Изучение функциональной роли метилирования G966/C967 16S PPHK Escherichia coli тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.10, кандидат химических наук Прохорова, Ирина Валерьевна

• Прохорова, Ирина Валерьевна
• кандидат химических наук
• 2012

Оглавление диссертации кандидат химических наук Прохорова, Ирина Валерьевна

Содержание

Список сокращений

Введение

Обзор литературы

Регуляция трансляции на стадии инициации

Роль фактора IF3 в регуляции инициации трансляции

Регуляция инициации: «арест» 30S пре-инициаторного комплекса:

Регуляция инициации: «сопряженная» трансляция

Регуляция инициации на стадии образования 30S пре-инициаторного комплекса:

«конкуренция» за мРНК

Регуляция трансляции спектиномицинового оперона

Регуляция трансляции стрептомицинового оперона

Регуляция трансляции rplKAJL-rpoBC оперона

Регуляция трансляции белка S1

Регуляция трансляции белков бактериофагов

Адаптация бактерий к различным условиям посредством регуляции трансляции

РНК-термосенсоры: адаптация к холодовому шоку на стадии инициации трансляции.

РНК-термосенсоры: адаптация к тепловому шоку на стадии инициации трансляции.

Регуляция трансляции малыми некодирующими РНК

Регуляция системы токсин-антитоксин с помощью мнкРНК

Роль мнкРНК в активации различных метаболических путей и адаптации бактерий к

стрессовым условиям

Роль мнкРНК в регуляции экспрессии факторов вирулентности бактерий и передаче

межклеточных сигналов («quorum sensing»)

Взаимодействие рибосомы с РНК-полимеразой, аттенюация и анти терминация

транскрипции

Регуляция экспрессии S10 оперона, антитерминация транскрипции

Регуляция экспрессии белков биосинтеза аминокислот: аттенюация транскрипции. .46 Механизмы регуляции, основанные на остановке трансляции при связывании с

рибосомой низкомолекулярных кофакторов

Регуляция трансляции РНК рибопереключателями

Роль метилирования в регуляции трансляции

Роль метилирования 16S рРНК в регуляции трансляции на стадии инициации

Диметилирование остатков А1518, А1519 16S рРНК

Роль метилирования в поддержании структуры элементов рРНК: метилирование по

2'-ОН группе

Роль метилирования тРНК в поддержании рамки считывания

Метилирование как вторичная функция рРНК метилтрансфераз

Роль метилирования G966/C967 в 16S рРНК

Обсуждение результатов

Постановка задачи

Характеристика фенотипа мутантного штамма ArsmB/A.rsmD

Анализ холодочувствительного фенотипа штамма ArsmB/ArsmD

Влияние метилирования G966/C967 на белковый состав клетки

Влияние метилирования G966/C967 на регуляцию триптофанового оперона E.coli

Определение аффинности fMet-TPHKfMet к Р-участку 30S субчастиц дикого и

мутантного типов

Влияние метилирования G966/C967 на образование 30S инициаторных комплексов

Влияние метилирования G966/C967 на эффективность образования 70S 1С in vitro

Эффективность инициации трансляции в штаммах дикого и мутантного типа in vivo

Материалы и методы

Реактивы

Буферы и растворы

Конструирование штамма с двойной делецией генов rsmB/rsmD

Сравнение протеом штаммов дикого типа и мутантного ArsmBIArsmD

Идентификация белковых зон при помощи МАЛДИ масс спектрометрическим анализа.

Измерение точности инициации трансляции с помощью репортерных конструкций in

vivo

Создание плазмид pAra2AUG, pAra2GUG, pAra2UUG, pAra2CUG, pAra2AUU, pAra2TrpL, pAra2TrpL-trpE, pAra2TrpLtrpE2A несущих гены репортеров Flue, Rluc. 99 Трансформация штаммов дикого типа и мутантного ArsmB/ArsmD репортерными

конструкциями и измерение активности белков репортеров Flue, Rluc

Измерение количеств мРНК белков Flue, Rluc, экспрессированных в штаммах дикого типа и мутантного ArsmB/ArsmD, несущих плазмиды pAra2TrpL и pAra2TrpL-trpE,

методом RT-qPCR

Выделение суммарной РНК и проведение обратной транскрипции

Проведение количественного ПЦР анализа в реальном времени

Исследование рибосомных профилей из клеток дикого типа и мутантного

ArsmB/ArsmD, выращенных при 37°С и 18°С

Выделение рибосом из штаммов дикого типа и мутантного ArsmB/ArsmD

Получение препаратов мРНК

Детекция образования 70SIC, 30SIC и комплексов f[3H]Met-TPHKfMet с 30S

субчастицами при связывании на нироцеллюлозных фильтрах

Определение эффективности образования 30SIC методом RelE-принтинга

Анализ модификации рРНК с помощью реакции обратной транскрипции

Исследование этапов образования 30SIC методом «stopped flow»

Выводы

Список литературы

Список сокращений

мРНК - матричная РНК

тРНК - транспортная РНК

IF1, IF2, IF3 - факторы инициации 1, 2,

EF-Tu - фактор элогации Tu

EF-G - фактор элонгации G

RF1, RF2, RF3 - факторы терминации 1, 2,

RRF - фактор рециклирования

elFl - фактор инициации 1 эукариот

RNAP, a2ßß' - РНК-полимераза

РСА - рентгено-структурный анализ

н. - нуклеотиды

GTP - гуанозинтрифосфат

Pre-30S 1С - 3 OS пре-инициаторный комплекс

3OS 1С - 3OS инициаторный комплекс

70S 1С - 70S инициаторный комплекс

SAM - S-аденозилметионин

«stopped flow» - метод остановленного потока

RT-qPCR - обратная транскрипции с последующим количественным ПЦР анализом ИЭФ - изоэлектрофокусировка

МАЛДИ - матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация 5'-UTR - 5'-нетранслируемая область мРНК З'-UTR - З'-нетранслируемая область мРНК Kd - константа диссоциации

FRET - резонансный перенос энергии флуоресценции

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Изучение функциональной роли метилирования G966/C967 16S PPHK Escherichia coli»

Введение

Функциональные центры рибосомы, осуществляющей биосинтез белка, состоят преимущественно из остатков РНК. Во всех организмах рибосомные РНК содержат модифицированные нуклеотидные остатки. Кроме того, широко распространены модификации тРНК. Модификацию рРНК бактерий производят специализированные ферменты - рРНК-метилтрансферазы, псевдоуридинсинтазы, специфические практически для каждого из положений модифицированного остатка. Гены, кодирующие ферменты посттранскрипционной модификации, действующие на компоненты аппарата трансляции, составляют третью часть от всех генов, ассоциированных с трансляцией. Количество модифицированных нуклеотидных остатков увеличивается для эукариот по сравнению с прокариотами. Для них внесение модификаций осуществляют унифицированные ферменты, специфичность которых определяют малые ядерные РНК.

Несмотря на широкую известность и высокую консервативность многих модификаций строго определенная функция пока приписана только нескольким из более тридцати модификаций в рРНК Escherichia coli. Замена гена фермента на хромосоме бактерии приводит к отсутствию соответствующей модификации. На данный момент идентифицированы все гены, отвечающие за модификацию рРНК Escherichia coli за исключением гена одной рРНК-метилтрансферазы. Наличие штаммов, в каждом из которых инактивирован один из генов, отвечающих за образование определенного модифицированного нуклеотида, позволяет изучать роль соответствующих модификаций in vitro и in vivo. Существует несколько гипотез о роли модифицированных нуклеотидов, основные из них - это поддержание структуры рибосомы и тРНК и так называемая «настройка» работы рибосомы. Эти гипотезы не исключают друг друга, и скорее всего, будут дополнены новыми. Ни одна из модификаций не является строго необходимой для работы базовых стадий трансляции. Было показано, что 30S субчастица рибосомы, лишенная всех модификаций, сохраняет часть функциональной активности, в то время как 5OS субчастица, лишенная модификаций, полностью неактивна [1]. Ни один из генов модифицирующих ферментов бактерии Escherichia coli не является жизненно необходимым для клетки. Однако условия жизни бактерий в окружающей среде существенно отличаются от лабораторных условий. Таким образом, существует предположение, что наличие той или иной модификации может играть существенную роль в адаптации клетки к изменяющимся условиям. При этом за счет регуляции транскрипции и трансляции происходят изменения в экспрессии генов, необходимые для адаптации. Модификации рРНК и тРНК могут влиять на трансляцию не всех, но некоторых мРНК, что оказывается критическим в определенных условиях. Не менее

важна регуляция трансляции для поддержания нужных количеств и соотношений компонентов аппарата трансляции в клетке.

Обзор литературы

Рибосома осуществляет синтез белков во всех клетках, считывая информацию о последовательности аминокислот с матричной РНК. Этот процесс называется трансляцией. Уровень базовой трансляции в клетке может меняться в зависимости от условий окружающей среды, при этом рибосома участвует в регуляции экспрессии генов с помощью множества специфических механизмов. Регуляция трансляции вносит свой вклад в адаптацию клетки к внешним условиям. Для регуляции экспрессии генов рибосомы бактерий взаимодействуют с РНК-полимеразой, с различными белковыми факторами, низкомолекулярными веществами.

В процессе трансляции прокариот задействованы молекулы мРНК, тРНК, несущей аминокислоту, факторы инициации IF1, IF2, IF3, факторы элонгации EF-G и EF-Tu, факторы терминации RF1, RF2, RF3 и фактор рециклирования REF. Делеции генов большинства из этих факторов детальны для бактериальной клетки. На данный момент базовые принципы работы рибосомы на стадии инициации, элонгации и терминации трансляции изучены достаточно хорошо, тем не менее, не до конца выяснены многие аспекты ее работы в клетке. В частности, мало изучено, какова организация рибосом в полисомы, как аппарат трансляции адаптируется к недостатку питательных веществ и другим стрессовым условиям. Исследуется стратегии, с помощью которых бактериофаги, внедряющиеся в бактериальную клетку, переключают трансляцию с клеточных на фаговые мРНК, а также механизмы, использующиеся для корегуляции экспрессии всех компонентов трансляционного аппарата.

Регуляция работы рибосомы чаще всего осуществляется на стадии инициации трансляции. Эффективность инициации трансляции в свою очередь зависит от строения участка связывания с рибосомой на мРНК и от доступности этого участка для связывания с рибосомой. Образование вторичной и, в некоторых случаях, третичной структуры в мРНК происходит ко-транскрипционно, причем в бактериальной клетке трансляция может начаться, когда РНК-полимераза еще не закончила синтез мРНК. Таким образом, и РНК-полимераза, и рибосома могут влиять на сворачивание мРНК. Кроме того, вторичную структуру мРНК может изменять связывание белков, низкомолекулярных соединений, например свободной аминокислоты или антибиотика.

Для эффективного образования комплекса рибосомы с мРНК и тРНК во время инициации трансляции важны правильное позиционирование и геометрия дуплекса кодона мРНК с антикодоном тРНК. Окружение этого дуплекса в малой субчастице рибосомы преимущественно составляют остатки рибосомной РНК. Известно, что некоторые нуклеотидные остатки рРНК подвергаются посттранскрипционной

модификации. Они сосредоточены в функциональных центрах рибосомы, в том числе в участках связывания тРНК, Их роль на данный момент изучена слабо, известно, что некоторые из них участвуют в механизмах устойчивости клеток к антибиотикам» в то время как про функцию других практически ничего не известно. Не исключено участие модифицированных нуклеотидов и в регуляции трансляции. В данном обзоре будут рассмотрены механизмы регуляции трансляции, известные примеры влияния модификаций на различные этапы синтеза белка и их участия в регуляции синтеза белка.

Регуляция трансляции на стадии инициации

Среди трех этапов синтеза белка на рибосоме инициация трансляции больше всего подвержена регуляции. На стадии инициации происходит узнавание инициаторного AUG кодопа мРНК и образование 70S инициаторного комплекса (70S 1С) рибосомы с мРНК и инициаторноЙ íMet-TPHKfMct, связанной в Р-участкс рибосомы. На первом этапе образуется 30S пре-нпициаторный комплекс (pre-30S 1С), состоящий из 30S субчастицы, трех факторов IF1, IF2, IF3, мРНК и инициаторноЙ тРПК (рис. 1). Дуплекс между ко дон ом мРНК и антикодоном тРНК образуется не сразу, а в результате конформационных перестроек и аккомодации мРНК, При этом образуется 30S инициаторный комплекс (30S 1С), тРНК занимает так называемый P/I-участок, характерный только для стадии инициации [2]. На второй стадии присоединяется 50S субчастица, диссоциируют факторы инициации и образуется 70S инициаторный комплекс. тРНК занимает положение в классическом Р-участке, изменяется конформация 30S субчастицы и ее положение относительно 50S субчастицы [3]. В частности, «голова» 30S субчастицы переходит в «закрытую» конформацию, наклоняясь ближе к «телу» [4], Для протекания второй стадии необходим гидролиз GTP фактором 1F2.

элонгзция ТА р МИ НАЦИ Я

р«и,И;К.п.нрооа-нио_

Рис. I. Схема инициации трансляция прокариот. 30S субчастица рибосомы изображена желтым, 50S -темно-зеленым, факторы инициации [FL. JK2, 11-3 - синим, зеленым и голубым, соответственно, fívlet-TPHKfMel красным, мРНК - черным. Отмечены элементы 30S субчастицы: голова, тело, платформа, участок, содержащий последовательность анти-Шайн-Дальгарно, участок, связывающий мРНК («канал мРНК»), а также последовательность Шайн-Дальгарно и нницнаторный AUG кодон в мРНК [5].

Для мРНК прокариот характерно наличие двух элементов, обеспечивающих ее связывание с 30S 1С: это последовательность Шайн-Дальгарно и ннициаторный кодон. Они расположены в 5"-концевой области мРНК па расстоянии 4-7 нуклеотидов друг от друга. Последовательность Шайн-Дальгарно - это 4-8 нуклеотидов, комплементарных последовательности 3'-концевого домена 16S рРНК. Таким образом, образование дуплекса LI (айн-Дальгарно на стадии инициации обеспечивает высокую аффинность мРНК к рибосоме. Хотя известно, что инициация может идти и в отсутствие последовательности Шайн-Дальгарно, например для безлидерных мРНК или мРНК, содержащих участки узнавания белка S1. В качестве инициаторного кодона для бактерии Escherichia coli кроме AUG могут выступать также канонические GUG (17,3% генов), UUG (3,7% генов) и редко встречающиеся неканонические AUA, AUC, GUC, UUC, ACG, GUA. CUG. AUU кодопы (1-3% генов).

Роль фактора IF3 в регуляции инициации трансляции

Проверку геометрии кодон-антикодонового дуплекса осуществляет фактор инициации IF3 [6J, Он вызывает диссоциацию fMet-TPHKt-Mci при образовании пары отличной от Уотсон-Криковской в любом положении кодон-антикодоиового дуплекса кроме первого положения, где допускается образование U-U или G-U пары. Экспрессия гена этого фактора регулируется на стадии трансляции по механизму отрицательной обратной связи. мРНК, синтезирующаяся с гена infC, кодирует IF3 и имеет AUU ннициаторный кодон, таким образом фактор подавляет трансляцию собственной мРНК [7J. Подавление IF3 собственной трансляции кажется вполне обоснованным, поскольку большое количество IF3 в клетке привело бы к снижению уровня экспрессии ряда белков, чьи мРНК имеют неканонические инициаторные кодоны.

Положение IF3 па рибосоме определено методами РСА и криоэлектронной микроскопии (Рис. 2). Впервые определение структуры комплекса фактора с 30S субчастицей было произведено методом криоэлектронной микроскопии с разрешением 27Á [8]. С-копиевой домен был локализован в районе «платформы», а N-концсвой домен -в области «шеи» 30S субчастицы занимаемой также 50S субчастицей, что объясняет анти-ассоциирующую активность фактора (Рис. 2А).

Рис. 2. Положение 1РЗ на рибосоме. А. ЗОЙ су б частиц?-, изображена желтым, 1РЗ малиновым, инициаторная тРНК - зеленым, обозначены элементы ЗОЭ субчастицы: И - голова, п — «шея», р1 -«платформа», к — «плечо», а также С-конце вой и N-концевой домены 1РЗ С и N. соответственно [8]. Б. ЗОБ субчастнца изображена желтым, 1ГЗ оранжевым, инициаторная тРНК красным, 1К2 - зеленым, обозначены элементы ЗОЯ субчастицы; Ь - «голова», р! «платформа», sp - «шпора», Ь44 - спираль 44 [2]. С. 165 рРНК изображена серым. С-концевой домен ТРЗ красным, обозначен 1ГЗС, М-копцевой домен — синим, обозначен 1РЗЫ [9].

При кристаллизации комплекса ЗОЙ 1КЗ использовался только С-концевой домен фактора, были обнаружены его взаимодействия со спиралями 23, 26, 45 16Э рРНК и с белками 82. 87, 811, 818. Положение >4-концевого домена было смоделировало на основе биохимических данных [9], что выявило его контакты со спиралями 28, 29. 31. 34, 44 30$ субчастицы (Рис. 2С). Стоит отмстить, что при получении кристаллов комплекса использовался метод вымачивания кристаллов 308 субчастиц в растворе белка 113О. Известно, что в одной кристаллической ячейке две 308 субчастицы расположены таким образом, что «шпора?) одной субчастицы занимает положение тРНК в Р-участке другой субчастицы. Это могло повлиять па позиционирование ШЗС на «платформе» 308 субчастицы, поскольку он является РНК-связывающим белком и может связываться с РНК за счет неспецифических взаимодействий. Недавно было определено положение фактора !РЗ в составе 308 1С, включающего в себя также Ш1, 1Г2, мРНК и инициаторную тРНК [2]. Согласно этим данным С-концевой домен контактирует с петлей 790 спирали 24 в районе «платформы» 308 суб частицы, а Ы-конце вой домен - с «изгибом» инициаторной тРНК. Положение 1РЗ, определенное криоэл ектрош юй микроскопией, хорошо соотносится с данными о структуре комплекса малой 408 субчастицы рибосомы Те1гаИутепа 1ЬегторИИа с фактором е!р1, схожим по функциям с С-концевым доменом 1РЗ, полученной методом РСА {Рис. 3) [10]. е!Р1 был локализован внизу «платформы» 408 субчастицы (рис. ЗА), где он контактирует со спиралями 24 и 44 188 рРНК (нумерация

спирален А

рГ'НК бактерий

эукариот

Б

40S head

совпадает С

за

исключением

/

в. , . > р • - - Г elF1

"Л 4 feí' >/л

W

inRNA

Sh

h 44 Во

• >.;д\

b^Ât- , г

>- , mRttA

Ц 40$ body

4DS head

44. / *

V- * ■ - » A

* V' '23S rRNA И69

40S body

Рис. 3. Положение фактора elFI на 40S субчастице Tetrahymena thermophila. A. I8S рРНК изображена серым, рнбосомные белки светло-голубым, el F1 красным. Отмечены элементы 40S субчастицы: П -«голова», Ве - «клюй», Р - «платформа», Sh - «плечо», Во - «тело», Ii44 - спираль 44, расположение мРНК отмечено пунктиром. Б. Зеленым показано расположение тРНК в Л-. Р-, E-участках 40S субчастицы, полученное наложением со структурой комплекса 705 бактерии. elFI показан красным, мРНК желтым. С. Красным показано расположение спирали 69 23S рРНК относительно 40S субчастицы, полученное наложением со структурой комплекса 70S бактерии [10].

дополнительных элементов, отсутствующих в рРНК бактерий). С помощью наложения данной структуры па структуру комплекса 70S рибосомы с мРНК и тремя тРНК в А-, Р- и I'-участках было определено положение cIFt относительно молекулы тРНК в Р-участке и спирали 69 большой субчастицы рибосомы (рис. ЗБ, С, соответственно). Оказалось, что elFI может напрямую взаимодействовать с кодон-аитикодоновым дуплексом. Также обнаружилось, что положение фактора совпадает с положением спирали 69 большой субчастицы, и таким образом препятствует ассоциации субчастиц. Несмотря на многие отличия в процессах инициации прокариот и эукариот данные, полученные в этой работе, позволяют предположить механизм действия IF3. С-коннсвой домен IF3 в силу его расположения предотвращает связывание 50S субчастицы до тех пор, пока не образуется правильный 30S 1С. N-концевой домен IF3 инспектирует кон формацию тР11К в Р-участке, которая в свою очередь зависит от геометрии кодон-антикодонового дуплекса. Лишь при связывании инициаторной тРНК возможен переход к кон формации, способствующей диссоциации IF3 и связыванию 50S субчастицы.

Регуляция инициации: «арест» 30S пре-инициаторного комплекса;

Большая часть механизмов регуляции инициации трансляции осуществляется на стадии образования 30S пре-инициаторного комплекса (pre-30S ÍC). На этой стадии кодон мРНК еще не позиционирован в Р-участке рибосомы для образования дуплекса с антикодоиом тРНК, а сама мРНК еще не занимает «тоннеля» в 30S субчастице. мРНК связывается в районе «платформы» 30S субчастицы, где образуется дуплекс Шайп-Далъгарно. При этом

дуплекс стабилизируется на рибосоме за счет контактов с белком 82 (рис. 4А), а 3'-коицевая часть мРНК может сохранять элементы вторичной структуры [II]. При переходе к 308 инициаторному комплексу происходит расплетание вторичной структуры мРНК, позиционирование иншшаторного кодона и расположение мРНК вокруг «шеи» ЗОЭ субчастицы. Дуплекс Ш айн -Далъгарно удлиняется, поворачивается на 70° и изменяет свое положение па платформе 30Э субчастицы - теперь он взаимодействует с белком Й18 (рис. 4Б). Таким образом, до тех пор, пока мРНК не занимает сиос классическое местоположение на ЗОЯ субчастице, она является хорошей мишенью для связывания белков или различных метаболитов.

Б

IN НА

v — mRNA3

Ov

Mb " SoJùS

с»

ni

mrna 3

^ --4 ri /

& с

S*» 3QS

JCM> | rnRhAb

пита iv 308

Pnc, 4, Расположение мРНК на разны\ стадиях инициации трансляции [11]. Л. Окружение дуплекса Шайн-Далыарно в pre-30S [С: 30S субчастица и спираль 45 показаны серым, белок S2 светло-зеленым, дуплекс Шай н-Дал ьгар но и тРНК в Е-участке красным, тРНК в Р-участке оранжевым. Б. Схематическое изображение движения мРНК на стадиях инициации I - pre-30S [С, Il - 30S 1С. 111 - 70S 1С, IV элонгация. Положение мРНЬГ отмечено черным, 30S субчастица серым, последовательность анти-Шайн-Дальгарно красным, белки S2. S18 зеленым, тРНК в A-, Р-, Е-участках - желтым, оранжевым н красным, соответственно,

Па данный момент известны два механизма регуляции на стадии образования pre-3QS 1С. Первый сводится к конкуренции между 30S субчастицей и регуляторной молекулы за связывание с мРНК. При этом в комплексе мРНК с регулятором последовательность Шайн-Дальгарно вовлечена в образование вторичной структуры. Второй, так называемый «арест» pre-30S 1С, включает в себя образование неактивного pre-30S 1С в результате связывания с регулятором. Примером такого механизма является регуляция трансляции мРНК rpsO, кодирующая рибосомный белок S15. Было показано [12], что 5'-концевая часть rpsO мР1 IK может иметь две вторичные структуры: в одной из них, содержащей три шпильки, последовательность Шайн-Дальгарно участвует в образовании одной из шпилек и недоступна для связывания с 30S субчастицей. Альтернативная структура содержит

псевдоузел и может связываться с 30S субчастицей, поскольку последовательность Шайн-Дальгарно расположена в одноцепочечном участке мРНК. Псевдоузел стабилизируется при связывании белка S15, однако мРНК в этом случае образует неактивный 30S пре-инидиаторный комплекс. Структура такого комплекса была определена методом криоэлсктронной микроскопии (Рис. 5) [13]. Видно, что белок S15 связывается с одной стороны от псевдоузла мРНК rpsO и не имеет множественных контактов с 3ÛS субчастицей- что позволяет ему диссоциировать, когда рибосомных бе;|ков станет в недостатке относительно рРНК.

Рис. 5. Структура комплекса rpsO mPÍ IK с рибосомой. Домен 1 rp.sC) мр] IK изображен синим, псевдоузел

- красным, последовательность Шайн-Даль гарно - фиолетовым, AUG инициаторный кодон — голубым. Отмечены эЛшенты 30S субчастицы: спираль 26, h26, - бежевым, белки S2, Sil - желтым, черным и бледно-фиолетовым, соответственно, последовательность анти-Шайн-Дальгарно, aSD, - желтым, белок S15

- зеленым. Положение комплекса на платформе 30S субчастицы показано на панели справа; электронная плотность, соответствующая 30S субчастиие изображена синим, 50S - желтым [13].

После диссоциации рспрессора происходит расплетание вторичной структуры мРНК, позиционирование AUG инициаторного кодона в Р-участок 3ÜS субчастицы и переход к следующим стадиям инициации.

Стоит отмстить, что регуляция трансляции S15 мРНК для Thermits (hermophilus происходит по другому механизму, так называемой «конкуренции» между 16S рРНК и мр] 1К за взаимодействие с белком. В этом случае белок S15 стабилизирует образование в своей мРНК двух шпилек, одна из которых включает в себя последовательность Шайн-Дапыарно. В результате блокируется связывание мРИК с 30S субчастицей. Наличие различных механизмов у бактерий коррелирует с разной аффинностью S15 к мРНК: для

мРПК Escherichiii coli она существенно ниже, чем для мРНК Thermus ihermophilus. что обусловливает образование «арестованных» 3ÜS пре-ипициаторных комплексов.

Лрсст preoOS 1С осуществляется при контроле трансляции а-оперона бактерии Escherichia coli при участии белка S4. В этом опероне закодирован ряд рибосомных белков, а именно S13 (rpsM), Sil (rpsK), S4 (rpsD), LI7 (rpIQ), а также а-еубъединица PI IK-полимеразы (rpoA) (Рис. 6).

Рис. 6. Строение а-иперона бактерии Escherichia coli (www.ecocvc.com). Отмечены промотор транскрипции rpsMp] и терминатор, а так же гены rpaM. rpsK, rpsD, rpoA, rpIQ. кодирующие белки S13, S11, S4. а-субъединпца РНК-полимеразы и L17. соответственно.

В результате транскрипции синтезируется нолицистронпая мРНК, продукт трансляции третьего цистрона - белок S4 - является регулятором трансляции всего оперона. 5'-концевая часть мРНК образует псевдоузел и может иметь активную и неактивную форму. Причем в обеих формах мРНК последовательность Шайн-Дальгарно доступна для образования дуплекса. Было показано, что белок S4 связывается с неактивной формой мРНК и смещает равновесие между двумя формами в сторону неактивной формы [14]. Трансляция мРНК возможна лишь для активной формы, а при связывании 30S субчастицы с комплексом неактивной формы мРНК с S4 образуется нефункциональный пре-ининиаторный комплекс. Диссоциация S4 из pre-30S 1С происходит при добавлении неактивной формы мРНК или фрагмента последовательности 16S рРНК. связывающей этот белок в составе рибосомы, но не при добавлении активной формы мРНК.

Регуляция инициации: «сопряженная» трансляция.

Интересным является устройство оперона. кодирующего гены четырех белков, задействованных в трансляции: треонил-тРНК-синтегазы (fhrS), фактора инициации 3

(ш/С), рибосомных белков L35 (rpmf) и L20 (rplT) (Рис. 7).

Ч.1 и-

■i * i " Hit-.].

Ar) I 1

u'iil ! pml ш |ws ¡NsrR4!

Рис. 7. Строение оперона ihrS-'mfC-rpml-vplT бактерии Escherichia coli iuww.ec осу с. с um). Отмечены промоторы транскрипции tlirSp. int'Cp, infCp2. rpmlp. гр!Тр и терминатор, гены thrS, tnflC, rptol, rplT, кодирующие белки ThrRS, IF3, L35, L20, соответственно, а так же NsrR участок посадки репрессора транскрипции.

Помимо сложной регуляции на уровне транскрипции, экспрессия этих белков регулируется на уровне трансляции, по крайней мере па трех этапах: треопил-тРНК-синтетаза TUrRS ингибирует трансляцию своей собственной мРПК по механизму «конкуренции», так же как и рибосомный белок L20 регулирует трансляцию бицистронной мРНК, кодирующей L35 и L20. IF3 подавляет трансляцию своей мРНК за счет дискриминации неканонических инициаторных кодопов. как было описано выше. Для трансляции мРНК, кодирующей L35 и [.20, показано такое распространенное явление, как «сопряженная» трансляция [15J. При этом место посадки рибосомы для трансляции второго цистрона L2Q скрыто во вторичной структуре, оно становится доступным, когда рибосома, транслирующая первый цистрон L35, расплетает шпильку, образованную 3'-концейой частью первого цистрона и межцисгронной областью. В результате становится возможна инициация трансляции второго цистрона. При недостатке рРНК по отношению к рибосомным белкам L20 ингибирует трансляцию первого цистрона, как будет описано ниже, плотность посадки рибосом на мРНК уменьшается и увеличивается вероятность образования шпильки в мРНК, скрывающей участок для инициации трансляции L35. Таким образом, белок L20 регулирует экспрессию обоих генов, rpml и rplT.

Регуляция инициации на стадии образования 30S пре-ииициаторного комплекса: «конкуренция» за мРНК.

Механизм «конкуренции», характерный для 1,20. распространен среди оперонов, кодирующих рибосомные белки. При этом один из белков оперона связывается с мР1 IK, что препятствует образованию 3 0 S-пре-шшциато рн ого комплекса. Но модели, предложенной группой Номуры, это обусловлено схожей структурой мРНК и участком рРНК, взаимодействующим с данным белком в составе рибосомы. Для белка L20 известно два участка связывания с rpml-rplT мРНК. Их вторичная структура имеет общий элемент, который напоминает соединение спиралей 40. 4! в 23S рРНК, связывающие L20 в составе большой субчастицы рибосомы (Рис. 8. справа). Оператор rpml-rpYT мРНК, содержащий участки связывания L20. составляет 420 нуклеотидных остатков и занимает 220 н. в 3'-коацевой части inJC мРНК и межцистронную область infC-rpml, Методом химического пробинга была определена структура участков связывания L20 1 и 2, с помощью мутационного анализа была показана важность их образования для регуляции трансляции ш vivo [16]. II 1пилька S1 в кодирующей области injC взаимодействует с последовательностью мРНК в межцистронной области ir¡JC-rpmI (шпилька S2), образуя псевдоузсл (участок 1) (Рис. 8, слева). Участок связывания 2 (Рис. 8, по центру) расположен в межцистронной области за 9 н. от шпильки S2 в направлении 5'-конца

мРНК. Участок инициации rpml находится непосредственно за шпилькой S2 в направлении 3', причем последовательность Шайя-Дальгарно и инициаторный AUG кодом вовлечены в образование шпильки S3 и недоступны для связывания с 30S субчастицей. Таким образом, образование вторичной структуры мРНК, стабилизированной связыванием белка L20. препятствует инициации трансляции rpml-rplT мРНК. Когда внутриклеточная концентрация свободного белка L20 мала, данная вторичная структура не образуется и rpml-rp!Т мРНК может участвовать в образовании pre-30S 1С.

stem S3 а и и

. .U А

VgVaa

rprnf 1

заса jm

?аАл 4Ас stem S2

1ПТС330 AU»G

G-C

G- С —¿тсэ-io

A-U

C-G

ГР1С320 ¡J— /\

stem S1 g:¡¡

G-С C-G G-C G»U

A-U

in!C3'0- G~C

5' 3

3'

CU - "A ..5

ч ,, vbCu U

и Q >.850

UCC-G G-C

ÍIÍS1-Q-C

A-U yA-U

,ga- и

nfCs40 C-G

A- U - «wo

A-U

A-U

A-UG A-U 5' 3

A auc VjA

с

Ccu-A-^

G-c A°C

10М1-Л

U-A

c-Ga

g-c A-U

cc-g-G-C c-g c-g 5' 3'

AuOc

L20-mRNA

участок 1

H40-H41 спирали 23S rRNA

L20-mRNA

участок 2

Рис. 8, Вторичная структура участков связывания L20: I и 2 в составе rpml-rplT мРНК и спиралей 40, 41 в составе 50S субчастицы рибосомы. Шпильки 1 (S1), 2 (S2) и 3 (S3) отмечены светло-серым, темно-серым и зеленым, соответственно. Обозначена нумерация нуклеотидных остатков: in/C - в кодирующей области 1F3, iris - в межцистронной области infC-rpml, rpml - в кодирующей области L35. Последовательность Шайп-Далы арно цистрона rpml отмечена звездочками [17].

Конкуренция за связывание с rpml-rplT мРНК между белком [,20 и 3ÜS субчастицей рибосомы была показана методом ту-принтинга [17]. Однако остается неясной роль каждого из двух участков связывания L20 на rpml-rplT мРНК, при этом в комплексе на два связывающих участка приходится один белок L20 и эти участки также взаимодействуют между собой.

Хорошо изученным примером «конкуренции» белка-реп рессора и 30S субчастицы рибосомы за связывание с mPÍ ПС является регуляция трансляции треонил-тРНК-синтетазы ThrRS. Помимо функции аминоацилирования, ThrRS связывается со своей собственной мРНК и подавляет ее трансляцию. 5;-концсвая часть ThrRS мРНК содержит 4 домена,

домены 2 и 4 напоминают антикодоновый стебель тРНК, их петли содержат триплеты 1.1011 и СОи, имитирующие антикодон треопиловой тР11К (СОИ) (Рис. 8, А).

А домен 3 дамен 1

С

^ ^ домен 2 домен 4

Б

каталитические гимены

С-кониезь;с домены

Рис. Регуляция трансляции ТЬг85. Л. Схематическое изображение вторичной структуры !Иг5 мРНК. Отмечены домены 1-4 и последовательность Ш айн-Даль гарно 81). Модель связывания димера (показаны серым и зеленым) с двумя молекулами тРНК (показаны желтым) и двумя доменами 2 ¡Иг$ мРНК (показаны красным) [18], С. Модель комплекса 308 с доменом 2 (НгИ мРНК и белка ТЬтЯЗ, 168 рРНК изображена голубым, рибосом ные белки Синим, домен 2 ШгЯмРИК желтым, ТЬгИЗ зеленым, Ы-концевой домен Т11гК8 красным. Стерическое столкновение N-концевого домена ТЬгК5 и ЗОЯ субчастицы отмечено кружочком [191.

Методом РСА была исследована структура комплекса димера ТЬгК$ с доменом 2 г$ мРНК [18]. Гомодимер ТЬтЯБ связывает две молекулы домена 2 так же, как 2 молекулы треонил-тРНК при аминоацилировании. Как показано на рис. 8, Б, полученном при наложении данной структуры на структуру комплекса ТИгКЗ с тРНК, молекулы тРНК и домена 2 полностью совпадают в области антикодона тРНК и немного расходятся в антикодоновом стебле. Это обусловлено вторичной структурой домена 2, который, в отличие от антикодон ового стебля тРНК, имеет внутреннюю петлю, что возможно определяет более высокую аффинность домена 2 к белку по сравнению с тРНК. Если обратиться к структуре комплекса полученной методом

РСА [19], становится ясно, каким образом осуществляется механизм «конкуренции» между ТЬгЯЙ и ЗОЙ субчастицей, В данном комплексе домен 1 м РНК располагается Вокруг «шеи» ЗОЯ субчастицы, а шпилька домена 2 направлена перпендикулярно к поверхности «платформы», под углом в 110°С к дуплексу Шайн-Дальгарно. При моделировании расположения ТИгЯЙ относительно домена 2 оказалось, что М-концевой домен белка располагается в пространстве, занимаемом ЗОЙ субчастицей. Таким образом.

связывание ThrRS с мРИК стерически препятствует образованию ее комплекса с 30S субчастицей. Образование прочного комплекса ThrRS с мРПК приводит к деградации мРНК пуклеазами. Домен 4. по-видимому, необходим для улучшения аффинности мРНК к ThrRS, поскольку -этот белок функционирует в виде димера н содержит два связывающих участка. Ингибироваиие трансляции thrS мРНК происходит, когда количество треонил-тРНК-синтетазы превышает потребности клетки и появляется «свободный», не занятый аминоацилированием, ThrRS белок.

Регуляция трансляции спектииомицинового оперона.

Спектиномициновый одерон Escherichia cali кодирует 11 рнбосомиых белков и SecY субъединицу SecEGY-еекреторного комплекса. Свое название он получил, когда было обнаружено, что мутации в восьмом гене rpsE, кодирующем белок S5, придают клетке устойчивость к антибиотику спектиномицину [20].

....................................______________ ______i:.......................

Рис. 10. Строение с п ект и н о м и ци но во го оперона бактерии Escherichia cali (www.ccocvc.cphO. Отмечены гены rplN\ rpiX, rplE, rpsN, rpsH. rplF, rplR, prsE, rpinD, rplO, sec Y, rpmJ, колирующие белки Í.14, L24, L5. SI 4. SB, L6. LIS, S5, L30, L15, SecY, 1.36, соответственно, а также промотор транскрипции rplNp.

Регуляция синтеза белков оперона осуществляется с помощью нескольких механизмов. В экспериментах in vivo и in vitro было показано, что белок S8, закодированный пятым в оиероне, подавляет трансляцию при связывании с участком spe мРНК в 5'-направлении от третьего цистрона грШ. кодирующего белок L5 [2IJ. Это является еще одним примером «конкуренции» между белком и 30S субчастицей за мРНК. S8 взаимодействует со шпилькой в 5"-концевой области rplB, которая имеет схожую вторичную структуру со спиралью 21 — участком связывания белка с 16S рРНК (Рис. 11, А).

Шпилька в spe мРНК включает в себя инициаторный AUG кодом, препятствуя инициации трансляции, а связывание S8 способствует образованию шпильки. Структура фрагмента мРНК. содержащего данную шпильку, с белком S8 показала, что связывание S8 с мРНК происходит аналогично его связыванию с 16S рРНК, а наиболее важными являются взаимодействия белка с внутренней петлей (Рис. 11, Б) [22].

11ри недостатке рРНК по отношению к рибосомным белкам свободный белок S8 подавляет трансляцию всего оперона. Ингибироваиие трансляции цистронов, расположенных в направлении 3"-конца spe мРНК от грШ цистрона происходит координировано за счет «сопряженной» трансляции [23] по описанному выше механизму.

А

(ГрсчРн^ Б

с с

Л и

« с

ц 1

* Ц

а с

* и

и 1

Ы *. и-а

и

5 £ \

л и 1

е г. и * с и

и

" И 80

с. с

А И

А

Рис. 11. Связывание белка Э8 с 165 рРНК и яре мРНК. Л. Вторичная структура спирали 21 165 рРНК (слева) и фрагмента яре мРНК (справа). Инициаторный кодон мРНК отмечен красным, последовательность Шайн-Далыарно обозначена прямоугольной рамкой. Б. Наложение структуры комплекса 58-1121 (изображен оранжевым) со структурой комплекса 58 с фрагментом зре мРНК изображен синим, яре мРНК голубым). Отмечены С- и ТМ-коиец белка 58 (С и соответственно), а также нуклеотидные остатки зре мРНКа1,С47,С10.117 [22].

Но как же регулируется синтез двух первых цистронов грШ, гр1Х, кодирующих Ь14 и Ь24? Оказалось, что их синтез также зависит от концентрации 58. но опосредованно [241. При исследований эффектов дозы гена rp.sH на экспрессию 1Л4 и Ь24 было обнаружено сначала резкое снижение синтеза, а затем его восстановление почти до начального уровня. Анализ штаммов с термочувствительными нолинуклеотид-фосфорилазой и рибонуклеазой II показал увеличение количеств 1Л4 и Ь24. что говорит об участии в механизме регуляции рибонуклеаз. Авторами была предложена следующая схема (Рис. 12): при недостатке рРПК по отношению к рибосомным белкам свободный белок 58 стабилизирует образование шпильки перед цистроном гр!Е и тем самым ингибирует трансляцию его и всех остальных цистронов на З'-конце мРНК. В результате плотность посадки рибосом па этом участке мРНК сильно снижается и участок узнавания эндонуклеазой становится доступным; происходит разрезание мРНК, Последующее действие 3'-5* экзонуклеаз, в частности полинуклеотид-фосфорилазы и рибонуклеазы II, приводит к деградации всей мРНК, включая цистроны грШ и гр\Х. Восстановление уровня экспрессии И4 и Ь24. наблюдаемое в эксперименте по эффекту дозы гена, авторы объясняют частичной деградацией мРНК до шпильки, которая стабилизируется при накоплении белка 58. Так или иначе, эпдонуклеаза, участвующая в разрезании хре пока не была определена, и для детального описания данного механизма необходимы дополнительные исследования.

Участки посадки рибосомы

III!

о О • О

LS SI 4 SB LS

. Экзонуклоаза

1 tPNPat«, Я И» it Ш

Рис, 12. Регуляция трансляции spc мРПК [24] Регуляция трансляции стрептомицинового опсрона.

Стрсптомициновый onepoii Escherichia coli содержит гены rpsL, rpsG, fusA и Inf А, кодирующие рибосомиые белки S12. 87, а также факторы элонгации EF-G и EF-Tu, соответственно (Рис. 13). EF-Tu. единственный т этих белков, имеет еще одну копию в геноме Escherichia coli.

Рис. 13, Строение стрептомицинового оперона бактерии Escherichia coli (www.ecucvc.coml Отмечены гены rpsL. rpsG,fusA, tu/A, кодирующие йен к и S12, S7, EF-G; EF-Tu. соответственно, а также промотор транскрипции rpsLp,

Для стрептомицинового оперона также описана регуляция но механизму «конкуренции» и «сопряженная» трансляция. Было показано, что белок S7 связывается с межцистронной областью rpsL-rpsG мРНК, которая содержит несколько шпилек [25J, что предполагает образование сложной третичной структуры. Хотя эта структура имеет мало общего с участком связывания S7 в I6S рРНК. отдельные элементы в структуре мРНК и рРНК совпадают (Рис. 14).

У 5'

cap-AUpj

yh-i £»

" rtr\

28

Ï - x c-ЧЛ,с ч

; £

S в-II — л

* F С-Л | 41 AAt.

c«l s« „ МО v£«\ >с

? .---(----А- \

Заключение диссертации по теме «Биоорганическая химия», Прохорова, Ирина Валерьевна

Выводы

1. Метилирование нуклеотидов G966/C967 16S рРНК необходимо для адаптации клеток Escherichia coli к пониженной температуре.

2. Метилирование нуклеотидов G966/C967 16S рРНК повышает стабильность инициаторного комплекса.

3. Метилирование нуклеотидов G966/C967 16S рРНК необходимо для функционирования механизма аттенюации транскрипции.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Прохорова, Ирина Валерьевна, 2012 год

Список литературы

1. Rodnina, M.V., Wintermeyer, W., Green, R., ribosomes structure, function, and dynamics. 2011. 09: p. 97-111.

2. Julian, P., et al., The Cryo-EM structure of a complete 30S translation initiation complex from Escherichia coll PLoS Biol. 9(7): p. el001095.

3. Allen, G.S., et al., The cryo-EM structure of a translation initiation complex from Escherichia coli. Cell, 2005.121(5): p. 703-12.

4. Vila-Sanjurjo, A., et al., X-ray crystal structures of the WT and a hyper-accurate ribosome from Escherichia coli. Proc Natl Acad Sei USA, 2003.100(15): p. 8682-7.

5. Myasnikov, A.G., et al., Structure-function insights intoprokaryotic and eukaryotic translation initiation. Curr Opin Struct Biol, 2009.19(3): p. 300-9.

6. Meinnel, T., et al., Discrimination by Escherichia coli initiation factor IF3 against initiation on non-canonical codons relies on complementarity rules. J Mol Biol, 1999. 290(4): p. 825-37.

7. Butler, J.S., et al., Escherichia coli protein synthesis initiation factor IF3 controls its own gene expression at the translational level in vivo. J Mol Biol, 1986.192(4): p. 767-80.

8. McCutcheon, J.P., et al., Location of translational initiation factor IF3 on the small ribosomal submit. Proc Natl Acad Sei USA, 1999. 96(8): p. 4301-6.

9. Pioletti, M., et al., Crystal structures of complexes of the small ribosomal subunit with tetracycline, edeine and IF3. EMBO J, 2001. 20(8): p. 1829-39.

10. Rabl, J., et al., Crystal structure of the eukaryotic 40S ribosomal submit in complex with initiation factor 1. Science. 331(6018): p. 730-6.

11. Yusupova, G., et al., Structural basis for messenger RNA movement on the ribosome. Nature, 2006. 444(7117): p. 391-4.

12. Philippe, C., et al., Ribosomal protein SI 5 from Escherichia coli modulates its own translation by trapping the ribosome on the mRNA initiation loading site. Proc Natl Acad Sei U S A, 1993. 90(10): p. 4394-8.

13. Marzi, S., et al., StructuredmRNAs regulate translation initiation by binding to the platform of the ribosome. Cell, 2007. 130(6): p. 1019-31.

14. Schlax, P.J., et al., Translational repression of the Escherichia coli alpha operon mRNA: importance of an mRNA conformational switch and a ternary entrapment complex. J Biol Chem, 2001. 276(42): p. 38494-501.

15. besage, P., et al., Messenger RNA secondary structure and translational coupling in the Escherichia coli operon encoding translation initiation factor IF3 and the ribosomal proteins, 135 andL20. J Mol Biol, 1992. 228(2): p. 366-86.

16. Chiaruttini, C., et al., Translational coupling in the Escherichia coli operon encoding translation initiation factor IF3 and ribosomal proteins L20 and L35. Biochimie, 1996. 78(7): p. 555-67.

17. Haentjens-Sitri, J., et al., A competition mechanism regulates the translation of the Escherichia coli operon encoding ribosomal proteins L35 and L20. J Mol Biol, 2008. 375(3): p. 612-25.

18. Torres-Larios, A., et al., Structural basis of translational control by Escherichia coli threonyl tRNA synthetase. Nat Struct Biol, 2002. 9(5): p. 343-7.

19. Jenner, L., et al., Translational operator of mRNA on the ribosome: how repressor proteins exclude ribosome binding. Science, 2005. 308(5718): p. 120-3.

20. Wittmann-Liebold, B. and B. Greuer, The primary structure of protein S5 from the small submit of the Escherichia coli ribosome. FEBS Lett, 1978. 95(1): p. 91-8.

21. Cerretti, D.P., et al., Translational regulation of the spc operon in Escherichia coli. Identification and structural analysis of the target site for S8 repressor protein. J Mol Biol, 1988. 204(2): p. 309-29.

22. Merianos, H.J., J. Wang, and P.B. Moore, The structure of a ribosomal protein S8/spc operon mRNA complex. RNA, 2004. 10(6): p. 954-64.

23

24

25

26

27

28

29

30

31

32,

33,

34,

35,

36.

37,

38.

39.

40.

41.

Mattheakis, L.C. and M. Nomura, Feedback regulation of the spc operon in Escherichia coli: translational coupling and mRNA processing. J Bacteriol, 1988.170(10): p. 448492.

Mattheakis, L., et al., Retroregulation of the synthesis of ribosomal proteins L14 and L24 by feedback repressor S8 in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci USA, 1989. 86(2): p. 448-52.

Saito, K. and M. Nomura, Post-transcriptional regulation of the str operon in Escherichia coli. Structural and mutational analysis of the target site for translational repressor S7. J Mol Biol, 1994. 235(1): p. 125-39.

Robert, F. and L. Brakier-Gingras, Ribosomal protein S7 from Escherichia coli uses the same determinants to bind 16S ribosomal RNA and its messenger RNA. Nucleic Acids Res, 2001. 29(3): p. 677-82.

Saito, K., L.C. Mattheakis, and M. Nomura, Post-transcriptional regulation of the str operon in Escherichia coli. Ribosomal protein S7 inhibits coupled translation ofS7 but not its independent translation. J Mol Biol, 1994. 235(1): p. 111-24. Golovin, A., V. Spiridonova, and A. Kopylov, Mapping contacts of the S12-S7 intercistronic region of str operon mRNA with ribosomal protein S7 of E. coli. FEBS Lett, 2006. 580(25): p. 5858-62.

Barry, G., C. Squires, and C.L. Squires, Attenuation and processing of RNA from the rplJL—rpoBC transcription unit of Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci USA, 1980. 77(6): p. 3331-5.

Chow, J. and P.P. Dennis, Coupling between mRNA synthesis and mRNA stability in Escherichia coli. Mol Microbiol, 1994.11(5): p. 919-31.

Railing, G. and T. Linn, Relative activities of the transcriptional regulatory sites in the rplKAJLrpoBC gene cluster of Escherichia coli. J Bacteriol, 1984.158(1): p. 279-85. Yates, J.L. and M. Nomura, Feedback regulation of ribosomal protein synthesis in E. coli: localization of the mRNA target sites for repressor action of ribosomal protein LI. Cell, 1981. 24(1): p. 243-9.

Baughman, G. and M. Nomura, Localization of the target site for translational regulation of the LI 1 operon and direct evidence for translational coupling in Escherichia coli. Cell, 1983. 34(3): p. 979-88.

Nevskaya, N., et al., Ribosomal protein LI recognizes the same specific structural motif in its target sites on the autoregulatory mRNA and 23S rRNA. Nucleic Acids Res, 2005. 33(2): p. 478-85.

Nevskaya, N., et al., New insights into the interaction of ribosomal protein LI with RNA. J Mol Biol, 2006. 355(4): p. 747-59.

Iben, J.R. and D.E. Draper, Specific interactions of the L10(L12)4 ribosomal protein complex with mRNA, rRNA, andLll. Biochemistry, 2008. 47(9): p. 2721-31. Climie, S.C. and J.D. Friesen, Feedback regulation of the rplJL-rpoBC ribosomal protein operon of Escherichia coli requires a region of mRNA secondary structure. J Mol Biol, 1987.198(3): p. 371-81.

Petersen, C., Long-range translational coupling in the rplJL-rpoBC operon of Escherichia coli. J Mol Biol, 1989. 206(2): p. 323-32.

Artamonova, V.S., N.V. Tsareva, and I.V. Boni, [Regulation of synthesis of ribosomal protein L7-L12: role of intercistronic rplJL region as an enhancer of translation]. Bioorg Khim, 1998. 24(7): p. 530-8.

Downing, W. and P.P. Dennis, RNA polymerase activity may regulate transcription initiation and attenuation in the rplKAJLrpoBC operon in Escherichia coli. J Biol Chem, 1991. 266(2): p. 1304-11.

Sorensen, M.A., J. Fricke, and S. Pedersen, Ribosomal protein SI is requiredfor translation of most, if not all, natural mRNAs in Escherichia coli in vivo. J Mol Biol, 1998. 280(4): p. 561-9.

42

43

44.

45

46,

47,

48,

49

50,

51.

52.

53.

54,

55.

56,

57.

58.

59.

60.

61.

62.

63.

64.

Sengupta, J., R.K. Agrawal, and J. Frank, Visualization of protein SI within the 30S ribosomal subunit and its interaction with messenger RNA. Proc Natl Acad Sei USA, 2001. 98(21): p. 11991-6.

Komarova, A.V., et al., Protein SI counteracts the inhibitory effect of the extended Shine-

Dalgarno sequence on translation. RNA, 2002. 8(9): p. 1137-47.

Boni, I.V., et al., Non-canonical mechanism for translational control in bacteria:

synthesis of ribosomal protein SI. EMBO J, 2001. 20(15): p. 4222-32.

Valegard, K., et al., The three-dimensional structures of two complexes between

recombinant MS2 capsids and RNA operator fragments reveal sequence-specific protein-

RNA interactions. J Mol Biol, 1997. 270(5): p. 724-38.

Wulczyn, F.G. and R. Kahmann, Translational stimulation: RNA sequence and structure requirements for binding of Com protein. Cell, 1991. 65(2): p. 259-69. Shamoo, Y., et al., Translational repression by the bacteriophage T4 gene 32protein involves specific recognition of an RNA pseudoknot structure. J Mol Biol, 1993. 232(1): p. 89-104.

Phadtare, S., Recent developments in bacterial cold-shock response. Curr Issues Mol Biol, 2004. 6(2): p. 125-36.

Thieringer, H.A., P.G. Jones, and M. Inouye, Cold shock and adaptation. Bioessays, 1998. 20(1): p. 49-57.

Giangrossi, M., et al., Cold-shock-induced de novo transcription and translation of infA and role oflFl during cold adaptation. Mol Microbiol, 2007. 64(3): p. 807-21. Giuliodori, A.M., et al., Cold-stress-induced de novo expression of infC and role of IF3 in cold-shock translational bias. RNA, 2007.13(8): p. 1355-65.

Giuliodori, A.M., et al., The cspA mRNA is a thermosensor that modulates translation of the cold-shock protein CspA. Mol Cell. 37(1): p. 21-33.

Nagai, H., H. Yuzawa, and T. Yura, Interplay of two cis-acting mRNA regions in translational control of sigma 32 synthesis during the heat shock response of Escherichia coli. Proc Natl Acad Sei USA, 1991. 88(23): p. 10515-9.

Morita, M.T., et al., Translational induction of heat shock transcription factor sigma32: evidence for a built-in RNA thermosensor. Genes Dev, 1999.13(6): p. 655-65. Morita, M., et al., Heat-induced synthesis of sigma32 in Escherichia coli: structural and functional dissection of rpoHmRNA secondary structure. J Bacteriol, 1999. 181(2): p. 401-10.

Waldminghaus, T., et al., RNA thermometers are common in alpha- andgamma-proteobacteria. Biol Chem, 2005. 386(12): p. 1279-86.

Gaubig, L.C., T. Waldminghaus, and F. Narberhaus, Multiple layers of control govern expression of the Escherichia coli ibpAB heat-shock operon. Microbiology, 2011.157(Pt 1): p. 66-76.

Chowdhury, S., et al., Molecular basis for temperature sensing by an RNA thermometer. EMBO J, 2006. 25(11): p. 2487-97.

Waldminghaus, T., et al., The Escherichia coli ibpA thermometer is comprised of stable and unstable structural elements. RNA Biol, 2009. 6(4): p. 455-63. Johansson, J., et al., An RNA thermosensor controls expression of virulence genes in Listeria monocytogenes. Cell, 2002. 110(5): p. 551-61.

Geissmann, T., S. Marzi, and P. Romby, The role of mRNA structure in translational control in bacteria. RNA Biol, 2009. 6(2): p. 153-60.

Livny, J., et al., High-throughput, kingdom-wide prediction and annotation of bacterial non-coding RNAs. PLoS One, 2008. 3(9): p. e3197.

Gottesman, S., Micros for microbes: non-coding regulatory RNAs in bacteria. Trends Genet, 2005. 21(7): p. 399-404.

Gerdes, K. and E.G. Wagner, RNA antitoxins. Curr Opin Microbiol, 2007.10(2): p. 11724.

65

66

67

68

69

70

71.

72.

73.

74,

75.

76.

77,

78.

79.

80.

81.

82.

83.

84.

85.

86.

Darfeuille, F., et al., /In antisense RNA inhibits translation by competing with standby ribosomes. Mol Cell, 2007. 26(3): p. 381-92.

Repoila, F. and F. Darfeuille, Small regulatory non-coding RNAs in bacteria: physiology and mechanistic aspects. Biol Cell, 2009. 101(2): p. 117-31. Wei, B.L., et al., Positive regulation of motility and flhDC expression by the RNA-binding protein CsrA of Escherichia coli. Mol Microbiol, 2001. 40(1): p. 245-56. Timmermans, J. and L. Van Melderen, Post-transcriptional global regulation by CsrA in bacteria. Cell Mol Life Sci, 2010. 67(17): p. 2897-908.

Vanderpool, C.K., D. Balasubramanian, and C.R. Lloyd, Dual-function RNA regulators in bacteria. Biochimie, 2011. 93(11): p. 1943-9.

Repoila, F., N. Majdalani, and S. Gottesman, Small non-coding RNAs, co-ordinators of adaptation processes in Escherichia coli: the RpoSparadigm. Mol Microbiol, 2003. 48(4): p. 855-61.

Basineni, S.R., et al., The influence of Hfq and ribonucleases on the stability of the small non-coding RNA OxyS and its target rpoS in E. coli is growth phase dependent. RNA Biol, 2009. 6(5): p. 584-94.

Zhang, A., et al., The Sm-like Hfq protein increases OxyS RNA interaction with target mRNAs. Mol Cell, 2002. 9(1): p. 11-22.

Argaman, L. and S. Altuvia,//?//! repression by OxyS RNA: kissing complex formation at two sites results in a stable antisense-target RNA complex. J Mol Biol, 2000. 300(5): p. 1101-12.

Vogel, J. and K. Papenfort, Small non-coding RNAs and the bacterial outer membrane. Curr Opin Microbiol, 2006. 9(6): p. 605-11.

Zhou, Y. and J. Xie, The roles of pathogen small RNAs. J Cell Physiol, 2011. 226(4): p. 968-73.

Toledo-Arana, A., F. Repoila, and P. Cossart, Small noncoding RNAs controlling pathogenesis. Curr Opin Microbiol, 2007.10(2): p. 182-8.

Proshkin, S., et al., Cooperation between translating ribosomes and RNA polymerase in transcription elongation. Science. 328(5977): p. 504-8.

Burmann, B.M., et al., A NusE.NusG complex links transcription and translation. Science. 328(5977): p. 501-4.

Greive, S.J., A.F. Lins, and P.H. von Hippel, Assembly of an RNA-protein complex. Binding ofNusB and NusE (S10) proteins to boxA RNA nucleates the formation of the antitermination complex involved in controlling rRNA transcription in Escherichia coli. J Biol Chem, 2005. 280(43): p. 36397-408.

Yates, J.L. and M. Nomura, E. coli ribosomal protein L4 is a feedback regulatory protein. Cell, 1980. 21(2): p. 517-22.

Stelzl, U., et al., RNA-structural mimicry in Escherichia coli ribosomal protein L4-dependent regulation of the S10 operon. J Biol Chem, 2003. 278(30): p. 28237-45. Sha, Y., L. Lindahl, and J.M. Zengel, Role ofNusA in L4-mediated attenuation control of the S10 r-protein operon of Escherichia coli. J Mol Biol, 1995. 245(5): p. 474-85. Choonee, N., et al., Ribosomal protein L20 controls expression of the Bacillus subtilis infC operon via a transcription attenuation mechanism. Nucleic Acids Res, 2007. 35(5): p. 1578-88.

Kuroda, M.I. and C. Yanofsky, Evidence for the transcript secondary structures predicted to regulate transcription attenuation in the trp operon. J Biol Chem, 1984. 259(20): p. 12838-43.

Roesser, J.R., Y. Nakamura, and C. Yanofsky, Regulation of basal level expression of the tryptophan operon of Escherichia coli. J Biol Chem, 1989. 264(21): p. 12284-8. Landick, R. and C. Yanofsky, Stability of an RNA secondary structure affects in vitro transcription pausing in the trp operon leader region. J Biol Chem, 1984. 259(18): p. 11550-5.

87. Mayaux, J.F., et al., Control of phenylalanyl-tRNA synthetase genetic expression. Site-directed mutagenesis of the pheS, T oper on regulatory region in vitro. J Mol Biol, 1985. 184(1): p. 31-44.

88. Babitzke, P. and P. Gollnick, Posttranscription initiation control of tryptophan metabolism in Bacillus subtilis by the trp RNA-binding attenuation protein (TRAP), anti-TRAP, andRNA structure. J Bacteriol, 2001.183(20): p. 5795-802.

89. Gong, F., et al., The mechanism of tryptophan induction of tryptophanase operon expression: tryptophan inhibits release factor-mediated cleavage ofTnaC-peptidyl-tRNA(Pro). Proc Natl Acad Sci USA, 2001. 98(16): p. 8997-9001.

90. Konan, K.V. and C. Yanofsky, Rho-dependent transcription termination in the tna operon of Escherichia coli: roles of the boxA sequence and the rut site. J Bacteriol, 2000. 182(14): p. 3981-8.

91. Gong, F. and C. Yanofsky, A transcriptional pause synchronizes translation with transcription in the tryptophanase operon leader region. J Bacteriol, 2003. 185(21): p. 6472-6.

92. Cruz-Vera, L.R., et al., Ribosomal features essential for tna operon induction: tryptophan binding at thepeptidyl transferase center. J Bacteriol, 2007.189(8): p. 3140-6.

93. Seidelt, B., et al., Structural insight into nascent polypeptide chain-mediated translational stalling. Science, 2009. 326(5958): p. 1412-5.

94. Vazquez-Laslop, N., C. Thum, and A.S. Mankin, Molecular mechanism of drug-dependent ribosome stalling. Mol Cell, 2008. 30(2): p. 190-202.

95. Werckenthin, C., S. Schwarz, and H. Westh, Structural alterations in the translational attenuator of constitutively expressed ermC genes. Antimicrob Agents Chemother, 1999. 43(7): p. 1681-5.

96. Vazquez-Laslop, N., et al., The key function of a conserved and modified rRNA residue in the ribosomal response to the nascent peptide. EMBO J, 2010. 29(18): p. 3108-17.

97. Lovett, P.S., Translation attenuation regulation of chloramphenicol resistance in bacteria—a review. Gene, 1996. 179(1): p. 157-62.

98. Lovett, P.S. and E.J. Rogers, Ribosome regulation by the nascent peptide. Microbiol Rev, 1996. 60(2): p. 366-85.

99. Spahn, C.M., et al., Localization of the ribosomal protection protein Tet(O) on the ribosome and the mechanism of tetracycline resistance. Mol Cell, 2001. 7(5): p. 1037-45.

100. Taylor, D.E., et al., Host mutations (miaA and rpsL) reduce tetracycline resistance mediated by Tet(O) andTet(M). Antimicrob Agents Chemother, 1998. 42(1): p. 59-64.

101. Wang, Y., et al., Translational control of tetracycline resistance and conjugation in the Bacteroides conjugative transposon CTnDOT. J Bacteriol, 2005.187(8): p. 2673-80.

102. Lodato, P.B., E.J. Rogers, and P.S. Lovett, A variation of the translation attenuation model can explain the inducible regulation of the pBC16 tetracycline resistance gene in Bacillus subtilis. J Bacteriol, 2006.188(13): p. 4749-58.

103. Nudler, E. and A.S. Mironov, The riboswitch control of bacterial metabolism. Trends Biochem Sci, 2004. 29(1): p. 11-7.

104. Winkler, W.C., Riboswitches and the role of noncoding RNAs in bacterial metabolic control. Curr Opin Chem Biol, 2005. 9(6): p. 594-602.

105. Spinelli, S.V., et al., Regulation of magnesium homeostasis in Salmonella: Mg(2+) targets the mgtA transcript for degradation by RNase E. FEMS Microbiol Lett, 2008. 280(2): p. 226-34.

106. Liberman, J.A. and J.E. Wedekind, Riboswitch structure in the ligand-free state. Wiley Interdiscip Rev RNA, 2011.

107. Serganov, A., et al., Structural basis for discriminative regulation of gene expression by adenine- andguanine-sensing mRNAs. Chem Biol, 2004.11(12): p. 1729-41.

108. Rieder, R., et al., Ligand-induced folding of the adenosine deaminase A-riboswitch and implications on riboswitch translational control. Chembiochem, 2007. 8(8): p. 896-902.

109

110

111

112

113

114.

115

116

117

118.

119,

120.

121.

122.

123.

124.

125.

126.

127.

Serganov, A., et al., Structural basis for gene regulation by a thiamine pyrophosphate-sensing riboswitch. Nature, 2006. 441(7097): p. 1167-71.

Winkler, W., A. Nahvi, and R.R. Breaker, Thiamine derivatives bind messenger RNAs directly to regulate bacterial gene expression. Nature, 2002. 419(6910): p. 952-6. Vitreschak, A.G., et al., Comparative genomic analysis ofT-box regulatory systems in bacteria. RNA, 2008.14(4): p. 717-35.

Das, G., et al., Role of 16S ribosomal RNA methylations in translation initiation in Escherichia coli. EMBO J, 2008. 27(6): p. 840-51.

Kimura, S. and T. Suzuki, Fine-tuning of the ribosomal decoding center by conserved methyl-modifications in the Escherichia coli 16S rRNA. Nucleic Acids Res, 2010. 38(4): p. 1341-52.

Lafontaine, D., et al., The DIM1 gene responsible for the conserved m6(2)Am6(2)A dimethylation in the 3'-terminal loop of 18 S rRNA is essential in yeast. J Mol Biol, 1994. 241(3): p. 492-7.

van Buul, C.P., W. Visser, and P.H. van Knippenberg, Increased translational fidelity caused by the antibiotic kasugamycin and ribosomal ambiguity in mutants harbouring the ksgA gene. FEBS Lett, 1984.177(1): p. 119-24.

O'Connor, M., et al., Decoding fidelity at the ribosomal A and P sites: influence of mutations in three different regions of the decoding domain in 16S rRNA. Nucleic Acids Res, 1997. 25(6): p. 1185-93.

Poldermans, B., H. Bakker, and P.H. Van Knippenberg, Studies on the function of two adjacent N6,N6-dimethyladenosines near the 3' end of 16S ribosomal RNA of Escherichia coli. IV. The effect of the methylgroups on ribosomal subunit interaction. Nucleic Acids Res, 1980. 8(1): p. 143-51.

Van Charldorp, R., H.A. Heus, and P.H. Van Knippenberg, Adenosine dimethylation of I6S ribosomal RNA: effect of the methylgroups on local conformational stability as deduced from electrophoretic mobility of RNA fragments in denaturing Polyacrylamide gels. Nucleic Acids Res, 1981. 9(2): p. 267-75.

Demirci, H., et al., Modification of 16S ribosomal RNA by the KsgA methyltransferase restructures the 3OS subunit to optimize ribosome function. RNA, 2010.16(12): p. 231924.

Noon, K.R., E. Bruenger, and J.A. McCloskey, Posttranscriptional modifications in 16S and 23S rRNAs of the archaeal hyperthermophile Sulfolobus solfataricus. J Bacteriol, 1998.180(11): p. 2883-8.

Caldas, T., et al., Translational defects of Escherichia coli mutants deficient in the Um(2552) 23S ribosomal RNA methyltransferase RrmJ/FTSJ. Biochem Biophys Res Commun, 2000. 271(3): p. 714-8.

Widerak, M., et al., U2552 methylation at the ribosomal A-site is a negative modulator of translational accuracy. Gene, 2005. 347(1): p. 109-14.

O'Connor, M. and S.T. Gregory, Inactivation of the RluD pseudouridine synthase has minimal effects on growth and ribosome function in wild-type Escherichia coli and Salmonella enterica. J Bacteriol, 2011.193(1): p. 154-62.

Kipper, K., et al., Pseudouridylation of23SrRNA helix 69 promotes peptide release by release factor RF2 but not by release factor RF1. Biochimie, 2011. 93(5): p. 834-44. Jenner, L.B., et al., Structural aspects of messenger RNA reading frame maintenance by the ribosome. Nat Struct Mol Biol, 2010.17(5): p. 555-60. Green, R. and H.F. Noller, In vitro complementation analysis localizes 23S rRNA posttranscriptional modifications that are required for Escherichia coli 50S ribosomal subunit assembly and function. RNA, 1996. 2(10): p. 1011-21.

Liu, M., G.W. Novotny, and S. Douthwaite, Methylation of 23S rRNA nucleotide G745 is a secondary function of the RlmAI methyltransferase. RNA, 2004.10(11): p. 1713-20.

128

129.

130

131

132

133

134,

135.

136.

137.

138,

139.

140.

141.

142.

143.

144.

145.

146.

147.

148.

Abeydeera, N.D. and C.S. Chow, Synthesis and characterization of modified nucleotides in the 970 hairpin loop of Escherichia coli 16S ribosomal RNA. Bioorg Med Chem, 2009. 17(16): p. 5887-93.

Brimacombe, R., et al., Clustering of modified nucleotides at the functional center of bacterial ribosomal RNA. FASEB J, 1993. 7(1): p. 161-7. Shapkina, T.G., et al., Initiation factor 3-induced structural changes in the 30 S ribosomal subunit and in complexes containing tRNA(f)(Met) and mRNA. J Mol Biol, 2000. 299(3): p. 615-28.

Moazed, D. and H.F. Noller, Transfer RNA shields specific nucleotides in 16S ribosomal

RNA from attack by chemical probes. Cell, 1986. 47(6): p. 985-94.

von Ahsen, U. and H.F. Noller, Identification of bases in 16S rRNA essential for tRNA

binding at the 30S ribosomal P site. Science, 1995. 267(5195): p. 234-7.

Liang, X.H., Q. Liu, and M .J. Fournier, Loss of rRNA modifications in the decoding

center of the ribosome impairs translation and strongly delays pre-rRNA processing.

RNA, 2009. 15(9): p. 1716-28.

Higa-Nakamine, S., et al., Loss of ribosomal RNA modification causes developmental defects in zebrafish. Nucleic Acids Res, 2011.

Jemiolo, D.K., J.S. Taurence, and S. Giese, Mutations in 16S rRNA in Escherichia coli at methyl-modified sites: G966, C967, andG1207. Nucleic Acids Res, 1991. 19(15): p. 4259-65.

Weitzmann, C., et al., A paradigm for local conformational control offunction in the ribosome: binding of ribosomal protein SI 9 to Escherichia coli 16S rRNA in the presence of S7 is required for methylation of m2G966 and blocks methylation of m5C967 by their respective methyltransferases. Nucleic Acids Res, 1991. 19(25): p. 7089-95. Abdi, N.M. and K. Fredrick, Contribution of 16S rRNA nucleotides forming the 30S subunit A and P sites to translation in Escherichia coli. RNA, 2005.11(11): p. 1624-32. Saraiya, A.A., et al., Identification and role of functionally important motifs in the 970 loop of Escherichia coli 16S ribosomal RNA. J Mol Biol, 2008. 376(3): p. 645-57. Lesnyak, D.V., et al., Methyltransferase that modifies guanine 966 of the 16 S rRNA: functional identification and tertiary structure. J Biol Chem, 2007. 282(8): p. 5880-7. Tscherne, J.S., et al., Purification, cloning, and characterization of the 16S RNA m5C967 methyltransferase from Escherichia coli. Biochemistry, 1999. 38(6): p. 1884-92. Datsenko, K.A. and B.L. Wanner, One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc Natl Acad Sei USA, 2000. 97(12): p. 6640-5.

Connolly, K., J.P. Rife, and G. Culver, Mechanistic insight into the ribosome biogenesis functions of the ancient protein KsgA. Mol Microbiol, 2008. 70(5): p. 1062-75. Nystrom, T. and F.C. Neidhardt, Effects of overproducing the universal stress protein, UspA, in Escherichia coli K-12. J Bacteriol, 1996.178(3): p. 927-30. Springer, M., et al., Attenuation control of the Escherichia coli phenylalanyl-tRNA synthetase operon. J Mol Biol, 1985.181(4): p. 467-78.

Andreev, D.E., et al., Differential contribution of the m7G-cap to the 5' end-dependent translation initiation of mammalian mRNAs. Nucleic Acids Res, 2009. 37(18): p. 613547.

Landick, R., et al., Replacement of the Escherichia coli trp operon attenuation control codons alters operon expression. J Mol Biol, 1990. 216(1): p. 25-37. Kirillov, S.V., et al., The mechanism of codon-anticodon interaction in ribosomes. Heterogeneity of tRNA complexes with 70-S ribosomes of Escherichia coli. Eur J Biochem, 1978. 89(1): p. 305-13.

Andreev, D., et al., The bacterial toxin RelE induces specific mRNA cleavage in the A site of the eukaryote ribosome. RNA, 2008. 14(2): p. 233-9.

149. Milon, P., et al., Transient kinetics, fluorescence, and FRET in studies of initiation of translation in bacteria. Methods Enzymol, 2007. 430: p. 1-30.

150. Milon, P., et al., Kinetic checkpoint at a late step in translation initiation. Mol Cell, 2008. 30(6): p. 712-20.

151. Milon, P., et al., The ribosome-bound initiation factor 2 recruits initiator tRNA to the SOS initiation complex. EMBO Rep, 2010. 11(4): p. 312-6.

152. La Teana, A., C.L. Pon, and C.O. Gualerzi, Late events in translation initiation. Adjustment of fMet-tRNA in the ribosomal P-site. J Mol Biol, 1996. 256(4): p. 667-75.

153. La Teana, A., C.L. Pon, and C.O. Gualerzi, Translation of mRNAs with degenerate initiation triplet AUU displays high initiation factor 2 dependence and is subject to initiation factor 3 repression. Proc Natl Acad Sci USA, 1993. 90(9): p. 4161-5.

154. Baba, T., et al., Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection. Mol Syst Biol, 2006. 2: p. 2006 0008.

155. Govoran, V.M. and A.I. Archakov, Proteomic technologies in modern biomedical science. Biochemistry (Mosc), 2002. 67(10): p. 1109-23.

156. Shevchenko, A., et al., Mass spectrometric sequencing of proteins silver-stained polyacrylamide gels. Anal Chem, 1996. 68(5): p. 850-8.

157. Kramer, E.B. and P.J. Farabaugh, The frequency of translational misreading errors in E. coli is largely determined by tRNA competition. RNA, 2007. 13(1): p. 87-96.