Изучение иммуностимулирующей активности естественных и синтетических олигодезоксинуклеотидов бактерильной ДНК тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.00.36, кандидат медицинских наук Пак, Владимир Геннадьевич

• Пак, Владимир Геннадьевич
• кандидат медицинских наук
• 2006

Оглавление диссертации кандидат медицинских наук Пак, Владимир Геннадьевич

Список сокращений.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Бактериальная ДНК.

Краткая история.

Структурное строение ДНК.

Структурные различия ДНК прокариотов от эукариотов.

Основные типы Срв ОДН.

Б» или «А» тип ОДН.

К» или «В» тип ОДН.

С» тип ОДН.

Иммуностимулирующие эффекты Срв ОДН.

В-лимфоциты.

Моноциты и макрофаги. и Т-лимфоциты.

Нейтрофилы.

Молекулярные механизмы стимуляции иммунокомпетентных клеток СрС

Распознавание Срв ДНК.

ТЬЯ-9, БКА-РКз.

Индукция врожденного и адаптивного иммунного ответа.

Устойчивость к инфекциям.

Адъювантные свойства.

Возможность иммунотерапии при аллергических состояниях.

Противоопухолевые эффекты Срв ДНК.

Срв ДНК как адъювант опухолевых вакцин.

Эффекты на различных экспериментальных моделях.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Реактивы.

Оборудование.

Получение естественных ОДН.

Определение АОК к ЭБ после подкожного введения CpG мотивов естественных и синтетических ОДН.

Анализ хемилюминесценции фагоцитарных клеток.

Забор крови и выделение МНК.

Определение митогенных свойств ОДН в культуре МНК здоровых доноров

Определение NK-литической активности МНК здоровых доноров после инкубации с CpG ОДН.

Продукция внутриклеточной перекиси водорода лейкоцитами.

Продукция цитокинов МНК здоровых доноров.

Определение провоспалительных Thl-зависимых цитокинов in vivo.

Определение NK-активности спленоцитов мышей после введения ОДН.

Анализ поглотительной и бактерицидной активности клеток перитонеального экссудата мышей.

Анализ поглотительной активности клеток перитонеального экссудата мышей.

Анализ внутриклеточного киллинга бактерий.

Резистентность мышей к экспериментальной инфекции.

Статистическая обработка данных.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Влияние ДНК Е. coli Ml7, естественных и синтетических ОДН на гуморальный иммунный ответ.

Влияние ДНК и ОДН на хемилюминесценцию спленоцитов.

Влияние- различных типов ОДН на пролиферативную активность МНК здоровых доноров.

Влияние ОДН на NK-литическую активность МНК здоровых доноров.

Влияние различных типов ОДН на образование внутриклеточной перекисиводорода.

Влияние ОДН на продукцию МНК здоровых доноров ИЛ-12р

Продукция ИФН-а МНК здоровых доноров индуцированная ОДН.

Влияние ОДН на продукцию ИФН-у МНК доноров

Влияние на продукцию цитокинов in vivo.

Уровень сывороточного ИЛ-12р70 мышей после введения ss ODN, 2395ps,

2006ps.

Влияние ss ODN, 2006ps, 2395ps на уровень ИЛ-12р70 in vivo спленоцитами.

Влияние ss ODN, 2006ps, 2395ps на уровень ИФН-у спленоцитами.

Влияние ss ODN, 2006ps, 2395ps на NK-литическую активность спленоцитов мышей к Yac-1.

Влияние ОДН на поглощение и бактерицидность клеток перитонеального экссудата после внутрибрюшинного введения мышам.

Влияние ОДН на неспецифическую резистентность мышей к экспериментальной инфекции.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Изучение иммуностимулирующей активности естественных и синтетических олигодезоксинуклеотидов бактерильной ДНК»

Актуальность темы диссертации Одной из актуальных задач современной медицины является создание высокоэффективных иммуномодуляторов, лекарственных средств, восстанавливающих функции иммунной системы и обладающих избирательным действием на иммунную систему, а таюке усиливающих иммунный ответ - иммуностимуляторов. Главной мишенью применения иммуномодулирующих препаратов являются вторичные иммунодефицита, которые проявляются в частых, рецидивирующих, трудно поддающихся лечению инфекционно-воспалительных заболеваниях различных локализаций. В основе любого хронического инфекционно-воспалительного процесса лежат те или иные изменения в иммунной системе, которые и являются одной из причин существования этого процесса.Иммуномодуляторы могут применяться в виде монотерапии и в комплексной терапии. Применение иммуномодуляторов в лечении онкологических заболеваний является перспективным направлением клинической иммунологии и онкологии. Целесообразным является применение иммуномодулирующей терапии при аллергических заболеваниях, особенно, когда эти заболевания осложнены какими-либо проявлениями вторичной иммунологической недостаточности: например атопический дерматит с пиодермией [Хаитов P.M., Пинегин Б.В., 1996, Хаитов P.M., Пинегин Б.В., 2000].Модулирование иммунного ответа является одним из главных направлений применения новых иммунотерапевтических средств при воспалительных и иммунных нарушениях. Всё больше информации поступает о роли врожденной иммунной системы, включающей открытие новых лигандов для рецепторов врожденного иммунитета, с их сигнальными путями, что даёт новые подходы подбора иммунотерапевтических средств.Несомненно, что все аспекты иммунного ответа контролируются комбинацией факультативных и инструктивных сигналов более древней системы врожденного иммунитета [Medzhitov, 2001]. Врождённая иммунная система активируется при контакте с патоген ассоциированными молекулярными паттернами (РАМР). Активация врожденного иммунитета сопровождается продукцией цитокинов, хемокинов и полиреактивных IgM антител [Medzhitov R., 1997]. Одним из перспективных направлений, является создание препаратов на основе бактериальной ДНК, содержащей неметилированные последовательности гуанина-цитозина (CpG).Прокариотическая ДНК является РАМР и оценивается иммунной системой позвоночных как чужеродная, благодаря высокому содержанию в ней неметилированных фрагментов CpG [Bird et al., 1987]. Синтетические ОДН, содержащие CpG, являются аналогами бактериальной ДНК и вызывают активацию иммунной системы [Tokunaga et al., 1988; Kuramoto et al., 1992]. Иммуномодуляторные ОДН обладают различными терапевтическими эффектами: обеспечивают защиту от инфекционных агентов [Yamamoto et al., 1994; Klinman et al., 1999; Verthelyi et al., 2003], действуют как вакцинные адьюванты [Horner et al, 1998; Klinman et al., 2000; Halpern et al., 2003], предотвращают развитие аллергии, стимулируя развитие ТЫ-зависимого ответа [Kline et al., 1998; Sur et al., 1999; Horner et al., 2002], эффективны при иммуннотерапии опухолей [Wickstrom Е., 1997; Smith et al., 1998; Hafner et al., 2001]. Клинические испытания на добровольцах показали, что содержащие CpG олигодезоксинуклеотиды способны повышать продукцию антигенспецифических антител [Halpern et al., 2003; Klinman et al., 2000].В настоящее время в России на фоне постоянного повышения общей заболеваемости населения, ведётся разработка новых иммунотерапевтических средств, обладающих иммуномодулирующими и иммуностимулирующими свойствами, поэтому является актуальным изучение CpG ОДН, как нового иммуномодулятора, и дальнейшее внедрение его в качестве иммунотерапевтического средства в клиническую практику.Цель работы Целью работы является оценка и сравнение иммуностимулирующей активности естественных и синтетических ОДН, для отбора веществ с оптимальными свойствами, и дальнейшее продвижение работ по созданию нового высокоэффективного иммуномодулятора.Задачи исследования 1. Исследовать влияние естественных и синтетических ОДН на развитие гуморального и клеточного иммунного ответа.2. Изучить влияние естественных и синтетических ОДН на функциональную активность мононуклеарных клеток человека in vitro: продукцию внутриклеточной перекиси, продукцию цитокинов.3. Исследовать влияние естественных и синтетических ОДН па продукцию цитокинов in vivo.4. Изучить влияние естественных и синтетических ОДН на процесс поглощения, бактерицидность и NK-литическую активность in vivo.5. Исследовать влияние изучаемых ОДН на резистентность мышей к стафилококковой инфекции.Научная новизна Показана способность отобранных веществ вызывать бласттрансформацию, индуцировать синтез цитокинов: интерферонов-а, у, ИЛ-12, а также повышать NK-литическую активность естественных киллерных лимфоцитов в культуре мононуклеарных клеток периферической крови человека. Установлено, что фосфоротиоатные CpG ОДН вызывают достоверное увеличение внутриклеточной перекиси водорода в нейтрофилах и моноцитах периферической крови здоровых доноров.Изучена иммуностимулирующая активность естественных и синтетических ОДН с помощью комплекса методов, позволяющих оценивать различные звенья врожденного иммунитета in vivo, а именно, способность веществ естественных и синтетических ОДН вызывать индукцию провоспалительных цитокинов, повышать NK-литическую активность спленоцитов стимулированных мышей, увеличивать бактерицидность клеток перитонеального экссудата мышей. Изучена способность веществ вызывать индукцию интерлейкина-12р70 (ИЛ-12р70), интерферона гамма (ИФН-у) спленоцитами, после внутрибрюшинного введения. Выявлено различное влияние естественных ОДН и синтетических фосфоротиоатных ОДН на процесс антителообразования у мышей к Т-зависимому антигену.Практическая значимость работы Практическая значимость работы заключается в комплексном исследовании действия серии синтетических фосфородиэфирных, фосфоротиоатных, смешанных ОДН и естественных ОДН из ДНК E.coli штамма Ml7, отборе ОДН, обладающих оптимальной иммунотропной активностью, что является основой для создания принципиально нового поколения иммуномодулирующих препаратов.

Заключение диссертации по теме «Аллергология и иммулология», Пак, Владимир Геннадьевич

Выводы

1. Установлено, что наиболее значимо стимулируют процесс антителообразования ss ODN, а все синтетические фосфоротиоатные ОДН подавляют. При исследовании влияния естественных и синтетических ОДН на бластгрансформацию лимфоцитов и NK-литическую активность здоровых доноров выявлено, что ИС бластгрансормации и процент лизиса мишеней был выше после стимуляции синтетическим фосфоротиоатпым ОДН 2395ps. Для дальнейшего изучения иммунотропного потенциала веществ выбраны: естественные ss ODN, синтетические фосфоротиоатные ОДН 2395ps и 2006ps.

2. Установлено, что синтетические фосфоротиоатные ОДН 2395ps и 2006ps вызывали увеличение содержания внутриклеточной перекиси водорода нейтрофилами и моноцитами. Эффект ss ODN менее выражен. Синтетический фосфоротиоатный ОДН 2395ps стимулировал наиболее мощную продукцию цитокинов ИЛ-12р70, ИФН-а, -у, в культуре мононуклеарных лейкоцитов здоровых доноров.

3. Установлено, что ss ODN, 2395ps, 2006ps вызывают продукцию провоспалительных цитокинов ИЛ-12р70, ИФН-у in vivo, что является сигналом для активации иммунной системы по Thl -зависимому пути.

4. Установлено, что все вещества повышают NK-активность, бактерицидность клеток перитонеального экссудата мышей и не влияют на поглощение клетками перитонеального экссудата FITC-меченного стафилококка invivo.

5. Установлено, что ss ODN и 2395ps повышают резистентность к стафилококковой инфекции, иммуностимулирующая активность синтетического фосфоротиоатного ОДН 2395ps более выражена.

Заключение

Исследована иммуностимулирующая активность принципиально нового типа препаратов бактериального происхождения, а именно, естественных ОДН и различных типов синтетических ОДН, на развитие гуморального и клеточного иммунного ответа in vitro и in vivo. В ходе исследования выявлено, что естественные ОДН бактериальной ДНК e.coli Ml 7 и фосфородиэфирные ОДН «А» типа, достоверно повышают антителообразование мышей, иммунизированных ЭБ. Синтетические фосфоротиоатные ОДН «В» и «С» типов достоверно подавляют процесс антителообразования. При оценке влияния естественных и синтетических ОДН на пролиферацию мононуклеарных клеток здоровых доноров выявлено, что естественные ss ODN и синтетические ОДН фосфородиэфирной модификации обладают слабыми митогенными свойствами, а при отсутствии CpG динуклеотидов в составе ОДН, не вызывают бластгрансформации лимфоцитов периферической крови здоровых доноров. Синтетические фосфоротиоатные ОДН, вне зависимости

87 от наличия или отсутствия CpG динуклеотидов, обладают митогенными свойствами, причём при наличии CpG динуклеотидов, эффект более выражен. Выявлено, что естественные ss ODN и синтетические фосфоротиоатные ОДН «В» и «С» типов, достоверно повышают литическую активность NK-лимфоцитов in vivo, причём эффект при введении ss ODN и синтетических ОДН «С» типа, более выражен. Синтетические ОДН «С» типа, ss ODN, синтетические ОДН «А» типа, имеющие смешанный фосфоротиоатный-фосфодиэфирный остов, в культуре мононуклеаров периферической крови здоровых доноров, вызывают наиболее значимое увеличение NK-литической активности. Синтетические ОДН «В» типа, также увеличивают литическую активность NK-лимфоцитов, но слабее.

Изучено влияние естественных и синтетических ОДН на функциональную активность мононуклеарных клеток человека in vitro: продукцию внутриклеточной перекиси, продукцию цитокинов и интерферонов. Выявлено, что синтетические ОДН «С» типа, значительно повышали уровень внутриклеточной перекиси водорода нейтрофилами и моноцитами (нейтрофилами более чем в 6 раз, моноцитами более чем в 5 раз). Синтетические ОДН «В» типа также повышали уровень внутриклеточной перекиси водорода (нейтрофилами и моноцитами более чем в 3 раза), естественные ss ODN приблизительно в 2 раза, в нейтрофилах и моноцитах периферической крови здоровых доноров. Увеличение образования в микромолярпых количествах внутриклеточной перекиси водорода [Krieg et al, 2001], которая обладает способностью взаимодействать с 1кВ-субъединицей фактора транскрипции NF-кВ, ведет к активации NF-kB. Активация NF-кВ приводит к активации клетки и запуску синтеза провоспалительных цитокинов. При стимуляции мононуклеаров синтетическими ОДН «С» типа выявлено более высокое увеличение концентрации в супериатантах ИЛ-12р70 и ИФН-у, чем при стимуляции естественными или синтетическими ОДН «В» типа. Естественные ss ODN сильнее вызывали продукцию ИФН-а, по сравнению с синтетическими ОДН «С» типа. Исследовано влияние естественных и синтетических ОДН на продукцию цитокинов in vivo. Выявлено, что синтетические ОДН «В» и «С» типов, в результате однократного внутрибрюшинного введения, достоверно повышали уровень сывороточного ИЛ-12р70 и продукцию спленоцитами ИЛ-12р70 и ИФН-у. Естественные ss ODN оказывали слабое влияние на продукцию ИЛ-12р70 и ИФН-у и спленоцитами, и мононуклеарами периферической крови человека, но оставались стойкими индукторами ИФН-а. Кроме того, ss ODN индуцировали синтез ИЛ-10 макрофагами, полученными из моноцитов периферической крови здоровых доноров в результате культивирования с ГМ-КСФ (результаты не представлены). Высокие уровни ИЛ-10 отмечались после введения ss ODN в сыворотках мышей (результаты не приведены). Вероятно, что повышение антителообразования, после введения ss ODN, связано именно с ИЛ-10, являющимся цитокином, усиливающим синтез IgM антител. Можно предположить, что повышение NK-литической активности, бактерицидности вызываемое ss ODN, опосредовано ИФН-а и высоким уровнем IgM антител.

Изучено влияние синтетических ОДН «В» и «С» типов на поглощение и бактерицидность in vivo. Оба типа увеличивали бактерицидность клеток перитонеального экссудата. Естественные и синтетические ОДН «В» и «С» типов не влияют на процесс поглощения клетками перитонеального экссудата после внутрибрюшинного введения. Бактерицидность клеток перитонеального экссудата значительно возрастала после введения синтетических ОДН «В» и «С» типов, менее после введения ss ODN. NK-литическая активность спленоцитов мышей наиболее значимо возрастала после внутрибрюшинного введения синтетического ОДН 2395ps и ss ODN, стимуляция синтетическим ОДН «В» типа 2006ps менее выражена. Таким образом, можно отметить, что синтетический фосфоротиоатный ОДН 2395ps действительно обладает свойствами ОДН «В» типа и естественных ОДН.

Исследовано влияние изучаемых олигодезоксинуклеотидов на резистентность мышей к стафилококковой инфекции. Выбранные ОДН «С» типа и естественные ss ODN, практически одинаково увеличивали неспецифическую резистентность мышей к стафилококковой инфекции, после однократного введения.

В результате НИР проведена оценка и сравнение иммуностимулирующих эффектов естественных ОДН и синтетических ОДН «С» и «В» типов. Отобраны вещества с оптимальными имммуностимулирующими свойствами для дальнейшего продвижения работ по созданию нового высокоэффективного иммуномодулятора.

Суммируя полученные данные, можно заключить, что естественные и синтетические ОДН обладают определёнными иммуностимулирующими свойствами и могут быть предложены для дальнейшего исследования. Однако использование синтетических фосфоротиоатных ОДН в качестве нового иммунотерапевтического выглядит предпочтительнее, вследствие более устойчивого фосфоротиоатного остова и известной последовательности ОДН. Невозможность использования природных ОДН, прежде всего, объясняется тем, что они быстро разрушаются в клетке, а также естественные ОДН получаются в результате разрушения ультразвуком, что приводит к образованию случайных последовательностей. Применение случайных последовательностей нежелательно, так как уже известны данные не только по иммуностимулирующим последовательностям - AACGTT, AGCGCT, ATCGAT, CGATCG, CGCGCG, TCGCGA, но и по иммунонейтрализующим последовательностям -GCGCGC, GCGGCG, GGCGGC, GCCGCC, CGCCGC [Krieg A.M., 1999]. Фосфоротиоатные ОДН «С» типа обладают выраженными иммуностимулирующими свойствами по сравнению с остальными типами ОДН и могут быть предложены для дальнейшего изучения.

Список литературы диссертационного исследования кандидат медицинских наук Пак, Владимир Геннадьевич, 2006 год

1. Jlycc Л.В., Некрасов А.В., Пучкова Н.Г., Бхардварж А., Бхардварж Л.А Роль иммуномодулирующей терапии в общеклинической практике. Иммунология, 2000, N 5, с. 34-39.

2. Манько В.М., Петров Р.В., Хаитов P.M. Иммуномодуляция: история, тенденции развития, современное состояние и перспективы. Иммунология, 2002, N3, с. 132-138.

3. Хаитов P.M., Пинегин Б.В. Иммуномодуляторы и некоторые аспекты их клинического применения. Клиническая медицина, 1996, N8, с.7-12.

4. Хаитов P.M., Пинегин Б.В. Современные иммуномодуляторы: основные принципы их применения. Иммунология, 2000, N5, с.4-8.

5. Ярилин А.А. Основы иммунологии. Учебник. М., Медицина, 1999.

6. Akira S., Takeda К. & Kaisho Т. Toll-like receptors: critical proteins linking innate and acquired immunity. Nature Immunol., 2001, v. 2, p. 675-680.

7. Akira S., Takeda K. Toll-like receptors signaling. Nature, 2004, v.4 p.499-511.

8. Ballas Z., Krieg A.M., Warren T.L., Rasmussen W.L., Davis H.L., Waldschmidt M., Weiner G.J. Divergent therapeutic and immunologic effects of oligodeoxynucleotides with distinct CpG motifs. J. Immunol., 2001, v. 167, p.4878-4886.

9. Ballas Z.K., Rasmussen W.L., Krieg A.M. Induction of NK activity in murine and human cells by CpG motifs in oligodeoxynucleotides and bacterial DNA. J. Immunol., 1996, v. 157, N5, p. 1840-1845.

10. Bass D.A., Parce J. W., Decyaitelet L. R., Szeijga P., Seeds M.C., Thomas M. Flow cytometric studies of oxidative product formation by neutrophils: a92graded response to membrane stimulation. J. Immunol., 1983, v. 130, N4, p.1910-1917.

11. Behboudi S., Chao D., Klenerman P., Austyn J. The effects of DNA containing CpG motif on dendritic cells. Immunology, 2000, v.99, N3, p.361-366.

12. Bird A.P. CpG islands as gene markers in the vertebrate nucleus. Trends Genet., 1987, v.3, p.342-347.

13. Boggs R.T., McGraw K., Condon T., Flournoy S., Villiet P., Bennett C.F., Monia B.P., Characterization and modulation of immune stimulation by modified oligonucleotides. Antisense Nucleic Acid Drug Dev., 1997, v.7, N5, p.461-471.

14. Carpentier A.F., Chen L., Maltonti F., Delattre J.Y. Oligodeoxynucleotides containing CpG motifs can induce rejection of a neuroblastoma in mice. Cancer Res., 1999, v.59, p.5429-5432.

15. Dow S.W., Fradkin L.G., Liggitt D.H., Willson A.P., Heath T.D., Potter T.A. Lipid-DNA complexes induce potent activation of innate immune responses and antitumor activity when administered intravenously. J. Immunol., 1999, v.163, N3, p.1552-1561.

16. Edwards L., Williams A.E., Krieg A.M., Rae A.J., Snelgrove R.J., Hussell T. Stimulation via Toll-like receptor 9 reduces Cryptococcus neoformans-induced pulmonary inflammation in an IL-12-dependent manner. Eur. J. Immunol., 2005, v.35, N1, p.273-281.

17. Fearon D.T., Locksley R.M. The instructive role of innate immunity in the acquired immune response. Science, 1996, v.272, p.50-53.

18. Fitzgerald-Bocarsly P. Human natural interferon-alpha producing cells. Pharmacol. Ther., 1993, v.60, p.39-62.

19. Glik B., Pasternak J., Molecular Biotehnology, 1998, 2-nd edition.

20. Hafner M., Zawatzky R., Hirtreiter C., Buurman W.A., Echtenacher B., Hehlgans T., Mannel D.N. Antimetastatic effect of CpG DNA mediated by type IIFN. Cancer Res., 2001, v.61, N14, p.5523-5528.

21. Halpern S. A phase I study of the safety and immunogenicity of recombinant hepatitis B surface antigen co-administered with an immunostimulatory phosphorothioate oligonucleotide adjuvant. Vaccine, 2003, v.21, p.2461-2467.

22. Han J., Zhu Z., Hsu C., Finley W.H. Selection of antisense oligonucleotides on the basis of genomic frequency of the target sequence. Antisense Res. Dev., 1994, v.4,Nl,p. 53-65.

23. Hartmann G. Rational design of new CpG oligonucleotides that combine B cell activation with high IFN-a induction in plasmacytoid dendritic cells. Eur. J. Immunol., 2003, v. 33, p. 1633-1641.

24. Hartmann G., Krieg A.M. CpG DNA and LPS induce distinct patterns of activation in human monocytes. Gene Ther., 1999, v.6, N5, p.893-903.

25. Hartmann G., Weiner G.J., Krieg A.M. CpG DNA: a potent signal for growth, activation, and maturation of human dendritic cells. Proc. Natl. Acad. Sci., 1999, v.96, N16, p.9305-9310.

26. Hemmi H.A. Toll-like receptor recognizes bacterial DNA. Nature, 2000, v.408, p.740-745.

27. Hensley K., Robinson K.A., Gabbita S.P., Salsman S., Floyd R.A. Reactive oxygen species, cell signaling, and cell injury. FRB &M, 2000, v.28, N10, p.1456-1462.

28. Horner A.A., Nguyen M.D., Ronaghy A., Cinman N., Verbeek S., Raz E. DNA-based vaccination reduces the risk of lethal anaphylactic hypersensitivity in mice. J. Allergy Clin. Immunol., 2000, v.106, p.349-356.

29. Horner A.A., Ronaghy A., Cheng P.M., Nguyen M.D., Cho H.J., Broide D., Raz E. Immunostimulatory DNA is a potent mucosal adjuvant. Cell. Immunol., 1998, v. 190, p.77-82.

30. Horner A.A., Takabaysahi K., Zubeldia J.M. & Raz E. Immunostimulatory DNA-based therapeutics for experimental and clinical allergy. Allergy, 2002, v.57 p. 24-29.

31. Horner A.A., Widhopf G.F., Burger J.A., Takabayashi K., Cinman N., Ronaghy A., Spiegelberg H.L., Raz E. Immunostimulatory DNA inhibits IL-4-dependent IgE synthesis by human B cells. J. Allergy Clin. Immunol.,2001, v. 108, p.417-423.

32. Janeway C.A. Immunobiology in health and disease. Immunobiology, 2005, 6-th edition.

33. Jerne N.K., Nordin A.A. Plaque formation in agar by single antibody-producing cells. Science, 1963, p. 140-405.

34. Jones T.R., Obaldia N 3rd., Gramzinski R.A., Charoenvit Y., Kolodny N., Kitov S., Davis H.L., Krieg A.M., Hoffman S.L. Synthetic oligodeoxynucleotides containing CpG motifs enhance immunogenic vaccine in Aotus monkeys. Vaccine, 1999, v.17, p.3065-3071.

35. Kadowaki N., Liu Y.J. Natural type I interferon-producing cells as a link between innate and adaptive immunity. Hum. Immunol., 2002, v. 63, N12, p.1126-1132.

36. Kamata H., Manabe T., Oka S., Hirata H. Hydrogen peroxide activates IkB kinases through phosphorilation of serine residues in the activation loops. FEBS Lett., 2002, v.519, N1-3, p.231-237.

37. Kim D.K., Cho E.S., Seong J.K., Um H.D. Adaptive concentration of hydrogen peroxide suppress cell death by blocking the activation of SAPK/JNK pathway. J. Cell Science, 2001, v. 114, p.4329-4334

38. Kline J.N., Waldschmidt T.J., Businga T.R., Lemish J.E., Weinstock J.V., Thorne P.S., Krieg A.M. Modulation of airway inflammation by CpG oligodeoxynucleotides in a murine model of asthma. J. Immunol., 1998, v.160, p.2555-2559.

39. Klinman D. M. CpG DNA as a vaccine adjuvant. Expert Rev. Vacc., 2003, v.2, p.305-315.

40. Klinman D.M., Barnhart K.M. & Conover J. CpG motifs as immune adjuvants. Vaccine, 1999, v.17, p.19-25.

41. Klinman D.M., Ishii K.J., Gursel M., Gursel I., Takeshita S., Takeshita F. Immunotherapeutic applications of CpG-containing oligodeoxynucleotides. Drug News Perspect., 2000, v. 13, p.289-296.

42. Kobayashi M., Fitz L., Ryan M., Hewick R.M., Clark S.C. Identification and purification of natural killer cell stimulatory factor, a cytokine with multiple biologic effects on human lymphocytes. J. Exp. Med., 1989, v. 170, p.827-845.

43. Krieg A.M. Mechanisms and applications of immune stimulatory CpG oligodeoxynucleotides. Biochem. Biophys. Acta, 1999, v.1489, p.107-116.

44. Krieg A.M., Davis H.L. Enhancing vaccines with immune stimulatory CpG DNA. Curr. Opin. Mol. Ther., 2001, v.3, N1, p. 15-24.

45. Krieg A.M., Yi A.K., Matson S., Waldschmidt T.J., Bishop G.A., Teasdale R., Koretzky G.A., Klinman D.M. CpG motifs in bacterial DNA trigger direct B-cell activation. Nature, 1995, v. 374, p. 546-549.

46. Kuramoto E., Yano O., Kimura Y., Baba M., Makino T., Yamamoto S., Yamamoto T., Kataoka T., Tokunaga T. Oligonucleotide sequences required for natural killer cell activation. Jpn. J. Cancer Res., 1992, v.83, N11, p. 1128-1131.

47. Lenert P., Brummel R., Field E.H., Ashman R.F. TLR-9 Activation of Marginal Zone B Cells in Lupus Mice Regulates Immunity Through Increased IL-10 Production. J. Clin. Immunol., 2005, v.25, N1, p.29-40.

48. Liang H., Nishioka Y., Reich C.F., Pisetsky D.S., Lipsky P.E. Activation of human B cells by phosphorothioate oligodeoxynucleotides. J. Clin. Invest., 1996, v.98, N5, p.l 119-1129.

49. Lipford G.B., Bendigs S., Heeg K., Wagner H. Poly-guanosine motifs costimulate antigen-reactive CD8 T cells while bacterial CpG-DNA affect T-cell activation via antigen-presenting cell-derived cytokines. Immunology,2000, v.101,N1, p.46-52.

50. Lipford G.B., Sparwasser T., Bauer M., Zimmermann S., Koch E.S., Heeg K., Wagner H. Immunostimulatory DNA: sequence-dependent production of potentially harmful or useful cytokines. Eur. J. Immunol., 1997, v.27, N12, p.3420-26.

51. Marmur J. A procedure for the isolation of deoxyribonucleic acid from microorganisms. J. Mol. Biol., 1961, v.3, p.108-218.

52. Matson S., Krieg A.M. Nonspecific suppression of 3H. thymidine incorporation by "control" oligonucleotides. Antisense Res. Dev., 1992, v. 2, N4, p.325-330.

53. McCluskie M.J., & Davis H.L. Oral, intrarectal and intranasal immunizations using CpG and non-CpG oligodeoxynucleotides as adjuvants. Vaccine, 2000, v. 19, p.413-422.

54. Medzhitov R. & Janeway C. A. Innate immunity, the virtues of a nonclonal system of recognition. Cell, 1998, v.91, p. 295-298.

55. Medzhitov R. Toll-like receptors and innate immunity. Nature Reviews,2001, vl,p,135-145.

56. Medzhitov R., Janeway C.A. Jr. Innate immunity: impact on the adaptive immune response. Curr. Opin. Immunol., 1997; v.9, p.4-9.

57. Medzhitov R., Preston-Hurlburt P., Kopp E., Stadlen A., Chen C., Ghosh S., Janeway C.A. Jr. MyD88 is an adaptor protein in the hToll/IL-1 receptor family signaling pathways. Mol. Cell, 1998, v.2, p.253-258.

58. Messina J.P., Gilkeson G.S., Pisetsky D.S. Stimulation of in vitro murine lymphocyte proliferation by bacterial DNA. J. Immunol., 1991, v. 147, N6, p.1759-1764.

59. Messina J.P., Gilkeson G.S., Pisetsky D.S. The influence of DNA structure on the in vitro stimulation of murine lymphocytes by natural and synthetic polynucleotide antigens. Cell Immunol., 1993, v.147, N1, p.148-157.

60. Moldoveanu Z., Love-Homan L., Huang W. Q. & Krieg A.M. CpG DNA, a novel immune enhancer for systemic and mucosal immunization with influenza virus. Vaccine, 1998, v. 16, N11, p. 1216-1224.

61. Morales A. Adjuvant, immunotherapy in superficial bladder cancer. Natl. Cancer Inst. Monogr., 1978, v.49, p.315-319.

62. Ninalga C., Loskog A., Klevenfeldt M., Essand M., Totterman T.H. CpG oligonucleotide therapy cures subcutaneous and orthotopic tumors and evokes protective immunity in murine bladder cancer. J. Immunother., 2005, v.28, N1, p.20-27.

63. Pashenkov M. Studies on dendritic cells and cytokyne in inflammatory diseases of the central nervous system. 2001, Stockholm.

64. Pisetsky D.S., Reich C.F. III. The influence of base sequence on the immunological properties of defined oligonucleotides. Immunopharmacology, 1998, v.40, N3, p.199-208.

65. Ray N.B., Krieg A.M. Oral Pretreatment of Mice with CpG DNA Reduces Susceptibility to Oral or Intraperitoneal Challenge with Virulent Listeria monocytogenes. Infection and Immunity, 2003, v.71, N8, p. 4398-4404.

66. Reiter I., Krammer B., Schwamberger G. Cutting Edge: Differential Effect of Apoptotic Versus Necrotic Tumor Cells on Macrophage Antitumor Activities. J. Immunology, 1999, v. 18 p.1730-1732.

67. Roberts T.L., Sweet M.J., Hume D.A., Stacey K.J. Cutting edge: species-specific TLR9-mediated recognition of CpG and non-CpG phosphorothioate-modified oligonucleotides. Immunol., 2005, v. 174, N2, p.605-608.

68. Rothenfusser S., Hornung V., Krug A., Towarowski A., Krieg A.M., Endres S., Hartmann G. Distinct CpG oligonucleotide sequences activate human gamma delta T cells via interferon-alpha/-beta. Eur. J. Immunol., 2001, v.31, N12, p.3525-3534.

69. Rothenfusser S., Tuma E., Endres S., Hartmann G. Plasmacytoid Dendritic Cells: The Key to CpG. Human Immunol., 2002, v.63, p.l 111-1119.

70. Sandberg K., Eloranta M., Johannisson A., Aim G. Flow cytometric analysis of natural interferon-alpha producing cells. Scand. J. Immunol., 1991, v.34, p.565-576.

71. Sano M., Mitsuyama M., Watanabe Y. & Nomoto K. Impairment of T cellmediated immunity to Listeria monocytogenes in pregnant mice. Microbiol. Immunol., 1986, v.30, p.165-176.

72. Santeliz J.V., Van Nest G., Traquina P., Larsen E. & Wills-Karp M. Amb a 1-linked CpG oligodeoxynucleotides reverse established airway hyper responsiveness in a murine model of asthma. J. Allergy Clin. Immunol., 2002, v.109, p.455-462.

73. Saresella M., Roda K., Speciale L., Taramelli D., Mendozzi E., Guerini F., Ferrante P. A flow cytometric method for analysis of phagocytosis and killing by polymorphonuclear leukocytes. Ann. N. Y. Acad. Sci., 1997, v.832, p.53-61.

74. Schnare M., Holtdagger A. C., Takeda K., Akira S. & Medzhitov R. Recognition of CpG DNA is mediated by signaling pathways dependent on the adaptor protein MyD88. Curr. Biol., 2000, v.10, p.l 139-1142.

75. Smith J.B., Wickstrom E. Antisense c-myc and immunostimulatory oligonucleotide inhibition of tumor genesis in a murine B-cell lymphoma transplant model. J. Natl. Cancer Inst., 1998, v.90, N15, p.l 146-1154.

76. Snapper C.M., Peschel C. & Paul W.E. Interferon--/ stimulates IgG2a secretion by murine B cells stimulated with bacterial lipopolysaccharide. J. Immunol., 1988, v. 140, p.2121-2130.

77. Sparwasser T., Hultner L., Koch E.S., Luz A., Lipford G.B., Wagner H. Immunostimulatory CpG-oligodeoxynucleotides cause extramedullary murine hemopoiesis. J. Immunol., 1999, v.162, N4, p.2368-2374.

78. Stein C.A., Subasinghe C., Shinozuka K., Cohen J.S. Physicochemical properties of phosphorothioate oligodeoxynucleotides. Nucleic Acids Res., 1988, v. 16, N8, p.3209-3221.

79. Sudo N., Aiba Y., Takaki A., Tanaka K., Yu X.N., Oyama N., Koga Y., Kubo C. Dietary nucleic acids promote a shift in Thl/Th2 balance toward Thl-dominant immunity. Clin. Exp. Allergy, 2000, v.30, N7, p.979-987.

80. Sun S., Beard C., Jaenisch R., Jones P., Sprent J. Mitogenicity of DNA from different organisms for murine B cells. J. Immunol., 1997, v. 159, N7, p. 3119-3125.

81. Sun S., Cai Z., Langlade-Demoyen P., Kosaka H., Brunmark A., Jackson M.R., Peterson P.A. Sprent J. Dual function of Drosophila cells as APCs for naive CD8C T cells: implications for tumor mimmunotherapy. Immunity, 1996, v.4, N6, p. 555-564.

82. Sur S., Wild J.S., Choudhury B.K., Sur N., Alam R., Klinman D.M. Long-term prevention of allergic lung inflammation in a mouse model of asthma by CpG oligodeoxynucleotides. J. Immunol., 1999, v. 162, p.6284-6291.

83. Sweet M.J., Stacey K.J., Kakuda D.K., Markovich D., Hume D.A. IFN-y primes macrophage responses to bacterial DNA. J. Interferon Cytokine Res., 1998, v.18, N4, p.263-271.

84. Takeshita A., Imai K., Hanazawa S. CpG motifs in Porphyromonas gingivalis DNA stimulate interleukin-6 expression in human gingival fibroblasts. Infect. Immun., 1999, v.61, N9, p.4340-4345.

85. Takeshita F., Leifer C.A., Gursel I., Ishii K.J., Takeshita S., Gursel M., Klinman D.M. Cutting Edge, role of toll-like receptor 9 in CpG DNA-induced activation of human cells. J. Immunol., 2001, v.167, p.3555-3558.

86. Tanaka T., Chu C.C., Paul W.E. An antisense oligonucleotide complementary to a sequence in Ig 2b increases y 2b germline transcripts, stimulated B cell DNA syntesis, inhibits immunoglobulin secretion. J. Exp. Med., 1992, v.175, N2, p.597-607.

87. Tokunaga T., Yamamoto S., Namba K. A synthetic single-stranded DNA, poly(dG,dC), induces interferon-a/ß and y, augments natural killer activity, and suppresses tumor growth. Jpn. J. Cancer Res., 1988, v.19, N6, p.682-686.

88. Tokunaga T., Yamamoto T., Yamamoto S. How BCG led to the discovery of immunostimulatory DNA. Jpn. J. Infect. Dis., 1999, v.52, N1, p.1-11.

89. Trevani A.S., Chorny A., Salamone G, Vermeulen M., Gamberale R., Schettini J., Raiden S, Geffner G. Bacterial DNA activates human neutrophils by a CpG-independent pathway. Eur. J. Immunol., 2003, v. 33, N11, p.3164-3174.

90. Trinchieri G. Interleukin-12 and the regulation of innate resistance and adaptive immunity. Nature Reviews, 2003, v.3, p. 133-146.

91. Uchijima M., Nagata T., Aoshi T., Koide Y. IFN-gamma overcomes low responsiveness of myeloid dendritic cells to CpG DNA. Immunol. Cell Biol., 2005, v.83, N1, p.92-95.

92. Utaisincharoen P., Anuntagool N., Chaisuriya P., Sirisinha S. CpG ODN activates NO and iNOS production in mouse macrophage cell line. Clin. Exp. Immun, 2002; v. 128, N3, p.467-473.

93. Verthelyi D, Gursel M, Kenney R.T, Lifson J.D, Shuying L, Mican J, Klinman D.M., CpG oligodeoxynucleotides protect normal band SIV infected macaques from Leishmania infection. J. Immunol, 2003, v. 170, p.4717-4723.

94. Verthelyi D, Ishii K.J., Gursel M, Takeshita F. & Klinman D. M. Human peripheral blood cells differentially recognize and respond to two distinct CpG motifs. J. Immunol, 2001, v. 166, p.2372-2377.

95. Verthelyi D, Zeuner A. Differential signaling by CpG DNA in DC and B cells: not just TLR9. TRENDS in Immunology, 2003, v.24, N10, p.519-522.

96. Wagner H. Bacterial CpG DNA activates immune cells to signal infectious danger. Adv. Immunol, 1999, v.73, p.329-368.

97. Weiner G.J., Liu H.M., Wooldridge J.E., Dahle C.E., Krieg A.M. Immunostimulatory oligodeoxynucleotides containing the CpG motif are effective as immune adjuvants in tumor antigen immunization. Proc. Natl. Acad. Sci., 1997, v.94, p.10833-10837.

98. Wickstrom E. Antisense c-myc inhibition of lymphoma growth. Antisense Nucleic Acid Drug Dev., 1997, v.7, N3, p.225-228.

99. Wiemann B., Starnes C.O. Coley's toxins, tumor necrosis factor and cancer research: a historical perspective. Pharmacol. Ther. 1994, v.64, N3, p.529-564.

100. Yi A.K., Chang M., Peckham D.W., Krieg A.M., Ashman R.F. CpG oligodeoxyribonucleotides rescue mature spleen B cells from spontaneous apoptosis and promote cell cycle entry. J. Immunol., 1998, v. 160, N12, p. 5898-5906.

101. Yi A.K., Tuetken R., Redford T., Waldschmidt M., Kirsch J., Krieg A.M. CpG motifs in bacterial DNA activate leukocytes through the pH-dependentgeneration of reactive oxygen species. J. Immunol., 1998, v.160, N10, p.4755-4761.