Изучение механизмов сочетанного влияния гестагенов и доксорубицина на клетки опухолевых линий HeLa и MCF-7 тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.00.25, кандидат медицинских наук Атрошкин, Кирилл Андреевич

• Атрошкин, Кирилл Андреевич
• кандидат медицинских наук
• 2009

Оглавление диссертации кандидат медицинских наук Атрошкин, Кирилл Андреевич

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Апоптоз и другие пути гибели клеток.

1.1.1. Молекулярные механизмы апоптоза.

1.2. Гестагены.

1.2.1. Молекулярные механизмы действия гестагенов.

1.2.2. Рецепторы прогестерона.

1.2.3. Мишени рецепторов прогестерона.

1.3. Антрациклиновые антибиотики.

1.3.1. Противоопухолевая активность антрациклинов.

1.3.2. Влияние антрациклинов на активность топоизомеразы II.

1.3.3. Антрациклины и апоптоз. Роль повреждения ДНК и белка р53.

1.3.4. Дополнительные механизмы действия антрациклинов.

1.4. Основные принципы лекарственной терапии злокачественных новообразований.

1.5. Гестагены, апоптоз и антрациклиновые антибиотики.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Химическая структура изучаемых гестагенов.

2.2 Используемые реактивы.

2.3. Объекты исследования.

2.4. Метод культивирования клеток (Фрешни, 1989).

2.5. Методы оценки противоопухолевой активности изучаемых соединений.

2.5.1. Интегральный МТТ-тест оценки жизнеспособности и метаболической активности опухолевых клеток (Mealey, 2002).

2.5.2. Оценка экспрессии онкобелка bcl-2 методом иммуногистохимического окрашивания.

2.5.3. Колориметрическое измерение активности каспазы 3.

2.5.4. Выделение ДНК из образца клеток методом фенол-хлороформной экстракции.

2.5.5. Определение количества ДНК в образце.

2.5.6. Электрофорез экстракта геномной ДНК в агарозном геле и флуориметрическая оценка апоптоза в культуре клеток.

2.6. Статистическая обработка результатов.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ.

3.1. Влияние новых гестагенов и доксорубицина на жизнеспособность опухолевых клеток линий MCF-7 и HeLa.

3.1.1. Цитостатическая активность новых гестагенов на культурах клеток. Концентрационная и временная зависимости.

3.1.2. Подавление жизнеспособности клеток культуры MCF-7 под действием гестагенов.

3.1.3. Подавление жизнеспособности клеток культуры MCF-7 под действием доксорубицина в сочетании с гестагенами.

3.1.4. Подавление жизнеспособности клеток культуры HeLa под действием гестагенов.

3.1.5. Подавление жизнеспособности клеток культуры HeLa под действием доксорубицина в сочетании с гестагенами.

3.2. Индукция апоптоза под действием гестагенов.

3.2.1. Фрагментация ДНК в культуре клеток MCF-7 под действием гестагенов.

3.2.2. Фрагментация ДНК в культуре клеток MCF-7 под действием доксорубицина.

3.2.3. Апоптоз в культуре клеток MCF-7 под действием гестагенов в комбинации с доксорубицином.

3.2.4. Экспрессия антиапоптотического белка Вс1-2 в культуре клеток MCF-7 при инкубации с гестагенами и доксорубицином.

3.2.5. Активность каспазы 3 в культуре клеток HeLa при инкубации с гестагенами и доксорубицином.

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Изучение механизмов сочетанного влияния гестагенов и доксорубицина на клетки опухолевых линий HeLa и MCF-7»

Актуальность работы.

По данным Всемирной Организации Здравоохранения (ВОЗ) смертность от злокачественных новообразований в развитых странах занимает третье место в структуре общей смертности, уступая лишь ишемической болезни сердца и цереброваскулярным нарушениям [1]. Среди онкологических заболеваний существенную часть представляют опухоли репродуктивной системы. Так, рак молочной железы (РМЖ) - наиболее часто встречающаяся злокачественная опухоль и причина смерти. По данным ВОЗ, в мире наблюдается и проходит лечение более 11 млн. женщин с диагнозом РМЖ [1]. Каждый год регистрируется 1 млн. 200 тыс. новых случаев заболевания [2]. Ежегодно от РМЖ погибает более 500 тысяч женщин [1]. Основная причина смерти от РМЖ - прогрессирование заболевания с возникновением отдаленных метастазов, поэтому в настоящее время методом выбора в лечении РМЖ является системная химиотерапия [3].

Рак шейки матки (РШМ) занимает второе место по распространенности среди женщин репродуктивного возраста. В год в мире регистрируется в среднем 500000 новых случаев рака шейки матки и 250000 случаев смерти, связанной с этим заболеванием. Примерно 80% случаев РШМ приходится на страны с низким и средним уровнем развития [1]. В общей структуре заболеваемости органов репродуктивной системы женщин в России РШМ занимает 3-е место после рака молочной железы и рака тела матки. В 2002 г. в России зарегистрировано 12 285 новых случаев РШМ и 6288 смертей. Стандартизованный показатель заболеваемости РШМ на 2002 г. составил 11,6, а смертности — 5,1 на 100 000 женщин [4]. В настоящее время четко прослеживается увеличение заболеваемости в группе женщин до 40 лет, особенно заметное повышение - до 29 лет (ежегодно на 2,1%). Кроме того, отмечается существенный рост показателей запущенности. Удельный вес больных III—IV стадией в 19.90 г. составлял 34,2%; в 1992 г. - 37,1%; в 1995 г. - 38,8%; в 2003 г. - 39,7%,

В настоящее время химиотерапия становится важнейшим, а в некоторых случаях основным, методом лечения при злокачественных новообразованиях.

Химиотерапия при раке молочной железы применяется уже более 40 лет. В результате тестирования на противоопухолевую активность в предклинических и клинических исследованиях большого числа веществ около 50 препаратов стали доступными для практического использования. При этом 5 цитостатиков (доксорубицин, доцетаксел, эпирубицин, паклитаксел, винорельбин) позволяют получить лечебный эффект более чем у 50% пациенток. Эффективность остальных препаратов колеблется от 15 до 30%. Несмотря на все эти успехи, за весь период поиска новых средств для химиотерапии РМЖ существенно не удалось улучшить показатели выживаемости пациентов. Средняя продолжительность жизни пациентов с диссеминированным РМЖ по сравнению с 60-ыми годами ХХ-го века увеличилась в среднем не более, чем на несколько месяцев. Более того, до настоящего времени нет общепринятых стандартов лечения этой патологии. Поэтому в практической деятельности по-прежнему в качестве I и II линий химиотерапии рекомендуются схемы с антрациклиновыми антибиотиками. При дальнейшем прогрессировании опухоли (III и IV линии) - таксаны, винорельбин + 5-фторурацил, длительные инфузии 5-фторурацила [5].

При раке шейки матки на сегодняшний день лучевой и хирургический методы лечения или их комбинация считаются стандартом, но вместе с тем они имеют и свои ограничения. Увеличение объема оперативного вмешательства при местно-распространенном РШМ повышает число осложнений, но не увеличивает выживаемость больных. Проведение лучевой терапии с использованием повышенных доз облучения ведет к уменьшению частоты местного рецидивирования, но лучевые повреждения тканей и органов малого таза лимитируют возможности дальнейшего увеличения дозы. С целью улучшения результатов лечения больных РШМ последние десятилетия изучаются возможности лекарственной терапии и ее сочетание со стандартными методами. В качестве средств химотерапии при раке шейки матки используются препараты платины и антрациклиновые антибиотики [4].

Таким образом, в современной клинической практике для лечения опухолей репродуктивной системы используются цитостатические препараты, которые нарушают жизнедеятельность опухолевых клеток и блокируют их митотическое деление. Широкое распространение и применение в клинической онкологии получили антрациклиновые антибиотики, в частности, доксорубицин (антибиотик антрациклинового ряда, выделенный из культуры Streptomyces peuceticus var. Caesius), являющийся базовым препаратом для лечения многих онкологических заболеваний. Однако, применение доксорубицина, как и других химиотерапевтических средств, сопряжено с развитием побочных эффектов, в некоторых случаях требующих снижения дозы или полной отмены препарата.

Побочные эффекты системной химиотерапии существенно снижают качество жизни пациентов, зачастую становясь причиной прекращения курса терапии. Токсическое действие цитостатических агентов на организм проявляется в первую очередь воздействиями на костномозговое кроветворение, клетки иммунной системы и функции желудочно-кишечного тракта, а также, в некоторых случаях (часто при применении препаратов платины и алкилирующих агентов), вторичной канцерогенностыо. Эти факторы, в совокупности с изнуряющими пациентов тошнотой и рвотой, нарушениями функции кожи и слизистых оболочек, заставляют снижать дозы химиотерапевтических препаратов, что может приводить к неэффективности лечения [6].

Таким образом, успех химиотерапии зависит от применения препаратов, избирательно подавляющих злокачественные клетки и минимально затрагивающих нормальные клетки организма. Подобные эффекты можно достичь путем применения гормонотерапии в сочетании с химиотерапией в лечении гормонзависимых опухолей (образующихся из гормонзависимых тканей и сохранивших рецепторы гормонов). Несмотря на то, что раковые клетки отличает менее дифференцированная морфология, известно, что большая часть новообразований, проистекающих из гормонозависимых тканей, сохраняет рецепторный аппарат, а в некоторых случаях количество рецепторов в опухолевой ткани даже увеличивается [7]. Этот факт может быть использован для разработки новых схем лечения пациентов с гормонзависимыми опухолями.

Так как гормональные соединения могут оказывать самостоятельное влияние на опухолевый рост, дополняя действие цитостатика, то совместное применение гормональных и цитостатических препаратов позволит повысить эффективность терапии, уменьшить терапевтическую дозу и снизить токсическое воздействие препаратов на здоровые ткани. В частности, в терапии рака молочной железы на сегодняшний день выделяют такие наиболее значимые направления, как: 1) выявление новых комбинаций и режимов хорошо известных противоопухолевых препаратов (высокодозная химиотерапия, пролонгированные инфузии, еженедельное введение); 2) выявление новых эффективных при РМЖ химиотерапевтичеких средств; 3) индивидуализация лечения на основе молекулярных маркеров [5].

В комплексной терапии гормонозависимых опухолей, наряду с цитостатиками широко используются препараты на основе прогестерона — прогестагены. В настоящее время большое количество исследований посвящено изучению механизмов действия прогестагенов. Все больше данных свидетельствует о том, что прогестагены влияют на экспрессию факторов, задействованных в регуляции пролиферации и гибели (апоптоза) клеток. Однако четких данных о том, вызывают ли гестагены апоптоз, в настоящее время нет. Поэтому исследование влияния гестагенов и их сочетания с цитостатическими препаратами на апоптоз опухолевых клеток является весьма актуальной проблемой в ключе поиска новых средств и схем терапии онкологических заболеваний репродуктивных органов.

Цель работы: исследование свойств гестагенов как противоопухолевых препаратов и модуляторов сенсибилизации опухолевых клеток к химиотерапии, а также выявление молекулярных механизмов действия гестагенов на пролиферацию клеток-мишеней. Задачи работы:

1. Исследовать дозовую и временную зависимость действия прогестинов на апоптоз клеток-мишеней в клеточной культуре непосредственно и в сочетании с цитостатическими средствами.

2. Оценить влияние прогестинов на уровень экспрессии факторов роста и апоптоза.

3. Отобрать наиболее эффективные соединения и сочетания соединений на основании полученных данных.

Заключение диссертации по теме «Фармакология, клиническая фармакология», Атрошкин, Кирилл Андреевич

выводы.

1. АБМП и вещества сравнения: ЛНГ, МПА, прогестерон обладают цитостатической активностью в отношении опухолевых клеток рака молочной железы человека MCF-7 и рака шейки матки человека HeLa.

2. Снижение жизнеспособности клеток опухолевых линий HeLa и MCF-7 возрастает с увеличением дозы и времени действия исследуемых веществ.

3. В цитостатическом действии сочетания гестагенов и доксорубицина выявлен синергизм, наиболее выраженный в случае АБМП в клетках MCF-7 и в клетках HeLa. Комбинация АБМП и доксорубицина обладает выраженной цитостатической активностью в отношении клеточных культур MCF-7 и HeLa при инкубации в течение 72 часов с добавлением доксорубицина в последние 24 часа инкубации.

4. АБМП и другие гестагены не оказывают статистически значимого влияния на экспрессию антиапоптотического фактора bcl-2 в клетках-мишенях при инкубации в течение 72 часов. Следует считать, что реализация цитостатического действия гестагенов при коротких сроках инкубации осуществляется без влияния на экспрессию фактора bcl-2.

5. Сочетанное использование АБМП (в отличие от препаратов сравнения ЛНГ и МПА) и доксорубицина приводит к достоверной активации каспазы-3. Таким образом, при совместном действии АБМП и доксорубицина происходит активация систем, участвующих в реализации апоптоза клеток. В данном случае показано превосходство АБМП по отношению к препаратам сравнения.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Согласно поставленной; цели, было; исследовано- влияние АБМП: на рост опухолевых клеток гормончувствительных клеточных культур MCF-7 и HeLa как самостоятельного; препарата; иг в комбинации с доксорубицином, в; сравнении с используемымшв.клинической практикетестагенамш

Показано- что АБМП; дозозависимо тормозит рост опухолевых клеток, цитостатический эффект: при самостоятельном- действии; соединения1 развивается на 6 сутки-, инкубации с клетками, максимально; действующая, концентрация - 10"5М. Препараты? сравнения4 — МПА, прогестерон и левоноргестрел - ингибируют рост клеток менее эффективно.

ТакихМ образом; АБМП как; самостоятельный! препарат обладает выраженной цитостатической активностью в отношении; клеточных, культур MCF-7 и HeLa. : .

Показано, что АБМП дозозависимо тормозит рост опухолевых клеток при использовании в комбинации с доксорубицином, причем этот эффект реализуется в условиях краткосрочного воздействия гормональногошещества (72 часа) и цитостатика (24 часа' на фоне воздействия гормона), максимально действующая концентрация — 10'6М.

Таким образом, комбинация АБМП и доксорубицина обладает выраженной цитостатической", активностью- в отношении клеточных культур MCF-7 H*HeLa при инкубацишв течение. 72 часов.

Возможные механизмы;- обусловливающие синергизм в цитостатическом действии гестагенов и: доксорубицина, обусловлены; изменением; метаболизма опухолевых клеток, 1)- не затрагивающими при коротких сроках, инкубации- факторы, определяющие инициацию апоптоза; или дифференцировки;клеток, 2)-не приводящими к,инициации апоптоза при-условии применения; гестагена как самостоятельного средства, и 3) приводящими к, как минимум; субпороговой активации внутриклеточных систем, участвующих в реализации клеточной гибели посредством апоптоза, причем в случае применения комбинации синтетический гестаген (АБМП)+антрациклиновый антибиотик этот эффект активации достигал максимума. В то же время, эффект активации сигнальных систем (каспазы-3) не является определяющим в апоптозе клеток некоторых клеточных популяций (в частности, линии клеток MCF-7), что позволяет предполагать реализацию цитостатического действия гестагенов в комбинации с цитостатиками через изменения метаболизма на уровне различных клеточных структур.

Этот эффект может быть реализован, со стороны гестагенов — через быстрые эффекты, опосредуемые мембранными рецепторами, влияющими на градиенты биологически активных веществ в клетке, и, со - стороны цитостатика — его перераспределением под влиянием гестагенов.

Полученные данные свидетельствуют о цитостатической и противоопухолевой активности нового гестагена. В работе обоснована целесообразность комбинированного применения гестагенов с цитостатиками. Новый гестаген, АБМП, обладает химиосенсибилизирующей активностью и может быть рекомендован для последующего изучения с перспективой использования в клинической практике в качестве универсального модулятора эффекта химиотерапевтических средств.

Список литературы диссертационного исследования кандидат медицинских наук Атрошкин, Кирилл Андреевич, 2009 год

1. WHO (World Health Organization). 10 ведущих причин смерти. 2008.2. Материалы IARC. 2007.

2. Донских Р.В., Зернов К.Ю., Иванов В.Г. и соавт. Таргетная Целевая) терапия рака молочной железы. Миф или реальность. Русский Медицинский журнал, 2007.15(14).

3. Т.В.Харитонова. Возможности лекарственной терапии рака шейки матки. Современная Онкология, 2005. 07(3).

4. Моисеенко, В.М. Современная химиотерапия диссеминированного рака молочной железы. Материалы третьей ежегодной Российской онкологической конференции. Санкт-Петербург, 1999.

5. Wittliff J. Steroid-hormone receptors in breast cancer. Cancer. , 1984. Feb 1;(53(3 Suppl)): p. 630-43.

6. В.Д. Самуилов, E.M. Лагунова, , Программируемая клетчная смерть. . Биохимия, 2000. том 65(вып. 8): р. с. 1029-1046.

7. Rubinsztein DC et al. Autophagy and Its Possible Roles in Nervous System Diseases, Damage and Repair. Autophagy 2005. 1(1): p. 11-22.

8. Yorimitsu T. Autophagy: molecular machinery for self-eating. . Cell Death and Differentiation 2005.12: p. 1542-1552.

9. Vicencio JM et al. Senescence, apoptosis or autophagy? When a damaged cell must decide its path—a mini-review. Gerontology., 2008. 54(2): p. 92-9.

10. Chalah A., Khosravi-Far R., The mitochondrial death pathway. Adv Exp Med Biol, 2008. 615: p. 25-45.

11. Kaufmann S.H. et al., Analysis of caspase activation during apoptosis. Curr Protoc Cell Biol, 2001. Chapter 18(18): p. Unit 18 2.

12. Gizard F, Gervois P, Faucompre A et al. Progesterone inhibits human breast cancer cell growth through transcriptional upregulation of the cyclinidependent kinase inhibitor p27Kipl gene. . FEBS Lett. , 2005 Oct 579(25): p. 5535-41.

13. Ory K. et al., Apoptosis inhibition mediated by medroxyprogesterone acetate treatment of breast cancer cell lines. Breast Cancer Res Treat, 2001. 68(3): p. 187-98.

14. Moore M.R. et al., Progestin inhibition of cell death in human breast cancer cell lines. J Steroid Biochem Mol Biol, 2006. 98(4-5): p. 218-27.

15. Yin P. et al., Progesterone receptor regulates Bcl-2 gene expression through direct binding to its promoter region in uterine leiomyoma cells. J Clin Endocrinol Metab, 2007. 92(11): p. 4459-66.

16. Allen G. Physiology of the corpus luteum. American Journal of Physiology, 1929(88): p. 326-346.

17. Pasqualini JR, Chetrite GS. Biological effects of progestins in breast cancer. Gynecol Endocrinol., 2001. 15 SuppI 6: p. 44-52.

18. Conneely OM. Progesterone receptors in reproduction: functional impact of the A and В isoforms. Steroids., 2000 Oct-Nov. 65((10-11)): p. 571-7.

19. Li X. Unfolding the action of progesterone receptors. J Biol Chem. , 2003 Oct 278((41)): p. 39261-4.

20. Abdel-Hafiz H., Takimoto G. S., Tung, L. et al. The Inhibitory Function in Human Progesterone Receptor N Termini Binds SUMO-1 Protein to Regulate Autoinhibition and Transrepression. J. Biol. Chem., 2002. Vol. 277(Issue 37): p. 33950-33956.

21. J P Lydon, F.J.D., С R Funk, S К Mani et al. Mice lacking progesterone receptor exhibit pleiotropic reproductive abnormalities. Genes & Development, 1995 9: p. 2266-2278.

22. Hochmann, J. Ratio of concentrations of estrogen receptors to progesterone receptors (ER/PR) in the cytosol of breast cancers (stratification by forming of groups differing in PR). Neoplasma., 2007. 54(4).

23. Ogle T. Progesterone-action in the decidual mesometrium of pregnancy. Steroids., 2002 Jan. 67(1): p. 1-14.

24. Bramley T. Non-genomic progesterone receptors in the mammalian ovary: some unresolved issues. Reproduction 2003. 125: p. 3-15

25. Rasar MA. The physiology of the Xenopus laevis ovary. Methods Mol Biol., 2006(322): p. 17-30.

26. Simoncini T Genazzani AR. Non-genomic actions of sex steroid hormones. Eur J Endocrinol., 2003 Mar. 148(3): p. 281-92.

27. Асе С., Okulicz W. Microarray profiling of progesterone-regulated endometrial genes during the rhesus monkey secretory phase. Reprod Biol Endocrinol., 2004. 2(54).

28. Liszewska E, Rikawiecki R., Kotwica J. , Effect of progesterone on the expression of bax and bcl-2 and on caspase activity in bovine luteal cells.Prostaglandins Other Lipid Mediat., 2005 Dec;. 78(1-4): p. 67-81.

29. Cheung J., and Smith D. F. Molecular Chaperone Interactions with Steroid Receptors: an Update. Mol. Endocrinol., 2000. 14: p. 939-946.

30. Poukka H et al. Coregulator small nuclear RING finger protein (SNURF) enhances Spl- and steroid receptor-mediated transcription by different mechanisms. J Biol Chem., 2000. 275(1): p. 571-9.

31. Auboeuf D., Honig A., Berget S. et al. Coordinate Regulation of Transcription and Splicing by Steroid Receptor Coregulators. Science 11, October 2002. Vol. 298.(5592): p. pp. 416 419.

32. Monsalve M et al. Direct coupling of transcription and mRNA processing through the thermogenic coactivator PGC-1. Mol Cell., 2000 6(2): p. 30716.

33. RF Power, et al. Dopaminergic and ligand-independent activation of steroid hormone receptors. Science, 1991. Vol. 254.(no. 5038): p. pp. 1636 1639.

34. SK Mani, et al. Convergent pathways for steroid hormone- and neurotransmitter-induced rat sexual behavior. Science, 2000. Vol 265(5176): p. 1246-1249.

35. Hewitt SC, Korach KS. Progesterone action and responses in the alphaERKO mouse. Steroids., 2000 65((10-11)): p. 551-7.

36. Medina D et al. Mechanisms of Hormonal Prevention of Breast Cancer. Ann. N. Y. Acad. Sci. ,2001. 952: p. 23-35.

37. Boonyaratanakornkit V et al. Progesterone receptor contains a proline-rich motif that directly interacts with SH3 domains and activates c-Src family tyrosine kinases. Mol Cell., 2001 Aug;. 8((2)): p. 269-80.

38. Ballare C. et al. Two Domains of the Progesterone Receptor Interact with the Estrogen Receptor and Are Required for Progesterone Activation of the c-Src/Erk Pathway in Mammalian Cells. Mol. Cell. Biol. , 2003. 23, : p. 1994-2008.

39. Syed V, Ho SM. Progesterone-Induced Apoptosis in Immortalized Normal and Malignant Human Ovarian Surface Epithelial Cells Involves Enhanced FasL Expression. Oncogene. , 2003. .

40. Syed V et al. Expression of gonadotropin receptor and growth responses to key reproductive hormones in normal and malignant human ovarian surface epithelial cells. . Cancer Res., 2001. 61: p. 6768-6776.

41. Wang Z et al. Progesterone regulates human telomerase reverse transcriptase gene expression via activation of mitogen-activated protein kinase signaling pathway. Cancer Res. , 2000 Oct 60(19 ): p. 5376-81.

42. Abe M et al.Medroxyprogesterone acetate inhibits human pancreatic carcinoma cell growth by inducing apoptosis in association with Bcl-2 phosphorylation. . Cancer. , 2000 May 88(9): p. 2000-9.

43. Ho SM. Estrogen, Progesterone and Epithelial Ovarian Cancer. . Reprod Biol Endocrinol., 2003; . 1: p. 73.

44. Morath С et al. Effects of retinoids on the TGF-beta system and extracellular matrix in experimental glomerulonephritis. . J Am Soc Nephrol. , 2001 Nov. 12(11): p. 2300-9.

45. Qin Xu et al. Progesterone Receptor Modulator CDB-2914 Down-Regulates Proliferative Cell Nuclear Antigen and Bcl-2 Protein Expression and Up-Regulates Caspase-3 and Poly(Adenosine 5'-Diphosphate-ribose)

46. Polymerase Expression in Cultured Human Uterine Leiomyoma Cells. J Clin Endocrinol Metab., 2005 Feb. 90(2): p. 953-61.

47. Kuranaga E et al. Progesterone is a cell death suppressor that downregulates Fas expression in rat corpus luteum. . FEBS Lett. , 2000 Jan 466(2-3): p. 279-82.

48. Kurmasheva RT. IGF-I mediated survival pathways in normal and malignant cells. . Biochim Biophys Acta., 2006 Aug;. 1766(1): p. 1-22.

49. Campagnoli С et al.Pregnancy, progesterone and progestins in relationto breast cancer risk. . J of Steroid Biochemistry & Molecular Biology (2005). 97 p. 441-450.

50. Werner HM, HR Franke, I Vermes. Apoptosis and proliferation in breast cancer cells, cultured in vitro: effects ofSERMs. Climacteric, 2005. 8(3): p. 294-9.

51. Minotti G, et al. Anthracyclines: Molecular Advances and Pharmacologic Developments in Antitumor Activity and Cardiotoxicity. Pharmacol Rev, 2004. 56: p. 185-229.

52. Binaschi M, B. et ^.Anthracyclines: selected new developments. . Curr Med Chem 2001.1: p. 113-130.

53. Perego P et al .Role of apoptosis and apoptosis-related genes in cellular response and antitumor efficacy of anthracyclines. . Curr Med Chem 2001. 8: p. 31-37.

54. Buchholz ТА et al .Chemotherapy-induced apoptosis and Bcl-2 levels correlate with breast cancer response to chemotherapy. . Cancer J, (2003) 9: p. 33-41.

55. Lumachi F et al. PCNA-LII, Ki-67 immunostaining, p53 activity and histopathological variables in predicting the clinical outcome in patients with parathyroid carcinoma. . Anticancer Res., 2006 Mar-Apr;. 26((2A)): p. 1305-8.

56. Bertheau P et al. Effect of mutated TP53 on response of advanced breast cancers to high-dose chemotherapy. . Lancet (2002) 360: p. 852-854.

57. Ruiz-Ruiz С et al. A Characterization of p53-mediated up-regulation of CD95 gene expression upon genotoxic treatment in human breast tumor cells. . J Biol Chem (2003) 278: p. 31667-31675.

58. Gariboldi MB et al. Molecular determinants of intrinsic resistance to doxorubicin in human cancer cell lines. . Int J Oncol (2003) 22: p. 10571064.

59. Zhang W et al. High levels of constitutive WAFl/Cipl protein are associated with chemoresistance in acute myelogenous leukemia. . Clin Cancer Res (1995) 1: p. 1051-1057.

60. Martin D et al. Ceramide and reactive oxygen species generated by H202 induce caspase-3-independent degradation of Akt/protein kinase B. . J Biol Chem (2002). 277: p. 42943-42952.

61. Clementi ME et al. Doxorubicin-derived metabolites induce release of cytochrome с and inhibition of respiration on cardiac isolated mitochondria.

62. Anticancer Res (2003). 23: p. 2445-2450.

63. J Adams. The proteasome: structure, function and role in the cell. Cancer Treat Rev 29 (Suppl 1): 3-9. Cancer Treat Rev (2003). 29((Suppl 1)): p. 3-9.

64. Cusack JC. Rationale for the treatment of solid tumors with the proteasome inhibitor bortezomib. Cancer Treat Rev (2003). 29((Suppl 1)): p. 21-31.

65. Kiyomiya К et al. Mechanism of specific nuclear transport of adriamycin: the mode of nuclear translocation of adriamycin-proteasome complex. . Cancer Res 61, 2001: p. 2467-2471.

66. Kiyomiya К et ai.The role of the proteasome in apoptosis induced by anthracycline anticancer agents. Int J Oncol 2002. 20: p. 1205-1209.

67. Mitsiades N et al. The proteasome inhibitor PS-341 potentiates sensitivity of multiple myeloma cells to conventional chemotherapeutic agents: therapeutic applications. . Blood (2003) 101: p. 2377-2380.

68. DA Gewirtz., A critical evaluation of the mechanisms of action proposed for the antitumor effects of the anthracycline antibiotics adriamycin and daunorubicin. Biochem Pharmacol (1999) 57: p. 727-741.

69. Niedernhofer LJ et al. Malondialdehyde, a product of lipid peroxidation, is mutagenic in human cells. . J Biol Chem (2003). 278: p. 31426-31433.

70. WC, H., Role of telomeres and telomerase in the pathogenesis of human cancer. . J Clin Oncol (2003) 21: p. 2034-2043.

71. Marchetti A et al. Prediction of survival in stage I lung carcinoma patients by telomerase function evaluation. . Lab Investig (2002). 82: p. 729-736.

72. Elmore LW et al. Adriamycin-induced senescence in breast tumor cells involves functional p53 and telomere dysfunction. . J Biol Chem (2002) 277: p. 35509-35515.

73. Lebeau J et al. Down-regulation of telomerase activity after progesterone treatment of human breast cancer cells: essential role of the cell cycle status. Anticancer Res., 2002 Jul-Aug;. 22(4): p. 2161-6.

74. B.H. Прилепская. Левоноргестрел — новое решение проблемы экстренной гормональной контрацепции. Фармацевтический вестник, 2007. №6 ((453)).

75. Lun-Xiu Qin Z. The prognostic molecular markers in hepatocellular carcinoma. World J Gastroenterol 2002;. 8(3): p. 385-392.

76. Scholzen T. The Ki-67 protein: from the known and the unknown. . J Cell Physiol., 2000 Mar. 182(3): p. 311-22. .

77. Endl E. The Ki-67 protein: fascinating forms and an unknown function. . Exp Cell Res., 2000 Jun 257(2): p. 231-7.

78. Matsumoto Y. Molecular mechanism of PCNA-dependent base excision repair. Prog Nucleic Acid Res Mol Biol., 2001. 68: p. 129-38.

79. Maga G. Proliferating cell nuclear antigen (PCNA): a dancer with many partners. J Cell Sci., 2003 116(Pt 15): p. 3051-60.

80. Dlamini Z. Can targeting apoptosis resolve the cancer saga? . Future Oncol. , 2005 Jun;. 1(3): p. 339-49.

81. Fadeel B. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in human disease. J Intern Med., 2005 Dec;. 258(6): p. 479517.

82. LD Piro. Apoptosis, Bcl-2 antisense, and cancer therapy. Oncology (Williston Park)., 2004 Nov;. 18((13 Suppl 10)): p. 5-10.

83. Havelka P et al. Apoptosis and expression of Bcl-2 in human endometrium in natural and artificial cycles. . Biomed Pap Med Fac Univ Palacky Olomouc Czech Repub., 2005 Dec;. 149(2): p. 303-7.

84. Briton-Jones С et al. Changes in the ratio of Box and Bcl-2 mRNA expression and their cellular localization throughout the ovulatory cycle in the human oviduct. . Assist Reprod Genet., 2006 Mar;. 23(3): p. 149-56.

85. Wei Y et al. SeO(2) induces apoptosis with down-regulation of Bcl-2 and up-regulation of P53 expression in both immortal human hepatic cell line and hepatoma cell line. Mutat Res., 2001 Feb. 490(2): p. 113-21.

86. Matsuo H et al .Increased expression of Bcl-2 protein in human uterine leiomyoma and its up-regulation by progesterone. J Clin Endocrinol Metab. , 1997 Jan;. 82(1): p. 293-9.

87. Kooijman R et al. Regulation of apoptosis by insulin-like growth factor (IGF)-I. . Cytokine Growth Factor Rev. , 2006 Aug;. 17(4): p. 305-23.

88. Kurmasheva RT. IGF-I mediated survival pathways in normal and malignant cells. . Biochim Biophys Acta., 2006 Aug;. 1766(1): p. 1-22.

89. Macaulay VM et al. The IGF receptor as anticancer treatment target. Novartis Found Symp., 2004;. 262: p. 235-43; discussion 243-6, 265-8.

90. Leachy DJ. Structure and Function of the Epidermal Growth Factor (EGFEB) Family of Receptors. . Advances in Protein Chemistry, , 2004. 68: p. 1-27.

91. Skarpen E et al. Endocytosed epidermal growth factor (EGF) receptors contribute to the EGF-mediated growth arrest in A43I cells by inducing a sustained increase in p21/CIPl. . Exp Cell Res. , 1998 Aug 25;. 243(1): p. 161-72. .

92. Vassen L et al. Human insulin receptor substrate-2 (IRS-2) is a primary progesterone response gene. Mol Endocrinol. , 1999 Mar;. 13(3): p. 485-94.

93. Nakashima R, et al. Genetic alterations in the transforming growth factor receptor complex in sporadic endometrial carcinoma. Gene Expr. , 1999;. 8(5-6): p. 341-52.

94. Jones RL et al. TGF-beta superfamily expression and actions in the endometrium and placenta. . Reproduction 2006 Aug;. 132(2): p. 217-32.

95. Ho., S.-M., Estrogen, Progesterone and Epithelial Ovarian Cancer. . Reprod Biol Endocrinol. ., 2003; . 1: p. 73.

96. Morath С et al .Effects of retinoids on the TGF-beta system and extracellular matrix in experimental glomerulonephritis. . J Am Soc Nephrol. , 2001 Nov;.12(ll): p. 2300-9. .

97. Qin Xu et al .Progesterone Receptor Modulator CDB-2914 Down-Regulates Proliferative Cell Nuclear Antigen and Bcl-2 Protein Expression and Up-Regulates Caspase-3 and Poly(Adenosine 5'-Diphosphate-ribose)

98. Polymerase Expression in Cultured Human Uterine Leiomyoma Cells. . J Clin Endocrinol Metab. , 2005 Feb;. 90(2): p. 953-61.

99. Johnson AL. Caspase-mediated apoptosis in the vertebrate ovary . Reproduction., 2002 Jul;. 124(1): p. 19-27.

100. Slot KA et al.Estrous cycle dependent changes in expression and distribution of Fas, Fas ligand, Bcl-2, Box, and pro- and active caspase-3 in the rat ovary. J Endocrinol., 2006 Feb. 188(2): p. 179-92.

101. Kuranaga E et al. Progesterone is a cell death suppressor that downregulates Fas expression in rat corpus luteum. FEBS Lett. , 2000 Jan 466(2-3): p. 279-82.

102. Terry KL et al .Genetic variation in the progesterone receptor gene and ovarian cancer risk. . Am J Epidemiol., 2005 Mar 161(5): p. 442-51.

103. Campagnoli С et al. Pregnancy, progesterone and progestins in relationto breast cancer risk. . J of Steroid Biochemistry & Molecular Biology, 2005. 97: p. 441-450.

104. Haseroth К et al. Aldosterone- and progesterone-membi-ane-binding proteins: new concepts of nongenomic steroid action. . Curr Protein Pept Sci., 2000 Dec. 1(4): p. 385-401.

105. Losel RM et al. Nongenomic Steroid Action: Controversies, Questions, and Answers. Physiol. Rev., 2003. 83: p. 965-1016.

106. Cattoretti G et al. Antigen unmasking on formalin-fixed, paraffin-embedded tissue sections. J Pathol. , 1993 Oct. 171(2): p. 83-98.

107. Сергеев П. В., Федотчева Т.А., Ржезников В. М., Гриненко Г. С., Семейкин А. В., Ветчинкина В. Б., Атрошкин К. А., Шимановский Н.

108. Jl. Новый отечественный гестаген с противоопухолевой активностью. Вестник РАМН, 2007.

109. Т.А., Федотчева., Автореф. дисс. канд. мед. наук. 2003.

110. Kagawa S et al. Deficiency of Caspase-3 in MCF7 Cells Blocks Bax-mediated Nuclear Fragmentation but not Cell Death. Clinical Cancer Research, 2001. 7: p. 1474-1480.

111. Stockier M et al. Systematic reviews of chemotherapy and endocrine therapy in metastatic breast cancer. Cancer Treat Rev., 2000. 26(3): p. 151-68.

112. Ahola TM et al. Progestin upregulates G-protein-coupled receptor 30 in breast cancer cells. Eur J Biochem. , 2002. 269(10): p. 2485-90.

113. Thuneke I et al. Biphasic effect of medroxyprogesterone-acetate (MPA) treatment on proliferation and cyclin D1 gene transcription in T47D breast cancer cells. Breast Cancer Res Treat., 2000. 63(3): p. 243-8.

114. Alkhalaf M et al. Growth inhibition of MCF-7 human breast cancer cells by progesterone is associated with cell differentiation and phosphorylation of Aktprotein. Eur J Cancer Prev., 2002. 11(5): p. 481-8.

115. Ferreira-Dias G et al. Progesterone and caspase-3 activation in equine cyclic corpora lutea. Reprod Domest Anim., 2007. 42(4): p. 380-6.

116. Altinoz MA et al. Medroxyprogesterone and tamoxifen augment antiproliferative efficacy and reduce mitochondria-toxicity of epirubicin in FM3A tumor cells in vitro. Cell Biol Int., 2007. 31(5): p. 473-81.

117. Altinoz MA et al. Medroxyprogesterone acetate induces c6 glioma chemosensitization via antidepressant-like lysosomalphospholipidosis/myelinosis in vitro. Int J Neurosci. , 2007. 117(10): p. 1465-80.