Изучение биосинтеза трансферрина в печени крыс тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, кандидат биологических наук Тимченко, Николай Александрович
- Специальность ВАК РФ03.00.04
- Количество страниц 168
Оглавление диссертации кандидат биологических наук Тимченко, Николай Александрович
ВВЕДЕНИЕ.
ОБЗОР ЖГЕРАГУРЫ.
Глава I, Биологическая роль трансферрина и строение его молекулы
Глава 2. Биосинтез трансферрина и его регуляция
Глава 3. Молекулярная организация гена трансферрина птиц.
ЭКСПШЖНГАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Глава 4. Материалы и методы
4.1. Выделение и характеристика трансферрина
4.2. Получение ^-характеристика моноспецифических антител против трансферрина
4.3. Получение радиоактивных ■^1-иммуноглобулинов.
4.4. Выделение и фракционирование полирибосом из печени крысы.
4.5. Связывание х и1-антител с полирибосомами
4.6. Анализ полирибосом, синтезирующих трансферрин.
4.7. Выделение высокоочищенной мРНК трансферрина
4.7.1. Выделение суммарных полирибосом печени крысы.
4.7.2. Непрямая иммунопреципитация Тф-синтезирующих полирибосом.
4.7.3. Выделение суммарной РНК из Тф-синтезирующих полисом.
4.7.4. Выделение поли/А/~содержащей РНК
4.8. Мечение препаратов Тф-мРНК изотопом
4.9. Определение молекулярного веса Тф-мРНК
4.10» Определение размеров поли/А/последовательности в Тф-мРНК.
4.11. Анализ вторичной структуры Тф-мРНК
4.12. функциональная характеристика Тф-мРНК
4.12.1. Бесклеточная трансляция мРНК трансферрита
4.12.2. Обратная транскрипция Тф-мРНК.
4.13. Гибридизация РНК-Тф-кДНК.
4.14. Клонирование фрагментов структурного гена трансферрина.
4.14.1. Конструирование рекомбинантных плазмид на основе рВИ
4.14.2. Трансформация клеток рекомбинантными плазмидами
4.14.3. Гибридизация колоний с Р^-Тф-кДНК
4.14.4. Выделение рекомбинантных плазмид
4.14.5. Рестрикциюнный анализ рекомбинантных плазмид
4.15. Перенос ДНК на фильтры и гибридизация с Тф-кДНК.
4.16. Идентификация Тф-мРНК гибридизацией с рекомбинантными ДНК из плазмид рНТГ
4.16.1. Электрофорез РНК в 1,5$ агарозе с
6% формальдегидом.
4.16.2. Перенос РНК на нитроцеллюлозный фильтр
4.16.3. Ник-трансляция ДНК плазмид рНТГ
4.16.4. Гибридизация РНК, иммобилизованной на нитроцеллюлозном фильтре, с ник-транслированной ДНК плазмид рЕТ£
4.16.5. Выделение мРНК трансферрина гибридизацией с рекомбинантными ДНК плазмид
Глава 5. Выделение и характеристика трансферрина плазмы крови крыс.
5.1. Выделение трансферрина.
5.2. Оценка гомогенности препаратов трансферрина
5.3. Получение и характеристика антител к Тс
Глава б. Характеристика полирибосом печени, синтезирующих трансферрин
6.1. Общая характеристика полирибосом крысы
6.2. 14шунохимическая идентификация Тф-синтезирующих полирибосом печени крысы
Глава 7, . Информационная РНК трансферрина.
7.1. Выделение мРНК трансферрина.
7.2. Гомогенность и размеры молекулы Тф-мРНК
7.3. Размеры поли/А/-последовательностей в мРНК трансферрина.
7.4. Вторичная структура трансферриновой мРНК
7.5. функциональная характеристика мРНК трансферрина
7.5.1. Характеристика продукта бесклеточной трансляции Тф-мРНК.
7.5.2. Влияние рзЛ на трансляцию мРНК трансферрина
7.5.3. Синтез и характеристика ДНК, комплементарной мРНК трансферрина.
7.6. Кинетика гибрцдизации кДНК с различными фракциями РНК.III
Глава 8. Клонирование кДНК трансферрина крысы
8.1. Синтез рекомбинантных ДНК, содержащих последовательности Тф-кДНК
8.2. Рестрикционный анализ рекомбинантных плазмид
8.3. Идентификация Тф-мРНК блотинг-гибридизацией с ник-транслированной ДНК плазмид pRTf
8.4. Трансляция Тф-мРНК, выделенной гибридизацией с рекомбинантными ДНК.
ОБСЗОЯДЕНРЗЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.
ВЫВОД!.
СПИСОК ВДТИРУЕШЙ ЛИТЕРАТУРЫ.
СШЮОК 11РИНЯТЧХ СОКРАЩАЙ кДНК - комплементарная ДНК п.н, - пара нуклеотидов поли/А/ - полиадениловая кислота поли(U) - полиуридиловая кислота т.п.н, - тысяча пар нуклеотидов
ТйлЕД - тетраметилэтилендиамин
Теп - транс феррин
ТХУ - трихлоруксусная кислота
ЭДТА - этилецциаминтетраацетат
Рекомендованный список диссертаций по специальности «Биохимия», 03.00.04 шифр ВАК
Влияние гидрокортизона на синтез мРНК, кодирующей тирозинаминотрансферазу в печени крыс1984 год, кандидат биологических наук Блинова, Наталия Николаевна
Получение и характеристика клонотеки к ДНК хрусталика глаза лягушки и идентификация клонов, кодирующих полипептиды бета-кристаллинов1998 год, кандидат биологических наук Козлов, Константин Андреевич
Клонирование и характеристика мРНК, содержащей повторяющийся элемент В2 и богато представленной в печени мыши1984 год, кандидат биологических наук Иванов, Павел Леонидович
Структурная организация и особенности экспрессии генов CPLX2 и MAP1B, активно функционирующих в мозге человека2007 год, кандидат биологических наук Раевская, Наталья Михайловна
Внутриклеточная локализация полирибосом, синтезирующих полипептиды комплекса цитохромов bc11983 год, кандидат биологических наук Денежкина, Валентина Васильевна
Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Изучение биосинтеза трансферрина в печени крыс»
Трансферрин /Тф/ - это белок плазмы крови позвоночных животных, играющий исключительно важную физиологическую роль. Способность Тф к обратимому связыванию железа лежит в основе его функций в транспорте железа в организме, Тф является донором железа для таких важных внутриклеточных гемопротеидов как гемоглобин, миоглобин, цитохромы, каталаза и др. Тф синтезируется, в основном, в печени млекопитающих, а у птиц белок, идентичный Тф по первичной структуре, кональбумин, синтезируется в эпителиальных клетках яйцевода и играет роль одного из преобладающих структурных компонентов яйца. Недостаточность Тф наследственной природы имеет следствием тяжелые нарушения кроветворения, функций печени и других внутренних органов.
Изучение молекулярной организации гена, кодирующего Тф, и механизмов его экспрессии до сих пор производилось, в основном, на яйцеводе птиц /125,43,93/. Лишь единичные работы, выполненные на млекопитающих, касаются биосинтеза Тф в интактной и перфузируемой печени /111,113/ и в бесклеточной системе /148/. В то же время детальные сведения о структуре гена Тф, его экспрессии и свойствах Тф-мРНК необходимы для понимания механизмов регуляции синтеза Тф в нормальном организме и недостаточности этого процесса при наследственных заболеваниях человека. Цели и задачи исследования:
Основной целью работы было изучение биосинтеза Тф в печени крысы. Предполагалось исследовать внутриклеточную топографию Тф-синтезирующих полирибосом, предпринять попытку препаративного выделения Тф-мРНК, исследовать ее физико-химические и функциональные свойства и использовать Тф-мРНК как матрицу для синте
- 6 за комплементарной ДНК /вДНК/ в реакции обратной транскрипции. В конкретные задачи работы входило:
I/ выделить и охарактеризовать Тф из плазмы крови крыс и получить к нему моноспецифические антитела; 2/ произвести радиоиммунохимический анализ Тф-синтезирующих полирибосом печени крысы; 3/ выделить препаративно очищенную Тф-мРНК с использованием метода непрямой иммунопреципитации полирибосом с антителами к ТФ»
4/ охарактеризовать физико-химические свойства Тф-мРНК /степень гомогенности препарата, молекулярный вес, вторичную структуру, концевые группы/ и исследовать ее матричную активность в бесклеточном синтезе Тф и в реакции обратной, транскрипции;
5/ синтезировать однонитевую кДНК - обратный транскрипт Тф-мРНК и применить, ее как гибридизационный зонд для количественного определения стационарной концентрации Тф-мРНК в> печени крысы;
6/ произвести ферментативный синтез двухцёпочечной Тф-кДНК, интегрировать ее в плазмиду рВИ 3'22 и получить коллекцию трансформированных клонов Е„соИ,. несущих рекомбинантные плазмиды со вставками различных сегментов синтетического структурного гена Тф. Научная новизна работы:
В работе впервые охарактеризованы Тф-синтезирующие полирибосомы печени крысы и показано, что Тф синтезируется на мембра-носвязанных полирибосомах. Впервые выделена гомогенная Тф-мРНК млекопитающих, охарактеризован первичный продукт ее бесклеточной трансляции, определены ее молекулярная масса, размеры 3»
- 7 концевых поли/А/-трактов и получена общая характеристика ее вторичной структуры. В реакции обратной транскрипции Тф-мРНК синтезирована одноцепочечная Тф-кДНК. Определена стационарная концентрация Тф-мРНК в печени крысы /6000-7000 молекул на клетку/. Произведен двухступенчатый синтез двухцепочечных Тф-кДНК путем обратной транскрипции Тф-мРНК и достройки второй нити ДНК с ДНК-полимеразой I. Получена коллекция клонов Е^соИ, несущих рекомбинантные плазмиды - дериваты 322 со вставками, соответствующими различным сегментам структурного гена Тф.
Научно-практическое значение полученных результатов:
Основным итогом работы является препаративное выделение препарата Тф-мРНК, гомогенной по ряду независимых критериев, а также - синтез кДНК - обратного транскрипта Тф-мРНК, и клонирование двухцепочечной кДНК в бактериальных клетках. Препарат высокоочищенной и функционально активной Тф-мРНК может быть использован для изучения реакций посттрансляционного созревания Тф в реконструированных бесклеточных системах. Наличие коллекции клонированных фрагментов структурного гена Тф является необходимой предпосылкой для дальнейшей работы по изучению молекулярной структуры и механизмов экспрессии гена 4
Тф в нормальных клетках печени и при наследственных заболеваниях, связанных с недостаточностью синтеза Тф. Структура диссертации:
Диссертация состоит из введения, обзора литературы /главы 1-3/, материалов и методов исследования /глава 4/, собственных исследований /главы 5-8/, обсуждения результатов и выводов. Иллюстрирована 30 рисунками и 8 таблицами. Список литературы содержит 184 наименования /20 - отечественных ж 164
Похожие диссертационные работы по специальности «Биохимия», 03.00.04 шифр ВАК
Изучение биосинтеза сывороточных белков в бесклеточных системах1984 год, кандидат биологических наук Тимченко, Любовь Тимофеевна
Рекомбинантный антиген эхинококка EgF: Получение и свойства2005 год, кандидат биологических наук Одоевская, Ирина Михайловна
Взаимодействие аденовирусных онкопротеинов с клеточным белком AUP1 человека2002 год, кандидат биологических наук Карпишева, Ксения Владимировна
Рибосомная супрессия и функционирование аппарата белкового синтеза у эукариот1984 год, доктор биологических наук Сургучев, Андрей Павлович
Поиск изоформы церулоплазмина человека, способной локализоваться в митохондриях2008 год, кандидат биологических наук Клотченко, Сергей Анатольевич
Заключение диссертации по теме «Биохимия», Тимченко, Николай Александрович
Результаты работы Lee и др. /93/ были подтверждены экспериментами Perrin и др. /125/. Эти авторы показали, что последовательности, кодирующие Тф-мРНК, содержатся в трех фрагментах /"а", "ъ" и "с"/ геномной ДНК птиц, причем в пре/ делах транскрипционной единицы они расположены следующим образом: 5» - «ъ" - "с" - "а" -39. Методом гибридизации колоний с радиоактивной ДНК плазмиды pBR 322-Con I из трех независимо .
- 36 полученных библиотек генов птиц на А -векторе были выделены. клоны, несущие фрагменты "ъ" и "с" и часть фрагмента "а" гена Тф. В одном из этих клонов (.А С4-Соп I) обнаружена вставка, которая содержала 5*-последовательность мРНК с суммарной длиной 940 нуклеотидов. ДШ этого клона гибридизовали с Тф-мРНК в условиях образования н-петель, которые анализировали электронной микроскопией. Оказалось, что в гибриде ДНК фага Дс4-Со-п I с Тф-мРНК содержатся 6 интронов длиной 1306-125, 266-61, 1108-128, 134*35, 333*47 и 457*44 п.н. Семь экзонов, образующих гибриды с клонированным фрагментом, хромосомного гена Тф, имели длину 113*22, 174*20, 133*31, 197^6, 145*21, 84*19 и 107*12 п.н. Таким образом, область природного гена, определяющая структуру менее половины молекулы Тф-мРНК с ее 5*-конца, превышает эту величину в 5 раз. Такие же отношения между длиной экзонов и интронов найдены и для ряда других индивидуальных генов.
Исчерпывающая картина молекулярной организации птичьего гена Тф была создана после клонирования полного фрагмента ЕсоШ - хромосомного гена /43/, который по данным электронной микроскопии гибридов ДНК-мРНК содержит 14 экзонов и соответственно - 13 интронов, разделяющих эти экзоны. Совокупность всех результатов изучения клонированных фрагментов гена Тф свидетельствует о том, что ген Тф представлен 17-ю экзонами и содержит 16 интронов /рис.3/. Общая длина экзонов гена Тф, по данным группы СЛштЪоп составляет 2508*164 п.н. Эта величина хорошо согласуется с опубликованными в 1982 г. результатами определения полной первичной структуры Тф-мРНК из яйцевода птиц /80/. По этим данным, цепь Тф-мРНК состоит из 2376 нуклеотидов /не считая 3*-концевую полиаденилатную последовательность/.
Совокупность кодирующих сегментов гена Тгп локализована в
Рис;3 Молекулярная организация гена транеферрина птиц Масштаб сверху - т.п.н. Цифры 1-17 - экзоны, латинские буквы А-Р - интроны С по данным /43/5 пределах сегмента хромосомной ДНК протяженностью 10,3 т.п;ш! /между 5*-концом экзона I и 3*-концом экзона 17/.- Этот вывод подтверждается и данными определения размеров ядерных предшественников Тф-мРНК, которые показали, что самый протяженный предшественник имеет длину цепи 9900-10100 нуклеотидов /43/.
Изучение первичной структуры хромосомного гена Тф птиц в настоящее время только начато /43,80/. В литературе, имеются сведения о нуклеотидной последовательности экзона I, который кодирует 5*-нетранслируемую зону Тф-мРНК /от кепа до инициатор-ного АШ -кодона/, имеющую длину 76 нуклеотидов, а также -участок транслируемой зоны Тф-мРНК, определяющий почти всю сигнальную последовательность пре-Тф /14" кодонов из 19/. В общем: виде этот результат подтверждает гипотезу о том, что каждый эк-зон кодирует определенный функциональный или структурный домен
- 38 белкового продукта 'гена /19,47,43,142,167/. В частности, экзон I кодирует домен пре-Тф /сигнальную последовательность/, необходимый для векториального транспорта этого белка в клетке. Подобная ситуация описана таете для генов легких цепей иммуноглобулинов - 1-й экзон также кодирует 15 из 19 аминокислот сигнальной пре-последовательности /167,142/.
Таким образом, ген Тф птиц является одним из наиболее расщепленных генов, исследованных к настоящему времени. Он содержит 17 экзонов, характеризующихся незначительной протяженностью /50-200 н.п./. Интересно отметить,, что в интроне С обнаружена одна из умеренно повторяющихся последовательностей, рассеянных по геному птиц, которой приписываются возможные регуляторные функции в экспрессии генов /43/.
На рис¿4 представлена'схема молекулярной организации зрелой Тф-мРНК, построенная на основании результатов определения ее нуклеотидной последовательности /80/. О
500 1000 1500 2000 2500 « .« « | « |.« »
I » | » « I * » « » I « « « » I дис
Рис.4 Схема структуры зрелой мРНК трансферрина птиц /80/ Сверху масштаб - число нуклеотидов. Черная линия -транслируемая зона, заштрихованы 5»- и, 3»-нетранслиру-емые зоны
Тф-мРНК имеет длину цепи 2376 нуклеотидов, не считая поли/А/
7 с» тракта и инвертированного остатка т'о - компонента о -концевого кепа. На 3'-конце цепи Тф-мРНК имеется нетранслируемая последовательность незначительной длины /182 нуклеотида/, которая при прямом структурном анализе оказалась существенно короче, чем это предполагалось на основании сравнения длины цепи Тф-мРНК и молекулярного веса пре-Тф /39,92/. В з'-не-транслируемой зоне Тф-мРНК найдена каноническая последовательность ААиААА, локализованная на расстоянии 18 нуклеотидов от поли/А/ и играющая, как это предполагается, роль участка узнавания для поли/А/-полимеразы /80/. Длина 5'-нетранслируемой области Тф-мРНК составляет 76 нуклеотидов.
Таким образом, результаты изучения молекулярной архитектуры хромосомного гена Тф птиц показывают, что этот ген, подобно большинству исследованных эукариотических генов, имеет линейно-мозаичную структуру. Обращает на себя внимание множественность интронов и их существенная протяженность, превышающая в несколько раз суммарную длину кодирующих сегментов гена Тф. Такой тип структурной организации характерен и для ряда других структурных генов. Так, ген про- уЦ-коллагена цыпленка имеет общую протяженность 42 т.п.н. и содержит 50 интронов. Кодирующая последовательность этого гена представлена короткими экзонами /длина 45-108 п.н., чаще всего - 54 п.н./ /181/. Предполагается, что такой сложно организованный ген проколла-гена в эволюции сформировался в результате многократных дупликаций элементарной кодирующей единицы протяженностью 54 п.н. Большим количеством интронов характеризуется также хромосомный ген вителлогенина птиц и амфибий /172/. Сопоставление мозаичной структуры гена Тф и доменной организации самого Тй позволяет также предполагать, что ген Тф сформировался в результате дупликации гена-пред шественника в эволюции /80,177,178/ или даже - квадрипликации раннего гена-предшественника.
Суммарная длина экзонов гена Тф достигает примерно 25°/ его общей протяженности. Для некоторых других генов доля экзонов составляет лишь 5-10% общей длины единиц транскрипции, а основная масса ДНК этих единиц приходится на очень длинные ин-троны. К таким генам относятся овальбуминовый ген и ген, кодирующий дигидрофолатредуктазу /35/.
Изучение молекулярной организации гена Тф представляет интерес в связи с тем, что у птиц этот ген активно экспрессиру-ется в двух органах - в печени и в яйцеводе. Однако, эти два органа отличаются друг от друга как по степени экспрессии гена Тф, так и по регуляции его функциональной активности. В яйцеводе экспрессия гена Тф находится под строгим контролем эстро-генных гормонов, которые лишь незначительно стимулируют синтез Тф в печени. В то же время недостаточность железа индуцирует синтез Тф и накопление Тф-мРНК в гепатоцитах и не влияет практически на экспрессию гена Тф в яйцеводе /104,105/. Поэтому выяснение особенностей молекулярной организации гена Тф в двух тканях представляло бы существенный интерес для понимания молекулярных механизмов, осуществляющих тканеспецифический позитивный контроль экспрессии гена Тф. Однако, до настоящего времени не выявлены какие-либо особенности молекулярной организации генов Тф в геноме печени и яйцевода, по данным рестрикцийнного картирования ДНК этих органов, или сравнительного анализа молекулярных размеров Тф-мРНК.
В серии работ группы Chambón клонированный ген Тф птиц был использован в качестве модельного объекта для изучения осо
- 41 бенностей структурной организации 5* -фланкирующих районов эука-риотических генов и идентификации функционально существенных последовательностей этих районов, необходимых для адекватной инициации транскрипции.
Известно, что инициация транскрипции прокариотических генов происходит в результате связывания РНК-полимеразы с промо-торными последовательностями. Одна из них /блок Прибнова/ удалена на 10 нуклеотидов от точки начала синтеза РНК, другая -удалена на 35 нуклеотидов /129/. По-видимому, РНК-полимераза последовательно связывается с этими участками, причем ее комплекс с блоком Прибнова является более прочным и обеспечивает точность инициации.
В эукариотических клетках существуют три молекулярные формы ДНК-зависимых РНК-полимераз,- различающихся по матричной специфичности. РНК-полимераза I /или А/ транскрибирует гены рРНК, РНК-полимераза II /или В/ обеспечивает транскрипцию генов, кодирующих белки, т.е. синтез пре-мРНК. Наконец, РНК-полимераза III /или С/ транскрибирует гены тРНК, 5Б -рРНК и низкомолекулярных ядерных РНК /41/. В последние годы достигнуты существенные успехи в изучении структуры эукариотических промоторов и тонких механизмов, обеспечивающих специфичность инициации транскрипции. Этот прогресс обусловлен, во-первых, возможностью клонирования индивидуальных генов и их фланкирующих районов геномной ДНК и, во-вторых, созданием высокоэффективных систем бесклеточной транскрипции с участием РНК-полимераз II и III. Прежде всего, оказалось, что в 5»-фланкирующих областях большинства эукариотических генов, кодирующих белки и транскрибируемых РИК-полимеразой II, содержится универсальная АТ-богатая последовательность /прототипная последовательность ТАТАААА для
- 42 кодирующей нити/, которая получила название ТАТА-блок, или последовательность Хогнесса-Голдберга /35,169,175/. ТАТА-блок найден более чем в 60 изученных генах. Строго консервативным элементом этого блока является тетрануклеотид TATA, однако при попарном сравнении некоторых эукариотических генов, не тлеющих эволюционной или функциональной общности, могут быть выявлены и более протяженные участки гомологии. Так, в 5*-флан-кирующих районах гена Тф птиц и поздней транскрипционной единицы аденовируса 2 найдена общая 12-нуклеотидная последовательность 5 - ctataaaagggg -3 /175/. Эта последовательность, так же как и ТАТА-блоки других генов обнаруживается на расстоянии 25-30 п.н. в 5*-направлении от стартовой точки транскрипции, которая в первом приближении совпадает с началом 1-го экзона.
Второй консервативный элемент первичной структуры 5*-фланкирующих районов большинства изученных эукариотических генов - это так называемый САТ-блок, который удален от старта транскрипции на 70 нуклеотидов. Предполагается, что блоки CAT и TATA являются пространственно разобщенными элементами промотора для РНК-полимеразы II. При этом САТ-блок обеспечивает эффективное связывание РНК-полимеразы II, а ТАТА-блок необходим для точной инициации транскрипции. Основные данные, доказывающие необходимость ТАТА-последовательности для точной инициации транскрипции, были получены в опытах по бесклеточной транскрипции гена Тф птиц и некоторых других клонированных генов. В работе Wasylyk и др. /175/ была изучена сравнительно эффективность бесклеточной транскрипции и точность инициации транскрипции генов Тф, овальбумина и ранних и поздних областей генома аденовируса 2 '/Ad-2/. Оказалось, что ТАТА-последова-тельность необходима для специфической инициации, т.е. для
- 43 правильного выбора РНК-полимеразой II стартовой точки синтеза РНК. Эффективность транскрипции гена ТФ и поздней области Ай-2, содержащих 12-нуклеотидную общую ТАТА-последователь-ность, была одинаковой, тогда как ген овальбумина и ранняя область Act-2, не имеющие в ТАТА-блоке такой протяженной гомологичной зоны, транскрибировались менее эффективно. Относительно низкая эффективность транскрипции овальбуминового гена в бесклеточной системе представляет специальный интерес, т.к. в клетках яйцевода птиц при индукции эстрогенами именно этот ген транскрибируется с максимальной эффективностью.
С целью дальнейшего анализа роли ТАТА-блока в адекватной инициации транскрипции гена Тф были получены мутанты этого гена с изменениями структуры этой зоны. Прежде всего, был сконструирован мутант с точковой заменой Т—*G, так называемый "TAGA" -мутант /174/. С этой целью рестрикционный фрагмент Pst 5 - Pst б хромосомного гена Тф, несущий ТАТА-последователь-ность, субклонировали в однонитевом векторе fdl03 и затем гибридизовали с синтетическим Ii-членным олигодезоксинуклеоти-дом 5 - CTTTTCTAGAG, который играл роль праймера в реакции достройки второй нити с ДНК-полимеразой I. Этот праймер комплементарен ТАТА-последовательности клонированного фрагмента гена Тф за исключением остатка G в положении 9 праймера /подчеркнуто/. Полученную таким образом рекомбинантную молекулу, содержащую замену Т — G в одной из нитей, клонировали в E^coli. Клоны, несущие мутантную ta-GA -последовательность, отбирали по характеру расщепления ДНК рестриктазой ХЪа1, т.к. в результате замены Т —G в ТАТА-последовательности образовался участок узнавания для этой эндонуклеазы. При сравнительном анализе продуктов бесклеточной транскрипции нормального
- 44 фрагмента гена Тф и его taga -мутанта в бесклеточной системе с РНК-полимеразой II оказалось, что точковая замена Т * g в ТАТА-блоке резко снижает специфичность инициации транскрипции, которая для taga -мутанта составляла лишь Ъ% контрольной величины.
Резко выраженное влияние точковой замены Т—на взаимодействие ТАТА-блока с РНК-полимеразой может быть обусловлено двумя альтернативными механизмами действия этой мутации: I/ мутация изменяет первичную структуру ТАТА-блока, специфичность которой необходима для адекватной инициации транскрипции; 2/ мутация сопровождается изменением нуклеотидного состава ТАТА-блока, в частности, заменой АТ-пары на gc -пару, и увеличением вследствие этого стабильности дуплекса ДНК, что может затруднять ее локальное расплетение при связывании с РНК-полимеразой.
Для однозначного ответа на эти вопросы был сконструирован ТААА-мутант ps"fc5 - Pst6 -фрагмента клонированного гена Тф, транскрипция которого также была изучена в бесклеточной системе /173/.
Авторы исходили из того, что ТААА-мутация - это трансверсия, которая не сопровождается изменениями нуклеотидного состава соответствующего блока и какими-либо сдвигами в стабильности дуплексной ДНК по отношению к расплетающим воздействиям. Оказалось, что точность инициации транскрипции ТААА-мутанта в 2 раза ниже, чем для TAGA -мутанта. Таким образом, РНК-по-лимераза,узнает тленно первичную структуру ТАТА-блока, а не АТ-богатые участки, причем точковые нуклеотидные замены в этом блоке резко нарушают специфичность транскрипции. Результаты опытов с различными мутантами, несущими локальные делеции
1-4 нуклеотида/ в ТАТА-блоке, подтвердили этот вывод /табл.2/.
Обратите внимание, представленные выше научные тексты размещены для ознакомления и получены посредством распознавания оригинальных текстов диссертаций (OCR). В связи с чем, в них могут содержаться ошибки, связанные с несовершенством алгоритмов распознавания. В PDF файлах диссертаций и авторефератов, которые мы доставляем, подобных ошибок нет.