Изучение фармакологических свойств отечественного генно-инженерного инсулина-инсулмикс тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.00.25, кандидат биологических наук Митрушкин, Дмитрий Евгеньевич

• Митрушкин, Дмитрий Евгеньевич
• кандидат биологических наук
• 2005

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Митрушкин, Дмитрий Евгеньевич

Список используемых сокращений.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Вводная часть.

1.2. Биологические и физико-химические свойства инсулина.

1.3. Генетические конструкции для производства субстанции инсулина человека.

1.4. Лекарственные формы инсулина и их фармакодинамика и фармакокинетика.

1.5. Осложнения, сопровождающие инсулинотерапию.

1.6. Инсулиннезависимый сахарный диабет и амилоидогенез.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Изучение фармакологических свойств отечественного генно-инженерного инсулина-инсулмикс»

Актуальность проблемы. Сахарный диабет - хроническое заболевание, обусловленное абсолютной или относительной недостаточностью инсулина. Оно характеризующееся глубоким нарушением обмена углеводов с гипергликемией и глюкозурией, а также другими нарушениями обмена веществ в результате воздействия ряда генетических и внешних факторов [23].

Инсулин до настоящего времени служит радикальным, а в большинстве случаев единственным средством для поддержания жизни и трудоспособности больных сахарным диабетом (СД). До получения и внедрения инсулина в клинику в 1922-1923 гг. больных сахарным диабетом I типа (СД I типа) ждал летальный исход в течение одного-двух лет с начала заболевания, несмотря на применение самых изнурительных диет. Больные СД I типа нуждаются в пожизненной заместительной терапии препаратами инсулина. Прекращение в силу тех или иных причин регулярного введения инсулина ведет к быстрому развитию осложнений и скорой гибели больного.

В настоящее время СД по распространенности находится на 3-м месте после сердечно-сосудистых и онкологических заболеваний. По данным Всемирной организации здравоохранения, распространенность СД среди взрослого населения в большинстве регионов мира составляет 2-5 % и имеется тенденция увеличения количества больных почти в два раза каждые 15 лет [26, 43]. Несмотря на очевидный прогресс в области здравоохранения, численность инсу-линзависимых больных увеличивается с каждым годом и на текущий момент только в России составляет около 2 миллионов человек. Прогнозируемая продолжительность жизни у больных СД I типа укорачивается на треть.

Выделяют два основных типа СД: СД I типа (инсулинзависимый СД) и II типа (инсулиннезависимый СД). 20% больных сахарным диабетом — это больные СД I типа, 80%- СД II типа.

СД I типа (ИЗСД) характеризуется абсолютной инсулиновой недостаточностью из-за первичного аутоиммунного поражения Р-клеток островков Лангерганса поджелудочной железы (ПЖ), и терапия инсулином требуется для сохранения жизни больному.

В основе патогенеза СДII типа (ИНСД) лежит возрастающая со временем резистентность инсулинчувствительных органов к действию гормона, развивающаяся на фоне повышенного уровня эндогенного инсулина (гиперинсули-немии), сопровождающегося превалированием в организме внепанкреатиче-ских антагонистов инсулина (инсулиназы, глюкокортикоидов, адреналина и др.) [1, 9, 73]. В последние годы был достигнут существенный прогресс в понимании патогенеза СД II типа, связанный с установлением значения для этого процесса синтеза и накопления специфической разновидности амилоидного белка (амилина), играющего ключевую роль в поражении островковых клеток ПЖ [8, 129, 136, 137].

Основной проблемой для любого больного СД является развитие поздних многочисленных осложнений болезни, которые вызывают не только ухудшение качества жизни пациентов, но и раннюю инвалидизацию, и преждевременную смерть больных. Среди них, в первую очередь, выделяют микроангиопатии — нефропатию, вызывающую в конечном итоге развитие терминальной почечной недостаточности (поражение почек отмечается у каждого шестого больного СД) и ретинопатию, приводящую к необратимой потере зрения (степень риска развития слепоты у больных СД I типа в 10 раз превышает этот показатель для не страдающих СД лиц), а также преждевременное развитие атеросклероза, поражающего сосуды, что приводит к развитию инфарктов и инсультов. Риск развития ишемической болезни сердца у больных СД I типа в 2-3 раза выше, чем у здоровых лиц. Диабетическая нейропатия создает риск развития синдрома диабетической стопы и нарушает иннервацию жизненно важных внутренних органов, вызывая нарушение их функции. С СД связаны также прямые экономические издержки системы медицинского обслуживания и общества в целом, включая стоимость лекарственных средств, а также затраты из-за потери работоспособности и инвалидности [26,43].

В мировой практике накоплен 80-летний опыт применения инсулина, и пройден значительный путь по выделению и очистке инсулина, в результате чего он стал широко доступен для лечения больных СД.

До 1980 г. для терапии СД весь мир использовал только инсулин животного происхождения - крупного рогатого скота (КРС), свиней, а также полусинтетические инсулины, получаемые из свиного. С начала 1980-х годов внимание ведущих эндокринологов привлечено к биосинтетическим (генно-инженерным, рекомбинантным) инсулинам человека. Для их производства используются рекомбинантные штаммы-продуценты кишечной палочки или дрожжевых клеток. По структуре и биологическим свойствам эти инсулины идентичны панкреатическому инсулину человека. Они индуцируют минимальный уровень побочных реакций у больных СД в отличие от других видов инсулина, что дает возможность резко сократить частоту возникновения осложнений при проведении инсулинотерапии и ограничить инсулиновые аллергии и проявление резистентности к инсулину.

Создание препаратов отечественного генно-инженерного инсулина человека открывает новые возможности решения многих проблем диабетологии России и значительного уменьшения бюджетных затрат. В настоящее время в России созданы возможности производства в ограниченных масштабах лекарственных форм на основе высокоочищенного генно-инженерного инсулина человека, основным разработчиком которых является ГУ «Государственный институт кровезаменителей и медицинских препаратов» (ГУ «ГИКиМП»).

Цель исследования. Экспериментальное изучение фармакологических свойств новой отечественной лекарственной формы инсулина человека смешанного типа действия - Инсулмикс (30/70), изготовленной на основе высоко-очищенной генно-инженерной субстанции (производства ОАО «Национальные биотехнологии», Оболенск) в сравнении с зарубежным препаратом инсулина человека - Микстард 30 НМ, фирмы «Ново Нордиск», Дания.

Для достижения поставленной цели потребовалось решение следующих конкретных задач:

1. Сравнительное изучение фармакодинамики гипогликемического эффекта и фармакокинетики инсулинов смешанного типа действия путем определения содержания глюкозы и инсулина в крови кроликов до и через различные интервалы времени после введения исследуемых препаратов;

2. Оценка общетоксического действия:

- острой токсичности путем введения испытуемых препаратов однократно, белым мышам в различных дозах, значительно превышающих терапевтические, рекомендованные для человека;

- подострой токсичности путем введения испытуемых препаратов белым крысам в течение 30 дней и кроликам в течение 51 дня в различных дозах, значительно превышающих терапевтические, рекомендованные для человека;

- местнораздражающего действия посредством оценки местной реакции в участках парентерального введения препаратов экспериментальным животным и по реакции на инсталляцию препаратов инсулина в глаза кроликов.

3. Выявление срецифической токсичности:

- аллергизирующего действия в опытах анафилактического шока, гиперчувствительности «замедленного» типа (ГЗТ) и дегрануляции тучных клеток (РДТК);

- иммунотропного действия в опытах гиперчувствительности «замедленного» типа (ГЗТ) и по методу локального гемолиза Ерне и Нордина.

4. Разработка проекта Фармакопейной статьи предприятия и соответствующей нормативной документации на Инсулмикс (30/70).

Научная новизна работы. Автором впервые исследованы физико-химические и фармакологические свойства нового отечественного комбинированного препарата генно-инженерного инсулина человека - Инсулмикс (30/70) производства ГУ «ГИКиМП». Препарат содержит 30% нейтрального раствора инсулина (инсулин короткого действия) и 70% инсулин-протамина (инсулин пролонгированного действия).

В результате экспериментальных исследований выявлена адекватная специфическая сахароснижающая активность и безопасность отечественного лекарственного препарата, не уступающего по фармакологическим показателям зарубежной лекарственной форме генно-инженерного инсулина человека -Микстард 30 НМ. Показано, что Инсулмикс (30/70) и Микстард 30 НМ полностью биоэквивалентны и взаимозаменяемы. Ч» В подострых экспериментах на кроликах исследовано токсическое действие экзогенного препарата инсулина - Инсулмикс (30/70). На модели гиперин-сулинемии, индуцированной у животных высокими дозами экзогенного инсулина человека впервые показано, что при соответствующей компенсации гипогликемии одновременно вводимым раствором глюкозы предельные дозы экзогенного высокоочищенного генно-инженерного инсулина человека не вызывают патологических изменений в органах и тканях экспериментальных животных. С помощью специальных методов окрашивания показано отсутствие образования амилоидных отложений, прежде всего в межклеточном пространстве островков Лангерганса ПЖ.

Практическая значимость работы. Проведенные доклинические исследования показали высокий уровень специфического действия и безопасности препарата Инсулмикс (30/70). Эти данные открывают перспективы создания Ф комплекса отечественных лекарственных средств смешанного типа действия на основе генно-инженерного инсулина человека и их внедрения в клиническую практику. Полученные данные позволяют рекомендовать новый отечественный препарат инсулина человека Инсулмикс (30/70) для дальнейшего изучения в клинике. Материалы диссертации могут быть использованы для разработки новых и усовершенствования существующих методов доклинического испытания лекарственных препаратов инсулина человека.

Основные положения диссертационной работы, выносимые на защиту:

1. Результаты оценки фармакодинамики гипогликемического действия и фармакокинетики исследуемых образцов лекарственных форм инсулина. Введение препаратов вызывало длительное содержание инсулина в крови кроликов, заметное снижение концентрации глюкозы и длительное сохранение гипогликемического эффекта. Наблюдаемая пролонгация являлась адекватной продолжительностью гипогликемического эффекта на кроликах при введении смешанной формы инсулина (раствор плюс суспензия).

2. Данные изучения общетоксического действия испытуемых лекарственных форм инсулина. После однократного введения препаратов инсулина белым мышам в дозах, значительно превышающих терапевтические, погибло не более 12,5% животных, получавших большие дозы инсулина (100 МЕ/кг и выше). Введение испытуемых препаратов инсулина белым крысам в течение 30 дней и кроликам в течение 51 дня в дозах, существенно превышающих терапевтические, не оказывало влияния на динамику прироста массы тела, гематологический и биохимический состав крови и не вызывало патоморфологических изменений во внутренних органах.

3. Оценка местнораздражающего действия исследуемых препаратов инсулина. Исследования мест парентерального введения препаратов инсулина экспериментальным животным и реакции на инсталляцию инсулина в глаза кроликов свидетельствовали об отсутствии признаков воспаления после введения лекарственных форм инсулина человека.

4. Критерии оценки аллергизирующего и иммунотропного действия исследуемых препаратов инсулина. Введение исследуемых препаратов не вызывало анафилактического шока у морских свинок. Оба препарата в равной степени обуславливали развитие дегрануляции тучных клеток, феномена ГЗТ и существенно не влияли на индукцию АОК.

5. Полученные результаты сравнительной оценки биодоступности, биоэквивалентности и др. фармакологических свойств лекарственного препарата Ин-сулмикса (30/70) с препаратом Микстард 30 НМ свидетельствуют об идентичности исследуемых лекарственных форм инсулина. Это позволяет рассчитывать на эффективное использование препарата Инсулмикс (30/70) для индукции гипогликемического действия в организме человека и рекомендовать его для дальнейшего изучения в клинике.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы докладывались на отраслевой научной конференции ГУ «ГИКиМП» 2 октября 2003 г. и на внутриинститутской конференции молодых ученых ГУ «Научно-исследовательского института по изысканию новых антибиотиков им. Г.Ф. Гау-зе» в честь 50-летия института 14 декабря 2004 г.

Публикации. По результатам проведенных исследований опубликовано 3 печатные работы.

1. Митрушкин Д.Е., Новохатский А.С., Кондратьев B.C., Журавлева Е.Е. К вопросу о влиянии экзогенной гиперинсулинемии на амилоидогенез // Проблемы медицинской биотехнологии. Сб. материалов отраслевой научной конференции ГУ «ГИКиМП». М.: 2003. - С. 17-21.

2. Митрушкин Д.Е., Никулина Е.Е., Иванова М.Е., Черненко С.М. Доклиническое изучение лекарственной формы генно-инженерного инсулина человека — Инсулмикс (30/70) // XII Российский национальный конгресс «Человек и лекарство». Тезисы докладов. М., 2005. - С. 684.

3. Митрушкин Д.Е. Фармакологические свойства отечественного реком-бинантного человеческого инсулина смешанного типа действия - Инсулмикс (30/70) // Химико-фармацевтический журнал. - 2005.- т.39 (№5), с. 37-39.

Основная часть результатов получена автором самостоятельно. Химико-физические свойства препаратов инсулина исследованы сотрудниками ГУ «ГИКиМП» Мазовым М.Ю., Персановой JI.B., Костаковой Г.А. и Дубичевым А.Г. при участии автора. Вклад в работу соавторов отражен в публикациях по теме диссертации.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, собственных исследований, заключения, обсуждения, выводов и библиографического списка использованной литературы. Работа изложена на 114 страницах машинописного текста и включает 20 таблиц, 4 рисунка и 203 литературных источника.

Заключение диссертации по теме «Фармакология, клиническая фармакология», Митрушкин, Дмитрий Евгеньевич

ВЫВОДЫ

1. Новый отечественный лекарственный препарат генно-инженерного инсулина человека - Инсулмикс (30/70), разработанный ГУ «ГИКиМП», по физико-химическим показателям, показателям чистоты и биологической активности соответствует проекту Фармакопейной статьи предприятия и идентичен образцу аналогичного лекарственного препарата - Микстард 30 НМ, фирмы «Ново Нордиск», Дания.

2. Параметры фармакодинамики гипогликемического действия и фарма-кокинетики сравниваемых препаратов являются сопоставимыми.

3. При введении препаратов в дозах, значительно превышающих терапевтические, для выявления острой и подострой токсичности, Инсулмикс (30/70) не нарушает функциональное состояние жизненно важных внутренних органов, гематологические и биохимические показатели картины крови, а также не обладает местнораздражающим действием.

4. Препарат Инсулмикс (30/70) не обладает существенной аллергизирую-щей и иммунотропной активностью. Реакции анафилактического шока, ГЗТ, РДТК, метод локального гемолиза Ерне и Нордина не выявили влияния препарата на клеточный и гуморальный иммунитет.

5. Полученные данные в совокупности с имеющимися результатами физико-химического анализа позволяют сделать вывод о том, что созданная в ГУ «ГИКиМП» лекарственная форма генно-инженерного инсулина человека является биоэквивалентной аналогичному препарату зарубежного производства.

ГЛАВА 4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящей работе было проведено доклиническое изучение новой отечественной лекарственной формы генно-инженерного инсулина человека смешанного типа действия - Инсулмикс (30/70). Изучение показало, что по показателям биоэквивалентности и биодоступности (фармакодинамике специфического гипогликемического действия и фармакокинетике), безопасности, аллер-гизирующему и иммунотропному действию на кроликах, белых мышах, белых крысах и морских свинках исследуемый препарат не отличается от аналогичного коммерческого препарата Микстард 30 НМ фирмы «Ново Нордиск», Дания.

Динамика гипогликемического эффекта Инсулмикса (30/70) была подобна гипогликемическому эффекту, вызванному аналогичным препаратом сравнения Микстард 30 НМ. Фармакодинамические и фармакокинетические кривые Инсулмикс (30/70) и Микстард 30 НМ совпадают. Максимальный сахаросни-жаюший эффект и максимальное содержание инсулина в крови кроликов приходятся на 1,5 ч после введения препаратов, что является адекватной пролонгацией гипогликемического эффекта на введение смешанной лекарственной формы инсулина (раствор плюс суспензия) кроликам.

Токсикологические исследования Инсулмикса (30/70) в острых и субхронических опытах, показали безопасность препарата. Инсулмикс (30/70) введенный белым мышам однократно, совместно с глюкозой, не проявил острой токсичности. Препарат, вводимый белым крысам в течение 30 суток в дозах 20 и 100 ME на 1 кг массы животного, а также кроликам, в течение 51 дня в дозах 315 МЕ/кг, существенно превышающие терапевтические, под контролем введения глюкозы, не оказывал влияния на динамику массы тела, морфологический и биохимический состав крови.

Патоморфологическое исследование внутренних органов животных, получавших длительное время исследуемые образцы инсулина, свидетельствует об отсутствии признаков токсического действия нового лекарственного препарата инсулина человека - Инсулмикс (30/70).

Полученные данные свидетельствуют о высоком качестве исследуемой лекарственной формы рекомбинантного инсулина человека Инсулмикс (30/70), и в очередной раз показывают, что т.н. токсическое действие инсулина - это проявление его гипогликемического действия.

Аллергизирующие свойства Инсулмикс (30/70) в реакциях анафилаксиче-ского шока на морских свинках, ГЗТ типа на мышах и РДТК не выявлены. Иммунологическое изучение на линейных мышах (СВА) в реакциях ГЗТ и по методу локального гемолиза Ерне и Нордина показало, что препарат не оказывает существенного влияния на клеточный и гуморальный иммунный ответ.

Таким образом, полученные результаты исследований служат достаточным основанием для вывода, что исследуемый препарат удовлетворяет требованиям, предъявляемым к современным лекарственным препаратам на основе высоко-очищенной генно-инженерной субстанции инсулина человека.

Результаты экспериментального изучения смешанной лекарственной формы биосинтетического инсулина человека Инсулмикс (30/70) позволяют рекомендовать его для клинических испытаний. Более того, с учетом высокой воспроизводимости результатов, полного совпадения биологических и фармакологических свойств, физико-химических параметров и показателей качества в сравнении с зарубежным препаратом можно рассматривать отечественный препарат как воспроизведенный (генерик).

Проект Фармакопейной статьи предприятия и соответствующая нормативная документация на Инсулмикс (30/70) представлены в Государственный Фармакологический комитет МЗ России. Результаты доклинического испытания препарата Инсулмикс (30/70) рассмотрены Эндокринологической комиссией Государственного Фармакологического комитета. Препарат рекомендован для клинических испытаний.

Организация собственного производства препарата Инсулмикс (30/70) в России позволит сократить дорогостоящие закупки за рубежом рекомбинант-ных препаратов инсулина человека, в т.ч. Микстарда 30 НМ, и обеспечит отечественное здравоохранение жизненно важным лекарственным препаратом.

88

ОБСУЖДЕНИЕ

СД - наиболее распространенное и тяжелое хроническое заболевание. Число больных, находящихся на инсулиновой терапии, постоянно увеличивается, что связано с прогрессирующим ростом заболеваемости СД. По данным ВОЗ, количество больных СД в мире увеличивается ежегодно на 5-7 % и к 2025 г. число больных на планете достигнет 300 млн., и примерно половина из них будет нуждаться в инсулине. До настоящего времени основным антидиабетическим средством остается инсулин — гормон ПЖ человека и животных. Потребность России в инсулине составляет 300 кг в год, причем подавляющая его часть закупается за рубежом, что требует значительных валютных средств. Поскольку каждый больной обеспечивается бесплатным инсулином, наличие отечественного производства позволит не только получить независимость от западных поставщиков, но и существенно сократить бюджетные затраты.

Повышенный интерес к проблеме диабета обусловлен наметившейся тенденцией к учащению диагноза СД. Последнее объясняется как значительным улучшением диагностики, так и изменением образа жизни современного человека, влиянием психогенных и инфекционно-аллергических факторов.

Вопрос о классификации СД в различных ее вариантах продолжает оставаться дискуссионным. Предлагаемая классификация СД по И.Б. Хавину [77] построена на четком разграничении этиологических, патогенетических и клинических его особенностей с ориентацией лишь на имеющие диагностическое и лечебно-профилактическое значение.

Классификация СД по этиологии: психогенный, инфекционно-аллергический, «спонтанный»; по патогенезу: панкреатический (органический и функциональный), внепанкреатический; - по клинике: 1) явный - легкий, средней тяжести, тяжелый и осложненный; 2) латентный; 3) потенциальный.

Клинические особенности СД играют важную роль в оценке степени тяжести, прогноза и методов лечения СД.

Открытие инсулина и начало инсулинотерапии для коррекции углеводного обмена у больных СД - одно из величайших достижений медицины XX века. До получения инсулина больных ИЗСД ждала неминуемая смерть от диабетической комы в течение одного-двух лет от начала заболевания, несмотря на применение самых изнурительных диет. Как известно, инсулин впервые получили из ПЖ собаки Banting и Best в 1921 г., и уже в следующем году был выпущен первый фармацевтический препарат инсулина КРС фирмой «Эли Лил-ли», США, предназначенный для компенсации заболевания у больных СД. В последующие годы была доказана эффективность применения лекарственных препаратов инсулина для медикаментозной терапии больных СД, в связи с чем их промышленный выпуск был налажен многими фармацевтическими фирмами, основными из которых являются «Эли Лилли», США, «Ново Нордиск», Дания, «Хехст», Германия.

Исследования в течение 60 лет в области СД были, кроме всего прочего, направлены на то, чтобы найти инсулин с наименьшим иммуногенным действием. Высокоочищенный свиной и полусинтетический человеческий инсулины были значительным шагом вперед в этом направлении. Вместе с появлением возможности полного владения генетическими методами изготовления инсулина человека в 1980 г. эта исследовательская цель была окончательно достигнута. Генно-инженерные инсулины человека являются менее иммуногенными, чем высокоочищенные животные инсулины. Исследования показывают, что пациенты, принимающие инсулин человека, показали значительно более низкие значения титров антител. Доказана корреляция между наличием титров антиин-сулиновых антител и появлением более поздних осложнений. Именно поэтому диабетологи требуют для лечения диабетиков инсулин с наименьшим иммуногенным действием. Современные генно-инженерные инсулины человека полностью соответствуют этим требованиям.

Для многих пациентов, находящихся на инсулинотерапии, СД означает относительно стабильную ситуацию со случайными периодами ухудшающегося контроля сахара в крови. Имеются, однако, такие пациенты, у которых весьма трудно поддерживать нормальный уровень сахара. Постоянный самоконтроль, подборка дозы инсулина и соблюдение соответствующего образа жизни имеют для таких больных огромное значение, являясь критическими факторами при составлении терапевтического плана. Во многих случаях переход таких больных на генно-инженерные инсулиновые смеси приводит к улучшению обмена веществ. Факторами, которые при этом играют основную роль, являются: уменьшение секреции противорегулирующих, усложняющих действие инсулина гормонов и уменьшение осложнений, вызванных антигенностью инсулина.

За последние десятилетия появилось большое количество исследований по использованию смешанных типов инсулина для лечения СД. Показано, что смешанные генно-инженерные препараты инсулина человека способствуют снижению гликемии, гликозилированного гемоглобина, сокращению количества суточных инъекций, существенно не влияя на иммунологические реакции. Однако со временем клиницисты стали высказывать сомнения в целесообразности применения смешанных инсулинов при ИЗСД. В настоящее время некоторые клиники при лечении больных ИЗСД используют метод введения больному инсулина короткого действия и пролонгированного инсулина в виде двух отдельных инъекций с необходимым интервалом времени, считая, что это обеспечивает более гибкий контроль содержания сахара в крови. Тем не менее, большинство эндокринологов считает более правильным использование смешанных препаратов инсулина и при лечении больных ИНСД [112, 165, 203].

Лица, страдающие СД II типа, получают также несомненную пользу от лечения смесями инсулина, поскольку с помощью предлагаемых фиксированных смесей инсулинотерапия становится, особенно для диабетиков в преклонном возрасте, более простой и надежной. В случае еще имеющейся достаточной панкреатической секреции одна единственная инъекция в день дает больному СД II типа весьма удовлетворительный контроль углеводного обмена.

В связи с тем, что недостаточно очищенные инсулины животного происхождения часто вызывали «естественную» аллергическую реакцию организма и ряд более тяжелых последствий, в 1990 г. в России было свернуто существовавшее собственное производство дешевого инсулина животного происхождения. После этого она была вынуждена перейти на закупки у западных производителей генно-инженерного препарата, который полностью идентичен природному гормону человека. Пожалуй, единственным недостатком при получении инсулина человека является сложность производства. В настоящее время в России появилась возможность промышленного выпуска в ограниченном масштабе субстанции высокоочищенного рекомбинантного инсулина человека и на ее основе лекарственных форм инсулина, в частности - Инсулмикса (30/70). Оригинальная технология приготовления этой лекарственной формы была разработана в ГУ «ГИКиМП».

В настоящем исследовании представлены данные об экспериментальном изучении физико-химических и фармакологических свойств новой лекарственной формы генно-инженерного препарата - Инсулмикса (30/70).

При изучении физико-химических свойств субстанции препарата показано, что они соответствуют требованиям Европейской Фармакопеи. Субстанция стерильна и апирогенна. При анализе с помощью ВЭЖХ высокомолекулярные вещества присутствуют в допустимых количествах. Специфическая активность субстанции инсулина составляет не менее 27,5 МЕ/мл.

Создание новых лекарственных препаратов предполагает обязательное проведение фармакокинетических исследований: изучения скоростей и механизмов процессов, происходящих с введением в организм биологически активных, в частности лекарственных, соединений [47]. Известно, что фармакокине-тические исследования проводятся на разных этапах получения лекарственных средств: на стадии предклинического изучения на экспериментальных животных, при первичных и расширенных клинических испытаниях, а также после внедрения лекарства в практическую медицину.

По фармакокинетическим данным, полученными нами в эксперименте, Инсулмикс (30/70) так же, как и Микстард 30 НМ, при подкожном введении кроликам достаточно долго сохранялся в крови, что соответствует литературным данным по экспериментальному изучению препаратов инсулина человека [100а, 125, 202].

За годы применения генно-инженерного инсулина человека накоплены обширные данные, свидетельствующие о практическом отсутствии токсичности лекарственных препаратов на основе рекомбинантого инсулина человека.

Изучение общетоксического действия позволяет решать следующие задачи:

- определить переносимые и токсические дозы фармакологического вещества;

- выявить наиболее чувствительные к изучаемому фармакологическому веществу органы и системы организма, характер и степень патологических изменений в них, а также исследовать обратимость вызываемых повреждений;

- изучить зависимость токсических эффектов от дозы и длительности применения фармакологического вещества.

Наше экспериментальное изучение острой токсичности на белых мышах не выявило отличий между Инсулмиксом (30/70) и Микстардом 30 НМ.

Введение Инсулмикса (30/70) белым крысам в дозах, значительно превышающих терапевтические, в течение 30 дней, не оказывало влияния на общее состояние и поведение животных, массу тела, гематологические и биохимические показатели крови и объем мочи крыс. При патоморфологическом исследовании сердца, легких, печени, почек, надпочечников, селезенки, ПЖ, кожи и подкожной клетчатки не было отмечено нарушения гистологического строения этих органов и развития воспалительных и дистрофических процессов. Полученные экспериментальные данные по изучению субхронической токсичности совпадали с данными Gamst-Andersen Н. et al. [123].

В последнее десятилетие был достигнут существенный прогресс в понимании ИНСД и роли в этом заболевании амилоидного перерождения островков Лангерганса ПЖ, происходящего, в первую очередь, от эндогенной гиперинсу-линемии и гипергликемии, которые играют ключевую роль в поражении |3-клеток. Нами был поставлен вопрос - вызывает ли длительное введение больших доз экзогенного инсулина амилоидное перерождение внутренних органов биологической модели, включая Р-клетки островков Лангерганса ПЖ. С целью подбора оптимальной биомодели для проведения эксперимента, по литературным данным, был изучен аминокислотный состав амилина (амилоидного полипептида), состоящего из 37 аминокислотных остатков. Было выяснено, что за агрегацию амилоидных фибрилл ответственен участок 21-30. Однако у крыс и мышей, являющихся общепринятыми моделями для изучения токсичности инсулина, связанный с диабетом клеточный амилоидоз не развивается в силу особенностей генетики. Аминокислотный состав амилина не позволяет амилоидным фибриллам агрегировать, приводя к образованию амилоидных отложений [89, 97, 108, 166]. Поскольку по аминокислотному составу к амилоидному пептиду человека наиболее близки амилин обезьян,' кошек, собак, и менее кроликов, в качестве оптимальной биологической модели для проведения эксперимента были выбраны кролики.

Инъекции инсулина в дозах, существенно превышающих терапевтические, рекомендованные для человека, под контролем глюкозы, в течение 51 дня, не привели к патоморфологическим нарушениям во внутренних органах, в т.ч. к накоплению амилоидных масс. Это позволяет сделать вывод о том, что подо-строе введение больших доз экзогенного инсулина человека не вызывает пато-морфологических изменений во внутренних органах, в. т.ч. образования отложений амилоидных масс.

Инсулмикс (30/70) не обладал местнораздражающим действием при закапывании в конъюнктивальный мешок глаз кроликов, не вызывал раздражения мест введения (кожа, подкожная клетчатка) у подобных животных и содержание бактериальных эндотоксинов в препарате соответствовало требованиям проекта Фармакопейной статьи предприятия и Европейской Фармакопеи.

Инсулин является одним из существенных факторов организма, определяющих активность иммунной системы. Показано, что он способствует восстановлению Т-клеток селезенки у взрослых тимэктомированных мышей, стимулирует тимусзависимый иммунный ответ и др. [65].

Исследование анафилактогенной активности было проведено на морских свинках, альбиносах. Полученные экспериментальные данные показали, что Инсулмикс (30/70) и Микстард 30 НМ не способны вызывать анафилактический шок у морских свинок при введении в вышеуказанных дозах. При изучении реакции ГЗТ на мышах и РДТК не обнаружено различий между Инсулмик-сом (30/70), Микстардом 30 НМ и контролем.

При изучении влияния препаратов на развитие клеточного и гуморального иммунного ответа установлено, что Инсулмикс (30/70) и Микстард 30 НМ не вызывают сдвига индекса реакции в реакции ГЗТ и не стимулируют развитие гуморального ответа, индуцированного тимусзависимым антигеном - эритроцитами барана. Следовательно, испытуемые препараты не оказывали влияния на клеточный и гуморальный иммунный ответ.

Таким образом, проведенные экспериментальные исследования свидетельствуют о том, что новая отечественная лекарственная форма инсулина смешанного типа действия - Инсулмикс (30/70) - на основе высокоочищенной генно-инженерной субстанции инсулина человека обладает практически теми же физико-химическими и фармакологическими свойствами, что и зарубежный препарат сравнения - Микстард 30 НМ, Дания. Следовательно, Инсулмикс (30/70) по своим фармакологическим свойствам и безопасности соответствует международным требованиям к лекарственным препаратам на основе высоко-очищенного рекомбинантного инсулина человека.

Сочетание высокого специфического действия Инсулмикса (30/70) с отсутствием токсичности делает его перспективным для лечения больных СД.

95

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Митрушкин, Дмитрий Евгеньевич, 2005 год

1. Аметов А.С. Стратегии в области сахарного диабета: начало новой эры // Рус. мед. журнал. 1998. Т.6. - №12. - С. 752-756.

2. Анциферов М.Б., Майоров А.Ю., Ристич С., Дедов И.И., Сергеев А.В. Глюкодинамика и фармакокинетика аналога инсулина (Хумалонга) у больных инсулинзависимым сахарным диабетом // Клиническая фармакология и терапия. 1997. - 6(1). - С. 68-70.

3. Анциферов М.Б., Старостина Е.Г., Галстян Г.Р., Дедов И.И. Тактика лечения больных с инсулинзависимым сахарным диабетом: анализ существующих подходов, основные проблемы и пути их решения // Проблемы эндокринологии. 1994. - Т. 40. - №4. - С. 8-10.

4. Бабич П.А. О процессе образования инактивированного инсулина при терапевтической денатурации в водных растворах. Материалы 3-й научной конференции молодых ученых. М.: ВИЭЭ. - 1964. — С. 7.

5. Балаболкин М.И. Эндокринология. -М.: Медицина, 1989. С. 274-289.

6. Балаболкин М.И. Инсулин и его место в терапии сахарного диабета I и II типа // Проблемы эндокринологии. 1990. - Т. 36. - №4. - С. 63-68.

7. Балаболкин М.И. Диабетология. М.: Медицина, 2000. - С. 112-121, 155170, 482-503.

8. Баранов В.Г. Болезни эндокринной системы и обмена веществ. Л.: Мед-гиз, 1955.-С. 94-133.

9. Баскович Б.JI. Инсулиновые судороги у млекопитающих и птиц // Журнал эволюционной биохимии и физиологии. 1965 - Т.1. - №5. - С. 466476.

10. Беленький М.Л. Элементы количественной оценки фармакологического эффекта. Рига.: Изд. АН Латвийской ССР, 1959. С. 14-28.

11. Бергер М., Старостина Е.Г., Иоргенс В., Дедов И. Практика инсулинотерапии. Berlin, Springer-Verl., 1990. 365 с.

12. Вельбри С.К. Об аутоантителах при сахарном диабете // Проблемы эндокринологии. 1971. - Т. 17. - №1. - С. 44-47.

13. Веретенников С.В., Трусов В.В., Дмитриев А.А. и др. Иммунологические аспекты длительнотекущего инсулинзависимого сахарного диабета // Казанский медицинский журнал. 1991. - Т.72. - №1. - С. 30-32.

14. Воробьев А.И., Городецкий В.М., Шулутко Е.М., Васильев С.А. Острая массивная кровопотеря. М.: ГЭОТАР-МЕД, 2001. С. 169.

15. Генес С.Г. Инсулин и углеводный обмен // Успехи современной биологии. 1949. - Т. 27. - №3. - С. 443-460.

16. Генес С.Г. Современные данные о механизме действия инсулина на обмен веществ // Успехи современной биологии. 1958. -Т.45. - Вып. 2. - С. 150167.

17. Генес С.Г. Об инсулинорезистентности // Клиническая медицина. 1960. -Т. 38-№7.-С. 27-35.

18. Герман С.В. Новый панкреатический полипептид амилин // Клиническая медицина. 1995. - Т.73. - №5. - С.7-11.

19. Государственная фармакопея СССР, 11-е издание. М.: Медицина, 1990.1. Вып. 2.-С. 181-183.

20. Гребенщиков Ю.Б., Машковский Ю.Ш. Физико-химические свойства, структура и функциональная активность инсулина: Биоорганическая химия / Итоги науки и техники. М.: ВИНИТИ АН СССР. - 1986. - №7. -С. 255.

21. Григорян А.В., Оганесян С.С. Гнойные заболевания и гангрена при сахарном диабете. Ереван: Айастан, 1979. С. 126.

22. Гроллман А. Клиническая эндокринология и ее физиологические основы. М.: Медицина, 1969. С. 300-301.

23. Дацюк А.С., Агапова Н.П., Забурьянова В.Ю. Причины инвалидности больных сахарным диабетом // Современные проблемы ВТЭ и социально-трудовой реабилитации: Тез. докл. научн. конф. Днепропетровск, 1986. -С. 44-45.

24. Дедов И.И., Фадеев В.В. Введение в диабетологию. Руководство для врачей. М.: «Берег», 1998. - С. 76-82, 125-131.

25. Древаль А.В. Клиника аллергических реакций на инсулин // Советская медицина.- 1977. №6. - С. 112-116.

26. Забаровская З.В. Основные принципы лечения инсулинзависимого сахарного диабета // Медицинские новости. 1999. - №8. - С. 25-29.

27. Западнюк И.П., Западнюк В.И., Захария Е.А., Западнюк Б.В. Лабораторные животные. Разведение, содержание, использование в эксперименте. — Киев: Вища школа, 1983. С. 38-50.

28. Зефирова Г.С. Антагонисты инсулина. Инсулинорезистентность. МЗ СССР. Центральный институт усовершенствования врачей. М. 1971.1. С. 13-17.

29. Ивасько Е.П., Новохатский А.С. Имеют ли будущее неинъекционные лекарственные формы инсулина? // Конгресс «Человек и лекарство». Москва, 1996.-С. 24.

30. Ильин B.C. Механизм действия инсулина. // Вестн. Акад. мед. наук СССР. 1969. - №8. - С. 3-15.

31. Камаева О.И. Амилин и амилоидоз островков поджелудочной железы, их значение в этиологии и патогенезе сахарного диабета II типа // Терапевтический архив. 1993. - Т. 65. - №10. - С. 14-17.

32. Каряев М.А. Взаимоотношения гемокоагуляции и липидного обмена у больных сахарным диабетом // Проблемы эндокринологии. 1983. - Т. 29. -№2.-С. 3-6.

33. Касаткина Э.П. Современные тенденции в терапии инсулинзависимой формы сахарного диабета // Проблемы эндокринологии. 1986. - Т.32,-№ 1.-С. 42-45.

34. Касаткина Э.П. Обучение больных принципам самоконтроля резерв повышения эффективности лечения сахарного диабета // Проблемы эндокринологии. -1989.-Т. 35-№5.-С. 55-59.

35. Касаткина Э.П., Демидова И.Ю. Вопросы компенсации инсулинзависимой формы сахарного диабета. // Проблемы эндокринологии. 1985. - Т.31. -№5.-С. 59-63.

36. Кеворков Н.Н., Гусев Е.Ю., Князев Ю.А. Влияние глюкагона и кратковременного голодания на взаимосвязь клеточного и гуморального иммунного ответа // Проблемы эндокринологии. 1991. -№6. — С. 54-55.

37. Кепрыш И.И. Роль инсулина в регуляции углеводного обмена. // Успехи физиологических наук. 1986. - Т. 17. - №1. - С. 36-49.

38. Клюшниченко В.Е., Якимов С.А. Генно-инженерный инсулин человека. ВЭЖХ в анализе основных продуктов основных стадий производства // Биоорганическая химия. 1992. - Т.18. - №2. - С. 1478-1486.

39. Козловская JI.B. Амилоидоз. // Терапевтический архив. 1998. - Т. 70.6.-С. 62-70.

40. Комитет экспертов ВОЗ по сахарному диабету (серия технических докладов, № 727). ВОЗ, Женева, 1987. - 126 с.

41. Коростин В.И., Белова В.В., Ивасько Е.П., Меркишева З.А., Новохатский А. С. Создание назальной лекарственной формы инсулина // Мат. IV научно-технической конф. ВНИИТКГП. Москва, 1991. - С. 159.

42. Кочергин П.М. Современные гормональные препараты из животного сырья. Научный обзор. М., 1983. С. 20-22.

43. Курляндский Б.А. и др. Методические рекомендации по изучению общетоксического действия фармакологических средств МЗ России от 29 декабря 1997 г.

44. Лакин К.М., Крылов Ю.Ф. Биотрансформация лекарственных веществ. М.: Медицина, 1981.-С. 140-146.

45. Лилли Р. Патогистологическая техника и практическая гистохимия. М.: «Мир», 1969. С. 476-480.

46. Лоскутова З.Ф. Виварий. М.: Медицина, 1980.-574 с.

47. Лужников Е.А., Вавилов М.П. Об острых отравлениях инсулином // Токсикологический вестник. 1997. - №2. - С. 8-11.

48. Любимов Б.И., Коваленко Л.П., Федосеева В.Н. и др. Оценка аллергизи-рующих свойств фармакологических средств МЗ РФ // Ведомости Фармакологического комитета. НЦМИ «Тимотек». - 1999. - №2. - С. 15-21.

49. Мазовецкий А.Г., Беликов Ю.К. Сахарный диабет. М.: Медицина, 1987. -С. 288.

50. Майоров А.Ю., Науменкова И.В. Современные сахароснижающие средства в лечении сахарного диабета П типа // Русский медицинский журнал. 2001. - Т.9. -№24.-С. 1105.

51. Малахов А.Г., Вишняков С.И. Биохимия сельскохозяйственных животных. М.: Колос, 1984. - С. 95.

52. Маргявичене Л.Э., Грибаускас П.С. и др. Состояние липидного обмена и активности кардиоспецифических ферментов при сахарном диабете // Проблемы эндокринологии. 1986. - Т.32 -№5. - С. 28-32.

53. Михайлова Н.В., Покрышкин В.И. Инсулин. Новые препараты. — М.: ЦБНТИмедпром, 1985. С. 8.

54. Молчанова А.А., Хруцкая Л.Д., Рыкова Н.А. К вопросу получения препаратов инсулин цинк - суспензии трех видов. Гормональные и органоте-рап. препараты в медицине. М. - 1971. — С. 108-115.

55. Мохорт Т.В., Романов Г.Н. Аналоги инсулина в терапии сахарного диабета // Здравоохранение. 2001. - №9. - С. 56-60.

56. Навашин С.М., Яроцкий С.В., Иванкин А.Н. Неклюдов А.Д. Инсулин человека: физико-химические свойства и получение (Обзор) // Антибиотики и химиотерапия. 1989. - Т. 33. - №9. - С. 701-709.

57. Недосува К.Т., Балаболкин М.И., Цагурия К.Т. Применение полусинтетических инсулинов человека при сахарном диабете // Советская медицина -1991.-№16.-С. 75-78.

58. Новохатский А.С., Михеева Т.Г., Батрак Е.Е., Ивасько Е.П., Кочетова Е.В. Иммунная специфичность и биологическое действие моноклональ-ных антител к инсулину и проинсулину // Мат. IV научно-технической конференции ВНИИТКГП. Москва, 1991. - с. 167.

59. Перелыгина А.А., Смирнова О.М., Лобанова A.M., Горелышева В.А. Применение препаратов человеческого инсулина при лечении больных инсулинзависимым сахарным диабетом. //

60. Проблемы эндокринологии. 1988. - Т. 34. - №1. -С.3-5.

61. Петриева Л.Я., Белокрылов Г.А., Софронов Б.Н. Действие инсулина на иммунную систему и разные формы иммуного ответа у мышей // Иммунология. 1982. - №2. - С. 41 -43.

62. Пирс Э. Гистохимия. М.: Издательство иностранной литературы, 1962. -С. 766-767.

63. Пляц О.М., Алексеев Ю.П. Определение титра антител к инсулину у больных с тяжелой формой сахарного диабета // Проблемы эндокринологии. 1977. Т. 23. - №3. - С. 12-14.

64. Пронин B.C. История изучения сахарного диабета // Проблемы эндокринологии. 1992. - №3. - С. 50-52.

65. Ренолд А., Уайнгред А. . Мембранная теория действия инсулина. В кн.: Диабет. Под редакцией Р. Уильямса. М.: Медицина, 1964. С. 113-129.

66. Ситников А.Г., Неугодова Н.П., Долгова Г.В., Йорданова-Пашевич А. ЛАЛ-тест периодический бюллетень для пользователей ЛАЛ-теста. М.: «Центр по биотехнологии, медицине и фармации» - август 2002.

67. Смирнова О.М. Инсулинотерапия и ее осложнения. // Проблемы эндокринологии. 1987. - Т.ЗЗ. - №6. - С. 40-44.

68. Старосельцева Л.К. Рецепторы инсулина и механизм действия инсулина в организме // Проблемы эндокринологии. 1974. - т. 10. - №5. - С. 108-113.

69. Талантов В.В. Сахарный диабет: вопросы профилактики и лечения. Казань, 1982.-С. 4-12.

70. Теппермен Дж., Теппермен X. Физиология обмена веществ и эндокринной системы. М.: Мир, 1989. - С. 432-525.

71. ФСП 42 0434306502. Инсулин человеческий (субстанция). ОАО «Национальные биотехнологии», Оболенск. 2004 г.

72. Хавин И.Б. О классификации сахарного диабета // Проблемы эндокринологии. 1985. - Т. 31. - №2. - С. 37-40.

73. Хаитов P.M., Гущин И.С., Пинегин Б.В., Зебрев А.И. Экспериментальное изучение иммунотропной активности фармакологических препаратов // Ведомости Фармакологического комитета. — НЦМИ «Тимотек». —1999. -№1.-С. 31-36.

74. Халеева Л.Д. Биофармацевтическая оценка инсулина, его производных и лекарственных форм // Фармацевтический журнал. 1983. -№4. - с. 31-33.

75. Холодов Л.Е., Глезер М.Г., Махарадзе Р.В. Фармакокинетика, фармако-динамика и биотрансформация антиаритмических препаратов. Тбилиси: Ганатлеба, 1988. - С. 81-91.

76. Холодова Е.А., Забаровская З.В. Современные методы инсулинотерапии сахарного диабета: Метод, рекомендации. МЗ РБ. Минск, 1991. — 21 с.

77. Шварц Л.С. Побочное действие инсулина // Клиническая медицина. -1969. Т.47. - №3. - С. 85-89.

78. Швачкин Ю. П. Проблемы и перспективы получения инсулина человека. -I Российский национальный конгресс "Человек и лекарство". Тезисы докладов. М., 1992.-С. 519.

79. Шишкин А.Н. Амилоидоз. // Новые Санкт-Петербургские врачебные ведомости. 2001. - №4. - С. 33-41.

80. Шишко П.И., Древаль А.В., Андрианова К.В. Готовые смеси препаратов человеческого инсулина в практике лечения сахарного диабета // Проблемы эндокринологии. 1995. - Т.41. - №4. -С. 17-18.

81. Юдаев Н.А., Афиногенова С.А., Булатова А.А. и др. Биохимия гормонов и гормональной регуляции. М.: Наука, 1976. С. 93-125.

82. Юдаев Н.А. Биохимические основы патогенеза сахарного диабета. Тер. Архив. -1977.-Т. 49.-№5.-С. 6-11.

83. Adams M.J., Blundell T.L., Dodson G.G. et al. Structure of rombohedral 2zinc insulin crystals // Nature. 1969. - Vol.224. - P. 491-495.

84. Albrandt K., Mull E., Cooper G.J., Johnson M.J. Nucleotide sequence of a cDNA for canine amylin // Biochimica et Biophysica Acta. 1992. - Vol.1130.- №1. -P.97-9.

85. Ando Т., Watanabe S. A new method for fractination of protamines and amino acid sequences of salmine and three components of iridine // International journal of protein research. 1969. - Vol.1. - P. 221-224.

86. Ashcroft S.J., Bassett J.M., Randle P.J. Insulin secretion mechanisms and glucose metabolism in isolated islets // Diabetes. 1972. - Vol.21. - Suppl. 2. -P. 538-545.

87. Badger J. Structure and selectivity of a monovalent cation-binding site in cubic insulin crystals // Biophysical Journal. 1994. - Vol.66. - P. 286-292.

88. Bentley G., Dodson G., Lewitova A. Rhombohedral insulin crystal transformation//Journal of molecular biology. 1978. - Vol.126.-P. 871-875.

89. Berger M., Cuppers H.J., Hegner H., Jorgens V., Berchtold P. Absorption kinetics and biologic effects of subcutaneously injected insulin preparations //

90. Diabetes Care. 1982. - №5 (2). - P. 77-91.

91. Berson S.A., Yallow R.S. Antigens in insulin: determinants of specificity of porcine insulin in man // Science. 1963. - Vol. 139. - № 3557. - P. 844.

92. Berson S.A., Yallow R.S. Quantitative aspects of the reaction between insulin and insulin-binding antibody. // Journal of clinical investigation. 1959. -Vol.38.-P. 1996.

93. Bodendorfer T.W., Brown M.E., Francel E.H. et al. Desensitization with human (recombinant DNA) insulin. // Drug intelligence and clinical pharmacology. 1985. - Vol.19. - №11. - P.827-829.

94. Bottermann P., Wahl G.K., Ermler R. et al. Pharmacokinetics of biosynthetic human insulin and characteristics of its effect // Diabetes Care. 1981. -Vol.4.-P. 168.

95. Bruck E., MacGillivray M.H. Posthypoglycemic hyperglycemia in diabetic children // The journal of pediatrics. 1974. - Vol.84. - P. 672-680.

96. Bruck E., MacGillivray M.H. Interaction of endogenous growth hormone, Cortisol, and catecholamines with blood glucose in children with brittle diabetes mellitus // Pediatric research. 1975. - Vol.9. - P. 535-541.

97. Brunfeldt K., Deckert T. The antigenic properties of pig insulin. // Acta endo-crinologica. 1964. - Vol.47. - P. 353-366.

98. Carpenter F.H., Chranbach A. Amid content of insulin fractions isolated by partition column chromatography and countercurrent distribution // Journal of biological chemistry. 1962. - Vol.237. - №2. - P. 404-408.

99. Castillo M.J., Scheen A.J., Lefebvre P.J. Amylin/islet amyloid polypeptide: biochemistry, physiology, patho-physiology // Diabete Metab. 1995. -Vol.21.-№1.-P. 3-25.

100. Cerasi E., Luft R. The prediabetic state, its nature and consequences a look toward the future // Diabetes. 1972. - Vol.21. - Suppl.2. - P. 685-694.

101. Chamovitz A., Ackerman M., Levine R., Green D., Galloway J. and Fireman P. Desensitization with human insulin for therapy of insulin allergy // Journal of allergy. 1983.-Vol.71.-№1.-P. 112.

102. Cuatrecasas P., Illiano G. Membrane Sialic Acid and Mechanism of insulin Action // Journal of biological chemistry. 1971. - Vol.246. - P. 4938.

103. Czech M. et al. Biochemical basis of fat cell insulin resistance in obese rodents and man // Metabolism. 1977. - Vol.26. - P. 1057-1078.

104. Czech M.P. The nature and regulation of insulin receptor: structure and function // Annual review of physiology. 1985. - Vol.47. - P. 357-381.

105. Davis S.N., Thompson C.J., Brown M.D. et al. A comparison of the pharmacokinetics and metabolic effects of human regular and NPH insulin mixtures // Diabetes research and clinical practice. -1991. Vol.13. - №1-2. - P. 107-117.

106. Donnel D. Etzwiler. Patient education recent events in the United States. - Amsterdam-Oxford-Princeton: EXCERPTAMEDICA, 1983.-P. 277-285.

107. Ebihara A., Kondo K., Ohashi K. et al. Comparative clinical pharmacology of human (Novo) and porcine insulin in normal subjects // Diabetes Care. 1983. - Vol.6. - Suppl. 1. - P. 17-19.

108. Esther I. Krug, Louise DeRiso, Mary Beth Tedesco et al. Glucodynamics and pharmacokinetics of 70/30 vs. 50/50 NPH/Regular insulin mixtures after subcutaneous injection // Diabetes Care. 2001. - Vol.24. - №9. - P. 1694-1695.

109. Everefi J. Changing from porcine to human insulin // Drugs. 1994, Vol. 47. -P. 286-296.

110. Fineberg SE, Galloway JA, Fineberg NS et al. Immunogenicity of recombinant DNA human insulin // Diabetologia. 1983. - Vol.25. - №6. - P. 465-469.

111. Fredericq E. Reversible dissociation of insulin // Nature. 1953. - Vol.171. -P. 570-571.

112. Fullerton W.W., Low B.W. Insulin crystallization in the presence of basic proteins and peptides // Biochimica et Biophysica Acta. 1970. - Vol.214.1. P.141-147.

113. Gale E., Tattersall R. Unrecognised nocturnal hypoglycaemia in insulin-treated diabetics // Lancet. 1979. - Vol.1. - P. 1049-1052.

114. Gamst-Andersen H. et al. Preclinical studies on insulin. Acute and subacute toxicity studies // Acta Pharmacol. Et toxicological. 1983. - Vol.52. - №4. -P. 261-267.

115. Gerich J.E. Insulin glargine: long-acting basal insulin analog for improved metabolic control // Current Medical Research and Opinion. 2004. - Vol.20. -№1.-P. 31-37.

116. Goeders L.A., Esposito L.A., Peterson M.E. Absorption kinetics of regular and isophane (NPH) insulin in the normal dog // Domest. Anim. Endocrinol. -1987. Vol.4. - №1. - P.43-50.

117. Gorden P., Hendricks C.M., Roth J. Circulating proinsulin-like component in % man: increased proportion in hypoinsulinemic states // Diabetologia. 1974.1. Vol.10.-P. 469-474.

118. Hagedorn H.C., Jensen D.N., Krarup N.B., Wodstrup I., Protamine insulinate // Journal of the American medical association. 1936. - №106. -P. 177-180.

119. Hartroft W.S., Wrenshall G.A. Correlation of beta-cell granulation with ex-tractable insulin of the pancreas; studies in adult human diabetics and nondia-betics // Diabetes. 1955. - Vol.4. - P. 1-7.

120. Hayden M.R. Islet amyloid, metabolic syndrome, and the natural progressive history of type 2 diabetes mellitus // J. of the Pancreas. 2002. - Vol.3. - №5. -P. 126-138.

121. The metabolism of insulin receptors: internalization, degradation and recycling // New York: Plenum Press. 1985. - P. 45-65.

122. Herman L., Sato Т., Hales C.N. The electron microscopic localization ofcations to pancreatic islets of Langerhans and their possible role in insulin secretion // Journal of ultrastructure research. 1973. - Vol. 42. - P. 298-310.

123. Hodgkin D.C. Varieties of insulin // Journal of endocrinology. 1974. -Vol.63.-P. 3-14.

124. Hodgkin D.C., Dodson E., Dodson G. et al. Insulin: Threedimensional structure // Biochemical society transaction. 1984. - Vol.11. - P. 411.

125. Hoenig M., Hall G., Ferguson D., Jordan K., Henson M., Johnson K., O'Brien T. A feline model of experimentally induced islet amyloidosis // American journal of pathology. 2000. - Vol.l 57. - №6. - P.2143-2150.

126. Hoppener J.W., Nieuwenhuis M.G., Vroom T.M., Ahren В., Lips C.J. Role of islet amyloid in type 2 diabetes mellitus: consequence or cause? // Mol Cell Endocrinol. 2002. - Vol.197. - №1-2. - P.205-212.

127. Hoppener J.W., Ahren В., Lips C.J. Islet amyloid and type 2 diabetes mellitus

128. The New England J. of Medicine. 2000. - Vol.343. - №6. - P. 411-419.

129. Jonson O.S., Human Insulin from Recombinant DNA Technology // Science.1983. Vol. 219. - №4585. - P. 632-637.

130. Jorgensen K.D., Wolffbrandt K.H., Weis Y.U.// Preclinical studies on human insulin. II. General Pharmacological Studies. Acta rystallization et Toxi-cologica. 1983. - Vol.52. - №4. - P. 268-272.

131. Kapumiotu A. Amyloidogenicity and cytotoxicity of islet amyloid polypeptide // Biopolymers. 2001. - Vol.60. - №6. - P.438-59.

132. Kasuga M. et al. Effects of fasting and refeeding of insulin receptors and glucose metabolism in rat adipocytes // Endocrinology. 1977. - Vol.100. - P. 1384-1390.

133. Katsoyannis P.G., Tometsko A. Insulin synthesis by recombination of A and В chains: a highly efficient method // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1966. -Vol.55.-№6.-P.1554-61.

134. Kedracka J., Hanzlik H. et al. Modem views on the secretion of insulin // Wiadomosci Lekarskie. 1976. - Vol.24. - P. 1435-1439.

135. Keen H, Glynne A, Pickup JC et al. Human insulin produced by recombinant DNA technology: safety and hypoglycaemic potency in healthy men // Lancet. 1980. - Vol.2. - №8191. -P. 398-401.

136. Kemmler W., Peterson J.D., Rubenstein A.H., Steiner D.F. The biosynthesis, intracellular transport and mechanism of conversion of proinsulin to insulin and C-peptide // Diabetes. 1972. - Vol.21. - Suppl.2. - P. 572-581.

137. Kisel M.K., Kulik L.N., Kholodova E.A., Zabarovskaya Z.V. Liposomes with phosphatidylethanol as a carrier for oral delivery of insulin: studies in the rat // International journal of pharmaceutics. 2001. - Vol.216. - P. 105-114.

138. Krayenbuhl C., Rosenberg Т., Cristalline protamine insulin. // Journal of biochemistry. 1946. - №23. - P. 60-73.

139. Kurtz JI.B., Gray R.S., Markanday S., Nabarro J.D.N. Circulated IgG antibody to protamine in patients treated with protamine-insulins // Diabetologia. 1983. -Vol.25.-P. 322-324.

140. Lacy P.E., Young D.A., Fink C.J. Studies on insulin secretion in vitro from isolated islets of the rat pancreas // Endocrinology. 1968. - Vol.83. - P. 11551161.

141. Lacy P.E. Electron microscopic identification of different cell types in the islets of Langerhans of the guinea pig, rat, rabbit and dog // Anatomical record. -1957. Vol.128. - P. 255-267.

142. Lacy P.E. Electron microscopy of the beta cell of the pancreas // The American journal of medicine. -1961. Vol.31. - P. 851-859.

143. Lacy P.E. Beta cell secretion from the standpoint of a pathobiologist // Diabetes. -1970.-Vol. 19.-P. 895-905.

144. Lacy P.E. Endocrine secretory mechanisms // A review. American journal of pathology. -1975. - Vol. 79. -P. 170-188.

145. Lambert A.E., Blondel В., Kanazawa Y. et al. Monolayer cell culture of neonatal rat pancreas light microscopy and evidence for immunoreactive insulin synthesis and release // Endocrinology. 1972. - Vol.90. - P. 239-248.

146. Langgraf R., Nusser J., Schener R., Fiedler A. et al. Metabolic control and effect on secondary complications of diabetes mellitus by pancreatic transplantation // Clinics in gastroenterology. 1989. - Vol.3. - P. 865-876.

147. Lin S., Chen L.H., Chien Y.W. Comparative pharmacokinetic and pharmacodynamic studies of human insulin and analogues in chronic diabetic Yucatan minipigs. // Journal of pharmacology and experimental therapeutics. 1998. — Vol.286. - №2. - P. 959-966.

148. Malaisse W.J., Malaisse-Lagae F. Uptake of 45-Calcium by isolated islets of Langerhans // Diabetes. 1970. - Vol.19. - Suppl.l - P. 365.

149. Matschinsky F.M., Landgraf R., Ellerman J. et al. Glucoreceptor mechanisms in islets of Langerhans // Diabetes. 1972.- Vol. 21. - Suppl.2. - P. 555-569.

150. Melani F., Rubenstein, Steiner D. Human serum proinsulin // Journal of clinical investigation. 1970. - Vol.49. - P. 497.

151. Misugi K., Howell S.L., Greider M.H., Lacy P.E., Sorenson G.D. The pancreatic beta cell. Demonstration with peroxidase-labeled antibody technique // Archives of pathology. 1970. - Vol.89. - P. 97-102.

152. Motoyama Т., Honma Т., Watanabe H., Honma S., Kumanishi Т., Abe S. Interleukin 6-producing malignant mesothelioma // Virchows Arch В Cell Pathol Incl Mol Pathol. 1993. - Vol.64. - №6. - P. 367-372.

153. Mudaliar S.R., Mohideen P., Baxi S.C. et al. Pharmacodynamic and pharmacokinetic properties of a premixed 85/15 human insulin preparation // Clinical therapeutics. 2001. - Vol.23. - №3. - P. 404-412.

154. Olefsky J. Effects of fasting on insulin binding, glucose transport, and glucose oxidation in isolated rat adipocytes: relationships between insulin receptors and insulin action // Journal of clinical investigation. 1976. - Vol.58. - P. 14501460.

155. Olefsky J. Insensitivity of large rat adipocytes to the antilipolytic effects of insulin // Journal of lipid research. 1977. - Vol.18. - P. 459-464.

156. Olefsky J., Kobayashi M. Mechanisms of fasting-induced increase in insulin binding to rat adipocytes // Journal of clinical investigation. 1978. - Vol.61. -P. 329-338.

157. Olefsky J.M., Reaven G.M. Effects of age and obesity on insulin binding to isolated adipocytes // Endocrinology. 1975. - Vol.96. - P. 1486-1498.

158. Olefsky J.M., Reaven G.M. Insulin binding in diabetes. Relationships with plasma insulin levels and insulin sensitivity // Diabetes. 1977. - Vol.26. - P. 680-688.

159. Orci L. Some aspects of the morphology of insulin-secreting cells // Acta his-tochemica. 1976. - T. 55. - №1. - P. 147-158.

160. Orci L., Amherdt M., Malaisse-Lagae F. et al. Insulin release by emiocytosis: demonstration with freeze-etching technique // Science. -1973. Vol. 179. - P. 82-84.

161. Orci L., Malaisse-Lagae F., Ravazzola M. et al. Exocytosis-endocytosis coupling in the pancreatic beta cell // Science. -1973. Vol. 181. - P. 561-562.

162. Pauling L., Cory R. Compound helical configurations of polypeptide chains:

163. Structure of proteins of the L-keratin type. Nature, 1953. - Vol.171. - P. 5961.

164. Pearson F.C. Pyrogens. Endotoxins, LAL Testing, and Depyrogenation. New York & Basel: Marcel Dekker, Inc, 1985. P. 361.

165. Pepys M.B. Pathogenesis, diagnosis and treatment of systemic amyloidosis. Philos Trans R Soc bond В Biol Sci. 2001 Feb 28; 356(1406):203-10.

166. Peters A., Klose O., Hefty R., Keck F., Kerner W. The influence of insulin antibodies on the pharmacokinetics of NPH insulin in patients with type I diabetes treated with human insulin // Diabetic Medicine. 1995. - Vol.12. - №10. - P. 925-930.

167. Petkov P., Galabova R., Manoly S.T. Electron microscopic investigations on the Langerhans islets of the golden hamster // Archivum histologicum Japoni-cum. 1970. - Vol.32. - P. 229-238.

168. Pickup J. Human insulin // British Medical Journal. 1986. -Vol.292. -№6514.-P. 155-156.

169. Ravis W.R. Comerci C., Ganjam V.K. Pharmacokinetics of insulin following intravenous and subcutaneous administration in canines. // Biopharmaceutics Drug Disposition. 1986. - Vol.7. - №5. - P. 407-420.

170. Rocken C., Shakespeare A. Pathology, diagnosis and pathogenesis of AA amyloidosis // Virchows Arch. 2002. - Vol.440. - №2. - P. 111-122.

171. Rocken C., Wieker K., Grote H.J., Muller G., Franke A., Roessner A. Rosai-Dorfman disease and generalized AA amyloidosis: a case report // Hum Pathol. 2000. - Vol.31. - №5. - P. 621-624.

172. Rubenstein A.H., Melani F., Pilkis S., Steiner D.F. Proinsulin. Secretion, metabolism, immunological and biological properties // Postgraduate medical Journal. 1969. - Vol.45. - P. 476-481.

173. Ryle A.P., Sanger F., Smith L.F., Kitoi R. The disulphide bonds of insulin // Biochemical journal. 1955. - Vol.60. - P. 541-556.

174. Sanchez M.B., Paolillo M., Chacon R.S., Camejo M. Protamine as cause of generalized allergic reactions to NPH insulin // Lancet. 1982. - Vol.1. - P.

175. Sanger F. Chemistry of insulin // Science. 1959. - Vol.129. - P. 1340-1344.

176. Schmitz O., Nyholm В., Juhl C.B., Lund S., Orskov L. Aspects of secretion and actions of amylin: interplay between amylin and other hormones // J Endocrinol Invest. 1999. - Vol.22. - Suppl. 5. - P. 33-36.

177. Scott D.A., Fisher A.M. Studies on insulin with protamine // Journal of pharmacology and experimental therapeutics. 1936. - Vol.58. - №1. — P. 78-92.

178. Shade D.S., Eaton R.P., Carlson G.A. et al. Future therapy of the insulin-dependent diabetic patient: the implantable insulin deliveri system // Diabetes Care. 1981. - Vol.4. - P. 319-324.

179. Simkin R.D., Cole S.A., Ozava H. et al. Precipitation and crystallization of insulin in presence of lysosyme and salmine // Biochimica et Biophysica Acta. -1970. Vol.200. - P. 385-394.

180. Skyler J.S. Insylin pharmacology // Medical clinics of North America. 1988. -Vol.72.-№6.-P. 1337-1354.

181. Somogyi M. Diabetogenic effect of hyperinsulinism // American journal of medicine. 1959.- Vol.26. - P. 192-198.

182. Somogyi M. Exacerbation of diabetes by excess insulin action // The American journal of medicine. 1959. - Vol.26. - №2. - P. 169-191.

183. Sorenson R.L., Steffes M.W., Lindall A.W. Subcellular localization of proinsu-lin to insulin conversion in isolated rat islets // Endocrinology. 1970. -Vol.86.-P. 88-96.

184. Steiner D.F., Clark J.L., Nolan C., Rubenstein A.H., Margoliash E., Aten В., Oyer P.E. Proinsulin and the biosynthesis of insulin. Recent progress in hormone research. 1969.- Vol.25. - P. 207-282.

185. Stern J., Johnson P.R., Greenwood M.R., Zucker L.M., Hirsch J. Insulin resistance and pancreatic insulin release in the genetically obese Zucker rat // Proceedings of the society for experimental biology and medicine. 1972. -Vol.139.-P. 66-69.

186. Teuscher A. Treatment of insulin lipoatrophy with monocomponent insulin // Diabetologia. 1974. - Vol.10. - P. 211-214.

187. Tidar B. The contribution of vibrational entropy to molecular association. The dimerization of insulin // Journal of molecular biology. 1994. - Vol.238. - P. 405-414.

188. Vance J.E., Bushanan V.D., Challoner D.R. et al. Effect of glucose concentration on insulin and glucagons release from isolated islets of Langerhans of the rat // Diabetes. 1968. - Vol.17. - P. 187-193.

189. Wallace M.S., Peterson M.E., Nichols C.E. Absorption kinetics of regular, iso-phane, and protamine zinc insulin in normal cats // Domest. Anim. Endocrinol. 1990. -Vol.7. - №4. - P. 509-15.

190. Woodworth J.R. Comparative pharmacokinetics and glucodynamics of two human insulin mixtures 70/30 and 50/50 insulin mixtures // Diabetes Care. -1994.-Vol. 17.-P. 366-371.