Изучение аптамерных ингибиторов тромбина методами спектроскопии кругового дихроизма и поверхностного плазмонного резонанса тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.10, кандидат наук Юминова, Алина Валерьевна

• Юминова, Алина Валерьевна
• кандидат наук
• 2013

Оглавление диссертации кандидат наук Юминова, Алина Валерьевна

СОДЕРЖАНИЕ

Список сокращений

ВВЕДЕНИЕ

Глава I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. ТРОМБИН ЧЕЛОВЕКА И АПТАМЕРНЫЕ ИНГИБИТОРЫ

I.I. Способы ингибирования коагуляционного каскада, применяемые в терапии

I.II. Основные препятствия в дизайне прямых ингибиторов тромбина

I.III. Тромбин как мишень для антикоагулянтов в системе свертывания крови

I.IV. Строение тромбина человека

I.V. Получение аптамерных ингибиторов тромбина

I.VI. Модифицированные аптамеры к тромбину

I.VII. Пространственная структура аптамера 15TGT

I.VIII. Структура комплекса аптамера 15TGT и тромбина человека

I.IX. Ингибирование тромбина человека аптамером 15TGT в модельных системах и in vivo

I.X. Влияние структуры петель на функцию и структуру аптамера 15TGT

I.XI. Влияние структуры 5'- или З'-концевого участка аптамера

на функцию и структуру 15TGT

I.XII. Влияние структуры двух концевых участков аптамеров на функцию и структуру 15TGT

Глава II. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ. Изучение аптамерных ингибиторов тромбина методами спектроскопии кругового дихроизма и поверхностного плазмонного резонанса

II.I. Определение влияния структуры петель 15TGT на связывание с тромбином человека

II.II. Дополнительные структурные модули

Влияние двух дополнительных к G-квадруплексу комплементарных участков

Кинетика связывания двух-доменного аптамера 31TGT с тромбином человека

Влияние на структуру двух дополнительных к G-квадруплексу некомплементарных участков

Влияние длины двух дополнительных участков на структуру

Комбинирование элементов структуры аптамеров 31TGT и Nu 172

Влияние дополнительного участка, имеющего G-квадруплексный паттерн

Глава III. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

III.I. МАТЕРИАЛЫ

з

III.II. МЕТОДЫ

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

БЛАГОДАРНОСТИ

ДНК

КД

о.е.

осч

чда

РНК

РСА

ЯМР

G-квадруплекс

IU RU

SELEX

ТВА

ППР

вППР

FRET

TAMRA FAM

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

дезоксирибонуклеиновая кислота круговой дихроизм оптические единицы особо чистый чистый для анализа рибонуклеиновая кислота рентгеноструктурный анализ ядерный магнитный резонанс

неканоническая вторичная структура ДНК, обогащенной гуанином и способной образовывать структуры из двух, трёх или четырех цепей

international units (международные единицы активности) response units (единица изменения поверхностного плазмонного резонанса)

Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment (систематическая эволюция лигандов экспоненциальным обогащением)

thrombin-binding aptamer (тромбин-связывающий аптамер)

поверхностный плазмонный резонанс визуализация поверхностного плазмонного резонанса Fluorescence resonance energy transfer - резонансный перенос энергии флуоресценции Тетраметилкарбоксиродамин Карбоксифлуоресцеин

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Изучение аптамерных ингибиторов тромбина методами спектроскопии кругового дихроизма и поверхностного плазмонного резонанса»

ВВЕДЕНИЕ

Тромбин - это фермент класса гидролаз, важнейший компонент системы свертывания крови человека и животных; в крови присутствует в виде неактивного предшественника протромбина и активируется протромбиназой (активным тромбопластином). Основная функция тромбина - превращение фибриногена в фибрин.

Тромбин - гликопротеид с молекулярной массой около 40000; содержит около 5% углеводов. Данный фермент относится к классу сериновых пептидаз (трипсин и другие). Он состоит из двух полипептидных цепей, соединенных дисульфидной связью: А-цепи и Б-цепи, которая формирует активный центр фермента и содержит углеводный компонент. Для него существует несколько активных форм, которые различаются конформацией Б-цепи.

В крови тромбин инактивируется антитромбинами плазмы: а2-макроглобулином, антитромбином III и гепарином. Специфический неплазменный ингибитор тромбина - полипептид гирудин, который содержится в слюнных железах медицинской пиявки. В последние годы был получен новый тип ингибиторов тромбина - ДНК-аптамеры. Аптамерами называют олигомеры нуклеиновых кислот, которые специфически связываются с заданной мишенью - будь то низкомолекулярные соединения или целые клетки.

Аптамерная ДНК dGGTTGGTGTGGTTGG (15TGT), ингибирующая тромбин, впервые была получена методом SELEX (1). В отличие от широко применяемых в настоящее время ингибиторов тромбина, таких как гепарин, 15TGT обладает низкой иммуногенностью и малым временем жизни в организме, что определяет возможность получения нового лекарственного препарата. 15TGT имеет структуру внутримолекулярного G-квадруплекса, образуемого двумя G-квартетами, находящимися в стэкинге и соединенными одной TGT-петлей и двумя ТТ-петлями (рисунок 1). G-квартеты состоят из четырех гуанинов, взаимодействующих по хугстиновскому типу. Кроме внутримолекулярных (мономолекулярных) G-квадруплексов, из двух или четырех молекул ДНК могут образовываться димерные или тетрамерные межмолекулярные комплексы. Тип G-квадруплекса может быть определен с помощью характеристических спектров кругового дихроизма.

Рисунок 1. Схематическое изображение структуры аптамера 15ТОТ: антипараллельный й-квадруплекс из двух О-квартетов, соединенных петлями Т3Т4,

ТуОзТд И Т12Т13.

Пространственная структура тромбин-связывающего аптамера может стать основой для разработки улучшенных ингибиторов тромбина с О-квадруплексной структурой фармакофора. В стадии клинических испытаний находится один аптамерный ингибитор тромбина - N11172, разработанный "АгсЬегтх" в 2007 году. Данный ДНК-аптамер также имеет в своей первичной структуре О-квадруплексный паттерн, однако структура его неизвестна. Более того, как было впервые показано в данной работе, наличие квадруплексного паттерна у N11172 не определяет автоматически образование квадруплексной структуры в растворе. Понимание причин, определяющих структуру и свойства аптамеров к тромбину, необходимо для эффективной разработки антикоагулянтных препаратов.

Целью настоящей работы является изучение структуры ДНК-аптамерных ингибиторов тромбина человека, имеющих в своей первичной структуре О-квадруплексный паттерн ОО^ОО^ОО^ОО, где N - любой нуклеотид, а х, у, ъ -количество нуклеотидов в петлях О-квадруплекса. Кроме изучения предполагаемого фармакофора - минимального ДНК-аптамера, соответствующего паттерну, необходимо было исследовать влияние дополнительных к фармакофорной группе элементов структуры на стабильность О-квадруплексных аптамеров и кинетику связывания аптамеров с тромбином человека.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

• Исследовать структуру ДНК-аптамеров, имеющих в первичной структуре два паттерна: в-квадруплексный и дуплексный. Изучить условия существования в растворе структур, соответствующих этим паттернам.

• В условиях, когда одновременно существуют в-квадруплексный и дуплексный элементы структуры в растворе, изучить их взаимное влияние на структуру аптамера и способность связываться с тромбином человека.

• Количественно описать кинетику взаимодействия ДНК-аптамеров с тромбином человека с помощью метода поверхностного плазмонного резонанса в двух вариантах.

• Изучить влияние дополнительных к фармакофорной группе элементов структуры на взаимодействие с тромбином человека.

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ТРОМБИН ЧЕЛОВЕКА И АПТАМЕРИЫЕ ИНГИБИТОРЫ

1.1. Способы ингибирования коагуляционного каскада, применяемые в терапии

Заболевания, связанные с повышенной тромбообразующей активностью тромбина, являются основной причиной высокой смертности во всем мире (2). На данный момент, лечение в большей степени проводится непрямыми антикоагулянтами, стандартная терапия основана на парентеральных антикоагулянтах, таких как гепарин. Антикоагуляционный ответ на гепарин, однако, значительно различается у пациентов, так как гепарин имеет свойства связывать белки крови, что значительно усложняет подбор схемы лечения (3). Гепарины, т.е. гепарин/антитромбин комплексы, малоэффективны против тромбина, связанного с фибрином (4). Кроме того, гепарины

показывают снижение активности в области тромба, где наблюдается высокая концентрация тромбоцитарного фактора 4 (5). Формирование комплекса гепарин/тромбоцитарный фактор 4 может приводить к появлению неоантигенов на тромбоцитарный фактор 4, что, в конечном счете, ведет к развитию гепарин-индуцированной тромбоцитопении (6). С появлением низкомолекулярных гепаринов (НМГ), которые показывают меньший уровень связывания с белками плазмы, нежелательные побочные эффекты могут быть умеренными, хотя риск геморрагических осложнений недавно был отмечен для некоторых производных гепарина, таких как фондапаринукс (7). Применение антагонистов витамина К, таких как производное кумарина варфарин, является единственным рекомендованным подходом к оральным антикоагулянтам за последние 50 лет, хотя данные препараты имеют серьезные недостатки, такие как неспецифическое действие и трудно прогнозируемая фармакодинамика. Пациентам часто требуется постоянный лабораторный мониторинг, ввиду узкого терапевтического окна препарата, т.е. риска или тромботических осложнений, или кровотечения (8). Необходимость лабораторного мониторинга также возникает из-за различных взаимодействий лекарства с другими лекарствами и диетой, и позже осложнения возникают из-за медленного начала действия антикоагулянта (6, 8). Поэтому такие лекарства как варфарин обычно вводят вместе с парентеральными антикоагулянтами, по крайней мере, в начале терапии. Поскольку данные непрямые антикоагулянты, очевидно, имеют ряд серьезных недостатков, еще в середине 80-х была поставлена задача разработать новые, преимущественно пероральные, антикоагулянты, которые в частности могли бы заменить антагонисты витамина К.

1.11. Основные препятствия в дизайне прямых ингибиторов

тромбина

Ингибиторы прокоагулянтной активности тромбина, которые могут стать основой лекарства, должны удовлетворять ряду требований, помимо низкой константы скорости диссоциации комплекса ингибитора с тромбином. Низкие константы ингибирования не всегда приводят к эффективному действию антикоагулянта. В частности, значительное связывание ингибиторов с белками плазмы, как следствие гидрофобности молекулы ингибитора, увеличивает эффективную дозу ингибитора и, следовательно, ухудшает эффект антикоагулянта (9-12). Кроме того, связывание с

белками плазмы является фактором, определяющим фармакокинетику данного вещества, т.е. распределение и выведение вещества в организме человека. Быстрое выведение с помощью гепатобилиарной системы является недостатком многих ингибиторов тромбина (13). Параметры молекулы, влияющие на клиренс плазмы и экскрецию были исследованы для серии аналогов Ма-(2-нафтил-сульфонил-глицил)-DL-р-амидинофенилаланил-пиперидина (NAPАР, рисунок 2). Показано, что скорость выведения может быть значительно снижены за счет введения заряженных групп, например, наиболее выраженные отличия среди производных, содержащих карбоксильную группу, показали соединения, содержащие С-концевой незамещенный 4-амидинофенилаланин, структура приведена на рисунке 3 (14, 15).

амидинофенилаланил-пиперидина (NAPAP), прямого ингибитора активного сайта тромбина человека.

Рисунок 3. Структура NAPAP-аналога, скорость выведения которого почками в 4 раза меньше скорости выведения NAP АР.

Рисунок 2. Структура Ыа-(2-нафтил-сульфонил-глицил)-ОЬ-р-

nh2

I.III. Тромбин как мишень для антикоагулянтов в системе

свертывания крови

Различные участники коагуляционного каскада могут быть мишенями для действия новых антикоагулянтов. В настоящее время, антикоагулянты, находящиеся на испытаниях, действуют на такие мишени, как факторы Vila, IXa, Xa, Villa, Va и тромбин (16). Тромбин играет центральную роль в свертывании крови и по этой причине стал одной из самых популярных мишеней для открытия новых антитромботических агентов (17, 18). Прокоагулянтная активность тромбина заключается в расщеплении фибриногена до агрегирующего фибрина, активации связанного с фибрином фактора XIII, активации кофакторов V и VIII и даун-регуляцию фибринолиза путем генерации тромбин-активированного ингибитора фибринолиза (19, 20). Кроме того, тромбин опосредует активацию и агрегацию тромбоцитов, путем взаимодействия с рецепторами, которые активируются протеазами (21, 22). Однако, тромбин человека имеет и антикоагулянтную активность. В присутствии тромбомодулина и, особенно при низких концентрациях ионов натрия, он активирует протеин С (23, 24). Эта протеаза вместе с протеином S инактивируют факторы Va и Villa и, таким образом, даун-регулируют коагуляцию крови (25, 26). Из-за его центральной роли в регуляции коагуляции и гемостаза, тромбин считается идеальной мишенью для антикоагулянтной терапии, и в последние два десятилетия идет поиск малых молекул в качестве прямых ингибиторов тромбина (27-28).

I.IV. Строение тромбина человека

Тромбин - это трипсинподобная сериновая пептидаза, которая катализирует гидролиз фибриногена в фибрин, а также еще ряд реакций с другими мишенями. Почти без исключений он расщепляет пептидную связь только после остатка аргинина (таблица 1) (29). Тромбин человека состоит из двух полипептидных цепей: цепь А из 36 а. о. и цепь Б из 259 а. о., соединенных дисульфидными связями (рисунок 4). Как и другие сериновые пептидазы, тромбин содержит каталитическую триаду Asp 102, His57 и Serl95.

Рисунок 4. Структура молекулы тромбина: фиолетовым выделена А-цепь, розовым — Б-цепъ, голубым - экзосайт II, желтым - экзосайт I.

Особенностью тромбина является наличие дополнительной петли (ТугбОА, РгобОВ, РгобОС, ТгрбСЮ), которая отсутствует в других сериновых пептидазах и ограничивает доступ, как пептидных субстратов, так и ингибиторов в область активного сайта. Область активного сайта включает три отдельных «кармана». Специфичный карман 81 в тромбине содержит вверху остаток аспарагиновой кислоты Азр189, которая определяет сродство фермента к субстрату с основными остатками, такими как аргинин. В результате наличия вставки петли, соседний карман 82 обычно вмещает относительно небольшие и гидрофобные остатки субстрата. Дистальный карман, или арил-связывающий сайт (83/4) отделен от сайта 82 остатками Ьеи99,11е174 и Тг215, данный карман может вмещать гидрофобные и ароматические группы. Для взаимодействия с природными субстратами, такими как фибриноген или рецептор тромбина, также важны участки, далекие от области активного центра (29). В частности, экзосайт I, который расположен в 20 А от активного сайта и гепарин-связывающий экзосайт, каждый из которых формируется основными боковыми цепями лизина и аргинина, и вносит значительный вклад в специфичность и аффинность связывания субстрата (29, 30). В то время как связывание природных пептидных ингибиторов тромбина, таких как гирудин (31), ботрояроцин (32), триабин (33),

родниин (34), орнитодорин (35) и дипетолагостин (36) также включает связывание с экзосайтами, дизайн низкомолекулярных ингибиторов в основном направлен на связывание только с остатками в области активного сайта тромбина. Например, многие низкомолекулярные ингибиторы, такие как агротробан или мелагатран, содержат группы, имитирующие связывание аргинина в природном субстрате с Азр189 в кармане Б1.

Таблица 1. Сайты расщепления тромбином в пептидных субстратах.

Субстрат Сайт расщепления

N3 N2 N1 1 N'1 N'2 N'3

Фибриноген, а-цепь G V R G Р R

Фибриноген, Р-цепь S А R G Н R

Рецептор тромбина, подобный PARI D Р R S F L

Рецептор тромбина, подобный PAR3 Р I К т F L

Рецептор тромбина, подобный PAR4 А Р R G Y Р

Фактор II Т Р R S Е G

Фактор II N Р R т F G

Фактор V G I R S F R

Фактор V S Р R т F А

Фактор VII Q G R I V G

Фактор VIII Q I R S V А

Фактор VIII Е Р R S F S

Фактор XI к Р R I V G

Фактор XIII V Р R G V N

Протеин С D Р R L I D

Активируемый тромбином ингибитор фибринолиза S Р R А S А

I.V. Получение аптамерных ингибиторов тромбина

Аптамер, удлиняющий время образования кровяного сгустка в плазме крови с 25 до 43 секунд, получен в 1992 г. (1). Первичная структура семейства полученных аптамеров представлена в таблице 2.

Таблица 2. Первичная структура семейства аптамеров к тромбину. После 5-го цикла селекции набор фрагментов ДНК был амплифицирован ПЦР и клонирован. Для 32 вставок определены последовательности нуклеотидов. На основании частоты встречаемости оснований предложена консенсусная последовательность.

Клон Последовательность

1 ё С в 1 т с в - - ё г с в в 1 Т в в 1

2 ё в в а т с с - - г 1 1 в в 1 т в в ё

3 а в в 1 т в в ■ - ё а в с ё т в с &

4 1 в в 1 т в в - - с ё а в в а т в в а

5 а в с 1 т в в - ё 1 а ё 1 в 1 т в в 1

6 а в в 1 т с с - - ё с 1 в в 1 т в в ё

7 в в 1 т в в - - ё а С с 1 т в в а

8 1 С в 1 т в с - - ё 1 с в в 1 т с в ё

9 ё в в а т в в - - г ё 1 в в 1 т в в с

10 1 в в 1 т в в - - с а ё в в а т в в ё

11 1 в с а т с в - - 1 ё а в в 1 т в в а

12 ё в в ё т с в - - 1 г а в в I т в в 1

13 а в в ё т в в - - I г а С с 1 т в в 1

14 с в й 1 т в в - ё 1 г ё в в а т с в а

15 с в в I т с с - - 1 ё 1 в в 1 т в в 1

16 а в в 1 т с с - - 1 ё 1 С в ё т в в ё

17 с в с ё т с с - - а г а в в 1 т в в а

18 ё в 1 ё т в в 1 а ё г 1 1 в 1 т в в ё

19 1 С в 1 т в в 1 1 а с 1 в о 1 т в в ё

20 Б в в 1 т в в - - 1 с 1 в о ё т в в а

21 1 в с 1 т в в - - ё 1 1 в в ё т в в а

22 1 в в 1 т с в - - с с а в с 1 т с с а

23 С 1 а ё с в в - с а ё 1 в в г т с с ё

24 1 в С ё т с с - - ё ё а в с 1 т в в I

25 а с с г т в в - - г 1 1 в с ё т в в

26 а в в г т в в - 1 г а ё в с I т в в

27 ё в с а т в с - - ё ё г в с 1 т в в ё

28 1 в с 1 т в в - 1 г а 1 в с т в в 1

29 а с с 1 т в в - - t ё в в т в с С

30 а в в 1 т в в - - 1 ё 1 с в ё т в в й

31 1 в в 1 т в в - - ■ ё а в с 1 т в в т

32 ё в с 1 т с в 1 ё ё ё 1 в в а т в в т

в 31 30 6 0 32 31 30 32 6 0 32 32

А 0 1 4 0 0 0 0 0 4 0 0 0

Т 1 1 22 31 0 0 2 0 22 32 0 0

С 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0

Консенсусная последовательность

в в 1 т в в (¡4)3 С в 1 т в в

Исходя из консенсусной последовательности был выбран аптамер, связывающий тромбин 15ТВА (Thrombin Binding Aptamer), с первичной структурой 5'-GGTTGGTGTGGTTGG-3', по структуре верхней петли TGT называемый также 15TGT.

Используя алгоритм, имитирующий "эволюцию", был получен ряд аптамеров, имеющих в основе G-квадруплексный паттерн 15TGT (37). Данный алгоритм селекции предполагает на первом этапе синтез серии из 10 олигонуклеотидов, структуры GGNNGGNNNGGNNGG, где N - любой нуклеотид. По эффективности ингибирования тромбина отбираются первые 5 из серии и только эти олигонуклеотиды участвуют в следующем этапе отбора для дизайна 10 новых олигонуклеотидов.

Спустя 7 этапов получена последовательность нуклеотидов, идентичная 15TGT; таким образом, данный метод позволяет получить тот же результат для библиотеки из 70 олигонуклеотидов, а не 16384, как при полной рандомизации последовательности 15 нуклеотидов.

I.VI. Модифицированные аптамеры к тромбину

Первый модифицированный аптамер к тромбину получен в 1994 г (38). Аптамеры, содержащие 5-(1-пентинил)-2'-дезоксиуридин, имеют предположительно шпилечную структуру и могут быть разделены на 3 группы (рисунок 5). Константа диссоциации комплекса аптамера с тромбином, определенная методом связывания комплекса тромбина с радиоактивно меченым аптамером на нитроцеллюлозных фильтрах, для лучшего аптамера составляет 400 нМ.

Константы диссоциации комплекса а-тромбина с аптамером, определенные флуорометрическим методом, для аптамера, модифицированного оловоорганическим аналогом уридина (Ш* 5'-и*ООГГООТСТСОТТСО-3' и 15ТСТ составляют 36 нМ и 45 нМ, соответственно (39).

Константа диссоциации рассчитана для свето-зависимых аптамеров, структура которых приведена в таблице 3 (40).

Группа 1 Группа 2 Группа 3

Рисунок 5. Предполагаемые структуры трех групп тромбиновых аптамеров, содержащих 5-(1-пентинил)-2'-дезоксиуридин. Приведены значимые участки последовательности.

Таблица 3. Константа диссоциации комплекса тромбина со свето-зависимыми аптамерами. Проведены замены тимидина в разных позициях на свето-зависимый аналог, структура приведена на рисунке 6.

Последовательность Kd, hM

До облучения После облучения

5' -GGTTGGTGTGGTTGG-3' 99 ±21 99 ±21

5' -GGTTlWGGTGTGGTTGG-3' He детектируется 139 ±38

5'-GGTTGGTGTGGTTiNP,'GG-3' He детектируется 121 ±27

5'-GGTTlWGGTGTGGTT*ppGG-3' He детектируется 122 ±31

5'-GGTTGGTGT1>ppGGTTGG-3' 64 ±10 101 ±14

5' -GGTAGGTGTGGTTGG-3' He детектируется Не детектируется

Очевидно, что наименьшее влияние на функцию аптамера имеет модификация Т9 в петле ТОТ, так как аптамер связывается с тромбином как до, так и после облучения светом. Критической является замена тимина на аденин в позиции 4, ведущая к потере связывания с тромбином.

он

у»»РР

Рисунок 6. Структура свето-зависимого аналога тгшина

Циклический аптамер можно получить при наличии двух фосфатных групп на 3'- и 5'-концах удлиненного аптамера с1(рТООТТООТОТООТТООр), при образовании пирофосфатной связи под действием Ы-цианимидазола (41). Данный циклический аптамер остается интактным после 2 час инкубации с экзонуклеазой VII.

Химерные молекулы, состоящие из ДНК- и РНК-олигонуклеотидов, рассмотрены в работе группы Шафера (42). Аптамер гТВАсП (рисунок 7), в котором все нуклеотиды принадлежат рибо-ряду, кроме верхнего О-квартета (01-06-010-015), образует мономолекулярный антипараллельный О-квадруплекс, также как с1ТВАг2, в котором нижний О-квартет (02-05-011-014) представлен РНК.

с1ТВА 5'-ООТТСОТСТСОТТСО-3'

аТВАг1 5'-gGTTgGTGTgGTTgG-3'

(1ТВАг2 5'-С§ТТ^ТСТ^ТТСЕ-3'

гТВА гТВ Ас11

<1ТВАг2 З'-ЕОииЕОийиЕвииаО-З'

с!ТВАг1

с1ТВАг2 0

-^/лтл/ /шт- и

Л-У 4 /шиг/ V/

Рисунок 7. (А) Аптамеры на основе 15ТВА (15ТСТ) из ДНК- и РНК-олигонуклеотидов. В последовательности нуклеотидов заглавными буквами выделены дезоксирибонукпеотиды, строчными - рибонукчеотиды. (Б) Схематическое представление положения замен в С-квадруплексе аптамеров с!ТВАг1 и с1ТВАг2, положение рибонукчеотидов веделено ромбами.

Температура плавления О-квадруплексов в 25 мМ КС1 равна 51,8 ± 0,5° С и 49,4 ± 0,5° С, соответственно. Таким образом, сочетание ДНК-О-квартета (01-06-010-015) и РНК-О-квартета (02-05-011-014) делает О-квадруплекс более прочным, в данных

условиях Tm(15TBA) = 45,9 ± 0,5° С. Другие варианты, рассмотренные в работе, образует параллельные бимолекулярные G-квадруплексы с низкой температурой плавления.

При замене Т7(3-М1), где 3-MI - флуоресцентный аналог гуанина 3-метилизоксантоптерин, аптамер 15TGT не теряет способность связываться с тромбином, и при образовании комплекса происходит разгорание флуоресценции (43).

Флуоресцентные аналоги гуанина 2АР (2-аминопурин), 3MI (3-метилизоксантоптерин) и 6МАР (4-амино-6-метилптеридон), введенные вместо Т7 аптамера 15TGT, увеличивают флуоресценцию в 10 ± 1, 9,7 ± 0,5 и 30 ± 3 раз при связывании с тромбином (44). Для 15TGT Т7-6МАР рассчитана константа диссоциации KD= 12±2нМ.

При инверсии полярности части последовательности 15TGT - d(3 GGT5 -5TGGTGTGGTTGG3'), изменяется топология G-квадруплекса: три цепи параллельны друг другу и только одна имеет противоположное направление (45). Данный G-квадруплекс имеет спектр КД антипараллельного G-квадруплекса и более стабилен, чем не модифицированный 15TGT (57° С против 52° С в буфере 10 мМ КН2РО4, 70 мМ KCl, 200 мкМ ЭДТА, pH 7,0, соответственно). Однако ингибирующая активность этого аптамера в 4 раза ниже, чем 15TGT.

Конформационно блокированная нуклеиновая кислота (locked nucleic acid, LNA) — класс бициклических аналогов нуклеотидов, в которых 2'- и 4'-положения в фуранозном кольце соединены через О-метиленовый линкер (окси-ЗНК), S-метиленовый линкер (тио-ЗНК) или амино-метиленовый линкер (амино-ЗНК); в результате этого происходит блокирование рибозы в конформации, аналогичной в А-форме ДНК или РНК. По данным ЯМР ЗНК-олигонуклеотид 5'-ggttggtgtggttgg-3' в растворе не структурирован. Олигонуклеотиды из ДНК и ЗНК 5'-ggTTggTGTggTTgg-3' и 5' -gGTTGGTGTGGTTGG-3' (G - ДНК, g- ЗНК) образуют набор различных структур. ДНК-ЗНК аптамер 5'-GGTTGGTGTGGTTGg-3' образует антипараллельный мономолекулярный G-квадруплекс в буфере 10 мМ КН2РО4, 70 мМ KCl, 200 мкМ ЭДТА, pH 7,0 (46). G-квадруплекс этого аптамера менее стабилен, чем 15TGT (46° С против 52° С), и менее эффективно ингибирует тромбин человека.

2Т-АЫА - 2'-деокси-2'-фторарабинонуклеотиды в составе 15ТСТ увеличивают стабильность О-квадруплекса и устойчивость к нуклеазам крови (47). В сводной таблице 4 приведены температуры плавления модифицированных О-квадруплексов, I или II тип спектра КД для параллельного и антипараллельного типов О-квадруплексов, константа диссоциации с тромбином, и время полу-жизни в часах в плазме крови человека.

Таблица 4. Влияние модификаций 2Т-АЫА 15ТОТ на свойства в-квадруплекса. Приведены термостабильность О-квадруплекса. тип О-квадруплекса I (параллельный) и II (антипараллельный), гистерезис плавления О-квадруплекса, константа диссоциации комплекса с тромбином и время полу жизни аптамера в крови ///2 в часах. Подчеркиванием выделены модифицированные нуклеозиды О и Т.

Код Тип Последовательность Тш (ДТ), °С Спектр Гистерезис Тт К-сЬ нМ 11/2, Ч

Р01 ДНК осттсстстссттсс 47,4 II - 200 0,5

РС2 Р-А^ соттсстстссттсс 54,1 (+0,4) I + 500 >24

РОЗ F-ANA тетр.2 ссттсстстсоттсо 53,3(+1,5) II - >700 4,8

Рв4 Р-АМА тетр.2,п соттсстотсоттсс 61,6(+1,3) II - 500 9,4

Рв5 Р-АКА тетр.1 ооттсстотссттсс 45,4(-0,5) I + >700 0,8

Р06 Р-АКА тетр.1,п ооттсстотссттсс 48,5(+0,1) I + >700 0,6

РС7 Р-АЫА тетр.1-2 ШТТ^ТСТСЮТТСС} 50,2(+0,4) I + 450 4,0

Рв8 Р-АМА,п. ООТТСОТСТОСТТСС 56,3(+1,3) II - 280 5,9

Рй9 Р-АЫА,п. ОСЦОСТСТСС1ЮС 57,1 (+1,6) II - 300 2,8

РШО Р-АЫА,п. осттсстстссттсс 51,2(+0,8) II - 250 2,7

реп Р-АКА,п. 001ТССТСТССТТС0 56,6(+1,8) II - 370 5Д

Рй12 Р-АКА,п. ООЦССТСТОСЦСС 59,1 (+2,9) II - 310 3,5

РвП Р-АЫА,п. ОСТТСОТСТССТТСС 51,0(+0,9) II - 58 3,4

РбН Р-АЫА,п. ОСЩЗСТСТССТТСС 50,6(+0,8) II - 40 2,0

Модифицированный аптамер 3'-ООТ-5'-5'-ТООТОТООТТОО-3' (тТВА) образует антипараллельный О-квадруплекс, более стабильный, чем 15ТОТ (73° С против 53° С и 50 мМ КС1) и лучше связывается с тромбином человека (коП равна (4 ± 1)*107 М"1 и (3 ± 1)*106 М"1, соответственно (48). Получена стехиометрия комплекса

1:2, возможная структура комплекса предсказана методами молекулярной динамики (рисунок 8).

Рисунок 8. Предполагаемая структура комплекса аптамера (а) 15TGT и (б) тТВА с двумя молекулами тромбина человека. Экзосайт I выделен зеленым, экзосайт II выделен голубым.

I.VII. Пространственная структура аптамера 15TGT

Пространственная структура аптамера 15TGT описана методом ЯМР, при следовых количествах ионов К+ детектируются две структуры в растворе, а при 5 мМ Ю соответствующей концентрации ионов калия в буфере для комплексообразования, образуется одна структура - компактная и высоко симметричная, состоящая из двух тетрад гуанозинов и трех петель, конформации нуклеотидов в тетрадах anti-syn-anti-syn. (49). Позже структура описана методом ЯМР как антипараллельный G-квадруплекс (50). Также описаны структуры гетеродимера 15TGT с заменой одного из нуклеотидов на инозин, (G2I) и (G8I) при концентрации олигонуклеотида 2 мМ при 110 мМ KCl.

В работе Фейгон с сотр. (51) показано образование неканонической пары Т4-Т]з (рисунок 9). По неопубликованным данным (Macaya, Feigon), аналог 15TGT 5'-G4TTG4TGTG4TTG4-3' образует G-квадруплекс той же топологии, что и 15TGT, но с 4 G-квартетами.

Рисунок 9 Стекинг-взаимодействия Т4-Тц (желтый) на квартете С2-С5-Сц-(314 (зеленый).

Сравнение структур, полученных методами ЯМР и рентгеноструктурным анализом, представлено на рисунке 10 (52). Очевидно, что, несмотря на один тип О-квадруплекса 15ТОТ (мономолекулярный антипараллельный), данные структуры значительно различаются, поскольку направление цепи ДНК противоположно у структур, полученных разными методами.

Рисунок 10. Сравнение структуры 15ТСТ, описанной методами ЯМР и рентгеноструктурным анализом. Направление цепи ДНК противоположно у двух структур.

В работе Смирнова и Шафера (53) показано, что структура О-квадруплекса 15ТОТ, как и других О-квадруплексов, стабилизируется моновалентными катионами К', 1МНз+. Эффект КС1 и РЬ(МОз)2 можно проследить по изменению спектра кругового дихроизма (КД), рисунок 11. Без ионов металлов спектры КД имеют малую амплитуду, что указывает на мало сформированную структуру или ее отсутствие. При добавлении К (как и появляется характеристический максимум при 293 нм

Т13

ЯМР

РСА в 8

(рисунок 11 А). При добавлении РЬ2+ максимум наблюдается при 312 нм и достижение максимальных значений происходит при более низких концентрациях стабилизирующего иона (рисунок 11 Б). Стехиометрия образующего комплекса аптамер/РЬ2+ составляет 1:1, в то время как для катиона калия возможно связывание двух ионов одним G-квадруплексом.

По данным УФ-плавления, температура плавления G-квадруплекса 15TGT составляет 46,4 ± 1° С в 25 мМ KCl (рисунок 9) и 51,8 ± 1° С в 100 мМ KCl. Расчёт термодинамических параметров производили следующим образом:

Поглощение как функция от температуры равна:

А(Т) = (1-У)Астр(Т)-/Алин(Т)

i&IF'ffli 1 T—L7"mj

Е —-= е

ЦТ)

Где А(Т), Астр(Т), АЛИН(Т) - поглощение при температуре Т общее, поглощение структурированной формы (G-квадруплекса) и линейной формы, а / - доля олигонуклеотида в расплавленном или неструктурированном состоянии, Тш температура Т, при которой^ У2.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Юминова, Алина Валерьевна, 2013 год

СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Bock L.C., Griffin L.C., Latham J.A., Vermaas Е.Н., Toole J.J. Selection of single-stranded DNA molecules that bind and inhibit human thrombin. // Nature. 1992. V. 355(6360) P. 564-6.

2. Murray J. L. and Lopez A. D. Mortality by cause for eight regions of the world: global burden of disease study. // Lancet. 1997. V. 349. P. 1269-1276.

3. Hirsh J. Heparin. //N. Engl. J. Med. 1991. V. 324. P. 1565-1574.

4. Weitz J., Hudoba M., Massel D., Maragnore J. and Hirsh. Clot-bound thrombin is protected from inhibition by heparin-antithrombin-III but susceptible to inactivation by antithrombin-III-independent inhibitors. //J. Clin. Invest. 1991. V. 86. P. 385-391.

5. Eitzman D. Т., Chi L., Saggin L., Schwartz R. S., Lucchesi B. R. and Fay W. P. Heparin neutralization by platelet-rich thrombi: role of platelet factor 4. // Circulation. 1994. V. 89. P. 1523-1529.

6. Hirsh J. and Raschke R. Heparin and low-molecular-weight heparin: the seventh ACCP conference on antithrom-botic and thrombolytic therapy. // Chest. 2004. V. 126. P. 188S-203S.

7. Turpie A. G., Bauer K. A., Eriksson В. I. and Lassen M. R. Fondaparinux vs enoxaparin for the prevention of venous thromboembolism in major orthopaedic surgery: a meta-analysis of 4 randomised double-blind studies. // Arch. Intern. Med. 2002. V. 162. P. 1833-1840.

8. Hirsh J., Dalen J. E., Anderson D. R., Poller L., Bussey H., Ansell J. and Deykin D. Oral anticoagulants: mechanism of action, clinical effectiveness, and optimal therapeutic range. // Chest. 2001. V. 119. P. 8S-21S.

9. Tucker T. J., Lumma W. C., Lewis S. D., Gardell S. J., Lucas B. J., Baskin E. P., Woltmann R. F., Lynch J. J., Lyle E. A., Appleby S. D., Chen I. W„ Dancheck К. B. and Vacca J. P. Potent noncovalent thrombin inhibitors that utilize the unique amino acid D-dicyclohexylalanine in the P3 position: implications on oral bioavailability and antithrombotic efficacy. // J. Med. Chem. 1997. V. 40. P. 1565-1569.

10. Tucker T. J., Lumma W. C., Lewis S. D., Gardell S. J., Lucas B. J., Sisko J. Т., Lyle E. A., Baskin E. P., Woltmann R. F., Appleby S. D., Chen I. W., Dancheck К. В., Naylor-Olsen A. M., Krueger J. A., Cooper С. M. and Vacca J. P. Synthesis of a series of potent and orally bioavailable thrombin inhibitors that utilize 3,3-disubstituted propionic acid derivatives in the P3 position. // J. Med. Chem. 1997. V. 40. P. 3687-3693;

11. Isaacs R.C. A., Cutrona K. J., Newton C. L., Sanderson P.E. J., Solinsky M. G., Baskin E. P., Chen I. W., Cooper С. M., Cook J. J., Gardell S. J., Lewis S. D., Lucas R. J.,

Lyle E. A., Lynch J. J., Naylor-Olsen A. M., Stranieri M. T., Vastag K. and Vacca J. P. C6-modification of the pyridinone core of thrombin inhibitor L-3 74,087 as a means of enhancing its oral absorption. // Bioorg. Med. Chem. Lett. 1998. V. 8. P. 1719-1724.

12. Steinmetzer T., Batdorsdhjin M., Kleinwachter P., Seyfarth L., Greiner G., Reissmann S. and Stiirzebecher J. New thrombin inhibitors based on D-Cha-Pro-derivatives. // J. Enzyme Inhib. 1999. V. 14. P. 203-216.

13. Hauptmann J. and Stiirzebecher J. Synthetic inhibitors of thrombin and factor Xa: from bench to bedside. // Thromb. Res. 1999. V. 93. P. 203-241.

14. Steinmetzer T., Schweinitz A., Kunzel S., Wikstrom P., Hauptmann J. and Stiirzebecher J. Structure-activity relationships of new NAPAP-analogs. // J. Enzyme Inhib. Med. Chem. 2002. V. 17. P. 241-249.

15. Hauptmann J., Steinmetzer T., Vieweg H., Wikstrom P. and Stiirzebecher J. Influence of structural variations in peptidomimetic 4-amidinophenylalanine-derived thrombin inhibitors on plasma clearance and biliary excretion in rats. // Pharm. Res. 2002. V. 19. P. 1027-1033.

16. Linkins L.-A. and Weitz J. I. New anticoagulant therapy. // Annu. Rev. Med. 2005. V. 56. P. 63-77.

17. Furie B. and Furie B. C. Molecular and cellular biology of blood coagulation. // N. Engl. J. Med. 1992. V. 326. P. 800-805.

18. Monroe D. M., Hoffmann M. and Roberts H. R. Platelets and thrombin generation. // Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 2002. V. 22. P. 1381-1389.

19. Stewart R. J., Fredenburgh J. C., Rischke J. A., Bajzar L. and Weitz J. I. Thrombin-activatable fibrinolysis inhibitor attenuates (DD)-E-mediated stimulation of plasminogen activation by reducing the affinity of (DD)E for tissue plasminogen activator. // J. Biol. Chem. 2000. V. 275. P. 36612-36620.

20. Bouma B. N. and Mosnier L. O. Thrombin activatable fibrinolysis inhibitor (TAFI) at the interface between coagulation and fibrinolysis. // Pathophysiol. Haemost. Thromb. 2004. V. 33. P. 375-381.

21. Coughlin S. R. Thrombin signaling and protease-activated receptors. // Nature. 2000. V. 407. P. 258-264.

22. Sambrano G. R., Weiss E. J., Zheng Y. W., Huang W. and Coughlin S. R. Role of thrombin signaling in platelets in haemostasis and thrombosis. //Nature. 2001. V. 413. P. 7478.

23. De Filippis V., De Dea E., Lucatello F. and Frasson R. Effect of Na+ binding on the conformation, stability and molecular recognition properties of thrombin. // Biochem. J. 2005. V. 390. P. 485-492.

24. Bush L. A., Nelson R. W. and Di Cera E. Murine thrombin lacks Na+ activation but retains high catalytic activity. // J. Biol. Chem. 2006. V. 281. P. 7183-7188.

25. Di Cera E., Dang Q. D. and Ayala Y. M. Molecular mechanisms of thrombin function. // Cell. Mol. Life Sci. 1997. V. 53. P. 701-730.

26. Gale A. J. and Griffin J. H. Characterization of a thrombomodulin binding site on protein C and its comparison to an activated protein C binding site for factor Va. // Proteins. 2004. V. 54. P. 433-441.

27. Steinmetzer T., Hauptmann J. and Stiirzebecher J. Advances in the development of thrombin inhibitors. // Expert Opin. Invest. Drugs. 2001. V. 10. P. 845-864.

28. Steinmetzer T., Hauptmann J. and Stiirzebecher J. Progress in the development of synthetic thrombin inhibitors as new orally active anticoagulants. // Curr. Med. Chem. 2004. V. 11. P. 2297-2321.

29. Rose T. and Di Cera E. Three-dimensional modeling of thrombin-fibrinogen interaction. // J. Biol. Chem. 2002. V. 277. P. 18875-18880.

30. Stubbs M. T., Oschkinat H., Mayr I., Huber R., Angliker H., Stone S. R. and Bode W. The interaction of thrombin with fibrinogen: a structural basis for its specificity. // Eur. J. Biochem. 1992. V. 206. P. 187-195.

31. Griitter M. G., Priestle J. P., Rahuel J., Grossenbacher H., Bode, W., Hofsteenge J. and Stone S. R. Crystal structure of the thrombin-hirudin complex: novel mode of serine protease inhibition. // EMBO J. 1990. V. 9. P. 2361-2365.

32. Zingali R. B., Jandrot-Perrus M., Guilin M. C. and Bone C. Bothrojaracin, a new thrombin inhibitor isolated from Bothrops jararaca venom: characterization and mechanism of thrombin inhibition. //Biochemistry. 1993. V. 32. P. 10794-10802.

33. Noeske-Jungblut C., Haendler B., Donner P., Alagon A., Possani L. and Schleuning W. D. Triabin, a highly potent exosite inhibitor of thrombin. // J. Biol. Chem. 1995. V. 270. P.28629-28643.

34. Van der Locht A., Lamba D., Bauer M., Huber R., Friedrich T., Kroger B., Hoffken W. and Bode W. Two heads are better than one: crystal structure of the insect derived double domain Kazal inhibitor rhodniin in complex with thrombin. // EMBO J. 1995. V. 14. P. 5149-5157.

35. Van der Locht A., Stubbs M. T., Bode W., Friedrich T., Bollschweiler C., Hoffken W. and Huber R. The ornithodorin-thrombin crystal structure, a key to the TAP enigma? // EMBO J. 1996. V. 15. P. 6011-6017.

36. Mende K., Petoukhova O., Koulitchkova V., Schaub G. A., Lange U., Kaufmann R. and Nowak G. Dipetalogastin, a potent thrombin inhibitor from the blood-sucking insect Dipetalogaster maximus. // Eur. J. Biochem. 1999. V. 260. P. 583-590.

105

37. Ikebukuro K., Okumura Y., Sumikura K., Karube I. Novel strategy for DNA aptamers inhibiting enzymatic activity using algorithm mimicking evolution. // Nucleic Acids Res Suppl. 2003. V. 3. P. 205-206.

38. Latham J.A, Johnson R, Toole J.J. The application of a modified nucleotide in aptamer selection: novel thrombin aptamers containing 5-(l-pentynyl)-2'-deoxyuridine. // Nucleic Acids Res. 1994. V. 22(14). P. 2817-2822.

39. Dougan H., Hobbs J.B, Weitz J.I., Lyster D.M. Synthesis and radioiodination of a stannyl oligodeoxyribonucleotide. //Nucleic Acids Res. 1997. V. 25(14). P. 2897-901.

40. Heckel A., Mayer G. Light regulation of aptamer activity: an anti-thrombin aptamer with caged thymidine nucleobases. // J Am Chem Soc. 2005. V. 127(3). P. 822-823.

41. Qi J., Shafer R.H. Covalent ligation studies on the human telomere quadruplex. // Nucleic Acids Res. 2005. V. 33(10). P. 3185-92.

42. Tang C.F, Shafer R.H. Engineering the quadruplex fold: nucleoside conformation determines both folding topology and molecularity in guanine quadruplexes. // J Am Chem Soc. 2006. V. 128(17). P. 5966-73.

43. Lin C., Katilius E., Liu Y., Zhang J., Yan H. Self-assembled signaling aptamer DNA arrays for protein detection. // Angew Chem Int Ed Engl. 2006. V 45(32). P. 5296-301.

44. Katilius E., Katiliene Z., Woodbury N.W. Signaling aptamers created using fluorescent nucleotide analogues. // Anal Chem. 2006. V. 78(18). P. 6484-9

45. Martino L., Virno A., Randazzo A., Virgilio A., Esposito V., Giancola C., Bucci M., Cirino G., Mayol L. A new modified thrombin binding aptamer containing a 5'-5' inversion of polarity site. //Nucleic Acids Res. 2006. V. 34(22). P. 6653-62.

46. Virno A., Randazzo A., Giancola C., Bucci M., Cirino G., Mayol L. A novel thrombin binding aptamer containing a G-LNA residue. // Bioorg Med Chem. 2007. V. 15(17). P. 5710-8.

47. Peng C.G., Damha M.J. G-quadruplex induced stabilization by 2'-deoxy-2'-fluoro-D-arabinonucleic acids (2'F-ANA). // Nucleic Acids Res. 2007. V. 35(15). P. 4977-88.

48. Pagano B., Martino L., Randazzo A., Giancola C. Stability and binding properties of a modified thrombin binding aptamer. // Biophys J. 2008. V. 94(2). P. 562-9.

49. Wang K.Y., McCurdy S., Shea R.G., Swaminathan S., Bolton P.H. A DNA aptamer which binds to and inhibits thrombin exhibits a new structural motif for DNA. // Biochemistry. 1993. V. 32(8). P. 1899-904.

50. Macaya R.F. Schultze P., Smith F.W, Roe J.A, Feigon J. Thrombin-binding DNA aptamer forms a unimolecular quadruplex structure in solution. // Proc Natl Acad Sci USA. 1993. V. 90(8). P. 3745-9.

51. Schultze P., Macaya R.F., Feigon J. Three-dimensional solution structure of the

106

thrombin-binding DNA aptamer d(GGTTGGTGTGGTTGG). // J Mol Biol. 1994. V. 235(5). P. 1532-47.

52. Kelly J.A, Feigon J., Yeates T.O. Reconciliation of the X-ray and NMR structures of the thrombin-binding aptamer d(GGTTGGTGTGGTTGG). // J Mol Biol. 1996. V. 256(3) P. 417-22.

53. Smirnov I., Shafer R.H. Lead is unusually effective in sequence-specific folding of DNA. // J Mol Biol. 2000. V. 296(1). P. 1-5.

54. Macaya R. F., Schultze P., Smith F. W., Roe J. A., and Feigon J. Thrombin-binding DNA aptamer forms a unimolecular quadruplex structure in solution. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1993. V. 90. P. 3745-3749.

55. Jing N., Rando R.F., Pommier Y., Hogan M.E. Ion selective folding of loop domains in a potent anti-HIV oligonucleotide. // Biochemistry. 1997. V. 36(41). P. 12498-505.

56. Mergny J.L., Phan A.T., Lacroix L. Following G-quartet formation by UV-spectroscopy. // FEBS Lett. 1998. V. 435(1). P. 74-8.

57. Datta B., Armitage B.A. Hybridization of PNA to structured DNA targets: quadruplex invasion and the overhang effect. // J Am Chem Soc. 2001. V. 123(39). P. 9612-9.

58. Kankia B.I, Marky L.A. Folding of the thrombin aptamer into a G-quadruplex with Sr2+: stability, heat, and hydration. // J Am Chem Soc. 2001. V. 123(44). P. 10799-804.

59. Dapic V., Abdomerovic V., Marrington R., Peberdy J., Rodger A., Trent J.O., Bates P.J. Biophysical and biological properties of quadruplex oligodeoxyribonucleotides. // Nucleic Acids Res. 2003. V. 31(8). P. 2097-107.

60. Mao X., Marky L.A., Gmeiner W.H. NMR structure of the thrombin-binding DNA aptamer stabilized by Sr2+. // J Biomol Struct Dyn. 2004. V. 22(1). P. 25-33.

61. Balthasart F, Plavec J, Gabelica V. Ammonium ion binding to DNA G-quadruplexes: do electrospray mass spectra faithfully reflect the solution-phase species? // J. Am. Soc. Mass. Spectrom. 2013. V. 24(1). P.1-8.

62. Joyce M.V., McGown L.B. Detection of G-quartet structure in a DNA aptamer stationary phase using a fluorescent dye. // Appl Spectrosc. 2004. V. 58(7). P. 831-5.

63. Mondragon-Sanchez J.A., Liquier J., Shafer R.H., Taillandier E. Tetraplex structure formation in the thrombin-binding DNA aptamer by metal cations measured by vibrational spectroscopy. // J Biomol Struct Dyn. 2004. V. 22(3). P. 365-73.

64. Kankia B. I. Optical absorption assay for strand-exchange reactions in unlabeled nucleic acids. // Nucleic Acids Res. 2004. V. 32(19). P. el54.

65. Mao X.A., Gmeiner W.H. NMR study of the folding-unfolding mechanism for the thrombin-binding DNA aptamer d(GGTTGGTGTGGTTGG). // Biophys Chem. 2005. V.

113(2). P. 155-60.

66. Kankia B.I., Barany G., Musier-Forsyth K. Unfolding of DNA quadruplexes induced by HIV-1 nucleocapsid protein. //Nucleic Acids Res. 2005. V. 33(14). P. 4395-403.

67. Fialova M., Kypr J., Vorlickova M. The thrombin binding aptamer GGTTGGTGTGGTTGG forms a bimolecular guanine tetraplex. // Biochem Biophys Res Commun. 2006. V. 344(1). P. 50-54.

68. Nagatoishi S., Tanaka Y., Tsumoto K. Circular dichroism spectra demonstrate formation of the thrombin-binding DNA aptamer G-quadruplex under stabilizing-cation-deficient conditions. // Biochem Biophys Res Commun. 2007. V. 352(3). P. 812-7.

69. Miyoshi D., Karimata H., Sugimoto N. Factors regulating thermodynamic stability of DNA structures under molecular crowding conditions. // Nucleic Acids Symp Ser (Oxf). 2006. V. 50. P. 203-4.

70. Padmanabhan K., Padmanabhan K.P., Ferrara J.D., Sadler J.E., Tulinsky A. The structure of alpha-thrombin inhibited by a 15-mer single-stranded DNA aptamer. // J Biol Chem. 1993. V. 268(24). P. 17651-4.

71. Tsiang M., Jain A.K., Dunn K.E., Rojas M.E., Leung L.L., Gibbs C.S. Functional mapping of the surface residues of human thrombin. // J Biol Chem. 1995. V. 270(28). P. 16854-63.

72. Cao Z., Tan W. Molecular aptamers for real-time protein-protein interaction study. // Chemistry. 2005. V. 11(15). P. 4502-8.

73. Liu Y., Lin C., Li H., Yan H. Aptamer-Directed Self-Assembly of Protein Arrays on a DNA Nanostructure. // Angew Chem. 2005. V. 117. P. 4407 -4412.

74. Li W.X., Kaplan A.V., Grant G.W., Toole J.J., Leung L.L. A novel nucleotide-based thrombin inhibitor inhibits clot-bound thrombin and reduces arterial platelet thrombus formation.// Blood. 1994. V. 83(3). P. 677-82.

75. DeAnda A. Jr., Coutre S.E., Moon M.R., Vial C.M., Griffin L.C., Law V.S., Komeda M., Leung L.L., Miller D.C. Pilot study of the efficacy of a thrombin inhibitor for use during cardiopulmonary bypass.// Ann Thorac Surg. 1994. V. 58(2). P. 344-50.

76. Shaw J.P., Fishback J.A., Cundy K.C., Lee W.A. A novel oligodeoxynucleotide inhibitor of thrombin. I. In vitro metabolic stability in plasma and serum. // Pharm Res. 1995. V. 12(12). P. 1937-42.

77. Reyderman L., Stavchansky S. Pharmacokinetics and biodistribution of a nucleotide-based thrombin inhibitor in rats. // Pharm Res. 1998. V. 15(6). P. 904-10.

78. Dougan H., Weitz J.I., Stafford A.R., Gillespie K.D., Klement P., Hobbs J.B., Lyster D.M. Evaluation of DNA aptamers directed to thrombin as potential thrombus imaging agents. // Nucl Med Biol. 2003. V. 30(1). P. 61-72.

108

79. Holland C.A., Henry A.T., Whinna H.C., Church F.C. Effect of oligodeoxynucleotide thrombin aptamer on thrombin inhibition by heparin cofactor II and antithrombin. // FEBS Lett. 2000. V. 484(2). P. 87-91.

80. Kretz C.A., Stafford A.R., Fredenburgh J.C., Weitz J.I. HD1, a thrombin-directed aptamer, binds exosite 1 on prothrombin with high affinity and inhibits its activation by prothrombinase. // J Biol Chem. 2006. V. 281(49). P. 37477-85.

81. Wang K.Y., Krawczyk S.H., Bischofberger N.. Swaminathan S., Bolton P.H. The tertiary structure of a DNA aptamer which binds to and inhibits thrombin determines activity. //Biochemistry. 1993. V. 32(42). P. 11285-92.

82. Bracht F., Schror K. Isolation and identification of aptamers from defibrotide that act as thrombin antagonists in vitro. // Biochem Biophys Res Commun. 1994. V. 200(2). P. 9337.

83. Sumikura K., Yano K., Ikebukuro K., Karube I. Thrombin-binding properties of thrombin aptamer derivatives. // Nucleic Acids Symp Ser. 1997. V. 37. P. 257-8.

84. Tsiang M., Gibbs C.S., Griffin L.C., Dunn K.E., Leung L.L. Selection of a suppressor mutation that restores affinity of an oligonucleotide inhibitor for thrombinusing in vitro genetics. // J Biol Chem. 1995. V. 270(33). P. 19370-6.

85. Smirnov I., Shafer R.H. Lead is unusually effective in sequence-specific folding of DNA. // J Mol Biol. 2000. V. 296(1). P. 1-5.

86. Kuryavyi V., Majumdar A., Shallop A., Chernichenko N., Skripkin E., Jones R., Patel D.J. A double chain reversal loop and two diagonal loops define the architecture of a unimolecular DNA quadruplex containing a pair of stacked G(syn)-G(syn)-G(anti)-G(anti) tetrads flanked by a G-(T-T) Triad and a T-T-T triple. // J Mol Biol. 2001. V. 310(1). P. 18194.

87. Seela F., Jawalekar A.M., Sirivolu V.R., Rosemeyer H., He Y., Leonard P. Novel DNA nanoparticles and networks. // Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids. 2005. V. 24(5-7). P. 855-8.

88. Paborsky L.R., McCurdy S.N., Griffin L.C., Toole J.J., Leung L.L. The single-stranded DNA aptamer-binding site of human thrombin. // J Biol Chem. 1993. V. 268(28). P. 20808-11.

89. Potyrailo R.A., Conrad R.C., Ellington A.D., Hieftje G.M. Adapting selected nucleic acid ligands (aptamers) to biosensors. // Anal Chem. 1998. V. 70(16). P. 3419-25.

90. Dougan H., Lyster D.M., Vo C.V., Stafford A., Weitz J.I., Hobbs J.B. Extending the lifetime of anticoagulant oligodeoxynucleotide aptamers in blood. Nucl Med Biol. 2000. V. 27(3). P. 289-97.

91. Hamaguchi N., Ellington A., Stanton M. Aptamer beacons for the direct detection of

109

proteins. // Anal Biochem. 2001. V. 294(2). P. 126-31.

92. Berezovski M., Nutiu R., Li Y., Krylov S.N. Affinity analysis of a protein-aptamer complex using nonequilibrium capillary electrophoresis of equilibrium mixtures. // Anal Chem. 2003. V. 75(6). P. 1382-6.

93. McCauley T.G., Hamaguchi N., Stanton M. Aptamer-based biosensor arrays for detection and quantification of biological macromolecules. // Anal Biochem. 2003. V. 319(2). P. 244-50.

94. Pavlov V., Xiao Y., Shlyahovsky B., Willner I. Aptamer-functionalized Au nanoparticles for the amplified optical detection of thrombin // J Am Chem Soc. 2004. V. 126(38). P. 11768-9.

95. Baldrich E., Restrepo A., O'Sullivan C.K. Aptasensor development: elucidation of critical parameters for optimal aptamer performance. // Anal Chem. 2004. V. 76(23). P. 7053-63.

96. Gronewold T.M., Glass S., Quandt E., Famulok M. Monitoring complex formation in the blood-coagulation cascade using aptamer-coated SAW sensors. // Biosens Bioelectron. 2005. V. 20(10). P. 2044-52.

97. Heyduk E., Heyduk T. Nucleic acid-based fluorescence sensors for detecting proteins. // Anal Chem. 2005. V. 77(4). P. 1147-56.

98. So H.M., Won K., Kim Y.H., Kim B.K., Ryu B.H., Na P.S., Kim H., Lee J.O. Singlewalled carbon nanotube biosensors using aptamers as molecular recognition elements. // J Am Chem Soc. 2005. V. 127(34). P. 11906-7.

99. Levy M., Cater S.F., Ellington A.D. Quantum-dot aptamer beacons for the detection of proteins. // Chembiochem. 2005. V. 6(12). P. 2163-6.

100. Bang G.S., Cho S., Kim B.G. A novel electrochemical detection method for aptamer biosensors. // Biosens Bioelectron. 2005. V. 21(6). P. 863-70.

101. Radi A.E., Acero Sánchez J.L., Baldrich E., O'Sullivan C.K. Reagentless, reusable, ultrasensitive electrochemical molecular beacon aptasensor. // J Am Chem Soc. 2006. V. 128(1). P. 117-24.

102. Hianik T., Ostatná V., Sonlajtnerova M., Giman I. Influence of ionic strength, pH and aptamer configuration for binding affinity to thrombin. // Bioelectrochemistry. 2007. V. 70(1). P. 127-33.

103. Balamurugan S., Obubuafo A., Soper S.A., McCarley R.L., Spivak D.A. Designing highly specific biosensing surfaces using aptamer monolayers on gold. // Langmuir. 2006. V. 22(14). P. 6446-53.

104. Centi S., Tombelli S., Minunni M., Mascini M. Aptamer-based detection of plasma proteins by an electrochemical assay coupled to magnetic beads. // Anal Chem. 2007. V.

110

79(4). P. 1466-73.

105. Bini A., Minunni M., Tombelli S., Centi S., Mascini M. Analytical performances of aptamer-based sensing for thrombin detection. // Anal Chem. 2007. V. 79(7). P. 3016-9.

106. Di Primo C., Lebars I. Determination of refractive index increment ratios for protein-nucleic acid complexes by surface plasmon resonance. // Anal Biochem. 2007. V. 368(2). P. 148-55.

107. Tang Q., Su X., Loh K.P. Surface plasmon resonance spectroscopy study of interfacial binding of thrombin to antithrombin DNA aptamers. // J Colloid Interface Sei. 2007. V. 315(1). P. 99-106.

108. Wang X., Zhou J., Yun W., Xiao S., Chang Z., He P., Fang Y. Detection of thrombin using electrogenerated chemiluminescence based on Ru(bpy)3(2+)-doped silica nanoparticle aptasensor via target protein-induced strand displacement. // Anal Chim Acta. 2007. V. 598(2). P. 242-8.

109. Buff M., Schäfer F., Wulffen B., Müller J., Pötzsch B., Heckel A., and Mayer G., Dependence of aptamer activity on opposed terminal extensions: improvement of lightregulation efficiency. //NAR. 2010. V. 38(6). P. 2111-8.

110. Macaya R.F., Waldron J.A., Beutel B.A., Gao H., Joesten M.E., Yang M., Patel R., Bertelsen A.H., Cook A.F. Structural and functional characterization of potent antithrombotic oligonucleotides possessing both quadruplex and duplex motifs. // Biochemistry. 1995. V. 34(13). P. 4478-92.

111. Tasset D.M., Kubik M.F. and Steiner W. Oligonucleotide inhibitors of human thrombin that bind distinct epitopes. // .J. Mol. Biol. 1997. V. 272. P. 688-698.

112. Ikebukuro K., Okumura Y., Sumikura K., Karube I. Novel strategy for DNA aptamers inhibiting enzymatic activity using algorithm mimicking evolution. // Nucleic Acids Res Suppl. 2003. V. 3. P. 205-6.

113. Li J.J., Fang X., Tan W. Molecular aptamer beacons for real-time protein recognition. // Biochem Biophys Res Commun. 2002. V. 292(1). P. 31-40.

114. Xiao Y., Lubin A.A., Heeger A.J., Plaxco K.W. Label-free electronic detection of thrombin in blood serum by using an aptamer-based sensor. // Angew Chem Int Ed Engl. 2005. V. 44(34). P. 5456-9.

115. Kumar N., Maiti S. Quadruplex to Watson-Crick duplex transition of the thrombin binding aptamer: a fluorescence resonance energy transfer study. // Biochem Biophys Res Commun. 2004. V. 319(3). P. 759-67.

116. Di Giusto D.A., King G.C. Construction, stability, and activity of multivalent circular anticoagulant aptamers. // J Biol Chem. 2004. V. 279(45). P. 46483-9.

117. Ikebukuro K., Okumura Y., Sumikura K., Karube I. A novel method of screening

111

thrombin-inhibiting DNA aptamers using an evolution-mimicking algorithm. // Nucleic Acids Res. 2005. V. 33(12). P. el08.

118. Ikebukuro K., Yoshida W., Sode K. Development of a novel sensing probe using DNA aptamer inhibiting enzymatic activity. // Nucleic Acids Symp Ser (Oxf). 2005. V 49. P. 83-4.

119. Ikebukuro K., Yoshida W., Noma Т., Sode K. Analysis of the evolution of the thrombin-inhibiting DNA aptamers using a genetic algorithm. // Biotechnol Lett. 2006. V. 28(23). P. 1933-7.

120. Fredriksson S., Gullberg M., Jarvius J., Olsson C., Pietras K., Giistafsdottir S.M., Ostman A., Landegren U. Protein detection using proximity-dependent DNA ligation assays. //Nat Biotechnol. 2002. V. 20(5). P. 473-7.

121. Miiller J., Wulffen В., Potzsch В., Mayer G. Multidomain targeting generates a high-affinity thrombin-inhibiting bivalent aptamer. // Chembiochem. 2007. V. 8(18). P. 2223-6.

122. Rusconi C.P., Scardino E., Layzer J., et al.: RNA aptamers as reversible antagonists of coagulation factor IXa. //Nature. 2002. V. 419. P. 90-94.

123. Rusconi C.P., Yeh A., Lyerly H.K., et al. Blocking the initiation of coagulation by RNA aptamers to factor Vila. // Thromb Haemost. 2000. V. 84. P. 841-848.

124. Jeter M.L., Ly L.V., Fortenberry Y.M., Whinna H.C., White R.R., Rusconi C.P., Sullenger B.A., Church F.C. RNA aptamer to thrombin binds anion-binding exosite-2 and alters protease inhibition by heparin-binding serpins. // FEBS Lett. 2004. V. 568(1-3). P. 104.

125. Позмогова Г. E., Зайцева M.A., Смирнов И.П., Швачко А.Г., Мурина М.А., Сергиенко В.И. Антикоагуляционные свойства и стабильность в плазме крови тиоаналогов тромбинсвязывающего ДНК-аптамера // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины : ежемесячный международный научно-теоретический журнал. 2010. Т. 150(8). Стр. 142-147.

126. Kato Y., Minakawa N., Komatsu Y., Kamiya H., Ogawa N., Harashima H., Matsuda A. New NTP analogs: the synthesis of 4'-thioUTP and 4'-thioCTP and their utility for SELEX. //Nucleic Acids Res. 2005. V. 33(9). P. 2942-51.

127. Myszka D.G., He X., Dembo M., Morton T. A. and Goldstein B. Extending the range of rate constants available from Biacore: interpreting mass transport-influenced binding data. // Biophys J. 1998. V. 75. P. 583.

128. Onell A. and Andersson K. Kinetic determinations of molecular interactions using Biacore—minimum data requirements for efficient experimental design. // J. Mol. Recognit. 2005. V. 18(4). P. 307-17.

БЛАГОДАРНОСТИ

Выражаю благодарность научному руководителю, проф. Алексею Михайловичу Копылову за поддержку на всех этапах выполнения работы, за плодотворные дискуссии и ценные замечания.

Благодарю за совместную работу по спектроскопии кругового дихроизма зав. лабораторией, к.ф.-м.н. Александра Миграновича Арутюняна, а также благодарю за ценные уроки д. х. н., в.н.с. химфака МГУ им. М.В. Ломоносова, Нину Германовну Долинную.

Благодарю за консультации и новые идеи к.х.н. Головина Андрея Викторовича и к.ф.-м.н. Решетникова Романа Владимировича (факультет биоинженерии и биоинформатики МГУ им. М.В. Ломоносова,).

Особенно хочу поблагодарить своих родных и близких за терпение и поддержку.