Изучение функционирования склонной к ошибкам ДНК-полимеразы йота в экстрактах нормальных и опухолевых клеток человека и мыши тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.03, кандидат наук Лахин, Андрей Васильевич

• Лахин, Андрей Васильевич
• кандидат наук
• 2013

Оглавление диссертации кандидат наук Лахин, Андрей Васильевич

Содержание

СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ---------------------------------------------------------4

1. ВВЕДЕНИЕ----------------------------------------------------------------------------------------------5

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ------------------------------------------------------------------------------9

2.1. Повреждения ДНК и их последствия-------------------------------------------------------------9

2.1.1. Типы повреждений ДНК-----------------------------------------------------—

2.1.2. Система репарации ДНК----------------------------------------------------------------13

2.2. ДНК-полимеразы, принимающие участие в синтезе через повреждение (TLS-ДНК-полимеразы)

2.2.1. Специфичность TLS-ДНК-полимераз к различным повреждениям и модификациям ДНК

2.2.2. Регуляция активности TLS-ДНК-полимераз----------------------------------------21

2.3. Свойства и функции ДНК-полимеразы йота (Pol i) млекопитающих

2.3.1. Биохимические свойства Pol i in vitro-------------------------------------------------22

2.3.2. Регуляция активности Pol i в клетках млекопитающих---------------------------24

2.3.3. Активность Pol i в экстрактах клеток-------------------------------------------------25

2.3.4. Мп2+ как основной активирующий кофактор Pol t

2.3.5. Предполагаемые функции Pol i в клетке---------------------------------------------30

2.4. Аптамеры как перспективное средство терапии и диагностики нового поколения—

2.4.1. Принципы получения аптамеров------------------------------------------------------34

2.4.2. Области применения аптамеров

2.4.3. Ограничения использования аптамеров и пути их преодоления----------------42

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ-----------------------------------------------------------------------46

3.1. Список использованных ферментов, растворов и сред

3.2. Животные и клеточные линии

3.3. Приготовление экстрактов клеток для проведения ДНК-полимеразной реакции-----48

3.4. Получение субстрата для проведения ДНК-полимеразной реакции---------------------48

3.5. Реакция элонгации радиоактивно меченого праймера--------------------------------------49

3.6. Электрофорез продуктов ДНК-полимеразной реакции в денатурирующем полиакриламидном геле---------------------------------------------------------------------------------50

3.7. Процедура SELEX—-------------------------------------------------------------------------------51

3.8. ПЦР олигонуклеотидов библиотеки и анализ продуктов синтеза

3.9. Определение аффинности селектированных пулов олигорибонуклеотидов------------55

3.10. Получение компетентных клеток Е. coli и их трансформация----------------------------55

3.11. Выделение плазмидной ДНК--------------------------------------------------------------------56

3.12. Приготовление аптамеров для анализа in vitro-

3.13. Анализ SSCP индивидуальных РНК-аптамеров---------------------------------------------57

3.14. Определение Kd и IC50 РНК-аптамеров-------------------------------------------------------57

3.15. Изучение ингибирующего действия аптамера IKL5 на активность Pol i в экстрактах клеток-----------------------------------------------------------------------------------------58

4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ---------------------------------------------------------60

4.1. Получение РНК-аптамеров к Pol i----------------------------------------------------------------60

4.2. Ингибирование ДНК-полимеразной активности гомогенного препарата

Pol t аптамером IKL5----------------------------------------------------------------------------------—

4.3. Влияние аптамера IKL5 на интенсивность образования продуктов с некорректно встроенным G напротив Т матрицы в экстрактах нормальных

и опухолевых клеток человека-------------------------—----------------------------------------------67

4.4. Роль двухвалентных катионов металлов в функционировании всего комплекса ДНК-полимераз в экстрактах клеток---------------------------------------------------—

4.5. Влияние двухвалентных катионов металлов на ошибочность синтеза ДНК-----------78

4.6. Изменения в Мп-индуцировапной некорректной активности Pol i в экстрактах клеток под воздействием двухвалентных катионов металлов-----------------------------------82

4.7. Влияние концентрации Мп2+ на активность Pol i в экстрактах различных

типов клеток человека и мыши---------------------------

4.8. Изменения в Mn-зависимом синтезе ДНК, происходящие при

злокачественной трансформации клетки------------------------------------------------------------89

5. ВЫВОДЫ-----------------------------------------------------------------------------------------------92

6. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ-------------------------------------------------------------------------94

СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ

А - аденозин

G - гуанозин

Т - тимидин

U - уридин

С - цитозин

8-oxoG - 8-оксогуанин

BER - эксцизионная репарация оснований

dNMP - дезоксинуклеотидмонофосфат

dNTP - дезоксинуклеотидтрифосфат

HIFI - индуцируемый гипоксией фактор

NER - эксцизионная репарация нуклеотидов

MisGvA - Некомплиментарное встраивание G напротив Т матрицы

PCNA - ядерный антиген пролиферирующих клеток

Pol - ДНК-полимераза

RFC - репликативный фактор С

RPA - репликативный белок А

TLS - синтез ДНК через повреждение

UBM - убиквитинсвязывающий мотив

АП-сайты - апурин-апиримидиновые сайты

АФК - активные формы кислорода

миРНК - малые интерферирующие РНК

ПНК - полинуклеотидкиназа

ПСА - персульфат аммония

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ОТ-ПЦР - ПЦР с обратной транскрипцией

УФ - ультрафиолет

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Изучение функционирования склонной к ошибкам ДНК-полимеразы йота в экстрактах нормальных и опухолевых клеток человека и мыши»

1. ВВЕДЕНИЕ

Актуальность исследования. Процессы репликации и репарации ДНК в клетках эукариот являются очень сложными и осуществляются большим набором ферментов и регуляторных белков. В норме процесс репликации обеспечивается группой специализированных репликативных ДНК-полимераз. Однако на поврежденной или модифицированной ДНК эти ДНК-полимеразы не способны эффективно функционировать, что вызывает блок репликации. Для решения этой проблемы в клетке активируются механизмы, задействующие специализированные репаративные ДНК-полимеразы, осуществляющие синтез ДНК через повреждение - TLS-ДНК-полимеразы. Одной из особенностей TLS-ДНК-полимераз является то, что они способны эффективно и во многих случаях корректно встраивать нуклеотиды напротив поврежденных оснований. Однако из-за структурных особенностей каталитических центров TLS-ДНК-полимеразы, по сравнению с репликативными ДНК-полимеразами, при синтезе ДНК на неповрежденных матрицах допускают ошибки намного чаще. Данный конфликт пользы (преодоление блока репликации и поддержание стабильности генома) и вреда (высокая частота ошибок синтеза, приводящая к мутациям, т.н. error-prone synthesis) в нормальных клетках разрешается жесткой регуляцией функционирования TLS-ДНК-полимераз как на уровне транскрипции, так и на посттрансляционном уровне. Тем не менее, некоторые двухвалентные катионы металлов способны не только провоцировать снижение точности синтеза ДНК, но и приводить к сильной активации отдельных TLS-ДНК-полимераз.

Известно, что многие гомогенные препараты ДНК-полимераз в реакции синтеза ДНК in vitro могут в качестве кофакторов использовать не только Mg2+, но и ряд других двухвалентных катионов. Например, Мп2+, Со2+, Zn и некоторые другие могут довольно эффективно выступать в роли

кофакторов, но при этом снижается точность и процессивность синтеза ДНК.

5

В данном аспекте изучение влияния различных двухвалентных катионов металлов на синтез ДНК в экстрактах клеток вызывает особый интерес, поскольку позволяет оценить работу всего сложного комплекса ДНК-синтезирующих ферментов при сохраняющемся воздействии регуляторных факторов.

Изменение активности отдельных ДНК-полимераз в присутствии повышенных концентраций некоторых двухвалентных катионов металлов . может негативно сказаться на многих ключевых процессах клетки. Так, около сорока лет назад была сформулирована мутационная гипотеза возникновения рака. Согласно этой гипотезе, ранние события канцерогенеза могут быть следствием генерации мутаций из-за снижения точности работы репликации и репарации. Было показано, что одним из механизмов увеличения уровня мутагенеза в клетках является дерегуляция активности репаративных ДНК-полимераз. В связи с этим, изучение биохимических свойств и особенностей регуляции репаративных ДНК-полимераз может лечь в основу понимания тех механизмов, которые происходят при . злокачественной трансформации клетки. Одной из наиболее слабо изученных TLS-ДНК-полимераз является ДНК-иолимераза йота (Pol i).

Pol i относится к Y-семейству ДНК-полимераз и характеризуется крайне низкой точностью синтеза. К настоящему моменту биохимические свойства Pol i описаны в значительном количестве работ, однако в большинстве из них изучались чистые препараты рекомбинантного фермента. В этом случае остается совершенно невыясненным то, как происходит функционирование Pol i в живой клетке в присутствии содержащихся там разнообразных регуляторных факторов. Изучение . активности Pol i в экстрактах клеток может позволить в определенной мере решить эту проблему.

Характерным свойством Pol i является способность встраивать

некорректный G напротив Т матрицы даже в присутствии избытка

комплементарного dATP. Это уникальное свойство лежит в основе misGvA

6

(misincorporation of G versus А) метода, который позволяет выявлять активность Pol i в экстрактах клеток различных органов и тканей млекопитающих. Однако долгое время не было однозначных фактов, указывающих на то, что характерный для Pol i продукт с некорректно встроенным G напротив Т матрицы не может производиться другими ДНК-полимеразами человека. Кроме того, из данных литературы известно, что регуляция активности многих ферментов человека осуществляется по-разному в нормальных и в злокачественных клетках. В связи с этим актуальной проблемой настоящего времени является выяснение следующих положений: а) детектируется ли с помощью misGvA метода продукт активности именно Pol i как в нормальных, так и в опухолевых тканях; б) способны ли другие ДНК-полимеразы экстрактов нормальных или опухолевых клеток в значимых количествах образовывать продукт с некорректно включенным G напротив Т матрицы.

Изучение активности и биохимических свойств Pol i в экстрактах клеток эукариот является актуальным и фундаментально значимым для понимания молекулярно-биологических процессов, лежащих в основе поддержания стабильности генома, механизмов канцерогенеза и старения.

Цель настоящей работы заключалась в изучении функционирования склонной к ошибкам ДНК-полимеразы йота в экстрактах нормальных и опухолевых клеток человека и мыши. Были поставлены следующие задачи:

• получение высокоаффинного и специфичного РНК аптамера к Pol i;

• изучение воздействия полученного аптамера на активность как гомогенного препарата Pol i, так и на активность этого фермента в экстрактах нормальных и опухолевых клеток человека;

• изучение влияния 8 наиболее распространенных металлов в виде двухвалентных катионов на активность всего комплекса ДНК-синтезирующих ферментов;

• изучение влияния концентрации Мп2+ на синтез ДНК и на активность Pol

i в экстрактах нормальных и опухолевых клеток человека.

Научная новизна и практическая ценность работы. Исследовано

влияния 8 наиболее распространенных двухвалентных катионов металлов на

функционирование всего комплекса ДНК-полимераз в экстрактах клеток

эукариот. Охарактеризовано влияние двухвалентных катионов металлов на

точность синтеза ДНК. В работе показано, что наибольшее снижение

точности синтеза ДНК вызывает Мп2+. Установлено, что снижение точности

2+

синтеза ДНК в присутствии Мп обусловлено активацией некорректной

2+

активности Pol i. Изучена Мп -зависимая активация Pol i в экстрактах клеток различного происхождения. Впервые получен и охарактеризован РНК-аптамер к Pol i. Установлено, что полученный апгамер эффективно подавляет активность как гомогенного препарата Pol i, так и активность Pol i в экстрактах клеток нормальных и опухолевых тканей.

Эффективное подавление образования продукта с некомплиментарно встроенным G напротив Т матрицы полученным аптамером в экстрактах различных тканей является веским доказательством корректности MisGvA метода, а также того, что за образование продукта с некомплиментарно встроенным G ответственна именно Pol i. Потенциально данный аптамер может быть использован в терапии для снижения уровня мутагенеза, обусловленного повышенной активностью Pol i.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2Л. Повреждения ДНК и их последствия

Геном живых организмов подвергается постоянной атаке различных физических (ультрафиолетовая и ионизирующая радиация) и химических (генотоксические и канцерогенные вещества) факторов как окружающей среды, так и продуктов собственного метаболизма (свободные радикалы), которые могут повреждать ДНК клеток. Не будучи репарированными, повреждения ДНК являются препятствием для нормального протекания процессов репликации и вследствие этого могут инициировать каскад биологических реакций на клеточном, органном, организменном и популяционном уровне. В живых организмах генотоксичность этих факторов предотвращается системой репарации ДНК, действие которой направлено на восстановление исходной последовательности ДНК.

2ЛЛ. Типы повреждений ДНК

К наиболее часто возникающим повреждениям ДНК относятся апурин-апиримидиновые (АП) сайты. АП-сайты возникают при гидролитическом расщеплении Ы-гликозидной связи

дезоксирибонуклеотидов в составе ДНК (Рис. 1). Гидролиз может проходить как спонтанно, так и как промежуточный этап в ходе эксцизионной репарации окисленных, дезаминированных или алкилированных оснований [1, 2]. В физиологических условиях процессы апуринизации протекают со значительной скоростью [3]. Количество АП-сайтов в норме в одной клетке млекопитающих составляет порядка 5-20x104 [4, 5].

Гуанозин в составе ДНК

нм

о

л

N

N

N

>

О-

-О—Р—о— СИ? о

о

Гуанин

\ н н / н\| |/н

о н

о"

-о-Р-о-сн^о^ он

° КГ Н Н/1 н \[ 1/н

АП-сайт

о н

Рис. 1. Механизм образования АП-сайтов в составе ДНК.

АП-сайты являются высокомутагенными и блокируют корректную работу многих ДНК-полимераз, делая синтез ДНК намного более ошибочным [6, 7]. ДНК-полимеразы при достижении АП-сайта останавливаются, а затем либо высвобождают ДНК, либо катализируют включение с1АМР напротив АП-сайта матрицы, т.н. «правило А» [8, 9]. Показано также, что АП-сайты в значительной мере блокируют процессы транскрипции Т7 РНК-полимеразы [10], однако РНК-полимераза II млекопитающих свободно проходит данный тип повреждений, встраивая напротив АП-сайта С [11]. Кроме того, АП-сайты химически нестабильны и под действием нуклеофильных реагентов, оснований, и

повышенной температуры могут превращаться в одноцепочечные разрывы ДНК [3].

Образование продуктов дезаминирования оснований ДНК

представляет собой еще один мутагенный процесс, активно протекающий в клетках млекопитающих. Наиболее частой мутацией такого рода является спонтанное дезаминирование С с образованием и (Рис. 2) [12].

N«2

н

сА-^

I

Цитозин

N

N«2

О М'

5-Метилцитозин

0

нм у

о ^гг

1

Тимин

NN2

N

N

Аденин

нм

н2н N Гуанин

о

нн

N

к

Г >

м"

'М

Гипоксантин

N

О

А

НЦ

сДн-

Н !

Ксантин

■п

Рис. 2. Продукты дезаминирования оснований ДНК.

Ежедневно в каждой клетке человека образуется порядка 100 и за счет дезаминирования С [13]. В результате, при последующей репликации ДНК напротив и встраивается А, а не в, то есть происходит транзиция 0:С—>А:Т [14]. А и О также способны к спонтанному дезаминированию в физиологических условиях со скоростью в 50-100 раз меньшей, чем С, с образованием гипоксантина и ксантина соответственно [15, 16]. Гипоксантин в составе ДНК потенциально мутагенен, поскольку помимо образования канонической пары оснований с Т способен образовывать неканоническую пару оснований с С (транзиция А:Т—Ю:С) [17, 18]. Определенная мутагенность наблюдается и у ксантина, поскольку напротив него могут встраиваются как корректный С, так и

неканонический Т (в последнем случае происходит транзиция С:С—>А:Т) [19, 20].

Так как основания ДНК содержат атомы азота, обладающие нуклеофильными свойствами, нуклеотиды в составе ДНК способны взаимодействовать с электрофильными агентами, образуя продукты электрофилыюго присоединения. Электрофильное присоединение может идти по любому пиримидиновому гетероциклическому атому азота и по любой экзоциклической кето- или аминогруппе азотистых оснований, однако чаще всего алкилированию подвергаются позиции Ы3 у аденина и N у гуанина [21]. Ввиду того, что некоторые алкилирующие агенты (например, иприты) содержат два электрофильных центра, то они, помимо моноалкилирования, могут образовывать внутри- и межцепочечные сшивки ДНК, что мешает нормальному протеканию таких важных процессов, как репликация и транскрипция [22].

Фотопродукты являются еще одним распространенным видом повреждений ДНК. Данный тип повреждений образуется под воздействием УФ-излучения. При УФ-облучении ДНК возникают главным образом циклобутановые пиримидиновые димеры и пиримидин-пиримидоновые 6-4 фотопродукты [23, 24]. Вызываемые ультрафиолетом повреждения ДНК являются наиболее распространенной причиной рака кожи [25, 26].

Ввиду постоянного воздействия на живые системы окислительного

стресса эндогенной и экзогенной природы, к числу биологически

наиболее значимых повреждений ДНК можно отнести окислительные

повреждения ДНК. Главную роль в образовании окислительных

повреждений ДНК играют т.н. свободные радикалы, имеющие

неспаренный электрон на внешней орбите [27]. Большинство свободных

радикалов, повреждающих биологические системы, представляют собой

активные формы кислорода (АФК): супероксид-анион-радикал,

синглетный кислород и пр. АФК могут образовываться: а) в результате

12

воздействия УФ-излучеиия или гамма-излучения, б) в ходе металл индуцированных реакций (реакция Фентона), в) макрофагами и нейтрофилами в ходе воспаления, г) как побочные продукты при функционировании электрон-транспортной цепи в митохондриях, а также во многих других процессах [28, 29].

АФК образуют обширный ряд ДНК-повреждений, в том числе окисленные основания ДНК, АП-сайты, одно- и двухцепочечные разрывы [30]. Обнаружено более 100 типов окислительных модификаций оснований в ДНК млекопитающих [31, 32]. Наиболее чувствительным к АФК в силу низкого редокс потенциала является в, легко окисляющийся в 8-оксогуанин (8-охоС), наиболее распространенное и хорошо охарактеризованное окислительное повреждение ДНК [33, 34]. В свою очередь 8-охоО является крайне мутагенным повреждением ДНК, поскольку ДНК-полимеразы встраивают напротив данного типа повреждения неканонический А, что при отсутствии репарации приводит к трансверсии С:С—»Т:А [35, 36].

2.1.2. Система репарации ДНК

Функцию исправления повреждений в геноме живых организмов осуществляет система репарации ДНК, включающая в себя реактивацию, репарацию гетеродуплексов, гомологичную рекомбинацию (рекомбинационную репарацию), воссоединение негомологичных концов, эксцизионную репарацию нуклеотидов и эксцизионную репарацию оснований.

Исторически первым был открыт механизм реактивации,

представляющий собой непосредственное ферментативное обращение

химической модификации оснований без расщепления цепи ДНК.

Примерами данного механизма могут служить фотореактивация

циклобутановых димеров и деметилирование алкилированных оснований

[37]. При фотореактивации происходит фотохимическое расщепление

13

ковалентных связей между основаниями циклобутанового димера с восстановлением исходной структуры пиримидиновых нуклеотидов. Данный процесс осуществляют ДНК-фотолиазы, являющиеся группой флавопротеинов и использующие FADH" в качестве кофактора [38, 39]. Прямое деметилирование осуществляют (при этом необратимо инактивируясь) т.н. суицидальные ферметы. К данной группе ферментов относятся алкилтрансферазы, переносящие метальную группу на собственный остаток цистеина, и окислительные деметилазы, удаляющие метальную группу в виде формальдегида с помощью молекулярного кислорода, кетоглутарата и Fe в качестве кофактора (Рис. 3) [37].

Cys —SH

<о

active

Cvs —S —СН,

JL

<о

inactive

ОСН.

jL i /

О

methyltransferase

Hf|T\

H2N ^N

R

06-Methylguanine nucleotide

Ы

i

R

Guanine nucleotide

Рис. 3. Деалкилирование метилированного основания в составе ДНК (на примере гуанина) с помощью метилтрансферазы, осуществляющей прямое деметилирование.

Негомологичные пары оснований ДНК, обычно возникающие в результате ошибок ДНК-полимераз при репликации, удаляются системой репарации гетеродуплексов (DNA mismatch repair). Белки, входящие в состав этой системы, обнаруживают несоответствия в структуре двойной

цепи ДНК, вызванные неканоническими парами, и удаляют участок цепи протяженностью до нескольких сотен нуклеотидов. При этом система репарации гетеродуплексов опирается на специальные механизмы распознавания материнской и дочерней цепи, что делает ее высокоточным инструментом исправления ошибок ДНК-полимераз [40, 41].

Двуцепочечные разрывы являются наиболее опасными повреждениями ДНК и могут быть репарированными как в результате гомологичной рекомбинации, так и в результате воссоединения негомологичных концов. Механизм гомологичной рекомбинации заключается в образовании протяженного участка комплементарных пар (участка гомологии) между разорванной ДНК и неповрежденной копией этого генетического материала на сестринской хроматиде или на гомологичной хромосоме. Далее следуют разделение образовавшейся структуры и лигирование ДНК. За счет использования генетической информации неповрежденной копии ДНК система гомологичной рекомбинации позволяет полностью предотвратить негативные последствия двуцепочечного разрыва [42, 43].

В случае невозможности репарации двуцепочечного разрыва по пути гомологичной рекомбинации исправление повреждения происходит по пути воссоединения негомологичных концов ДНК, представляющего собой сшивку обеих разорванных цепей. Так как сшивка требует определенной обработки концов, процесс идет с потерей части генетической информации, но восстанавливает целостность хромосомы, что значительно важнее для жизнеспособности клетки при отсутствии других возможностей исправления повреждения [44, 45].

Эксцизионная репарация нуклеотидов (N£11) служит для

удаления из генома модификаций, значительно искажающих структуру

ДНК, например, объемных аддуктов ДНК с ксенобиотиками. Процесс

включает стадии узнавания искаженной структуры ДНК специальными

белками, вырезания содержащего повреждение участка цепи ДНК,

15

репаративного синтеза ДНК и последующего лигирования. Эксцизионная репарация нуклеотидов обладает низкой специфичностью к природе повреждения, обнаруживая нарушение нормальной структуры ДНК, а не конкретную химическую модификацию, что делает этот путь универсальным по отношению к широкому спектру повреждений [46, 47].

Эксцизионная репарация оснований (BER) представляет собой многофункциональную систему удаления широкого спектра поврежденных нуклеотидов и служит для устранения повреждений, незначительно искажающих структуру ДНК. Начальный этап данного пути - удаление повреждения с помощью одной из специфических ДНК-А^-гликозилаз с образованием АП-сайта. Затем АП-сайт расщепляется АП-эндонуклеазой с последующим заполнением образовавшейся однонуклеотидной бреши ДНК-полимеразой (Pol I у прокариот или Pol ß у эукариот). После включения в брешь ДНК первого dNMP возможно протекание BER по двум путям - короткозаплаточному и длиннозаплаточному, выбор между которыми определяется многими факторами, такими как тип повреждения, концентрации и соотношения ферментов этих двух путей [48, 49].

2.2. ДНК-полимеразы, принимающие участие в синтезе через повреждение (TLS-ДНК-полимеразы)

Геном клетки постоянно подвергается воздействию разнообразных

внешних и внутренних ДНК-повреждающих агентов.

Специализированные системы репарации ДНК способны восстановить

значительную часть образующихся повреждений. Тем не менее, некоторое

количество повреждений ДНК в силу различных причин избегает

репарации и провоцирует нарушение нормального функционирования

таких жизненно важных процессов, как репликация и транскрипция.

Репликативные ДНК-полимеразы на матрице с

поврежденными/модифицированными нуклеотидами не способны вести

16

эффективный синтез, останавливая репликацию. Потенциально, такая остановка синтеза может привести к нарушениям процессов клеточного деления и гибели клетки. Чтобы не допустить этого, в клетке имеется группа специализированных ДНК-полимераз, способных эффективно и во многих случаях корректно вести синтез напротив повреждений. Такие ДНК-полимеразы называются TLS-ДНК-полимеразы и их основной функцией является возобновление процессов репликации в случае остановки синтеза ДНК напротив поврежденного нуклеотида [50, 51]. Способностью вести синтез ДНК па поврежденной матрице у эукариот обладают все ДНК-полимеразы Y-семсйства (Pol i, Pol r|, Pol к и Revi), а также Pol С,, относящаяся к B-семейству (Рис. 4) [52, 53].

31 ЗОаа Pol Ç

125laa Revi

87{)аа Pol к

115аа Pol i

71 Заа Pol Г)

■■ Polymerase domain BKCT domain I HM

ШШ Pol к. Pol i. Fol П interaction domain PCNA interaction domain (PIP)

Rcv7 interaction domain ^p^- Rev I interaction domain

Рис. 4. Функциональные домены TLS-ДНК-полимераз.

UKZ

Характерной чертой ТЬБ-ДНК-полимераз является отсутствие у них домена, отвечающего за корректирующую 3'-5'-экзонуклеазную активность [51, 54]. В результате, на неповрежденных матрицах частота включения некорректного нуклеотида ТЬЯ-ДНК-полимеразами варьирует от 10"' до 10"4. Для сравнения, частота включения некорректного

(л 8

нуклеотида репликативными ДНК-полимеразами составляет 10" -10" [53,

55]. Тем не менее, даже сверхэкспрессия одной из TLS-ДНК-полимераз не обязательно приводит к повышенному мутагенезу и тем более возникновению опухоли. Это связано с тем, что для попадания на ДНК и задействования в процессах репликации необходимо участие целого ряда вспомогательных белков и регуляторных факторов [56, 57].

Таким образом, несмотря на низкую точность синтеза, TLS-ДНК-полимеразы играют крайне важную роль в поддержании стабильности генома и защите клетки от гибели вследствие остановки процессов репликации. В пользу этого свидетельствует и факт консервативности строения данной группы ДНК-полимераз в животном царстве. Кроме того, потеря хотя бы одной из TLS-ДНК-полимераз может привести к крайне негативным последствиям как для клетки, так и для всего организма. Так, повреждения в гене Pol т] приводят к повышенной восприимчивости к определенным повреждающим агентам [58, 59]. Подавление экспрессии Pol С, обуславливает гибель всего организма на ранних стадиях эмбриогенеза [60, 61].

2.2.1. Специфичность TLS-ДНК-полимераз к различным повреждениям и модификациям ДНК

Уникальная способность TLS-ДНК-полимераз вести синтез ДНК напротив повреждений во многом объясняются специфическим строением их каталитических центров [62, 63]. При этом индивидуальные особенности строения TLS-ДНК-полимераз обуславливают разную аффинность представителей этой группы ферментов к различным повреждениям ДНК. Такая специализация TLS-ДНК-полимераз обеспечивает включение наиболее подходящего нуклеотида, что делает процесс восстановления репликации, остановившейся напротив повреждения, значительно более корректным [64, 65]. Ниже приведена краткая характеристика TLS-ДНК-полимераз эукариот с описанием их

способности преодолевать различные повреждения ДНК.

18

Revi является одной из ключевых ДНК-полимераз, обеспечивающих переход повреждения ДНК в генетически закрепленную мутацию [66]. В клетках с нокаутированным геном revi отмечается значительное снижение скорости как спонтанного, так и индуцированного широким спектром ДНК-повреждающих агентов мутагенеза [67]. ДНК-полимеразная активность Revi ограничена исключительно включением dCMP напротив либо G матрицы, либо определенных повреждений ДНК, таких как АП-сайты и аддукты G [68, 69]. Несмотря на ограниченную ДНК-пол имеразную активность, Revi является крайне важным участником в процессах синтеза ДНК через повреждение in vivo и ее присутствие необходимо для эффективного преодоления многих типов повреждений ДНК. Связано это с тем, что Revi обладает доменами, необходимыми для ассоциации как с убиквитинированным PCNA (обеспечивает размещение TLS-ДНК-полимераз в месте остановки синтеза ДНК), так и с другими TLS-ДНК-полимеразами. Таким образом, одной из функций Revi является создание каркаса для расположения TLS-ДНК-полимераз в месте остановки репликации [70, 71]. Также, благодаря белок-белковым взаимодействиям, Revi играет важную роль в замене одной TLS-ДНК-полимеразы на другую в ходе синтеза через повреждение [72, 73].

Pol £ представляет собой гетеродимер, состоящий из каталитической субъединицы Rev3 и вспомогательной - Rev7 [74]. Подобно Revi, Pol С, также принимает важное участие в спонтанном и индуцированном мутагенезе, переводя повреждения ДНК различной природы в мутации [67, 75]. Pol ^ характеризуется ограниченной способностью встраивать нуклеотиды напротив различных повреждений ДНК. Предполагается, что основная роль Pol ^ in vivo состоит в катализировании реакции элонгации сразу после включенного другой TLS-ДНК-полимеразой нуклеотида напротив повреждения, даже если этот нуклеотид встроен некорректно [67, 76].

Pol к является относительно аккуратной TLS-ДНК-полимеразой, демонстрируя на неповрежденной матрице достаточно корректный синтез [77]. Нокаутирование гена Pol к почти никак не сказывается на интенсивности как спонтанного, так и индуцированного мутагенеза, что указывает на незначительную роль фермента в данных процессах [78, 79]. Pol к обладает способностью катализировать корректное включение нуклеотидов напротив не очень широкого спектра повреждений ДНК, среди которых в основном различные N -аддукты G [80, 81]. Pol к способна также довольно эффективно элонгировать цепь ДНК с некорректно включенным нуклеотидом, являясь в определенной мере функциональным аналогом Pol С, [53, 82].

Главной функцией Pol ц в организме является немутагенный синтез напротив УФ-ипдуцированных повреждений ДНК. В частности, Pol г| является основной TLS-ДНК-полимеразой, ответственной за корректное преодоление cis-syn циклобутан-пиримидиновых димеров - одного из основных УФ-индуцированных повреждений ДНК [83, 84]. Pol г| характеризуется также способностью эффективно преодолевать широкий спектр других повреждений ДНК [85, 86]. В то же время, на неповрежденной матрице Pol г\ демонстрирует крайне низкую точность синтеза [87]. Несмотря на мутагенный потенциал, нокдаун Pol г| посредством миРНК приводит не к снижению, а к увеличению частоты возникновения мутаций [88]. Кроме того, мутации в гене Pol г|, приводящие к потере активности фермента, у человека проявляются как вариант пигментной ксеродермы, характеризующийся повышенной частотой возникновения рака кожи и сверхчувствительностью к солнечному свету [59, 89]. Таким образом, крайне аккуратное преодоление индуцированных УФ-излучением повреждений ДНК делает Pol г| одним из ключевых ферментов в защите человека от рака кожи.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Лахин, Андрей Васильевич, 2013 год

6. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Croteau DL, Bohr VA. Repair of oxidative damage to nuclear and mitochondrial DNA in mammalian cells. J Biol Chem. 1997, 272, 25409-25412.

2. Kubota Y, Nash RA, Klungland A, Schär P, Barnes DE, Lindahl Т. Reconstitution of DNA base excision-repair with purified human proteins: interaction between DNA polymerase beta and the XRCC1 protein. EMBO J. 1996, 15,6662-6670.

3. Lindahl T, Nyberg B. Rate of depurination of native deoxyribonucleic acid. Biochemistry. 1972, 11,3610-3618.

4. Nakamura J, Swenberg JA. Endogenous apurinic/apyrimidinic sites in genomic DNA of mammalian tissues. Cancer Res. 1999, 59, 2522-2526.

5. Atamna H, Cheung I, Ames BN. A method for detecting abasic sites in living cells: age-dependent changes in base excision repair. Proc Natl Acad Sei USA. 2000, 97, 686-691.

6. Schaaper RM, Kunkel TA, Loeb LA. Infidelity of DNA synthesis associated with bypass of apurinic sites. Proc Natl Acad Sei U S A. 1983, 80, 487-491.

7. Shearman CW, Loeb LA. Depurination decreases fidelity of DNA synthesis in vitro. Nature. 1977, 270, 537-538.

8. Goodman MF, Cai H, Bloom LB, Eritja R. Nucleotide insertion and primer extension at abasic template sites in different sequence contexts. Ann N Y Acad Sei. 1994, 726,132-142.

9. Cuniasse P, Fazakerley GV, Guschlbauer W, Kaplan BE, Sowers LC. The abasic site as a challenge to DNA polymerase. A nuclear magnetic resonance study of G, С and T opposite a model abasic site. J Mol Biol. 1990, 213, 303-314.

10. Chen YH, Bogenhagen DF. Effects of DNA lesions on transcription elongation by T7 RNA polymerase. J Biol Chem. 1993, 268, 5849-5855.

11. Kuraoka I, Endou M, Yamaguchi Y, Wada T, Handa H, Tanaka K. Effects of endogenous DNA base lesions on transcription elongation by mammalian RNA polymerase II. Implications for transcription-coupled DNA repair and

transcriptional mutagenesis. J Biol Chem. 2003, 278, 7294-7299.

93

12. Василенко HJ1, Невинский ГА. Пути накопления и репарации остатков дезоксиуридина в ДНК клеток нисших и высших организмов. Биохимия. 2003,68, 165-183.

13. Frederico LA, Kunkel ТА, Shaw BR. A sensitive genetic assay for the detection of cytosine deamination: determination of rate constants and the activation energy. Biochemistry. 1990, 29, 2532-2537.

14. David SS, Williams SD. Chemistry of Glycosylases and Endonucleases Involved in Base-Excision Repair. Chem Rev. 1998, 98, 1221-1262.

15. Karran P, Lindahl T. Hypoxanthine in deoxyribonucleic acid: generation by heat-induced hydrolysis of adenine residues and release in free form by a deoxyribonucleic acid glycosylase from calf thymus. Biochemistry. 1980, 19, 6005-6011.

16. Lindahl T. Instability and decay of the primary structure of DNA. Nature. 1993,362, 709-715.

17. Hill-Perkins M, Jones MD, Karran P. Site-specific mutagenesis in vivo by single methylated or deaminated purine bases. Mutat Res. 1986, 162, 153-163.

18. Karran P, Lindahl T. Enzymatic excision of free hypoxanthine from polydeoxynucleotides and DNA containing deoxyinosine monophosphate residues. J Biol Chem. 1978, 253, 5877-5879.

19. Wuenschell GE, O'Connor TR, Termini J. Stability, miscoding potential, and repair of 2'-deoxyxanthosine in DNA: implications for nitric oxide-induced mutagenesis. Biochemistry. 2003, 42, 3608-3616.

20. Yasui M, Suzuki N, Miller H, Matsuda T, Matsui S, Shibutani S. Translesion synthesis past 2'-deoxyxanthosine, a nitric oxide-derived DNA adduct, by mammalian DNA polymerases. J Mol Biol. 2004, 344, 665-674.

21. Singer B, Kusmierek JT. Chemical mutagenesis. Annu Rev Biochem. 1982, 51,655-693.

22. Lawley PD, Phillips DH. DNA adducts from chemotherapeutic agents. Mutat Res. 1996,355, 13-40.

23. Brash DE, Haseltine WA. UV-induced mutation hotspots occur at DNA damage hotspots. Nature. 1982, 298, 189-192.

24. Franklin WA, Doetsch PW, Haseltine WA. Structural determination of the ultraviolet light-induced thymine-cytosine pyrimidine-pyrimidone (6-4) photoproduct. Nucleic Acids Res. 1985, 13, 5317-5325.

25. Lima-Bessa KM, Menck CF. Skin cancer: lights on genome lesions. Curr Biol. 2005, 15,58-61.

26. Daya-Grosjean L, Dumaz N, Sarasin A. The specificity of p53 mutation spectra in sunlight induced human cancers. J Photochem Photobiol B. 1995, 28, 115-124.

27. Riley PA. Free radicals in biology: oxidative stress and the effects of ionizing radiation. Int J Radiat Biol. 1994, 65, 27-33.

28. Cadenas E. Biochemistry of oxygen toxicity. Annu Rev Biochem. 1989, 58, 79-110.

29. Inoue M, Sato EF, Nishikawa M, Park AM, Kira Y, Imada I, Utsumi K. Mitochondrial generation of reactive oxygen species and its role in aerobic life. Curr Med Chem. 2003, 10, 2495-2505.

30. Krokan HE, Standal R, Slupphaug G. DNA glycosylases in the base excision repair of DNA. Biochem J. 1997, 325, 1-16.

31. Yazgan O, Krebs JE. Mitochondrial and nuclear genomic integrity after oxidative damage in Saccharomyces cerevisiae. Front Biosci. 2012, 17, 1079-1093.

32. Dizdaroglu M. Chemical determination of free radical-induced damage to DNA. Free Radic Biol Med. 1991, 10, 225-242.

33. Neeley WL, Essigmann JM. Mechanisms of formation, genotoxicity, and mutation of guanine oxidation products. Chem Res Toxicol. 2006, 19, 491-505.

34. Dizdaroglu M, Jaruga P, Birincioglu M, Rodriguez H. Free radical-induced damage to DNA: mechanisms and measurement. Free Radic Biol Med. 2002, 32, 1102-1115.

35. Grollman AP, Moriya M. Mutagenesis by 8-oxoguanine: an enemy within. Trends Genet. 1993, 9, 246-249.

36. Shibutani S, Takeshita M, Grollman AP. Insertion of specific bases during DNA synthesis past the oxidation-damaged base 8-oxodG. Nature. 1991, 349, 431 -434.

37. Eker AP, Quayle C, Chaves I, van der Horst GT. DNA repair in mammalian cells: Direct DNA damage reversal: elegant solutions for nasty problems. Cell Mol Life Sei. 2009, 66, 968-980.

38. Sanear A. Structure and function of DNA photolyase and cryptochrome blue-light photoreceptors. Chem Rev. 2003, 103, 2203-2237.

39. Deisenhofer J. DNA photolyases and cryptochromes. Mutat Res. 2000, 460, 143-149.

40. Kunz C, Saito Y, Schär P. Mismatched repair: variations on a theme. Cell Mol Life Sei. 2009, 66, 1021-1038.

41. Li GM. Mechanisms and functions of DNA mismatch repair. Cell Res. 2008, 18, 85-98.

42. Pardo B, Gómez-González B, Aguilera A. DNA double-strand break repair: how to fix a broken relationship. Cell Mol Life Sei. 2009, 66, 1039-1056.

43. Li X, Heyer WD. Homologous recombination in DNA repair and DNA damage tolerance. Cell Res. 2008, 18, 99-113.

44. Lieber MR, Gu J, Lu H, Shimazaki N, Tsai AG. Nonhomologous DNA end joining (NHEJ) and chromosomal translocations in humans. Subcell Biochem. 2010, 50, 279-296.

45. Lieber MR. The mechanism of double-strand DNA break repair by the nonhomologous DNA end-joining pathway. Annu Rev Biochem. 2010, 79, 181211.

46. Nouspikel T. Nucleotide excision repair: variations on versatility. Cell Mol Life Sei. 2009, 66, 994-1009.

47. Rechkunova N1, Lavrik OI. Nucleotide excision repair in higher eukaryotes: mechanism of primary damage recognition in global genome repair. Subcell Biochem. 2010,50, 251-277.

48. Zharkov DO. Base excision DNA repair. Cell Mol Life Sei. 2008, 65, 15441565.

49. Robertson AB, Klungland A, Rognes T, Leiros I. Base excision repair: the long and short of it. Cell Mol Life Sei. 2009, 66, 981-993.

50. Friedberg EC. Suffering in silence: the tolerance of DNA damage. Nat Rev Mol Cell Biol. 2005, 6, 943-953.

51. Goodman MF. Error-prone repair DNA polymerases in prokaryotes and eukaryotes. Annu Rev Biochem. 2002, 71, 17-50.

52. Ohmori H, Friedberg EC, Fuchs RP, Goodman MF, Hanaoka F, Hinkle D, Kunkel TA, et al. The Y-family of DNA polymerases. Mol Cell. 2001, 8, 7-8.

53. Prakash S, Johnson RE, Prakash L. Eukaryotic translesion synthesis DNA polymerases: specificity of structure and function. Annu Rev Biochem. 2005, 74, 317-353.

54. Yang W. Portraits of a Y-family DNA polymerase. FEBS Lett. 2005, 579, 868-872.

55. Kunkel TA. DNA replication fidelity. J Biol Chem. 2004, 279, 1689516898.

56. King NM, Nikolaishvili-Feinberg N, Bryant MF, Luche DD, Heffernan TP, Simpson DA, Hanaoka F, et al. Overproduction of DNA polymerase eta does not raise the spontaneous mutation rate in diploid human fibroblasts. DNA Repair (Amst). 2005,4,714-724.

57. Pavlov YI, Nguyen D, Kunkel TA. Mutator effects of overproducing DNA polymerase eta (Rad30) and its catalytically inactive variant in yeast. Mutat Res. 2001,478, 129-139.

58. Leibeling D, Laspe P, Emmert S. Nucleotide excision repair and cancer. J Mol Histol. 2006, 37, 225-238.

59. Masutani C, Kusumoto R, Yamada A, Dohmae N, Yokoi M, Yuasa M, Araki M, et al. The XPV (xeroderma pigmentosum variant) gene encodes human DNA polymerase eta. Nature. 1999, 399, 700-704.

60. Bemark M, Khamlichi AA, Davies SL, Neuberger MS. Disruption of mouse polymerase zeta (Rev3) leads to embryonic lethality and impairs blastocyst development in vitro. CurrBiol. 2000, 10, 1213-1216.

61. Esposito G, Godindagger I, Klein U, Yaspo ML, Cumano A, Rajewsky K. Disruption of the Rev31-encoded catalytic subunit of polymerase zeta in mice results in early embryonic lethality. Curr Biol. 2000, 10, 1221-1224.

62. Ling H, Boudsocq F, Woodgate R, Yang W. Crystal structure of a Y-family DNA polymerase in action: a mechanism for error-prone and lesion-bypass replication. Cell. 2001, 107, 91-102.

63. Trincao J, Johnson RE, Escalante CR, Prakash S, Prakash L, Aggarwal AK. Structure of the catalytic core of S. cerevisiae DNA polymerase eta: implications for translesion DNA synthesis. Mol Cell. 2001, 8, 417-426.

64. Jarosz DF, Godoy VG, Delaney JC, Essigmann JM, Walker GC. A single amino acid governs enhanced activity of DinB DNA polymerases on damaged templates. Nature. 2006, 439, 225-228.

65. Washington MT, Johnson RE, Prakash S, Prakash L. Fidelity and processivity of Saccharomyces cerevisiae DNA polymerase eta. J Biol Chem.

1999, 274,36835-36838.

66. Gibbs PE, Wang XD, Li Z, McManus TP, McGregor WG, Lawrence CW, Maher VM. The function of the human homolog of Saccharomyces cerevisiae REV1 is required for mutagenesis induced by UV light. Proc Natl Acad Sci USA.

2000, 97,4186-4191.

67. Lawrence CW. Cellular functions of DNA polymerase zeta and Revl protein. Adv Protein Chem. 2004, 69, 167-203.

68. Nelson JR, Lawrence CW, Hinkle DC. Deoxycytidyl transferase activity of yeast REV1 protein. Nature. 1996, 382, 729-731.

69. Washington MT, Minko IG, Johnson RE, Haracska L, Harris TM, Lloyd RS, Prakash S, et al. Efficient and error-free replication past a minor-groove N2-guanine adduct by the sequential action of yeast Revl and DNA polymerase zeta. Mol Cell Biol. 2004, 24, 6900-6906.

70. Otsuka C, Kunitomi N, Iwai S, Loakes D, Negishi K. Roles of the polymerase and BRCT domains of Rev 1 protein in translesion DNA synthesis in yeast in vivo. Mutat Res. 2005, 578, 79-87.

71. Guo C, Fischhaber PL, Luk-Paszyc MJ, Masuda Y, Zhou J, Kamiya K, Kisker C, et al. Mouse Revl protein interacts with multiple DNA polymerases involved in translesion DNA synthesis. EMBO J. 2003, 22, 6621-6630.

72. Lehmann AR. Replication of damaged DNA by translesion synthesis in human cells. FEBS Lett. 2005, 579, 873-876.

73. Friedberg EC, Lehmann AR, Fuchs RP. Trading places: how do DNA polymerases switch during translesion DNA synthesis? Mol Cell. 2005, 18, 499505.

74. Gan GN, Wittschieben JP, Wittschieben B0, Wood RD. DNA polymerase zeta (pol zeta) in higher eukaryotes. Cell Res. 2008, 18, 174-183.

75. McNally K, Neal JA, McManus TP, McCormick JJ, Maher VM. hRev7, putative subunit of hPolzeta, plays a critical role in survival, induction of mutations, and progression through S-phase, of UV((254nm))-irradiated human fibroblasts. DNA Repair (Amst). 2008, 7, 597-604.

76. Saribasak H, Maul RW, Cao Z, Yang WW, Schenten D, Kracker S, Gearhart PJ. DNA polymerase t, generates tandem mutations in immunoglobulin variable regions. J Exp Med. 2012, 209, 1075-1081.

77. Ohashi E, Bebenek K, Matsuda T, Feaver WJ, Gerlach VL, Friedberg EC, Ohmori H, et al. Fidelity and processivity of DNA synthesis by DNA polymerase kappa, the product of the human DINB1 gene. J Biol Chem. 2000, 275, 3967839684.

78. Takenaka K, Ogi T, Okada T, Sonoda E, Guo C, Friedberg EC, Takeda S. Involvement of vertebrate Polkappa in translesion DNA synthesis across DNA monoalkylation damage. J Biol Chem. 2006, 281, 2000-2004.

79. Ogi T, Shinkai Y, Tanaka K, Ohmori H. Polkappa protects mammalian cells against the lethal and mutagenic effects of benzo[a]pyrene. Proc Natl Acad Sci U S A. 2002, 99, 15548-15553.

80. Bavoux C, Hoffmann JS, Cazaux C. Adaptation to DNA damage and stimulation of genetic instability: the double-edged sword mammalian DNA polymerase kappa. Biochimie. 2005, 87, 637-646.

81. Yuan B, Cao H, Jiang Y, Hong H, Wang Y. Efficient and accurate bypass of N2-(l-carboxyethyl)-2'-deoxyguanosine by DinB DNA polymerase in vitro and in vivo. Proc Natl Acad Sei USA. 2008, 105, 8679-8684.

82. Lone S, Townson SA, Uljon SN, Johnson RE, Brahma A, Nair DT, Prakash S, et al. Human DNA polymerase kappa encircles DNA: implications for mismatch extension and lesion bypass. Mol Cell. 2007, 25, 601-614.

83. Yagi Y, Ogawara D, Iwai S, Hanaoka F, Akiyama M, Maki H. DNA polymerases eta and kappa are responsible for error-free translesion DNA synthesis activity over a cis-syn thymine dimer in Xenopus laevis oocyte extracts. DNA Repair (Amst). 2005, 4, 1252-1269.

84. Gibbs PE, McDonald J, Woodgate R, Lawrence CW. The relative roles in vivo of Saccharomyces cerevisiae Pol eta, Pol zeta, Revl protein and Pol32 in the bypass and mutation induction of an abasic site, T-T (6-4) photoadduct and T-T cis-syn cyclobutane dimer. Genetics. 2005, 169, 575-582.

85. Yuan F, Zhang Y, Rajpal DK, Wu X, Guo D, Wang M, Taylor JS, et al. Specificity of DNA lesion bypass by the yeast DNA polymerase eta. J Biol Chem. 2000, 275, 8233-8239.

86. Vaisman A, Masutani C, Hanaoka F, Chaney SG. Efficient translesion replication past oxaliplatin and cisplatin GpG adducts by human DNA polymerase eta. Biochemistry. 2000, 39, 4575-4580.

87. Matsuda T, Bebenek K, Masutani C, Hanaoka F, Kunkel TA. Low fidelity DNA synthesis by human DNA polymerase-eta. Nature. 2000, 404, 1011-1013.

88. Choi JH, Pfeifer GP. The role of DNA polymerase eta in UV mutational spectra. DNA Repair (Amst). 2005, 4, 211-220.

89. Kannouche P, Stary A. Xeroderma pigmentosum variant and error-prone DNA polymerases. Biochimie. 2003, 85, 1123-1132.

90. Choi JH, Besaratinia A, Lee DH, Lee CS, Pfeifer GP. The role of DNA polymerase iota in UV mutational spectra. Mutat Res. 2006, 599, 58-65.

91. Dumstorf CA, Clark AB, Lin Q, Kissling GE, Yuan T, Kucherlapati R, McGregor WG, et al. Participation of mouse DNA polymerase iota in strand-biased mutagenic bypass of UV photoproducts and suppression of skin cancer. Proc Natl Acad Sei USA. 2006, 103, 18083-18088.

92. Yang J, Chen Z, Liu Y, Hickey RJ, Malkas LH. Altered DNA polymerase iota expression in breast cancer cells leads to a reduction in DNA replication fidelity and a higher rate of mutagenesis. Cancer Res. 2004, 64, 5597-5607.

93. Maga G, Hubscher U. Proliferating cell nuclear antigen (PCNA): a dancer with many partners. J Cell Sei. 2003, 116, 3051-3060.

94. Naryzhny SN. Proliferating cell nuclear antigen: a proteomics view. Cell Mol Life Sei. 2008, 65, 3789-3808.

95. Chiu RK, Brun J, Ramaekers C, Theys J, Weng L, Lambin P, Gray DA, et al. Lysine 63-polyubiquitination guards against translesion synthesis-induced mutations. PLoS Genet. 2006, 2, el 16.

96. Kannouche PL, Wing J, Lehmann AR. Interaction of human DNA polymerase eta with monoubiquitinated PCNA: a possible mechanism for the polymerase switch in response to DNA damage. Mol Cell. 2004, 14, 491-500.

97. Bienko M, Green CM, Crosetto N, Rudolf F, Zapart G, Coull B, Kannouche P, et al. Ubiquitin-binding domains in Y-family polymerases regulate translesion synthesis. Science. 2005, 310, 1821-1824.

98. Hoege C, Pfander B, Moldovan GL, Pyrowolakis G, Jentsch S. RAD6-dependent DNA repair is linked to modification of PCNA by ubiquitin and SUMO. Nature. 2002,419, 135-141.

99. Zhang H, Lawrence CW. The error-free component of the RAD6/RAD18 DNA damage tolerance pathway of budding yeast employs sister-strand recombination. Proc Natl Acad Sei USA. 2005, 102, 15954-15959.

100. Guo С, Tang TS, Bienko M, Parker JL, Bielen AB, Sonoda E, Takeda S, et al. Ubiquitin-binding motifs in REV1 protein are required for its role in the tolerance of DNA damage. Mol Cell Biol. 2006, 26, 8892-8900.

101. Pages V, Fuchs RP. How DNA lesions are turned into mutations within cells? Oncogene. 2002, 21, 8957-8966.

102. McCulloch SD, Kokoska RJ, Masutani C, Iwai S, Hanaoka F, Kunkel ТА. Preferential cis-syn thymine dimer bypass by DNA polymerase eta occurs with biased fidelity. Nature. 2004, 428, 97-100.

103. McDonald JP, Rapic-Otrin V, Epstein J A, Broughton ВС, Wang X, Lehmann AR, Wolgemuth DJ, et al. Novel human and mouse homologs of Saccharomyces cerevisiae DNA polymerase eta. Genomics. 1999, 60, 20-30.

104. Tissier A, McDonald JP, Frank EG, Woodgate R. poliota, a remarkably error-prone human DNA polymerase. Genes Dev. 2000, 14, 1642-1650.

105. Zhang Y, Yuan F, Wu X, Wang Z. Preferential incorporation of G opposite template T by the low-fidelity human DNA polymerase iota. Mol Cell Biol. 2000, 20, 7099-7108.

106. Макарова AB, Кульбачинский AB. Структура ДНК-полимеразы йота человека и механизм синтеза ДНК. Биохимия. 2012, 77, 669-685.

107. Nair DT, Johnson RE, Prakash S, Prakash L, Aggarwal AK. Replication by human DNA polymerase-iota occurs by Hoogsteen base-pairing. Nature. 2004, 430, 377-380.

108. Johnson RE, Haracska L, Prakash L, Prakash S. Role of hoogsteen edge hydrogen bonding at template purines in nucleotide incorporation by human DNA polymerase iota. Mol Cell Biol. 2006, 26, 6435-6441.

109. Bebenek K, Tissier A, Frank EG, McDonald JP, Prasad R, Wilson SH, Woodgate R, et al. 5'-Deoxyribose phosphate lyase activity of human DNA polymerase iota in vitro. Science. 2001, 291, 2156-2159.

110. Vaisman A, Woodgate R. Unique misinsertion specificity of poliota may decrease the mutagenic potential of deaminated cytosines. EMBO J. 2001, 20, 6520-6529.

111. Vaisman A, Takasawa K, Iwai S, Woodgate R. DNA polymerase iota-dependent translesion replication of uracil containing cyclobutane pyrimidine dimers. DNA Repair (Amst). 2006, 5, 210-218.

112. Zhang Y, Yuan F, Wu X, Taylor JS, Wang Z. Response of human DNA polymerase iota to DNA lesions. Nucleic Acids Res. 2001, 29, 928-935.

113. Ito A, Koshikawa N, Mochizuki S, Omura K, Takenaga K. Hypoxia-inducible factor-1 mediates the expression of DNA polymerase iota in human tumor cells. Biochem Biophys Res Commun. 2006, 351, 306-311.

114. Lee GH, Nishimori H, Sasaki Y, Matsushita H, Kitagawa T, Tokino T. Analysis of lung tumorigenesis in chimeric mice indicates the Pulmonary adenoma resistance 2 (Par2) locus to operate in the tumor-initiation stage in a cell-autonomous manner: detection of polymorphisms in the Poli gene as a candidate for Par2. Oncogene. 2003, 22, 2374-2382.

115. Kannouche P, Fernández de Henestrosa AR, Coull B, Vidal AE, Gray C, Zicha D, Woodgate R, et al. Localization of DNA polymerases eta and iota to the replication machinery is tightly co-ordinated in human cells. EMBO J. 2003, 22, 1223-1233.

116. Ohashi E, Murakumo Y, Kanjo N, Akagi J, Masutani C, Hanaoka F, Ohmori H. Interaction of hREVl with three human Y-family DNA polymerases. Genes Cells. 2004, 9, 523-531.

117. Haracska L, Acharya N, Unk I, Johnson RE, Hurwitz J, Prakash L, Prakash S. A single domain in human DNA polymerase iota mediates interaction with PCNA: implications for translesion DNA synthesis. Mol Cell Biol. 2005, 25, 1183-1190.

118. Plosky BS, Vidal AE, Fernández de Henestrosa AR, McLenigan MP, McDonald JP, Mead S, Woodgate R. Controlling the subcellular localization of DNA polymerases iota and eta via interactions with ubiquitin. EMBO J. 2006, 25, 2847-2855.

119. Petta ТВ, Nakajima S, Zlatanou A, Despras E, Couve-Privat S, Ishchenko A, Sarasin A, et al. Human DNA polymerase iota protects cells against oxidative stress. EMBO J. 2008, 27, 2883-2895.

120. Caldecott KW. Protein-protein interactions during mammalian DNA single-strand break repair. Biochem Soc Trans. 2003, 31, 247-251.

121. Vidal AE, Woodgate R. Insights into the cellular role of enigmatic DNA polymerase iota. DNA Repair (Amst). 2009, 8, 420-423.

122. Frank EG, Woodgate R. Increased catalytic activity and altered fidelity of human DNA polymerase iota in the presence of manganese. J Biol Chem. 2007, 282, 24689-24696.

123. Pence MG, Blans P, Zink CN, Hollis T, Fishbein JC, Perrino FW. Lesion bypass of N2-ethylguanine by human DNA polymerase iota. J Biol Chem. 2009, 284, 1732-1740.

124. Kunkel ТА, Pavlov YI, Bebenek K. Functions of human DNA polymerases eta, kappa and iota suggested by their properties, including fidelity with undamaged DNA templates. DNA Repair (Amst). 2003, 2, 135-149.

125. Генинг JIB, Гришина EE, Петроченков АН, Тарантул ВЗ. Ассоциация повышенной активности ДНК-полимеразы йота с развитием увеальной меланомы человека. Генетика. 2006, 42, 98-103.

126. Генинг JIB, Петроченков АН, Решетняк АБ, Андреева JIE, Тарантул ВЗ. Активность, характерная для ДНК-полимеразы йота, в экстрактах клеток из разных органов мыши. Биохимия. 2004, 69, 537-543.

127. Генинг JIB, Макарова АВ, Малашенко AM, Тарантул ВЗ. Фальшивая нота ДНК-полимеразы йота в ансамбле сторожей генома млекопитающих. Биохимия. 2006, 71, 201-207.

128. Wang М, Devereux TR, Vikis HG, McCulloch SD, Holliday W, Anna C, Wang Y, et al. Pol iota is a candidate for the mouse pulmonary adenoma resistance 2 locus, a major modifier of chemically induced lung neoplasia. Cancer Res. 2004, 64, 1924-1931.

129. Kazakov AA, Makarova AV, Grishina EE, Tarantul VZ, Gening LV. Activity of DNA polymerase iota in human basal cell carcinoma. Current Topics in Biochemical Research. 2010, 12, 39-49.

130. Казаков AA, Генинг JIB, Гришина EE, Петроченков АН, Тарантул B3. Изменение баланса активности ДНК-полимераз в некоторых злокачественных опухолях. Медицинская генетика. 2008, 7, 32-39.

131. Казаков АА, Гришина ЕЕ, Тарантул ВЗ, Генинг J1B. Влияние злокачественного перерождения клеток человека на активность ДНК-полимеразы йота. Биохимия. 2010, 75, 1031-1039.

132. Keen CL, Ensunsa JL, Watson MH, Baly DL, Donovan SM, Monaco MH, Clegg MS. Nutritional aspects of manganese from experimental studies. Neurotoxicology. 1999, 20, 213-223.

133. Keen CL, Ensunsa JL, Clegg MS. Manganese metabolism in animals and humans including the toxicity of manganese. Met Ions Biol Syst. 2000, 37, 89-121.

134. Kondakis XG, Makris N, Leotsinidis M, Prinou M, Papapetropoulos T. Possible health effects of high manganese concentration in drinking water. Arch Environ Health. 1989, 44, 175-178.

135. Aschner M, Guilarte TR, Schneider JS, Zheng W. Manganese: recent advances in understanding its transport and neurotoxicity. Toxicol Appl Pharmacol. 2007, 221, 131-147.

136. Pal PK, Samii A, Calne DB. Manganese neurotoxicity: a review of clinical features, imaging and pathology. Neurotoxicology. 1999, 20, 227-238.

137. Lucchini RG, Martin CJ, Doney ВС. From manganism to manganese-induced parkinsonism: a conceptual model based on the evolution of exposure. Neuromolecular Med. 2009, 11,311-321.

138. Bagga P, Patel AB. Regional cerebral metabolism in mouse under chronic manganese exposure: implications for Manganism. Neurochem Int. 2012, 60, 177185.

139. Zhao F, Cai T, Liu M, Zheng G, Luo W, Chen J. Manganese induces dopaminergic neurodegeneration via microglial activation in a rat model of manganism. Toxicol Sci. 2009, 107, 156-164.

140. Klaassen CD. Biliary excretion of manganese in rats, rabbits, and dogs. Toxicol Appl Pharmacol. 1974, 29, 458-468.

141. Pomier-Layrargues G, Spahr L, Butterworth RF. Increased manganese concentrations in pallidum of cirrhotic patients. Lancet. 1995, 345, 735.

142. Burkhard PR, Delavelle J, Du Pasquier R, Spahr L. Chronic parkinsonism associated with cirrhosis: a distinct subset of acquired hepatocerebral degeneration. Arch Neurol. 2003, 60, 521-528.

143. Aschner M. Manganese: brain transport and emerging research needs. Environ Health Perspect. 2000, 108, 429-432.

144. Chandra SV, Shukla GS. Role of iron deficiency in inducing susceptibility to manganese toxicity. Arch Toxicol. 1976, 35, 319-323.

145. Erikson KM, Syversen T, Steinnes E, Aschner M. Globus pallidus: a target brain region for divalent metal accumulation associated with dietary iron deficiency. J Nutr Biochem. 2004, 15, 335-341.

146. Gitler AD, Chesi A, Geddie ML, Strathearn KE, Hamamichi S, Hill KJ, Caldwell KA, et al. Alpha-synuclein is part of a diverse and highly conserved interaction network that includes PARK9 and manganese toxicity. Nat Genet. 2009,41,308-315.

147. Chesi A, Kilaru A, Fang X, Cooper AA, Gitler AD. The role of the Parkinson's disease gene PARK9 in essential cellular pathways and the manganese homeostasis network in yeast. PLoS One. 2012, 7, e34178.

148. Beckman RA, Mildvan AS, Loeb LA. On the fidelity of DNA replication: manganese mutagenesis in vitro. Biochemistry. 1985, 24, 5810-5817.

149. El-Deiry WS, Downey KM, So AG. Molecular mechanisms of manganese mutagenesis. Proc Natl Acad Sci USA. 1984, 81, 7378-7382.

150. Zakour RA, Kunkel TA, Loeb LA. Metal-induced infidelity of DNA

synthesis. Environ Health Perspect. 1981, 40, 197-205.

106

151. Loeb LA, Kunkel TA. Fidelity of DNA synthesis. Annu Rev Biochem. 1982,51,429-457.

152. Ash DE, Schramm VL. Determination of free and bound manganese(II) in hepatocytes from fed and fasted rats. J Biol Chem. 1982, 257, 9261-9264.

153. Versieck J. Trace elements in human body fluids and tissues. Crit Rev Clin Lab Sei. 1985,22, 97-184.

154. Lee GH, Matsushita H. Genetic linkage between Pol iota deficiency and increased susceptibility to lung tumors in mice. Cancer Sei. 2005, 6, 256-259.

155. Ohkumo T, Kondo Y, Yokoi M, Tsukamoto T, Yamada A, Sugimoto T, Kanao R, et al. UV-B radiation induces epithelial tumors in mice lacking DNA polymerase eta and mesenchymal tumors in mice deficient for DNA polymerase iota. Mol Cell Biol. 2006, 26, 7696-7706.

156. Prasad R, Bebenek К, Hou E, Shock DD, Beard WA, Woodgate R, Kunkel TA, et al. Localization of the deoxyribose phosphate lyase active site in human DNA polymerase iota by controlled proteolysis. J Biol Chem. 2003, 278, 2964929654.

157. Малашенко AM, Бескова ТБ, Померанцева МД, Рамайя JIK. Сравнение трех инбредных линий мышей по общей и генетической радиочувствительности. Генетика животных. 2003, 39, 1247-1251.

158. Roderick ТН. The response of twenty seven inbred strains of mice to daily doses of whole body X-irradiation. Radiation Research. 1963, 20, 631-639.

159. Heaney JD, Nadeau JH. Testicular germ cell tumors in mice: new ways to study a genetically complex trait. Methods Mol Biol. 2008, 450, 211-231.

160. Simpson EM, Linder CC, Sargent EE, Davisson MT, Mobraaten LE, Sharp JJ. Genetic variation among 129 substrains and its importance for targeted mutagenesis in mice. Nat Genet. 1997, 16, 19-27.

161. Kawase E, Suemori H, Takahashi N, Okazaki K, Hashimoto K, Nakatsuji N. Strain difference in establishment of mouse embryonic stem (ES) cell lines. Int J Dev Biol.1994, 38, 385-390.

162. Suzuki О, Matsuda J, Takano К, Yamamoto Y, Asano T, Naiki M, Kusanagi M. Effect of genetic background on establishment of mouse embryonic stem cells. Exp Anim. 1999, 48, 213-216.

163. Inoue K, Ogonuki N, Mochida K, Yamamoto Y, Takano K, Kohda T, Ishino F, et al. Effects of donor cell type and genotype on the efficiency of mouse somatic cell cloning. Biol Reprod. 2003, 69, 1394-1400.

164. Albertella MR, Lau A, O'Connor MJ. The overexpression of specialized DNA polymerases in cancer. DNA Repair (Amst). 2005, 4, 583-593.

165. Conrad RC, Giver L, Tian Y, Ellington AD. In vitro selection of nucleic acid aptamers that bind proteins. Methods Enzymol. 1996, 267, 336-367.

166. Кульбачинский AB. Методы отбора аптамеров к белковым мишеням. Успехи биологической химии. 2006, 46, 193-224.

167. Bouchard PR, Hutabarat RM, Thompson K.M. Discovery and development of therapeutic aptamers. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 2010, 50, 237-257.

168. Cibiel A, Pestourie C, Duconge F. In vivo uses of aptamers selected against cell surface biomarkers for therapy and molecular imaging. Biochimie. 2012, 94, 1595-1606.

169. Ellington AD, Szostak JW. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 1990, 346, 818-822.

170. Tuerk C, Gold L. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science. 1990, 249,505-510.

171. Hermann T, Patel DJ. Adaptive recognition by nucleic acid aptamers. Science, 2000, 287, 820-825.

172. Nakamura Y, Ishiguro A, Miyakawa S. RNA plasticity and selectivity applicable to therapeutics and novel biosensor development. Genes Cells. 2012, 17,344-364.

173. Marimuthu C, Tang TH, Tominaga J, Tan SC, Gopinath SC. Single-stranded DNA (ssDNA) production in DNA aptamer generation. Analyst. 2012, 137, 1307-1315.

174. Mascini M, Palchetti I, Tombelli S. Nucleic acid and peptide aptamers: fundamentals and bioanalytical aspects. Angew Chem Int Ed Engl. 2012, 51, 13161332.

175. Liu J, You M, Pu Y, Liu H, Ye M, Tan W. Recent developments in protein and cell-targeted aptamer selection and applications. Curr Med Chem. 2011, 18, 4117-4125.

176. Feldheim DL, Eaton BE. Selection of biomolecules capable of mediating the formation of nanocrystals. ACS Nano. 2007, 1, 154-159.

177. Zaher HS, Unrau PJ. Selection of an improved RNA polymerase ribozyme with superior extension and fidelity. RNA. 2007, 13, 1017-1026.

178. Liu Y, Kuan CT, Mi J, Zhang X, Clary BM, Bigner DD, Sullenger BA. Aptamers selected against the unglycosylated EGFRvIII ectodomain and delivered intracellularly reduce membrane-bound EGFRvIII and induce apoptosis. Biol Chem. 2009,390, 137-144.

179. Sun W, Du L, Li M. Advances and perspectives in cell-specific aptamers. Curr Pharm Des. 2011, 17, 80-91.

180. Ye M, Hu J, Peng M, Liu J, Liu J, Liu LI, Zhao X, et al. Generating Aptamers by Cell-SELEX for Applications in Molecular Medicine. Int J Mol Sci. 2012, 13,3341-3353.

181. Wan Y, Liu Y, Allen PB, Asghar W, Mahmood MA, Tan J, Duhon H, et al. Capture, isolation and release of cancer cells with aptamer-functionalized glass bead array. Lab Chip. 2012, 12, 4693-4701.

182. Sheng W, Chen T, Kamath R, Xiong X, Tan W, Fan ZH. Aptamer-enabled efficient isolation of cancer cells from whole blood using a microfluidic device. Anal Chem. 2012, 84, 4199-4206.

183. Javier DJ, Nitin N, Levy M, Ellington A, Richards-Kortum R. Aptamer-targeted gold nanoparticles as molecular-specific contrast agents for reflectance imaging. Bioconjug Chem. 2008, 19, 1309-1312.

184. Khan SA, Kanchanapally R, Fan Z, Beqa L, Singh AK, Senapati D, Ray PC. A gold nanocage-CNT hybrid for targeted imaging and photothermal destruction of cancer cells. Chem Commun (Camb). 2012, 48, 6711-6713.

185. Göringer HU. Parasite-specific aptamers as biosynthetic reagents and potential pharmaceuticals. Trends Parasitol. 2012, 28, 106-113.

186. Moreno M, González VM. Advances on aptamers targeting Plasmodium and trypanosomatids. Curr Med Chem. 2011, 18, 5003-5010.

187. Kanoatov M, Javaherian S, Krylov SN. Selection of aptamers for a non-DNA binding protein in the context of cell lysate. Anal Chim Acta. 2010, 681, 9297.

188. Javaherian S, Musheev MU, Kanoatov M, Berezovski MV, Krylov SN. Selection of aptamers for a protein target in cell lysate and their application to protein purification. Nucleic Acids Res. 2009, 37, e62.

189. Han B, Zhao C, Yin J, Wang H. High performance aptamer affinity chromatography for single-step selective extraction and screening of basic protein lysozyme. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sei. 2012, 903, 112-117.

190. Arnau J, Lauritzen C, Petersen GE, Pedersen J. Current strategies for the use of affinity tags and tag removal for the purification of recombinant proteins. Protein Expr Purif. 2006, 48, 1-13.

191. Soontornworajit B, Wang Y. Nucleic acid aptamers for clinical diagnosis: cell detection and molecular imaging. Anal Bioanal Chem. 2011, 399, 1591-1599.

192. Hong P, Li W, Li J. Applications of aptasensors in clinical diagnostics. Sensors (Basel). 2012, 12, 1181-1193.

193. Bruno JG, Richarte AM, Carrillo MP, Edge A. An aptamer beacon responsive to botulinum toxins. Biosens Bioelectron. 2012, 31, 240-243.

194. Lauridsen LH, Shamaileh HA, Edwards SL, Taran E, Veedu RN. Rapid one-step selection method for generating nucleic acid aptamers: development of a DNA aptamer against a-bungarotoxin. PLoS One. 2012, 7, e41702.

195. Shin S, Kim IH, Kang W, Yang JK, Hah SS. An alternative to Western blot analysis using RNA aptamer-functionalized quantum dots. Bioorg Med Chem Lett. 2010, 20,3322-3325.

196. Tan X, Chen W, Lu S, Zhu Z, Chen T, Zhu G, You M, et al. Molecular beacon aptamers for direct and universal quantitation of recombinant proteins from cell lysates. Anal Chem. 2012, 84, 8272-8276.

197. Orozco J, Campuzano S, Kagan D, Zhou M, Gao W, Wang J. Dynamic isolation and unloading of target proteins by aptamer-modified microtransporters. Anal Chem. 2011, 83, 7962-7969.

198. Huang Y, Zhao S, Chen ZF, Shi M, Liang LI. Amplified fluorescence polarization aptasensors based on structure-switching-triggered nanoparticles enhancement for bioassays. Chem Commun (Camb). 2012, 48, 7480-7482.

199. Han K, Liang Z, Zhou N. Design strategies for aptamer-based bioensors. Sensors (Basel). 2010, 10, 4541-4557.

200. Ocana C, Pacios M, del Valle M. A reusable impedimetric aptasensor for detection of thrombin employing a graphite-epoxy composite electrode. Sensors (Basel). 2012, 12,3037-3048.

201. Missailidis S, Hardy A. Aptamers as inhibitors of target proteins. Expert Opin Ther Pat. 2009, 19, 1073-1082.

202. Huang YZ, Hernandez FJ, Gu B, Stockdale KR, Nanapaneni K, Scheetz TE, Behlke MA, et al. RNA Aptamer-Based Functional Ligands of the Neurotrophin Receptor, TrkB. Mol Pharmacol. 2012, 82, 623-635.

203. Pastor F, Kolonias D, McNamara JO 2nd, Gilboa E. Targeting 4-lBB costimulation to disseminated tumor lesions with bi-specific oligonucleotide aptamers. Mol Ther. 2011, 19, 1878-1886.

204. Blank M, Blind M. Aptamers as tools for target validation. Curr Opin Chem Biol. 2005, 9, 336-342.

205. Gavin AC, Bosche M, Krause R, Grandi P, Marzioch M, Bauer A, Schultz J, et al. Functional organization of the yeast proteome by systematic analysis of

protein complexes. Nature. 2002, 415, 141-147.

Ill

206. Pieroni E, de la Fuente van Bentem S, Mancosu G, Capobianco E, Hirt H, de la Fuente A. Protein networking: insights into global functional organization of proteomes. Proteomics. 2008, 8, 799-816.

207. Good PD, Krikos AJ, Li SX, Bertrand E, Lee NS, Giver L, Ellington A, et a. Expression of small, therapeutic RNAs in human cell nuclei. Gene Ther. 1997, 4, 45-54.

208. Binning JM, Leung DW, Amarasinghe GK. Aptamers in virology: recent advances and challenges. Front Microbiol. 2012, 3, 29.

209. Gopinath SC, Hayashi K, Kumar PK. Aptamer that binds to the gD protein of herpes simplex virus 1 and efficiently inhibits viral entry. J Virol. 2012, 86, 6732-6744.

210. Mufhandu HT, Gray ES, Madiga MC, Tumba N, Alexandre KB, Khoza T, Wibmer CK, et al. UCLA1, a synthetic derivative of a gpl20 RNA aptamer, inhibits entry of human immunodeficiency virus type 1 subtype C. J Virol. 2012, 86, 4989-4999.

211. Chu TC, Marks JW 3rd, Lavery LA, Faulkner S, Rosenblum MG, Ellington AD, Levy M. Aptamer.toxin conjugates that specifically target prostate tumor cells. Cancer Res. 2006, 66, 5989-5992.

212. Zhang Y, Hong H, Cai W. Tumor-targeted drug delivery with aptamers. Curr Med Chem. 2011, 18, 4185-4194.

213. Orava EW, Cicmil N, Gariepy J. Delivering cargoes into cancer cells using DNA aptamers targeting internalized surface portals. Biochim Biophys Acta. 2010, 1798,2190-2200.

214. Zhu Q, Shibata T, Kabashima T, Kai M. Inhibition of HIV-1 protease expression in T cells owing to DNA aptamer-mediated specific delivery of siRNA. Eur J Med Chem. 2012, 56, 396-399.

215. Yu B, Tai HC, Xue W, Lee LJ, Lee RJ. Receptor-targeted nanocarriers for therapeutic delivery to cancer. Mol Membr Biol. 2010, 27, 286-298.

216. Talekar M, Kendall J, Denny W, Garg S. Targeting of nanoparticles in

cancer: drug delivery and diagnostics. Anticancer Drugs. 2011, 22, 949-962.

112

217. Kang H, O'Donoghue MB, Liu H, Tan W. A liposome-based nanostructure for aptamer directed delivery. Chem Commun (Camb). 2010, 46, 249-251.

218. Chen CH, Dellamaggiore KR, Ouellette CP, Sedano CD, Lizadjohry M, Chernis GA, et al. Aptamer-based endocytosis of a lysosomal enzyme. Proc Natl Acad Sci USA. 2008, 105, 15908-15913.

219. Yan X, Gao X, Zhang Z. Isolation and characterization of 2'-amino-modified RNA aptamers for human TNFalpha. Genomics Proteomics Bioinformatics. 2004, 2, 32-42.

220. Kuwahara M, Sugimoto N. Molecular evolution of functional nucleic acids with chemical modifications. Molecules. 2010, 15, 5423-5444.

221. Li N, Nguyen HH, Byrom M, Ellington AD. Inhibition of cell proliferation by an anti-EGFR aptamer. PLoS One. 2011, 6, e20299.

222. Hernandez FJ, Stockdale KR, Huang L, Horswill AR, Behlke MA, McNamara JO 2nd. Degradation of nuclease-stabilized RNA oligonucleotides in Mycoplasma-contaminated cell culture media. Nucleic Acid Ther. 2012, 22, 58-68.

223. Beigelman L, Matulic-Adamic J, Haeberli P, Usman N, Dong B, Silverman RH, Khamnei S, et al. Synthesis and biological activities of a phosphorodithioate analog of 2',5'-oligoadenylate. Nucleic Acids Res. 1995, 23, 3989-3994.

224. Di Giusto DA, Knox SM, Lai Y, Tyrelle GD, Aung MT, King GC. Multitasking by multivalent circular DNA aptamers. Chembiochem. 2006, 7, 535544.

225. Levin AA. A review of the issues in the pharmacokinetics and toxicology of phosphorothioate antisense oligonucleotides. Biochim Biophys Acta. 1999, 1489, 69-84.

226. Eulberg D, Klussmann S. Spiegelmers: biostable aptamers. ChemBioChem. 2003, 4, 979-983.

227. Turner JJ, Hoos JS, Vonhoff S, Klussmann S. Methods for L-ribooligonucleotide sequence determination using LCMS. Nucleic Acids Res. 2011, 39, el47.

228. Pasut G, Veronese FM. State of the art in PEGylation: the great versatility achieved after forty years of research. J Control Release. 2012, 161, 461-472.

229. Milla P, Dosio F, Cattel L. PEGylation of proteins and liposomes: a powerful and flexible strategy to improve the drug delivery. Curr Drug Metab. 2012, 13, 105-119.

230. Tan L, Neoh KG, Kang ET, Choe WS, Su X. PEGylated anti-MUCl aptamer-doxorubicin complex for targeted drug delivery to MCF7 breast cancer cells. Macromol Biosci. 2011, 11, 1331-1335.

231. Boomer RM, Lewis SD, Healy JM, Kurz M, Wilson C, McCauley TG. Conjugation to polyethylene glycol polymer promotes aptamer biodistribution to healthy and inflamed tissues. Oligonucleotides. 2005, 15, 183-195.

232. Rusconi CP, Roberts JD, Pitoc GA, Nimjee SM, White RR, Quick G Jr, Scardino E, et al. Antidote-mediated control of an anticoagulant aptamer in vivo. Nat Biotechnol. 2004, 22, 1423-1428.

233. Marshall KA, Ellington AD. In vitro selection of RNA aptamers. Methods Enzymol. 2000, 318, 193-214.

234. McDonald JP, Frank EG, Plosky BS, Rogozin IB, Masutani C, Hanaoka F, Woodgate R, et al. 129-derived strains of mice are deficient in DNA polymerase i and have normal immunoglobulin hypermutation. J Exp Med. 2003, 198, 635-643.

235. Muñoz-Pinedo C, El Mjiyad N, Ricci JE. Cancer metabolism: current perspectives and future directions. Cell Death Dis. 2012, 3, e248.

236. Herling A, König M, Bulik S, Holzhiitter HG. Enzymatic features of the glucose metabolism in tumor cells. FEBS J. 2011, 278, 2436-2459.

237. Blanca G, Shevelev I, Ramadan K, Villani G, Spadari S, Hübscher U, Maga G. Human DNA polymerase lambda diverged in evolution from DNA polymerase beta toward specific Mn(++) dependence: a kinetic and thermodynamic study. Biochemistry. 2003, 42, 7467-7476.

238. Domínguez O, Ruiz JF, Lain de Lera T, García-Díaz M, González MA, Kirchhoff T, Martínez-A C, et al. DNA polymerase mu (Pol mu), homologous to

TdT, could act as a DNA mutator in eukaryotic cells. EMBO J. 2000, 19, 17311742.

239. Wang TS, Eichler DC, Korn D. Effect of Mn2+ on the in vitro activity of human deoxyribonucleic acid polymerase beta. Biochemistry. 1977, 16, 49274934.

240. Loeb LA, Springgate CF, Battula N. Errors in DNA replication as a basis of malignant changes. Cancer Res. 1974, 34, 2311-2321.

241. Bergoglio V, Pillaire MJ, Lacroix-Triki M, Raynaud-Messina B, Canitrot Y, Bieth A, Garés M, et al. Deregulated DNA polymerase beta induces chromosome instability and tumorigenesis. Cancer Res. 2002, 62, 3511-3514.

242. Canitrot Y, Cazaux C, Fréchet M, Bouayadi K, Lesca C, Salles B, Hoffmann JS. Overexpression of DNA polymerase beta in cell results in a mutator phenotype and a decreased sensitivity to anticancer drugs. Proc Natl Acad Sei USA. 1998, 95, 12586-12590.

243. Cerchia L, de Franciscis V. Targeting cancer cells with nucleic acid aptamers. Trends Biotechnol. 2010, 28, 517-525.

244. Sarkar G, Yoon HS, Sommer SS. Screening for mutations by RNA singlestrand conformation polymorphism (rSSCP): comparison with DNA-SSCP. Nucleic Acids Res. 1992, 20, 871-878.

245. Gening LV, Klincheva SA, Reshetnjak A, Grollman AP, Miller H. RNA aptamers selected against DNA polymerase beta inhibit the polymerase activities of DNA polymerases beta and kappa. Nucleic Acids Res. 2006, 34, 2579-2586.

246. Oktem HA, Bayramoglu G, Ozalp VC, Arica MY. Single-step purification of recombinant Thermus aquaticus DNA polymerase using DNA-aptamer immobilized novel affinity magnetic beads. Biotechnol Prog. 2007, 23, 146-154.