клеточной мембраны для таких важных клеточных осмолитов, как калий и натрий (Vereninov et al., 2007). Именно по этой причине при апоптозе нет осмотического лизиса, которым всегда сопровождается клеточный некроз. выводы

1. Апоптоз клеток 11937, вызванный стауроспорином, сопровождается дегидратацией на 2/3 за счет изменения содержания К+ и СГ. Изменение концентрации К+ во внутриклеточной воде при этом невелико и не может играть существенную роль в развитии апоптоза.

2. Ионные изменения при слабом апоптозе, вызванном стауроспорином, у сублинии Ш37-160В2 связаны, преимущественно, с увеличением потока Шэ+(К+) через каналы, а у сублинии и937-№9957 - только с уменьшением потока Шэ+(К+) через насос.

3. Ионные изменения при сильном апоптозе, вызванном стауроспорином, у сублинии Ш37-160В2 связаны, преимущественно, с уменьшением потока ЯЬ+(К+) через насос.

4. Апоптоз, вызванный у клеток 11937 этопозидом, в отличие от апоптоза, вызванного стауроспорином, не сопровождается дегидратацией и тем не менее сопровождается изменением ионного баланса - уменьшением отношения К"/Иа+ без уменьшения суммарного содержания К+, и С1", уменьшением потока Шэ+(К+) через насос и увеличением потока Шэ+(К+) через каналы.

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Веренинов А.А, Волгарева Е. В., Матвеев В. В., Мошков А.В., Розанов Ю.М., Широкова А.В., Юринская В.Е. 2003. Водный и ионный баланс тимо-цитов крысы при апоптозе, вызванном дексаметазоном и этопозидом. Ионо-осмотическая модель уменьшения объема клетки. Цитология. 45(5) : 500-509.

2. Веренинов А.А., Горячая Т.С., Матвеев В.В., Мошков А.В., Розанов Ю.М., Сакута Г.А., Широкова А.В., Юринская В.Е. 2004. Дегидратационное сокращение объема клеток при апоптозе - факультативный признак. Цитология. 46(7): 609-619.

3. Yurinskaya V., Goryachaya Т., Guzhova I., Moshkov A., Rozanov Y., Sakuta G., Shirokova A., Shumilina E., Vassilieva I., Lang F., Vereninov A. 2005. Potassium and sodium balance in U937 cells during apoptosis with and without cell shrinkage. Cell Physiology and Biochemistry. 16 : 155-162.

4. Yurinskaya V.E., Moshkov A.V., Rozanov Y.M., Shirokova A.V., Vassilieva I.O., Shumilina E. V., Lang F., Volgareva E. V., Vereninov A. A. 2005. Thymocyte K+, Na+ and water balance during dexamethasone- and etoposide-induced apoptosis. Cell Physiology and Biochemistry 16 : 15-22.

5. Широкова A.B. 2007. Апоптоз. Сигнальные пути и изменение ионного и водного баланса клетки. Цитология 49(5) : 385-394.

Shirokova A.V. 2007. Apoptosis. Signaling pathways and cell ion and water-balance. Cell and Tissue Biology 1 : 215-224].

6. Веренинов A.A., Горячая Т.С., Матвеев В.В., Мошков А.В., Розанов Ю.М., Сакута Г.А., Широкова А.В., Юринская В.Е. 2003. Уменьшение объема клеток и потеря воды как определяющий признак апоптоза. Цитология 45 (9) : 857. (Тезисы докладов и сообщений, представленных на 1-й всероссийский съезд Общества клеточной биологии).

7. Мошков А.В., Васильева И.О., Веренинов А.А., Матвеев В.В., Широкова А.В., Юринская В.Е. 2003. Механизмы сжатия клеток при апоптозе. Сб. "Итоги исследований по программам СПб НЦ РАН 2001-2003 г.г." - Наука, СПб. 6667.

8. Веренинов А.А., Горячая Т.С., Розанов Ю.М., Широкова А.В., Юринская В.Е., Ланг Ф., Рубашкин А.А. 2007. Баланс потоков К+, Na+ и С1* через плазматическую мембрану у клеток лимфомы человека U937 в норме и при апоптозе, ионные механизмы апоптозной дегидратации клеток. Цитология 49(9) : 726. (Тезисы докладов и сообщений, представленных на 2-й всероссийский съезд Общества клеточной биологии).

9. Vereninov А.А., Rubashkin А.А., Goryachaya T.S., Moshkov A.V., Rozanov Yu.M., Shirokova A.V., Strelkova E.G., Lang F., Yurinskaya V.E. 2008. Pump and channel K+ (Rb+) fluxes in apoptosis of human lymphoid cell line U937. Cellular Physiology and Biochemistry 22 : 187-194.

ЦИТИРОВАННАЯ ЛИТЕРАТУРА

Веренинов А. А. 1978. Транспорт ионов через клеточную мембрану. Анализ потоков. Д.: Наука. 286с.

Веренинов А. А., Марахова И.И. 1986. Транспорт ионов у клеток в культуре Д.: Наука. 292с.

Веренинов А. А. ст., Веренинов А. А. мл. 1991. Ионный, электрический и водный баланс в животной клетке. Система с активным транспортом катионов, гольдмановскими каналами и симпортом типа Na+K+2C1. Цитология 33 (11) : 4-17.

Веренинов А. А., Волгарева Е. В., Матвеев В. В., Мошков А. В., Розанов Ю. М., Широкова А. В., Юринская В. Е. 2003. Водный и ионный баланс тимоцитов крысы при апоптозе, вызванном дексаметазоном и этопозидом. Ионо-осмотическая модель уменьшения объема клетки. Цитология. 45(5) : 500-509.

Веренинов А. А., Юринская В.Е., Рубашкин A.A. 2004. Роль калия, калиевых каналов и симпортеров в апоптозном сокращении клеточного объема. Эксперимент и теория. Докл. РАН. 398(4) : 555-559.

Веренинов А. А., Юринская В. Е., Рубашкин А. А. 2006. Апоптозная дегидратация лимфоидных клеток: моделирование изменения баланса ионных потоков. Докл. РАН. 411 (6) : 824-828.

Донская H.A., Волгарева Е.В., Розанов Ю.М. [Lonskaya,I. A., Volgareva Е. V. Rozanov Y. M.] 2001. Two different types of apoptosis in thymocytes. Цитология. 43(3) : 244-249.

Розанов 10. M. 1988. Проточная цитометрия. В кн.: Методы культивирования клеток. Д.: Наука. 136-146.

Розанов Ю. М., Барский И. Я., Папаян Г. В., Платунов С. Е., Забродин А. С. 1990. Многопараметрический цитометр-анализатор на базе микроскопа лЛЮМАМ». В кн.: Автоматизация цитологических исследований. Киев: Наук, думка. 136-139.

Akimova O.A., Poirier M., Kotelevtsev S. V., Hamet P., Orlov S.N. 2008. The death of ouabain-treated renal epithelial cells: evidence against anoikis occurrence. Apoptosis. 13(5) : 670-80.

Aoki H., Kang P. M., Hampe J., Yoshimura K., Noma T., Matsuzaki M., Izumo S. 2002. Direct activation of mitochondrial apoptosis machinery by c-Jun N-terminal kinase in adult cardiac myocytes. J. Biol. Chem. 277 : 10244-10250.

Arrebola F., Cañizares J., Cubero M. A., Crespo P. V., Warley A., Fernández-Segura E. 2005a. Biphasic behavior of changes in elemental composition during staurosporine-induced apoptosis. Apoptosis. 10 : 1317-1331.

Arrebola F., Fernández-Segura E., Campos A., Crespo P. V., SkepperJ. N. Warley A. 2006. Changes in intracellular electrolyte concentrations during apoptosis induced by UY irradiation of human myeloblasts cells. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 290 : C638- C649.

Arrebola F., Zabiti S., Cañizares F. J., Cubero M. A., Crespo P.V., Fernández-Segura E. 2005b. Changes in intracellular sodium, chlorine, and potassium concentrations in staurosporine-induced apoptosis. J. Cell Physiol. 204 : 500507.

Banasiak K. J., Burenkova O., Haddad G. G. 2004. Activation of voltage-sensitive sodium channels during oxygen deprivation leads to apoptotic neuronal death. Neuroscience. 126 : 31-44.

Bar P. R. 1996. Apoptosis - the cell's silent exit. Life Sci. 59 : 369-378.

Barbiero G., Duranti F., Bonelli G., Amenta J. S., Baccino F. M. 1995. Intracellular ionic variations in the apoptotic death of L cells by inhibitors of cell cycle progression. Exp. Cell Res. 217 : 410-418.

Barry M. A., Eastman A. 1992. Endonuclease activation during apoptosis: the role of cytosolic Ca2+ and pH. Biochem. Biophys. Res. Commun. 186 : 782-789.

Barry M. A., Eastman A. 1993. Identification of deoxyribonuclease II as an endonuclease involved in apoptosis. Arch. Biochem. Biophys. 300 : 440-450.

Beauvais F., Michel L., Dubertret L. 1995. Human eosinophils in culture undergo a striking and rapid shrinkage during apoptosis. Role of K+ channels. J. Leu-koc. Biol. 57 : 851-855.

Bedner E., Li X., Kunicki J., Darzynkiewicz Z. 2000. Translocation of Bax to mitochondria during apoptosis measured by laser scanning cytometry. Cytometry. 41 : 83-88.

Beere H. M. 2004. "The stress of dying": the role of heat shock proteins in the regulation of apoptosis. J. Cell Sci. 117: 2641-2651.

Belaud-Rotureau M. A., Leducq N. Macouillard Poulletier d. G., Diolez P., Lacoste L., Lacombe F., Bernard P., Belloc F. 2000. Early transitory rise in intracellular pH leads to Bax conformation change during ceramide-induced apoptosis. Apoptosis. 5 : 551-560.

Benson R. S., Dive C., Watson A. J. 1999. Cytoplasmic acidification is not an effector mechanism of VP 16 or DEX-induced apoptosis in CEM T leukaemia cells. J. Cell Sci. 112 (Pt 11): 1755-1760.

Benson R. S., Heer S., Dive C., Watson A. J. 1996. Characterization of cell volume loss in CEM-C7A cells during dexamethasone-induced apoptosis. Am. J. Physiol 270 : C1190-C1203.

Bernardi P., Petronilli V., Di Lisa F, Forte M. 2001. A mitochondrial perspective on cell death. Trends Biochem.Sci. 26 : 112-117.

Blanco G., Nguyen A.-N. 2008. Ouabain stimulates both proliferation and. apoptosis in renal epithelial cells from patients with autosomal dominant polycystic kidney disease. FASEB J, 22 : 1157.6.

Bortner C. D., Cidlowski J. A. 1999. Caspase independent/dependent regulation of K+, cell shrinkage, and mitochondrial membrane potential during lymphocyte apoptosis. J. Biol. Chem. 274 : 21953-21962.

Bortner C. D., Cidlowski J. A. 2002. Apoptotic volume decrease and the incredible shrinking cell. Cell Death. Differ. 9 : 1307-1310.

Bortner C. D., Cidlowski J. A. 2003. Uncoupling cell shrinkage from apoptosis reveals that Na+ influx is required for volume loss during programmed cell death. J. Biol. Chem. 278 : 39176-39184.

Bortner CD, Cidlowski JA. 2007. Cell shrinkage and monovalent cation fluxes: role in apoptosis.Arch. Biochem Biophys. 462 : 176-88.

Bortner C. D., Gdmez-Angelats M., Cidlowski J. A. 2001. Plasma membrane depolarization without repolarization is an early molecular event in anti-Fas-induced apoptosis. J. Biol. Chem. 276 : 4304-4314.

Boviner C.D., Sifre M. L, CidlowskiJ. A. 2008. Cationic gradient reversal and cytoskeleton-independent volume regulatory pathways define an early stage of apop-tosis. J. Biol. Chem., 283 : 7219 - 7229.

Bossy-WetzelE., TalantovaM.V., Lee W.D., SchölzkeM.N., HarropA., Mathews E., Götz T., Han J., Ellisman M.H., Perkins G.A., Lipton S. A. 2004. Crosstalk between nitric oxide and zinc pathways to neuronal cell death involving mitochondrial dysfunction and p38-activated K+ channels. Neuron. Feb 41 : 351-65.

Boyle P.J., Conway E.H. 1941. Potassium accumulation in muscle and associated changes. J. Physiol. 100 : 1-63.

Burg E. D., Remillard C. V., Yuan J. X 2006. K+ channels in apoptosis. J. Membr. Biol. 209 : 3-20.

Candé G, Cecconi F., Dessen P., Kroemer G. 2002. Apoptosis-inducing factor (AIF): key to the conserved caspase-independent pathways of cell death? J. Cell Sei. 115 : 4727-4734.

Chang S. H., Phelps P. C., Berezesky I. K., Ebersberger M. L., Jr., Trump B. F. 2000. Studies on the mechanisms and kinetics of apoptosis induced by microin--jection of cytochrome c in rat kidney tubule epithelial cells (NRK-52E). Am. J. Pathol. 156 : 637-649.

ChenX., Ko L. J., Jayaraman L., Prives C. 1996. p53 levels, functional domains, and DNA damage determine the extent of the apoptotic response of tumor cells. Genes Dev. 10 : 2438-2451.

Cohen G. M., Sun X. M., Snowden R. T., Ormerod M. G., Dinsdale D. 1993. Identification of a transitional preapoptotic population of thymocytes. J. Immunol. 151 : 566-574.

Cotter T. G., Lennon S. V., Glynn J. M„ Green D. R. 1992. Microfilament-disrupting agents prevent the formation of apoptotic bodies in tumor cells undergoing apoptosis. Cancer Res. 52 : 997-1005.

Dallaporta B., Marchetti P., de Pablo M. A., Maisse C., Due H. T., Métivier D., Zamzami N., Geuskens M., Kroemer G. 1999. Plasma membrane potential in thymocyte apoptosis. J. Immunol. 162 : 6534-6542.

Darzynkiewicz Z, Bedner E., Traganos F., Murakami T. 1998. Critical aspects in the analysis of apoptosis and necrosis. Hum. Cell. 11 : 3-12.

DroinN., DubrezL., Eymin B„ Renvoize C., BreardJ., Dimanche-Boitrel-M. T., Solary E. 1998. Upregulation of CASP genes in human tumor cells undergoing etoposide- induced apoptosis. Oncogene 16 : 2885-2894.

Dumont C., Durrbach A., Bidere N. Rouleau M., Kroemer G., Bernard G., Hirsch F., Charpentier B., Susin S.A., SenikA. 2000. Caspase-independent commitment phase to apoptosis in activated blood T lymphocytes: reversibility at low apop-totic insult. Blood. 96 : 1030-1038.

Dussmann H., Rehm M., Kdgel D., Prehn J. H. 2003. Outer mitochondrial membrane permeabilization during apoptosis triggers caspase-independent mitochondrial and caspase-dependent plasma membrane potential depolarization: a single-cell analysis. J. Cell Sci. 116 : 525-536.

Earnshaw W. C., Martins L. M„ Kaufmann S. H. 1999. Mammalian cas-pases: structure, activation, substrates, and functions during apoptosis. Annu. Rev. Biochem. 68 :383-424.

Ekhterae D., Platoshyn 0., Krick S., Yu Y., McDaniel S. S„ Yuan J. X. 2001. Bcl-2 decreases voltage-gated K+ channel activity and enhances survival in vascular smooth muscle cells. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 281 : C157-C165.

Elliott J. I., Higgins C. F. 2003. IKCal activity is required for cell shrinkage, phosphatidylserine translocation and death in T lymphocyte apoptosis. EMBO Rep. 4: 189-194.

Elmore S. 2007. Apoptosis: a review of programmed cell death. Toxicologic Pathology 35:495-516.

Endresen P. C., Prytz P. S„ Aarbakke J. 1995. A new flow cytometric method for discrimination of apoptotic cells and detection of their cell cycle specificity through staining of F-actin and DNA. Cytometry 20 : 162-171

Ernest N. J., Habela C W., Sontheimer H. 2008. Cytoplasmic condensation is both necessary and sufficient to induce apoptotic cell death . J. Cell Sci., 121: 290 -297.

Esteves M. B., Marques-Santos L. F„ Affonso-Mitidieri O. R., Rumjanek V. M. 2005. Ouabain exacerbates activation-induced cell death in human peripheral blood lymphocytes. An. Acad. Bras. Cienc. 77 : 281-292.

Falcieri E., Martelli A.M., Bareggi R., CataldiA., Cocco L. 1993. The protein kinase inhibitor staurosporine induces morphological changes typical of apop-tosis in MOLT-4 cells without concomitant DNA fragmentation. Biochem. Biophys. Res. Commun. 193 : 19-25.

Fernández-Segura E., Cañizares F. J., Cubero M. A., Warley A., Campos A. 1999. Changes in elemental content during apoptotic cell death studied by electron probe X-ray microanalysis. Exp. Cell Res. 253 : 454-462.

Franco R., Bortner C. D., Cidlowski J. A. 2006. Potential roles of electrogenic ion transport and plasma membrane depolarization in apoptosis. J. Membr. Biol. 209 : 43-58.

Friis M. B., Friborg C. R, Schneider L., Nielsen M. B., Lambert I. H., Christensen S. T., Hoffmann E. K. 2005. Cell shrinkage as a signal to apoptosis in NIH 3T3 fibroblasts. J. Physiol. 567 : 427-443.

Furlong I. J., Lopez M. C., Ascaso R, Lopez R. A., Collins M. K. 1998. Induction of apoptosis by valinomycin: mitochondrial permeability transition causes intracellular acidification. Cell Death. Differ. 5 : 214-221.

Garcia-Bermejo L., Perez C., Vilaboa N. E., de Bias E., Aller P. 1998. cAMP increasing agents attenuate the generation of apoptosis by etoposide in promonocytic leukemia cells. J. Cell Sci. Ill (Pt 5): 637-644.

Ghibelli L., Maresca V., Coppola S., Gualandi G. 1995. Protease inhibitors block apoptosis at intermediate stages: a compared analysis of DNA fragmentation and apoptotic nuclear morphology. FEBS Lett. 377 : 9-14.

Ghobrial I. M., Witzig T. E., Adjei A. A. 2005. Targeting apoptosis pathways in cancer therapy. CA Cancer J. Clin. 55 : 178-194. >■

Ghosh A., KengP.C., KnaufP.A. 2007. Hypertonicity induced apoptosis in HL-60 cells in the presence of intracellular potassium. Apoptosis 12 : 1281-8.

Gilbert M., Knox S. 1997. Influence of Bcl-2 overexpression on Na+/K+-ATPase pump activity: correlation with radiation-induced programmed cell death. J. Cell Physiol. 171 : 299-304.

Gómez-Angelats M., Bortner C. D., Cidlowski J. A. 2000. Protein kinase C (PKC) inhibits fas receptor-induced apoptosis through modulation of the loss of K+ and cell shrinkage. A role for PKC upstream of caspases. J. Biol. Chem. 275 : 1960919619.

Gorczyca W., Gong J., Ardelt B., Traganos F., Darzynkiewicz Z. 1993. The cell cycle related differences in susceptibility of HL-60 cells to apoptosis induced by various antitumor agents. Cancer Res. 53 : 3186-3192.

Green D. R., Reed J. C. 1998. Mitochondria and apoptosis. Science. 281 : 1309-1312.

Gulbins E., Szabo I., Baltzer K., Lang F. 1997. Ceramide-induced inhibition of T lymphocyte voltage-gated potassium channel is mediated by tyrosine kinases. Proc. Natl. Acad. Sci.USA. 94 : 7661-7666.

Häcker G. 2000. The morphology of apoptosis. Cell Tissue Res. 301 : 5-17.

Hande K. R. 1998. Etoposide: four decades of development of a topoisomerase II inhibitor. Eur. J. Cancer 34 : 1514-1521.

Haupt S., Berger M., Goldberg Z, Haupt Y. 2003. Apoptosis - the p53 network. J. Cell Sei. 116 : 4077-4085.

Hengartner M.O. 2000. The biochemistry of apoptosis. Nature 407 : 770-776.

Hessler JA, Budor A, Putchakayala K, Mecke A, Rieger D, Banaszak Holl MM, Orr BG, Bielinska A, Beals J, Baker J Jr. 2005. Atomic force microscopy study of early morphological changes during apoptosis. Langmuir. 21 : 9280-6.

Ho P. K., Hawkins C. J. 2005. Mammalian initiator apoptotic caspases. FEBS J. 272 : 5436-5453.

Hoffmann E. K. 1987. Volume regulation in cultured cells. In: Current topics in membranes and transport. San-Diego: Academic Press. 30: 125-180.

Huang Y.T., ChuehS.C., TengC.M., GuhJ.H. 2004. Investigation ofouabain-induced anticancer effect in human androgen-independent prostate cancer PC-3 cells. Biochem Pharmacol.67 : 727-33.

Hughes F. M, Jr:, Bortner C. D„ Purdy G. D., Cidlowski J. A. 1997. Intracellular K+ suppresses the activation of apoptosis in lymphocytes. J. Biol. Chem. 272 : 30567-30576.

Hughes F. M., Jr., Cidlowski J. A. 1999. Potassium is a critical regulator of apoptotic enzymes in vitro and in vivo. Adv. Enzyme Regul. 39 : 157-171.

Inai Y., Yabuki M., Kanno T., Akiyama J., Yasuda T., Utsumi K. 1997. Valinomycin induces apoptosis of ascites hepatoma cells (AH-130) in relation to mitochondrial membrane potential. Cell Struct. Funct. 22 : 555-563.

Janicke R.U., Ng P., Sprengart M. L., Porter A. G. 1998. Caspase-3 is required for alpha-fodrin cleavage but dispensable for cleavage of other death substrates in apoptosis. J. Biol. Chem. 273 : 15540-15545.

Jarvis W. D., Johnson C. R., FornariF. A., Park J. S„ Dent P., GrantS. 1999. Evidence that the apoptotic actions of etoposide are independent of c-Jun/activating protein-1-mediated transregulation. J. Pharmacol. Exp. Ther. 290 : 1384-1392.

Johnson V. L., Ko S. C., Holmstrom T.H., Eriksson J.E., Chow S.C. 2000. Effector caspases are dispensable for the early nuclear morphological changes during chemical-induced apoptosis. J. Cell Sci. 113 ( Pt 17) : 2941-2953.

Kataoka S., Naito M., Tomida A., Tsuruo T. 1994. Resistance to antitumor agent-induced apoptosis in a mutant of human myeloid leukemia U937 cells. Exp. Cell Res. 215 : 199-205.

Kaufmann S. H., Earnshaw W. C. 2000. Induction of apoptosis by cancer chemotherapy. Exp. Cell Res. 256 : 42-49.

Kaufmann S. H., Hengartner M. O. 2001. Programmed cell death: alive and well in the new millennium. Trends Cell Biol. 11 : 526-534.

Kerr J. F. 1971. Shrinkage necrosis: a distinct mode of cellular death. J. Pathol. 105 : 13-20.

Komatsu N., Nakagawa M., Oda T., Muramatsu T. 2000. Depletion of intracellular NAD+ and ATP levels during ricin-induced apoptosis through the specific ribosomal inactivation results in the cytolysis of U937 cells. J. Biochem.(Tokyo) 128 : 463-470.

KrickS., Platoshyn O., Sweeney M., Kim H., Yuan J. X. 2001. Activation of K+ channels induces apoptosis in vascular smooth muscle cells. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 280 : C970-C979.

Krumschnabel G., Maehr T., Nawaz M., Schwarzbaum P.J., Manzl C. 2007. Staurosporine-induced cell death in salmonid cells: the role of apoptotic volume decrease, ion fluxes and MAP kinase signaling. Apoptosis. 12 : 1755-68.

Lagadic-Gossmann D., Hue L., Lecureur V. 2004. Alterations of intracellular pH homeostasis in apoptosis: origins and roles. Cell Death. Differ. 11 : 953-961.

Lang F., Fôller M., Lang K.S., Lang P.A., Ritter M., Gulbins E., Vereninov A., Huber S.M. 2005. Ion channels in cell proliferation and apoptotic cell death. J. Membr Biol. 205(3) : 147-57.

Lang F., Fôller M., Lang K., Lang P., Ritter M„ Vereninov A., Szabo I., Huber S.M., Gulbins E. 2007.Q.t\\ volume regulatory ion channels in cell proliferation and cell death.Methods Enzymol. 428 : 209-25.

Lang F., Gulbins E., Szabo /., Vereninov A., Huber S.M. 2008. Ion channels, cell volume, cell proliferation and apoptotic cell death. In: Sensing with ion channels, Springer-Verlag Berlin Heidelberg, 69-84.

Lang F., Madlung J., Bock J., Lukewille U., Kaltenbach S., Lang K. S., Belka C., Wagner C. A., Lang H. J., Gulbins E., Lepple-Wienhues A. 2000. Inhibition of Jurkat-T-lymphocyte Na+/H+-exchanger by CD95 (Fas/Apo-l)-receptor stimulation. Pflugers Arch. 440 : 902-907.

Lang F., Madlung J., Uhlemann A.C., Risler T., Gulbins E. 1998. Cellular taurine release triggered by stimulation of the Fas(CD95) receptor in Jurkat lymphocytes. Pflugers Arch. 436 : 377-83.

Lang F., Shumilina E., Ritter M., Gulbins E., Vereninov A., Huber S.M. 2006. Ion channels and cell volume in regulation of cell proliferation and apoptotic cell death. Contrib Nephrol. 152 : 142-60.

LockR.B., Thompson B.S., Sullivan D.M., Stribinskiene L. 1997. Potentiation of etoposide-induced apoptosis by staurosporine in human tumor cells is associated with events downstream of DNA-protein complex formation.Cancer Chemother Pharmacol.;39: 399-409.

Macknight A.D.C. 1987. Volume maintenance in isosmotic conditions. In: Current topics membr. and transp. 30 : 3-43.

Maeno E., Ishizaki Y., Kanaseki T., Hazama A., Okada Y. 2000. Normotonic cell shrinkage because of disordered volume regulation is an early prerequisite to apoptosis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97 : 9487-9492.

Maeno E, Takahashi N, Okada Y. 2006. Dysfunction of regulatory volume increase is a key component of apoptosis. FEBS Lett. 580 : 6513-7.

Mann C. L„ Bortner C. D., Jewell C. M., Cidlowski J. A. 2001. Glucocorticoid-induced plasma membrane depolarization during thymocyte apoptosis: association with cell shrinkage and degradation of the Na+/K+-adenosine triphosphatase. Endocrinology. 142 :5059-5068.

Marklund L., Behnam-Motlagh P., Henriksson R., Grankvist K. 2001. Bumet-anide annihilation of amphotericin B-induced apoptosis and cytotoxicity is due to its effect on cellular K+ flux. J. Antimicrob. Chemother. 48 : 781-786.

Martinsson P., Liminga G., Nygren P., Larsson R. 2001. Characteristics of etoposide-induced apoptotic cell death in the U-937 human lymphoma cell line. Anticancer Drugs 12 : 699-705.

MashimaT., Naito M„ FujitaN., Noguchi K., Tsuruo T. 1995. Identification of actin as a substrate of ICE and an ICE-like protease and involvement of an ICElike protease but not ICE in VP-16-induced U937 apoptosis. Biochem. Biophys. Res. Commun. 217 : 1185-1192.

Matsuyama S., Reed J. C. 2000. Mitochondria-dependent apoptosis and cellular pH regulation. Cell Death. Differ. 7 : 1155-1165.

McCarthy J. V., Cotter T. G. 1997. Cell shrinkage and apoptosis: a role for potassium and sodium ion efflux. Cell Death. Differ. 4 : 756-770.

Michea L., Combs C., Andrews P., Dmitrieva N., Burg M. B. 2002. Mitochondrial dysfunction is an early event in high-NaCl-induced apoptosis of mIMCD3 cells. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 282 : F981-F990.

Mills J. C., Stone N. L., Erhardt J., Pittman R.N. 1998. Apoptotic membrane bleb bing is regulated by myosin light chain phosphorylation. J. Cell Biol. 140 : 627-636.

Morales M. P., Galvez A., Eltit J. M., Ocaranza P., Diaz-Araya G., Lavandera S. 2000. IGF-1 regulates apoptosis of cardiac myocyte induced by osmotic-stress. Biochem. Biophys. Res. Commun. 270 : 1029-1035.

Moran J., Hernández-Pech X., Merchant-Larios H., Pasantes-Morales H. 2000. Release of taurine in apoptotic cerebellar granule neurons in culture. Pflugers Arch. 439 : 271-7.

Morana S. J., Wolf C. M., Li J., Reynolds J. E., Brown M. K., Eastman A. 1996. The involvement of protein phosphatases in the activation of ICE/CED-3 protease, intracellular acidification, DNA digestion, and apoptosis. J. Biol. Chem. 271 : 18263-18271.

Nagata S., Nagase H., Kawane K., Mukae N., Fukuyama H. 2003. Degradation of chromosomal DNA during apoptosis. Cell Death. Differ. 10 : 108-116.

Nobel C. S., Aronson J. K, van den Dobbelsteen D.J., Slater A. F. 2000. Inhibition of Na+/K+-ATPase may be one mechanism contributing to potassium efflux and cell shrinkage in CD95-induced apoptosis. Apoptosis. 5 : 153-163.

Nolte F., Friedrich O., Rojewski M., Fink R. H., Schrezenmeier H., Korper S. 2004. Depolarisation of the plasma membrane in the arsenic trioxide (As203)-and anti-CD95-induced apoptosis in myeloid cells. FEBS Lett. 578 : 85-89.

Numata T., Sato K, Okada Y., and Wehner F. 2008. Hypertonicity-indUced cation channels rescue cells from staurosporine-elicited apoptosis. Apoptosis 13(7): 895-903.

Oh J. H., O'Malley K. L, Krajewski S., Reed J. C„ Oh Y. J. 1997. Bax accelerates staurosporine-induced but suppresses nigericin-induced neuronal cell death. Neuroreport. 8 : 1851-1856.

Okada Y„ Maeno E„ Shimizu T., Dezaki K, Wang J., Morishima S. 2001. Receptor-mediated control of regulatory volume decrease (RVD) and apoptotic volume decrease (AVD). J. Physiol. 532 : 3-16.

Okada Y, Shimizu T., Maeno E., Tanabe S., Wang X., Takahashi N. 2006. Volume-sensitive chloride channels involved in apoptotic volume decrease and cell death. J. Membr. Biol. 209 : 21-29.

Orlov S. N. Thorin-Trescases N, Kotelevtsev S. V., Tremblay J., Hamet P. 1999. Inversion of the intracellular Na+/K+ ratio blocks apoptosis in vascular smooth muscle at a site upstream of caspase-3. J. Biol. Chem. 274 : 16545-16552.

Park 1. S., Kim J. E. 2002. Potassium efflux during apoptosis. J. Biochem. Mol. Biol. 35 : 41-46.

Panayiotidis M.I., Bortner C.D., Cidlowski J.A. 2006. On the mechanism of ionic regulation of apoptosis: would the Na+/K+-ATPase please stand up? Acta Physiol. 187(1-2): 205-15.

Platoshyn O., Zhang S., McDaniel S. S., Yuan J. X. 2002. Cytochrome c activates K+ channels before inducing apoptosis. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 283 : C1298-C1305.

Flo I., Hernandez H., Kohlhagen G., Lautier D., Pommier Y., Laurent G. 2002. Overexpression of the atypical protein kinase C zeta reduces topoisomerase II catalytic activity, cleavable complexes formation, and drug-induced cytotoxicity in monocytic U937 leukemia cells. J. Biol. Chem. 277 : 31407-31415.

Porcelli A.M., Ghelli A., ZannaC., Valente P., Ferroni S., Rugolo M. 2004. Apoptosis induced by staurosporine in ECV304 cells requires cell shrinkage and upregulation of CI" conductance. Cell Death Differ. 11 : 655-62.

Rao R., Hao C. M„ Breyer M. D. 2004. Hypertonic stress activates glycogen synthase kinase 3beta-mediated apoptosis of renal medullary interstitial cells, suppressing an NFkappaB-driven cyclooxygenase-2-dependent survival pathway. J. Biol. Chem. 279 : 3949-3955.

Reed J. C. 2000. Mechanisms of apoptosis. Am. J. Pathol. 157 : 1415-1430.

Remillard C. V., Yuan J. X. 2004. Activation of K+ channels: an essential pathway in programmed cell death. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 286 : L49-L67.

Rich I. N. Worthington-White D., Garden O. A., Musk P. 2000. Apoptosis of leukemic cells accompanies reduction in intracellular pH after targeted inhibition of theNa+/H+ exchanger. Blood. 95 : 1427-1434.

Roy S., Nicholson D.W. 2000. Cross-talk in cell death signaling. J. Exper. Med. 192 : F21-F25.

Saeki K., Kobayashi N., Inazawa Y., Zhang H, Nishitoh Ichijo H, Saeki K., Isemura M., Yuo A. 2002. Oxidation-triggered c-Jun N-terminal kinase (JNK) and p38 mitogen-activated protein (MAP) kinase pathways for apoptosis in human leukaemic cells stimulated by epigallocatechin-3-gaIlate (EGCG): a distinct pathway from those of chemically induced and receptor-mediated apoptosis. Biochem. J. 368 : 705-720.

Saini K. S., Walker N. I. 1998. Biochemical and molecular mechanisms regulating apoptosis. Mol. Cell Biochem. 178 : 9-25.

Salido M., Vilches J., Lopez A., Roomans G.M. 2001. X-ray microanalysis of etoposide-induced apoptosis in the PC-3 prostatic cancer cell line. Cell Biol. Int. 25 : 499-508.

Sakahira K, Enari M., Ohsawa Y., Uchiyama Y„ Nagata S. 1999. Apop-totic nuclear morphological change without DNA fragmentation. Curr. Biol. 9 : 543546.

Savill J., Fadok V. 2000. Corpse clearance defines the meaning of cell death. Nature. 407 : 784-788.

Shapiro H. M. 1988. Practical flow cytometry. New York: Alan R. Liss, Inc.

353 p.

Shimizu T., Numata T., Okada Y. 2004. A role of reactive oxygen species in apoptotic activation of volume-sensitive CI" channel. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101 : 6770-6773.

Shrode L. D., Tapper H., Grinstein S. 1997. Role of intracellular pH in proliferation, transformation, and apoptosis. J. Bioenerg. Biomembr. 29 : 393-399.

Skepper J. N., Karydis I., Garnett M. R., Hegyi L., Hardwick S. J., Warley A., Mitchinson M. J., Cary N. R. 1999. Changes in elemental concentrations are associated with early stages of apoptosis in human monocyte-macrophages exposed to oxidized low-density lipoprotein: an X-ray microanalytical study. J. Pathol. 188 : 100-106.

Skidachev V. P. 2000. Mitochondria in the programmed death phenomena; a principle of biology: "it is better to die than to be wrong". IUBMB Life. 49 : 365-73.

Skulachev V.P. 2006. Bioenergetic aspects of apoptosis, necrosis and mitop-tosis. Apoptosis 11 : 473-85.

Sperelakis N. 1997. Cell physiology source book. San Diego: Academic Press. 1095 p.

Sordet O., Rebe C., Leroy /., Bruey J. M., Garrido C., Miguet C., Lizard G., Plenchette S., Corcos L., Solary E. 2001. Mitochondria-targeting drugs arsenic triox-ide and lonidamine bypass the resistance of TPA-differentiated leukemic cells to apoptosis. Blood 97 : 3931-3940.

Stepczynska A., Lauber K., Engels I. H„ Janssen O., Kabelitz D., Wesselborg S., Schulze-Osthoff K. 2001. Staurosporine and conventional anticancer drugs induce overlapping, yet distinct pathways of apoptosis and caspase activation. Oncogene 20 : 1193-1202.

Storey N. M., Gômez-Angelats M., Bortner C. D., Armstrong D. L., Cid-lowski J. A. 2003. Stimulation of Kvl.3 potassium channels by death receptors during apoptosis in Jurkat T lymphocytes. J. Biol. Chem. 278 : 33319-33326.

Susin S. A., Daugas E., Ravagnan L., Samejima K, Zamzami N., Loeffler M., Costantini P., Ferri K. F., Irmopoulou T., Prévost M. C., Brothers G., Mak T. W., Penninger J., Earnshcrw W. C., Kroemer G. 2000. Two distinct pathways leading to nuclear apoptosis. J. Exp. Med. 192 : 571-580.

Szabo I., Gulbins E., Apfel H., Zhang X., Barth P., Busch A. E., Schlottmann K., Pongs O., Lang F. 1996. Tyrosine phosphorylation-dependent suppression of a voltage-gated K+ channel in T lymphocytes upon Fas stimulation. J. Biol. Chem. 271 : 20465-20469.

Szabo I., Lepple-Wienhues A., Kaba K. N., Zoratti M., Gulbins E., Lang F. 1998. Tyrosine kinase-dependent activation of a chloride channel in CD95-induced apoptosis in T lymphocytes. Proc. Natl. Acad. Sci.USA. 95 : 6169-6174.

Takahashi N., Wang X., Tanabe S., Uramoto H., Jishage K., Uchida S., Sasaki S., Okada Y. 2005. C1C-3-independent sensitivity of apoptosis to CI- channel blockers in mouse cardiomyocytes. Cell Physiol Biochem.15 : 263-70.

Tanabe S., Wang X, Takahashi N., Uramoto K, Okada Y. 2005. HCO(3)'-independent rescue from apoptosis by stilbene derivatives in rat cardiomyocytes. FEBS Lett. 579 : 517-22.

TangD., Kidd V. J. 1998. Cleavage of DFF-45/ICAD by multiple caspases is essential for its function during apoptosis. J. Biol. Chem. 273 : 28549-28552.

Than T. A., Ogino T., Omori M., Okada S. 2001. Monochloramine inhibits etoposide- induced apoptosis with an increase in DNA aberration. Free Radic.Biol. Med. 30 :932-940.

Thomas N. Bell P. A. 1981. Glucocorticoid-induced cell-size changes and nuclear fragility in rat thymocytes. Mol.Cell Endocrinol. 22 : 71-84.

Troyano A., Fernandez C., Sancho P., de Bias E., Aller P. 2001. Effect of glutathione depletion on antitumor drug toxicity (apoptosis and necrosis) in U-937 human promonocytic cells. The role of intracellular oxidation. J. Biol. Chem. 276 : 47107-47115.

Tsao N. Lei H. Y. 1996. Activation of the Na+/H+ antiporter, Na+/HC03" /CO32" cotransporter, or CI7HCO3" exchanger in spontaneous thymocyte apoptosis. J. Immunol. 157:1107-1116.

Veremnov A. A., Goryachaya T.S., Moshkov A.V., Vassilieva I.O., Yurinskaya V.E., LangF., Rubashkin A.A. 2007. Analysis of the monovalent ion fluxes in U937 cells under the balanced ion distribution: Recognition of ion transporters responsible for changes in cell ion and water balance during apoptosis. Cell. Biol. Int.31: 382-393.

Vermeulen K., Van Bockstaele D. R., Bememan Z. N. 2005. Apoptosis: mechanisms and relevance in cancer. Ann. Hematol. 84 : 627-639.

Vu C. C., Bortner C. D., Cidlowski J. A. 2001. Differential involvement of initiator caspases in apoptotic volume decrease and potassium efflux during Fas- and UV-induced cell death. J. Biol. Chem. 276 : 37602-37611.

Wang X., Takahashi N., Uramoto H., Okada Y. 2005. Chloride channel inhibition prevents ROS-dependent apoptosis induced by ischemia-reperfusion in mouse cardiomyocytes. Cell Physiol. Biochem. 16 : 147-154.

WangX. 0., Xiao A. Y., Sheline C., Hyrc K., Yang A., Goldberg M. P., Choi D. W., Yu S. P. 2003. Apoptotic insults impair Na+, K+-ATPase activity as a mechanism of neuronal death mediated by concurrent ATP deficiency and oxidant stress. J. Cell Sci. 116:2099-2110.

Wen J., Ramadevi N, Nguyen D., Perkins C., Worthington E., Bhalla K. 2000. Antileukemic drugs increase death receptor 5 levels and enhance Apo-2L-induced apoptosis of human acute leukemia cells. Blood 96 : 3900-3906.

Wyllie A. H., Kerr J. F., Currie A. R. 1980. Cell death: the significance of apoptosis. Int. Rev. Cytol. 68 : 251-306.

Wyllie A. H., Morris R. G. 1982. Hormone-induced cell death. Purification ad properties of thymocytes undergoing apoptosis after glucocorticoid treatment. Am. J. Pathol. 109 : 78-87.

Umeda T„ Kouchi Z., Kcnvahara II., Tomioka S., Sasagawa N., Maeda T., Sorimachi H., Ishiura S., Suzuki K. 2001. Limited proteolysis of filamin is catalyzed by caspase-3 in U937 and Jurkat cells. J. Biochem.(Tokyo) 130 : 535-542.

Yang N. C., Jeng K. C.f Ho W. M, Hu M. L. 2002. ATP depletion is an important factor in DHEA-induced growth inhibition and apoptosis in BV-2 cells. Life Sci. 70 : 1979-1988.

Yu S. P. 2003a. Regulation and critical role of potassium homeostasis in apoptosis. Prog.Neurobiol. 70 : 363-386.

Yu S. P. 2003b. Na+,K+-ATPase: the new face of an old player in pathogenesis and apoptotic/hybrid cell death. Biochem. Pharmacol. 66 : 1601-1609.

Zamaraeva M. V., Sabirov R. Z., Maeno E., Ando-Akatsuka Y., Bessonova S. V., Okada Y. 2005. Cells die with increased cytosolic ATP during apoptosis: a.bio-luminescence study with intracellular luciferase. Cell Death. Differ. 12 : 1390-1397.

Zelenin, A. V. 1999. Acridine Orange as a Probe for Cell and Molecular Biology. In: Fluorescent and luminescent probes, 2nd edn. New-York: Academic Press, 117-135.

Zhivotovsky B., Orrenius S. 2005. Caspase-2 function in response to D NA damage. Biochem. Biophys. Res. Commun. 331 : 859-867.

Zurgil N., Schiffer Z, Shafran Y., Kaufman M., Deutsch M. 2000. Fluorescein fluorescence hyperpolarization as an early kinetic measure of the apoptotic process. Biochem. Biophys. Res. Commun. 268 : 155-163.

Автор выражает благодарность Ю.М.Розанову за сотрудничество в получении данных по цитометрии, А.В.Мошкову за помощь в изучении морфологических изменений клеток при апоптозе, В.В.Матвееву за помощь в компьютерной обработке данных, В.Е.Юринской и А.А.Веренинову за руководство работой.

Заключение диссертации по теме «Гистология, цитология, клеточная биология», Широкова, Анна Вячеславовна

выводы

1. Апоптоз клеток 11937, вызванный стауроспорином, сопровождается дегидратацией на 2/3 за счет изменения содержания К+ и СГ. Изменение концентрации К+ во внутриклеточной воде при этом невелико и не может играть существенную роль в развитии апоптоза.

2. Ионные изменения при слабом апоптозе, вызванном стауроспорином, у сублинии Ш37-160В2 связаны, преимущественно, с увеличением потока КЬ+(К+) через каналы, а у сублинии и937-Ы9957 - только с уменьшением потока КЬ+(К+) через насос.

3. Ионные изменения при сильном апоптозе, вызванном стауроспорином, у сублинии 11937-160В2 связаны, преимущественно, с уменьшением потока КЬ+(К+) через насос.

4. Апоптоз, вызванный у клеток 11937 этопозидом, в отличие от апоптоза, вызванного стауроспорином, не сопровождается дегидратацией и тем не менее сопровождается изменением ионного баланса - уменьшением отношения К7/Иа+ без уменьшения суммарного содержания К+, и С1", уменьшением потока ЯЬ+(К+) через насос и увеличением потока Шэ+(К+) через каналы.

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Веренинов А.А, Волгарева Е. В., Матвеев В. В., Мошков А.В., Розанов Ю.М., Широкова А.В., Юринская В.Е. 2003. Водный и ионный баланс тимо-цитов крысы при апоптозе, вызванном дексаметазоном и этопозидом. Ионо-осмотическая модель уменьшения объема клетки. Цитология. 45(5) : 500-509.

2. Веренинов А.А., Горячая Т.С., Матвеев В.В., Мошков А.В., Розанов Ю.М., Сакута Г.А., Широкова А.В., Юринская В.Е. 2004. Дегидратационное сокращение объема клеток при апоптозе - факультативный признак. Цитология. 46(7): 609-619.

3. Yurinskaya V., Goryachaya Т., Guzhova I., Moshkov A., Rozanov Y., Sakuta G., Shirokova A., Shumilina E., Vassilieva I., Lang F., Vereninov A. 2005. Potassium and sodium balance in U937 cells during apoptosis with and without cell shrinkage. Cell Physiology and Biochemistry. 16 : 155-162.

4. Yurinskaya V.E., Moshkov A.V., Rozanov Y.M., Shirokova A.V., Vassilieva I.O., Shumilina E. V., Lang F., Volgareva E. V., Vereninov A. A. 2005. Thymocyte K+, Na+ and water balance during dexamethasone- and etoposide-induced apoptosis. Cell Physiology and Biochemistry 16 : 15-22.

5. Широкова A.B. 2007. Апоптоз. Сигнальные пути и изменение ионного и водного баланса клетки. Цитология 49(5) : 385-394.

[Shirokova A.V. 2007. Apoptosis. Signaling pathways and cell ion and water'balance. Cell and Tissue Biology 1 : 215-224].

6. Веренинов A.A., Горячая Т.С., Матвеев В.В., Мошков А.В., Розанов Ю.М., Сакута Г.А., Широкова А.В., Юринская В.Е. 2003. Уменьшение объема клеток и потеря воды как определяющий признак апоптоза. Цитология 45 (9) : 857. (Тезисы докладов и сообщений, представленных на 1-й всероссийский съезд Общества клеточной биологии).

7. Мошков А.В., Васильева И.О., Веренинов А.А., Матвеев В.В., Широкова А.В., Юринская В.Е. 2003. Механизмы сжатия клеток при апоптозе. Сб. "Итоги исследований по программам СПб НЦ РАН 2001-2003 г.г." - Наука, СПб. 6667.

8. Веренинов А.А., Горячая Т.С., Розанов Ю.М., Широкова А.В., Юринская В.Е., Ланг Ф., Рубашкин А.А. 2007. Баланс потоков К+, Na+ и С1* через плазматическую мембрану у клеток лимфомы человека U937 в норме и при апоптозе, ионные механизмы апоптозной дегидратации клеток. Цитология 49(9) : 726. (Тезисы докладов и сообщений, представленных на 2-й всероссийский съезд Общества клеточной биологии).

9. Vereninov А.А., Rubashkin А.А., Goryachaya T.S., Moshkov A.V., Rozanov Yu.M., Shirokova A.V., Strelkova E.G., Lang F., Yurinskaya V.E. 2008. Pump and channel K+ (Rb+) fluxes in apoptosis of human lymphoid cell line U937. Cellular Physiology and Biochemistry 22 : 187-194.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Широкова, Анна Вячеславовна, 2008 год

1. Веренинов А. А., Марахова И.И. 1986. Транспорт ионов у клеток в культуре Д.: Наука. 292с.

2. Веренинов А. А. ст., Веренинов А. А. мл. 1991. Ионный, электрический и водный баланс в животной клетке. Система с активным транспортом катионов, гольдмановскими каналами и симпортом типа Na+K+2C1. Цитология 33 (11) : 4-17.

3. Веренинов А. А., Юринская В.Е., Рубашкин A.A. 2004. Роль калия, калиевых каналов и симпортеров в апоптозном сокращении клеточного объема. Эксперимент и теория. Докл. РАН. 398(4) : 555-559.

4. Веренинов А. А., Юринская В. Е., Рубашкин А. А. 2006. Апоптозная дегидратация лимфоидных клеток: моделирование изменения баланса ионных потоков. Докл. РАН. 411 (6) : 824-828.

5. Донская И.А., Волгарева Е.В., Розанов Ю.М. LonskayaJ. A., Volgareva Е. V. Rozanov Y. M. 2001. Two different types of apoptosis in thymocytes. Цитология. 43(3) : 244-249.

6. Розанов 10. M. 1988. Проточная цитометрия. В кн.: Методы культивирования клеток. Д.: Наука. 136-146.

7. Розанов Ю. М., Барский И. Я., Папаян Г. В., Платунов С. Е., Забродин А. С. 1990. Многопараметрический цитометр-анализатор на базе микроскопа лЛЮМАМ». В кн.: Автоматизация цитологических исследований. Киев: Наук, думка. 136-139.

8. Akimova O.A., Poirier M., Kotelevtsev S. V., Hamet P., Orlov S.N. 2008. The death of ouabain-treated renal epithelial cells: evidence against anoikis occurrence. Apoptosis. 13 (5) : 670-80.

9. Aoki H., Kang P. M., Hampe J., Yoshimura K., Noma T., Matsuzaki M., Izumo S. 2002. Direct activation of mitochondrial apoptosis machinery by c-Jun N-terminal kinase in adult cardiac myocytes. J. Biol. Chem. 277 : 10244-10250.

10. Arrebola F., Cañizares J., Cubero M. A., Crespo P. V., Warley A., Fernández-Segura E. 2005a. Biphasic behavior of changes in elemental composition during staurosporine-induced apoptosis. Apoptosis. 10 : 1317-1331.

11. Arrebola F., Zabiti S., Cañizares F. J., Cubero M. A., Crespo P.V., Fernández-Segura E. 2005b. Changes in intracellular sodium, chlorine, and potassium concentrations in staurosporine-induced apoptosis. J. Cell Physiol. 204 : 500507.

12. Banasiak K. J., Burenkova O., Haddad G. G. 2004. Activation of voltage-sensitive sodium channels during oxygen deprivation leads to apoptotic neuronal death. Neuroscience. 126 : 31-44.

13. Bar P. R. 1996. Apoptosis - the cell's silent exit. Life Sci. 59 : 369-378.

14. Barbiero G., Duranti F., Bonelli G., Amenta J. S., Baccino F. M. 1995. Intracellular ionic variations in the apoptotic death of L cells by inhibitors of cell cycle progression. Exp. Cell Res. 217 : 410-418.

15. Barry M. A., Eastman A. 1992. Endonuclease activation during apoptosis: the role of cytosolic Ca and pH. Biochem. Biophys. Res. Commun. 186 : 782-789.

16. Barry M. A., Eastman A. 1993. Identification of deoxyribónuclease II as an endonuclease involved in apoptosis. Arch. Biochem. Biophys. 300 : 440-450.

17. Beauvais F., Michel L., Dubertret L. 1995. Human eosinophils in culture undergo a striking and rapid shrinkage during apoptosis. Role of K+ channels. J. Leu-koc. Biol. 57 : 851-855.

18. Bedner E., Li X., Kunicki J., Darzynkiewicz Z. 2000. Translocation of Bax to mitochondria during apoptosis measured by laser scanning cytometry. Cytometry. 41 : 83-88.

19. Beere H. M. 2004. "The stress of dying": the role of heat shock proteins in the regulation of apoptosis. J. Cell Sci. 117: 2641-2651.

20. Benson R. S., Dive C., Watson A. J. 1999. Cytoplasmic acidification is not an effector mechanism of VP 16 or DEX-induced apoptosis in CEM T leukaemia cells. J. Cell Sci. 112 (Pt 11): 1755-1760.

21. Benson R. S., Heer S., Dive C., Watson A. J. 1996. Characterization of cell volume loss in CEM-C7A cells during dexamethasone-induced apoptosis. Am. J. Physiol 270 : C1190-C1203.

22. Bernardi P., Petronilli V., Di Lisa F., Forte M. 2001. A mitochondrial perspective on cell death. Trends Biochem.Sci. 26 : 112-117.

23. Blanco G., Nguyen A.-N. 2008. Ouabain stimulates both proliferation and. apoptosis in renal epithelial cells from patients with autosomal dominant polycystic kidney disease. FASEB J, 22 : 1157.6.

24. Bortner C. D., Cidlowski J. A. 1999. Caspase independent/dependent regulation of K+, cell shrinkage, and mitochondrial membrane potential during lymphocyte apoptosis. J. Biol. Chem. 274 : 21953-21962.

25. Bortner C. D., Cidlowski J. A. 2002. Apoptotic volume decrease and the incredible shrinking cell. Cell Death. Differ. 9 : 1307-1310.

26. Bortner C. D., Cidlowski J. A. 2003. Uncoupling cell shrinkage from apoptosis reveals that Na+ influx is required for volume loss during programmed cell death. J. Biol. Chem. 278 : 39176-39184.

27. Bortner CD, Cidlowski J A. 2007. Cell shrinkage and monovalent cation fluxes: role in apoptosis.Arch. Biochem Biophys. 462 : 176-88.

28. Bortner C. D., Gomez-Angelats M., Cidlowski J. A. 2001. Plasma membrane depolarization without repolarization is an early molecular event in anti-Fas-induced apoptosis. J. Biol. Chem. 276 : 4304-4314.

29. Bortner C.D., Sifre M. I., CidlowskiJ. A. 2008. Cationic gradient reversal and cytoskeleton-independent volume regulatory pathways define an early stage of apop-tosis. J. Biol. Chem., 283 : 7219 - 7229.

30. Boyle P.J., Conway E.H. 1941. Potassium accumulation in muscle and associated changes. J. Physiol. 100 : 1-63.

31. Burg E. D., Remillard C. V., Yuan J. X 2006. K+ channels in apoptosis. J. Membr. Biol. 209 : 3-20.

32. Candé G, Cecconi F., Dessen P., Kroemer G. 2002. Apoptosis-inducing factor (AIF): key to the conserved caspase-independent pathways of cell death? J. Cell Sei. 115 : 4727-4734.

33. Chen X, Ko L. J., Jayaraman L„ Prives C. 1996. p53 levels, functional domains, and DNA damage determine the extent of the apoptotic response of tumor cells. Genes Dev. 10 : 2438-2451.

34. Cohen G. M., Sun X M., Snowden R. T., Ormerod M. G., Dinsdale D. 1993. Identification of a transitional preapoptotic population of thymocytes. J. Immunol. 151 : 566-574.

35. Cotter T. G., Lennon S. V., Glynn J. M., Green D. R. 1992. Microfilament-disrupting agents prevent the formation of apoptotic bodies in tumor cells undergoing apoptosis. Cancer Res. 52 : 997-1005.

36. Dallaporta B., Marchetti P., de Pablo M. A., Maisse C., Due H. T., Métivier D., Zamzami N., Geuskens M., Kroemer G. 1999. Plasma membrane potential in thymocyte apoptosis. J. Immunol. 162 : 6534-6542.

37. Darzynkiewicz Z, Bedner E., Traganos F., Murakami T. 1998. Critical aspects in the analysis of apoptosis and necrosis. Hum. Cell. 11 : 3-12.

38. Drain N„ DubrezL., Eymin B„ Renvoize C., BreardJ., Dimanche-Boitrel- M. T., Solary E. 1998. Upregulation of CASP genes in human tumor cells undergoing etoposide- induced apoptosis. Oncogene 16 : 2885-2894.

39. Earnshaw W. C., Martins L. M„ Kaufmann S. H. 1999. Mammalian cas-pases: structure, activation, substrates, and functions during apoptosis. Annu. Rev. Biochem. 68 : 383-424.

40. Ekhterae D., Platoshyn 0., KrickS., Yu Y, McDaniel S. S„ Yuan J. X. 2001. Bcl-2 decreases voltage-gated K+ channel activity and enhances survival in vascular smooth muscle cells. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 281 : C157-C165.

41. Elliott J. I., Higgins C. F. 2003. IKCal activity is required for cell shrinkage, phosphatidylserine translocation and death in T lymphocyte apoptosis. EMBO Rep. 4: 189-194.

42. Elmore S. 2007. Apoptosis: a review of programmed cell death. Toxicologic Pathology 35:495-516.

43. Endresen P. C., Ptytz P. S., Aarbakke J. 1995. A new flow cytometric method for discrimination of apoptotic cells and detection of their cell cycle specificity through staining of F-actin and DNA. Cytometry 20 : 162-171

44. Ernest N. J., Habela C W., Sontheimer H. 2008. Cytoplasmic condensation is both necessary and sufficient to induce apoptotic cell death. J. Cell Sci., 121: 290 -297.

45. Esteves M. B., Marques-Santos L. F„ Affonso-Mitidieri O. R., Rumjanek V. M. 2005. Ouabain exacerbates activation-induced cell death in human peripheral blood lymphocytes. An. Acad. Bras. Cienc. 77 : 281-292.

46. Fernández-Segura E., Cañizares F. J., Cubero M. A., Warley A., Campos A. 1999. Changes in elemental content during apoptotic cell death studied by electron probe X-ray microanalysis. Exp. Cell Res. 253 : 454-462.

47. Franco R., Bortner C. D., Cidlowski J. A. 2006. Potential roles of electrogenic ion transport and plasma membrane depolarization in apoptosis. J. Membr. Biol. 209 : 43-58.

48. Friis M. B., Friborg C. R, Schneider L., Nielsen M. B., Lambert I. H., Christensen S. T., Hoffmann E. K. 2005. Cell shrinkage as a signal to apoptosis in NIH 3T3 fibroblasts. J. Physiol. 567 : 427-443.

49. Furlong I. J., Lopez M. C., Ascaso R., Lopez R. A., Collins M. K. 1998„ Induction of apoptosis by valinomycin: mitochondrial permeability transition causes intracellular acidification. Cell Death. Differ. 5 : 214-221.

50. Garcia-Bermejo L., Perez C, Vilaboa N. E., de Bias E., Aller P. 1998. cAMP increasing agents attenuate the generation of apoptosis by etoposide in promonocytic leukemia cells. J. Cell Sci. Ill ( Pt 5): 637-644.

51. Ghibelli L., Maresca V., Coppola S., Gualandi G. 1995. Protease inhibitors block apoptosis at intermediate stages: a compared analysis of DNA fragmentation and apoptotic nuclear morphology. FEBS Lett. 377 : 9-14.

52. Ghobrial I. M., Witzig T. E., Adjei A. A. 2005. Targeting apoptosis pathways in cancer therapy. CA Cancer J. Clin. 55 : 178-194. >■

53. Ghosh A., KengP.C., KnaufP.A. 2007. Hypertonicity induced apoptosis in HL-60 cells in the presence of intracellular potassium. Apoptosis 12 : 1281-8.

54. Gilbert M., Knox S. 1997. Influence of Bcl-2 overexpression on Na+/K+-ATPase pump activity: correlation with radiation-induced programmed cell death. J. Cell Physiol. 171 : 299-304.

55. Gómez-Angelats M., Bortner C. D., Cidlowski J. A. 2000. Protein kinase C (PKC) inhibits fas receptor-induced apoptosis through modulation of the loss of K+and cell shrinkage. A role for PKC upstream of caspases. J. Biol. Chem. 275 : 1960919619.

56. Gorczyca W., Gong J., Ardelt B., Traganos F., Darzynkiewicz Z. 1993. The cell cycle related differences in susceptibility of HL-60 cells to apoptosis induced by various antitumor agents. Cancer Res. 53 : 3186-3192.

57. Green D. R., Reed J. C. 1998. Mitochondria and apoptosis. Science. 281 : 1309-1312.

58. Gulbins E., Szabo L, Baltzer K., Lang F. 1997. Ceramide-induced inhibition of T lymphocyte voltage-gated potassium channel is mediated by tyrosine kinases. Proc. Natl. Acad. Sci.USA. 94 : 7661-7666.

59. Hacker G. 2000. The morphology of apoptosis. Cell Tissue Res. 301 : 5-17.

60. Hande K. R. 1998. Etoposide: four decades of development of a topoisomerase II inhibitor. Eur. J. Cancer 34 : 1514-1521.

61. Haupt S., Berger M, Goldberg Z, Haupt Y. 2003. Apoptosis - the p53 network. J. Cell Sci. 116 : 4077-4085.

62. Hengartner M.O. 2000. The biochemistry of apoptosis. Nature 407 : 770-776.

63. Hessler JA, Budor A, Putchakayala K, Mecke A, Rieger D, Banaszak Holl MM, Orr BG, Bielinska A, BealsJ, Baker J Jr. 2005. Atomic force microscopy study of early morphological changes during apoptosis. Langmuir. 21 : 9280-6.

64. Ho P. K., Hawkins C. J. 2005. Mammalian initiator apoptotic caspases. FEBS J. 272 : 5436-5453.

65. Hoffmann E. K. 1987. Volume regulation in cultured cells. In: Current topics in membranes and transport. San-Diego: Academic Press. 30: 125-180.

66. Huang Y.T., ChuehS.C., TengC.M., GuhJ.H. 2004. Investigation of ouabain-induced anticancer effect in human androgen-independent prostate cancer PC-3 cells. Biochem Pharmacol.67 : 727-33.

67. Hughes F. M„ Jr., Bortner C. D„ Purdy G. D„ Cidlowski J. A. 1997. Intracellular K+ suppresses the activation of apoptosis in lymphocytes. J. Biol. Chem. 272 : 30567-30576.

68. Janicke R.U., Ng P., Sprengart M. L., Porter A. G. 1998. Caspase-3 is required for alpha-fodrin cleavage but dispensable for cleavage of other death substrates in apoptosis. J. Biol. Chem. 273 : 15540-15545.

69. Jarvis W. D., Johnson C. R., Fornari F. A., Park J. S„ Dent P., GrantS. 1999. Evidence that the apoptotic actions of etoposide are independent of c-Jun/activating protein-1-mediated transregulation. J. Pharmacol. Exp. Ther. 290 : 1384-1392.

70. Johnson V. L„ Ko S. C., Holmstrom T.H., Eriksson J.E., Chow S.C. 2000. Effector caspases are dispensable for the early nuclear morphological changes during chemical-induced apoptosis. J. Cell Sci. 113 ( Pt 17) : 2941-2953.

71. Kataoka S., Naito M., Tomida A., Tsuruo T. 1994. Resistance to antitumor agent-induced apoptosis in a mutant of human myeloid leukemia U937 cells. Exp. Cell Res. 215 : 199-205.

72. Kaufmann S. H., Earnshaw W. C. 2000. Induction of apoptosis by cancer chemotherapy. Exp. Cell Res. 256 : 42-49.

73. Kaufmann S. H., Hengartner M. O. 2001. Programmed cell death: alive and well in the new millennium. Trends Cell Biol. 11 : 526-534.

74. Kerr J. F. 1971. Shrinkage necrosis: a distinct mode of cellular death. J. Pathol. 105 : 13-20.

75. Komatsu N. Nakagawa M„ Oda T., Muramatsu T. 2000. Depletion of intracellular NAD+ and ATP levels during ricin-induced apoptosis through the specific ribosomal inactivation results in the cytolysis of U937 cells. J. Biochem.(Tokyo) 128 : 463-470.

76. KrickS., Platoshyn O., Sweeney M., Kim H„ Yuan J. X. 2001. Activation of K+ channels induces apoptosis in vascular smooth muscle cells. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 280 : C970-C979.

77. Macknight A.D.C. 1987. Volume maintenance in isosmotic conditions. In: Current topics membr. and transp. 30 : 3-43.

78. Maeno E., Ishizaki Y., Kanaseki T., Hazama A., Okada Y. 2000. Normotonic cell shrinkage because of disordered volume regulation is an early prerequisite to apoptosis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97 : 9487-9492.

79. Maeno E, Takahashi N, Okada Y. 2006. Dysfunction of regulatory volume increase is a key component of apoptosis. FEBS Lett. 580 : 6513-7.

80. Marklund L., Behnam-Motlagh P., Henriksson R., Grankvist K. 2001. Bumet-anide annihilation of amphotericin B-induced apoptosis and cytotoxicity is due to its effect on cellular K+ flux. J. Antimicrob. Chemother. 48 : 781-786.

81. Martinsson P., Liminga G., Nygren P., Larsson R. 2001. Characteristics of etoposide-induced apoptotic cell death in the U-937 human lymphoma cell line. Anticancer Drugs 12 : 699-705.

82. Matsuyama S., Reed J. C. 2000. Mitochondria-dependent apoptosis and cellular pH regulation. Cell Death. Differ. 7 : 1155-1165.

83. McCarthy J. V., Cotter T. G. 1997. Cell shrinkage and apoptosis: a role for potassium and sodium ion efflux. Cell Death. Differ. 4 : 756-770.

84. Michea L., Combs C., Andrews P., Dmitrieva N. Burg M. B. 2002. Mitochondrial dysfunction is an early event in high-NaCl-induced apoptosis of mIMCD3 cells. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 282 : F981-F990.

85. Mills J. C., Stone N. L., Erhardt J., Pittman R.N. 1998. Apoptotic membrane bleb bing is regulated by myosin light chain phosphorylation. J. Cell Biol. 140 : 627-636.

86. Morales M. P., Galvez A., Eltit J. M., Ocaranza P., Diaz-Araya G., Lavandero S. 2000. IGF-1 regulates apoptosis of cardiac myocyte induced by osmotic-stress. Biochem. Biophys. Res. Commun. 270 : 1029-1035.

87. Moran J., Hernández-Pech X., Merchant-Larios H., Pasantes-Morales H. 2000. Release of taurine in apoptotic cerebellar granule neurons in culture. Pflugers Arch. 439 : 271-7.

88. Morana S. J., WolfC. M., Li J., Reynolds J. E., Brown M. K., Eastman A. 1996.The involvement of protein phosphatases in the activation of ICE/CED-3 protease, intracellular acidification, DNA digestion, and apoptosis. J. Biol. Chem. 271 : 18263-18271.

89. Nagata S., Nagase H., Kcrwane K., Mukae N., Fukuyama H. 2003. Degradation of chromosomal DNA during apoptosis. Cell Death. Differ. 10 : 108-116.

90. Nobel C. S., Aronson J. K., van den Dobbelsteen D.J., Slater A. F. 2000. Inhibition of Na+/K+-ATPase may be one mechanism contributing to potassium efflux and cell shrinkage in CD95-induced apoptosis. Apoptosis. 5 : 153-163.

91. Nolte F., Friedrich O., Rojewski M., Fink R. H., Schrezenmeier H., Korper S. 2004. Depolarisation of the plasma membrane in the arsenic trioxide (As203)-and anti-CD95-induced apoptosis in myeloid cells. FEBS Lett. 578 : 85-89.

92. Numata T., Sato K, Okada Y., and Wehner F. 2008. Hypertonicity-indUced cation channels rescue cells from staurosporine-elicited apoptosis. Apoptosis 13(7): 895-903.

93. Oh J. H., O'Malley K. L„ Krajewski S., Reed J. C„ Oh Y. J. 1997. Bax accelerates staurosporine-induced but suppresses nigericin-induced neuronal cell death. Neuroreport. 8 : 1851-1856.

94. Okada Y., Maeno E., Shimizu T., Dezaki K., Wang J., Morishima S. 2001. Receptor-mediated control of regulatory volume decrease (RVD) and apoptotic volume decrease (AVD). J. Physiol. 532 : 3-16.

95. Okada Y., Shimizu T., Maeno E., Tanabe S., Wang X., Takahashi N. 2006. Volume-sensitive chloride channels involved in apoptotic volume decrease and cell death. J. Membr. Biol. 209 : 21-29.

96. Orlov S. N. Thorin-Trescases N, Kotelevtsev S. V., Tremblay J., Hamet P. 1999. Inversion of the intracellular Na+/K+ ratio blocks apoptosis in vascular smooth muscle at a site upstream of caspase-3. J. Biol. Chem. 274 : 16545-16552.

97. Park I. S., Kim J. E. 2002. Potassium efflux during apoptosis. J. Biochem. Mol. Biol. 35 : 41-46.

98. Panayiotidis M.I., Bortner C.D., Cidlowski J.A. 2006. On the mechanism of ionic regulation of apoptosis: would the Na+/K+-ATPase please stand up? Acta Physiol. 187(1-2): 205-15.

99. Platoshyn O., Zhang S., McDaniel S. S., Yuan J. X. 2002. Cytochrome c activates K+ channels before inducing apoptosis. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 283 : C1298-C1305.

100. Porcelli A.M., Ghelli A., ZannaC., Valente P., Ferroni S., Rugolo M. 2004. Apoptosis induced by staurosporine in ECV304 cells requires cell shrinkage and upregulation of CI" conductance. Cell Death Differ. 11 : 655-62.

101. Reed J. C. 2000. Mechanisms of apoptosis. Am. J. Pathol. 157 : 1415-1430.

102. Remillard C. V., Yuan J. X. 2004. Activation of K+ channels: an essential pathway in programmed cell death. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 286 : L49-L67.

103. Rich I. N. Worthington-White D., Garden O. A., Musk P. 2000. Apoptosis of leukemic cells accompanies reduction in intracellular pH after targeted inhibition of theNa+/H+ exchanger. Blood. 95 : 1427-1434.

104. Roy S., Nicholson D.W. 2000. Cross-talk in cell death signaling. J. Exper. Med. 192 : F21-F25.

105. Saini K. S., Walker N. I. 1998. Biochemical and molecular mechanisms regulating apoptosis. Mol. Cell Biochem. 178 : 9-25.

106. Salido M., Vilches J., Lopez A., Roomans G.M. 2001. X-ray microanalysis of etoposide-induced apoptosis in the PC-3 prostatic cancer cell line. Cell Biol. Int. 25 : 499-508.

107. Sakahira H„ Enari M., Ohsawa Y., Uchiyama Y., Nagata S. 1999. Apop-totic nuclear morphological change without DNA fragmentation. Curr. Biol. 9 : 543546.

108. Savill J., Fadok V. 2000. Corpse clearance defines the meaning of cell death. Nature. 407 : 784-788.

109. Shapiro H. M. 1988. Practical flow cytometry. New York: Alan R. Liss, Inc.353 p.

110. Shimizu T., Numata T., Okada Y 2004. A role of reactive oxygen species in apoptotic activation of volume-sensitive CI" channel. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101 : 6770-6773.

111. Shrode L. D., Tapper H., Grinstein S. 1997. Role of intracellular pH in proliferation, transformation, and apoptosis. J. Bioenerg. Biomembr. 29 : 393-399.

112. Skulachev V. P. 2000. Mitochondria in the programmed death phenomena; a principle of biology: "it is better to die than to be wrong". IUBMB Life. 49 : 365-73.

113. Skulachev V.P. 2006. Bioenergetic aspects of apoptosis, necrosis and mitop-tosis. Apoptosis 11 : 473-85.

114. Sperelakis N. 1997. Cell physiology source book. San Diego: Academic Press. 1095 p.

115. Storey N. M., Gômez-Angelats M., Bortner C. D., Armstrong D. L„ Cid-lowski J. A. 2003. Stimulation of Kvl.3 potassium channels by death receptors during apoptosis in Jurkat T lymphocytes. J. Biol. Chem. 278 : 33319-33326.

116. Szabo I., Lepple-Wienhues A., Kaba K. N., Zoratti M, Gulbins E., Lang F. 1998. Tyrosine kinase-dependent activation of a chloride channel in CD95-induced apoptosis in T lymphocytes. Proc. Natl. Acad. Sci.USA. 95 : 6169-6174.

117. Takahashi N., Wang X., Tanabe S., Uramoto H., Jishage K., Uchida S., Sasaki S., Okada Y. 2005. ClC-3-independent sensitivity of apoptosis to CI- channel blockers in mouse cardiomyocytes. Cell Physiol Biochem.15 : 263-70.

118. Tanabe S., Wang X, Takahashi N., Uramoto H., Okada Y. 2005. HCO(3)'-independent rescue from apoptosis by stilbene derivatives in rat cardiomyocytes. FEBS Lett. 579 : 517-22.

119. TangD., Kidd V. J. 1998. Cleavage of DFF-45/ICAD by multiple caspases is essential for its function during apoptosis. J. Biol. Chem. 273 : 28549-28552.

120. Than T. A., Ogino T., Omori M., Okada S. 2001. Monochloramine inhibits etoposide- induced apoptosis with an increase in DNA aberration. Free Radic.Biol. Med. 30 : 932-940.

121. Thomas N., Bell P. A. 1981. Glucocorticoid-induced cell-size changes and nuclear fragility in rat thymocytes. Mol.Cell Endocrinol. 22 : 71-84.

122. Troyano A., Fernandez C., Sancho P., de Bias E., Aller P. 2001. Effect of glutathione depletion on antitumor drug toxicity (apoptosis and necrosis) in U-937human promonocytic cells. The role of intracellular oxidation. J. Biol. Chem. 276 : 47107-47115.

123. Tsao N. Lei H. Y. 1996. Activation of the Na+/H+ antiporter, Na+/HC03" /CO32" cotransporter, or CI7HCO3" exchanger in spontaneous thymocyte apoptosis. J. Immunol. 157 : 1107-1116.

124. Vermeulen K., Van Bockstaele D. R., Berneman Z. N. 2005. Apoptosis: mechanisms and relevance in cancer. Ann. Hematol. 84 : 627-639.

125. Vu C. C., Bortner C. D., Cidlowski J. A. 2001. Differential involvement of initiator caspases in apoptotic volume decrease and potassium efflux during Fas- and UV-induced cell death. J. Biol. Chem. 276 : 37602-37611.

126. Wang X., Takahashi N., Uramoto H., Okada Y. 2005. Chloride channel inhibition prevents ROS-dependent apoptosis induced by ischemia-reperfusion in mouse cardiomyocytes. Cell Physiol. Biochem. 16 : 147-154.

127. Wen J., Ramadevi N., Nguyen D., Perkins C., Worthington E., Bhalla K. 2000. Antileukemic drugs increase death receptor 5 levels and enhance Apo-2L-induced apoptosis of human acute leukemia cells. Blood 96 : 3900-3906.

128. Wyllie A. H„ Kerr J. F., Currie A. R. 1980. Cell death: the significance of apoptosis. Int. Rev. Cytol. 68 : 251-306.

129. Wyllie A. H., Morris R. G. 1982. Hormone-induced cell death. Purification ad properties of thymocytes undergoing apoptosis after glucocorticoid treatment. Am. J. Pathol. 109 : 78-87.

130. Umeda T., Kouchi Z., Kcnvahara H., Tomioka S., Sasagawa N., Maeda T., Sorimachi H., Ishiura S., Suzuki K. 2001. Limited proteolysis of filamin is catalyzed by caspase-3 in U937 and Jurkat cells. J. Biochem.(Tokyo) 130 : 535-542.

131. Yang N. C., Jeng K. C, Ho W. M, Hu M. L. 2002. ATP depletion is an important factor in DHEA-induced growth inhibition and apoptosis in BV-2 cells. Life Sei. 70 : 1979-1988.

132. Yu S. P. 2003a. Regulation and critical role of potassium homeostasis in apoptosis. Prog.Neurobiol. 70 : 363-386.

133. Yu S. P. 2003b. Na+,K+-ATPase: the new face of an old player in pathogenesis and apoptotic/hybrid cell death. Biochem. Pharmacol. 66 : 1601-1609.

134. Zamaraeva M. V., Sabirov R. Z., Maeno E., Ando-Akatsuka Y., Bessonova S. V., Okada Y. 2005. Cells die with increased cytosolic ATP during apoptosis: a.bio-luminescence study with intracellular luciferase. Cell Death. Differ. 12 : 1390-1397.

135. Zelenin, A. V. 1999. Acridine Orange as a Probe for Cell and Molecular Biology. In: Fluorescent and luminescent probes, 2nd edn. New-York: Academic Press, 117-135.

136. Zhivotovsky B., Orr en jus S. 2005. Caspase-2 function in response to D NA damage. Biochem. Biophys. Res. Commun. 331 : 859-867.

137. Zurgil N. Schiffer Z, Shafran Y., Kaufman M, Deutsch M. 2000. Fluorescein fluorescence hyperpolarization as an early kinetic measure of the apoptotic process. Biochem. Biophys. Res. Commun. 268 : 155-163.