Изучение мембранотропной активности некоторых тритерпеновых гликозидов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, кандидат биологических наук Попов, Александр Михайлович

• Попов, Александр Михайлович
• кандидат биологических наук
• 1984

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Попов, Александр Михайлович

Введение

ЧАСТЬ I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

ГЛАВА I. ТРИТЕРПЕНОВЫЕ ГЛИКОЗИДЫ - БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЕ ВЕЩЕСТВА МЕМБРАНОТРОПНОГО ДЕЙСТВИЯ

1. Химическое строение, распространение и свойства тритерпеновых гликозидов

2. Применение тритерпеновых гликозидов в фармакологии и медицине.

3. Мембранотропная активность тритерпеновых гликозидов.

ГЛАВА П. РОЛЬ СТЕРИНОВ В МЕМБРАНАХ.

1. Структурно-функциональные свойства мембранных стеринов

2. Влияние стеринов на мембранную проницаемость

3. Стерины как "рецепторы" биологически активных веществ.

ЧАСТЬ П. СОБСТВЕННЫЕ ЭКСДЕРШЕНТАЛЪНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

ГЛАВА Ш. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

ГЛАВА 1У. БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ ТРИТЕРПЕНОВЫХ

ГЛИКОЗИДОВ.

ГЛАВА У. ДЕЙСТВИЕ ТРИТЕРПЕНОВЫХ ГЛИКОЗИДОВ НА

МЕМБРАННУЮ ПРОНИЦАЕМОСТЬ И ВНУТРИКЛЕТОЧНЫЙ МЕТАБОЛИЗМ.

1. Взаимосвязь мевду связыванием тритерпеновых гликозидов с клетками и изменением проницаемости

2. Действие тритерпеновых гликозидов на мембранную проницаемость для УФ-поглощагацих веществ и их метаболизм.

3. Влияние условий инкубирования на мембранную проницаемость, индуцированную тритерпеновыми гликозидами.

4. Особенности проницаемости мембран эритроцитов в присутствии тритерпеновых гликозидов

5. Сравнительное изучение мембранотропной активности тритерпеновых гликозидов и полиеновых антибиотиков.'.

ГЛАВА 71. ВЛИЯНИЕ ЛШВДОВ И СТЕРИНОВ НА АКТИВНОСТЬ

ТРИТЕРПЕНОВЫХ ГЛИКОЗИДОВ

1. Сродство липидов и стеринов к тритерпеновым гликозидам.

2. Изменение чувствительности опухолевых клеток к действию тритерпеновых гликозидов с помощью липосом.

3. Влияние тритерпеновых гликозидов на стабильность липидных и лшщц-стериновых мембран.

ГЛАВА УЛ. ДЕЙСТВИЕ ТРИТЕРПЕНОВЫХ ГЛИКОЗИДОВ НА БИСЛОЙНЫЕ

ЛИПИДНЫЕ МЕМБРАНЫ (БЛМ) И ЛИПОСОМЫ.

1. Связывание тритерпеновых гликозидов с липосомами.

2. Действие тритерпеновых гликозидов на проницаемость липосом. ИЗ

3. Действие тритерпеновых гликозидов на ионную проводимость бислойных лишщных мембран

4. Особенности дискретной проводимости БЛМ, модифицированных голотурином А.

5. Особенности дискретной проводимости БЛМ в присутствии каулозвда С.

6. О резистентности мембран, содержащих стерины трепанга и их метаболиты, к действию стихопозида А.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Изучение мембранотропной активности некоторых тритерпеновых гликозидов»

Основным источником лекарств является растительный и животный мир нашей планеты. В настоящее время лекарственные вещества природного происхождения занимают около половины всех используемых в медицинских целях препаратов и их доля в последнее десятилетие имеет тенденцию к постоянного увеличению. В связи с этим поиск лекарственных средств растительного и животного происхождения и изучение механизма их действия представляют собой одну из важнейших задач современной науки.

Тритерпеновые гликозиды, выделенные из растений и морских беспозвоночных класса Holothuroidea составляют многочисленную группу лекарственных веществ / 3, 56, 192 /. Широко известны препараты женьшеня, аралии маньжурской, конского каштана, календулы, действующим началом которых являются тритерпеновые гликозиды / 25, 210 /. В последнее время описаны и химически охарактеризованы новые тритерпеновые гликозиды, обладающие широким спектром медико-биологической активности и процесс накопления фактического материала продолжается / 26, 35, 43, 133, 138 /. Высока вероятность создания на их основе новых противоопухолевых и анти-фунгальных препаратов / 15, 49, 170 /. Рассматриваются возможности использования тритерпеновых гликозидов в качестве специфических сорбентов холестерина при гемосорбции для лечения атеросклероза. Значительный интерес представляет и то, что эти гликозиды являются естественными факторами устойчивости растений к различным грибковым заболеваниям / 178 / и защиты голотурий от их естественных врагов / 67 /.

Имеются немногочисленные данные, касающиеся механизма действия тритерпеновых гликозидов. Подобно полиеновым антибиотикам гликозиды образуют специфические комплексы со стеринаш и действуют, главным образом, на с т ерино с од ержащи е биологические и модельные мембраны /46, 82 /. Они вызывают общую перестройку структуры мембран / 191 / и нарушение избирательной проницаемости / 162 - 168 /. Эти факты легли в основу "стериновой гипотезы" механизма действия тритерпеновых гликозидов / 107, 184 /. Тем не менее, из-за противоречивости имеющихся на настоящий момент данных / 65, 186 /, единство мнений,по многим основным вопросам, связанным с биологической активностью и механизмом действия этих соединений, у исследователей отсутствует и остается еще много нерешенных проблем.

В настоящее время слабо исследован спектрбиологической активности большинства тритерпеновых гликозидов. Важной проблемой остается установление взаимосвязи между структурой данных соединений и биологической активностью. До сих пор не изучен вопрос о механизме нарушения этими гликозидами барьерных свойств мембран. Остается не выясненным воцрос о роли структуры стерина в мембрано-тропной активности тритерпеновых гликозидов.

Знание механизма мембранотропного действия тритерпеновых гликозидов представляет большой теоретический и практический интерес, поскольку может служить основой для создания наиболее рациональных способов их применения в медицине и целенаправленного поиска наиболее активных препаратов. Кроме того, исследование механизма мембранотропной активности тритерпеновых гликозидов имеет непосредственное отношение к информации о роли этих веществ в природе и о роли стеринов как "рецепторов" физиологически активных веществ в биологических мембранах / 17, 89, 175 /.

Исходя из вышесказанного, цель работы состояла в изучении биологической активности и некоторых сторон механизма действия тритерпеновых гликозидов на различные биологические и модельные мембраны. В задачу исследования входило:

1. Изучить спектр биологической активности некоторых тритерпеновых гликозидов.

2. Исследовать влияние этих гликозидов на проницаемость биологических и модельных мембран.

3. Выяснить особенности взаимодействия исследуемых тритерпеновых гликозидов с шпщаш, природными стеринами и их метаболитами.

4. Определить основные принципы и индивидуальные особенности действия тритерпеновых гликозидов на модельные лшщцные и биологические мембраны.

Материалы исследований представлены в пяти главах. Первая из них включает описание материалов и методов исследования, вторая -- результаты изучения спектра биологической активности ряда тритерпеновых гликозидов, третья - посвящена изучению их действия на проницаемость биологических мембран, в четвертой - приведены данные о взаимодействии исследуемых тритерпеновых гликозидов с липидами и стеринами. Последняя глава включает результаты исследований, проводившихся на модельных мембранах.

Основные результаты исследований являются частью плановой работы, проводимой в лаборатории биоиспытаний (зав.лаб. - ст. н.с., к.б.н. Анисимов М.М.). Тихоокеанского института биорганиче-ской химии (ТИБОХ) ДВНЦ АН СССР. Отдельные фрагменты работы были выполнены на базе лаборатории ионного транспорта (зав.лаб.-профессор Антонов В.Ф.) ВДИЛ 2-го МОЛГМИ им. Н.И.Пирогова (г.Москва) и лаборатории физической и коллоидной химии (зав.лаб.-ст.н.с., к.ф.м.н. Ровин Ю.Г.) института химии ДВНЦ АН СССР (г.Владивосток).

ЧАСТЬ I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ГЛАВА I. ТРИТЕРПЕНОВЫЕ ГЛИКОЗИДЫ - БИОЛОГИЧЕСКИ

АКТИВНЫЕ ВЕЩЕСТВА 1МБРАНОТРОПНОГО ДЕЙСТВИЯ I. Химическое строение, распространение и свойства тритерпеновых гликозидов.

Тритерпеновые гликозиды состоят из агликона (генина) три-терпеновой природы и углеводной части. По строению агликона они могут относится к об - ( I ) или оО - ашриново^у ( П ), лупановощу ( Ш ), гопановоиу (1У), даммаранововду (У), ланоста-новоаду ( У1 ) и голостанововду ( УП ) рядам / 3 , 25, 56 , 201 /: голостан

В составе углеводной части найдены моносахариды: d -глюкоза, 3-0-метил- D -глюкоза, D -галактоза, d -ксилоза, D -хиновоза, Ь- арабиноза, L -рибоза, D -фуко-за, ь рамноза, ь -ликсоза и D -глюкуроновая кислота. При этом в сахарных цепях тритерпеновых гликозидов могут находиться от I до II различных моносахаридов, отличающихся как способом связи с другими моносахирами, так и местом присоединения к агликону / 30 /. Помимо традиционного присоединения углеводной цепи в С-3 положении, у некоторых тритерпеновых гликозидов возможны и другие варианты её расположения и даже одновременное присоединение двух углеводных цепей / 37, 201 /.

В настоящее время изучена структура около 200 тритерпеновых гликозидов. Подавляющее большинство растительных тритерпеновых гликозидов относится к д$ -амириновому ряду /3, 23, 56, 75 /. Первое упоминание о наличии тритерпеновых гликозидов в голотуриях ( класс Holotfa.uroid.ea ) относится к 1952 году, когда был выделен первый тритерпеновый гликозид животного происхождения - голотурин из Actinopyga agassizi / 158 /. Строение его было установлено Чанли с сотрудниками / 86 /. Дальнейшее сравнительное изучение химической структуры тритерпеновых гликозидов голотурий Тихого, Индийского и Атлантического океанов показало, что каждому семейству свойственны определенные типы гликозидов / 24 , 26 , 35 , 43 , 98, 137 /, относящиеся к голоста-H0B0ivy ряду ( УП ).

Отдельные виды рода Holothuria и Actinopyga семейства истинных голотурий Holothuriidae содержат глико,зиды типа голотуринов А и В, характерной особенностью которых является наличие, соответственно, четырех ( D -ксилоза, в -глюкоза, D -хиновоза и 3-0-метил- D -глюкоза) и двух ( D -ксилоза и D -хиновоза) моносахаридов и агликонов (1-5) с 12 об -окси-9 (II) -еновым фрагментом. Углеводная цепь содержит также суль-фогруппу / 26, 35, 43 /. в2 = он ;

В2 = Н ;

Е2 = OH j

Исследованные ВИДЫ рода Bohadschia имеют ГЛИКОЗИДЫ типа бивитозида (6) / 137 /. Углеводная цепь гликозидов этого типа не содержит сульфогруппы. Помимо представленного ниже гексазида отмечено присутствие тетра- и биозидов.

3-0-Me-Glc!iGlc ! j Xyl

З-6-Me-Gle

6. г

Голотурии семейства Stichopodidae содержат, главным образом, гликозиды типа стихопозида D ( 7 ) / 26 /. Гликозиды, выделенные из дальневосточного трепанга Stichopus japonicus

Selenka отличаются от них строением агликона. Строение стихопозида А из этого вида приведено на стр* 43 / 24 /• В строении углеводной цепи у гликозидов данного семейства отмечено значительное разнообразие. Однако, все гликозиды имеют чётное число моносахаридов и ряд биозидных фрагментов, которые повторяются во многих структурах / 26, 44, 138 /.

В физико-химическом отношении тритерпеновые гликозиды представляют собой большей частью аморфные вещества, чаще белого цвета, иногда без характерных температур плавления. Под действием растворов кислот они разлагаются с образованием агликона и Сахаров / 30 /.

В большинстве работ, связанных с изучением биологической активности гликозидов, авторы не проводят чёткого разделения медцу стероидными и тритерпеновыми гликозидами. Довольно часто и те, и другие объединяют под общим термином "сапонины" (от латинского слова " sapo " - мыло). Такой подход не случаен, так как к сапонинам обычно относят тритерпеновые и стероидные гликозиды, водные растворы которых обладают рядом характерных, свойств: гемолитической и поверхностной активностью, токсичностью в отношении холоднокровных животных, а также способностью образовывать комплексы с холестерином / 30, 46 /, т.е. с точки зрения физико-химических свойств и биологической активности эти соединения имеют больше сходства, чем различий. Тем не менее, термин "сапонины" не отражает главных химических особенностей этих двух разных групп соединений.

Основное отличие мевду стероидными и тритерпеновыми глико-зидами коренится в путях их биосинтеза. Циклизация с образованием агликонов различных групп тритерпеновых гликозидов происходит на стадии сквалена, а главным метаболическим предшественником стероидных гликозидов является холестерин. Отсвда, характерная только для тритерпеновых гликозидов структурная особенность - наличие дополнительных 3-х метальных групп, например, в С-4,4* и C-I4 положениях у гликозидов голостанового ряда (УП) / 119 /.

Подавляющее большинство тритерпеновых гликозидов выделено из растений. В настоящее время доказано наличие этих веществ более чем в 500 семействах / 22 /. К наиболее важным семействам, содержащим тритерпеновые гликозиды, относятся линейные, гвоздичные, лютиковые, бобовые, аралиевые, сложноцветные и другие / 201 /. Многие растения, содержащие эти гликозиды, являются постоянным источником питания людей. К числу их относятся сахарная свекла, чай, соя, шпинат, баклажаны и многие другие / 3, 30 /.

Тритерпеновые гликозиды, выделенные из животных, широко распространены только среди различных видов голотурий класса

Hoio-fchuroidea . Некоторые тропические виды этих морских животных имеют специализированные органы - кювьеровы железы, которые являются своеобразным хранилищем синтезируемых гликозидов / 15, 66, 67 /.

Отмечая биологическую роль тритерпеновых гликозидов, следует сказать, что она ещё недостаточно ясна. Большинство авторов склонны считать, что тритерпеновые гликозиды выполняют защитную функцию у растений, предохраняя их от поражения грибами - паразитами / 178 /, а также выбрасываются голотуриями вместе с кювьеровыми органами, когда им угрожает опасность со стороны хищников / 159 /. Кроме защитной функции, некоторые авторы отводят им определенное значение в регуляции межвидового равновесия в растительных и морских биоцинозах / 3, 66, 67 /, а также не исключают определенную гормональную функцию в онтогенезе организма-продуцента / 120 /.

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Попов, Александр Михайлович

ВЫВОДЫ

1. Изучено мембранотропное действие некоторых тритерпеновых гликозидов с использованием различных биологических и модельных липидных мембран, содержащих разные стерины. Показано, что механизм действия этих гликозидов связан с образованием в мембранах малых каналов и лор большого диаметра.

2. Исследованы на антифунгальную и антиопухолевую активность in vitro тритерпеновые гликозиды из более чем 20 видов голотурий.

Обнаружено, что представители рода Bohadschia , н. eauiis , St. variegatus являются источниками высоко активных гликозидов.

3. Показано, что изменение клеточной проницаемости, вызванное действием тритерпеновых гликозидов пропорционально связыванию гликозидов с мембранами и в значительной степени зависит от условий инкубирования: температуры, рН, ионного состава среды, а также от вида биологической модели.

4. Определено, что для тритерпеновых гликозидов из голотурий характерен "ступенчатый" механизм нарушения проницаемости мембран, содержащих холестерин. Полиеновые антибиотики амфотерицин В и нистатин образуют в стеринсодержащих мембранах каналы одного размера. Растительный тритерпеновый гликозид каулозид С индуцирует формирование в лилидном бислое каналов и пор, функционирование которых является рН - зависимым.

5. Выявлено, что рецепторами исследуемых тритерпеновых гликозидов являются стерины, входящие в структуру биомембран. Введение дополнительного количества холестерина в структуру мембран увеличивает эффективность действия тритерпеновых гликозидов.

6. Обнаружено, что способность основных природных стеринов взаимодействовать с исследуемыми тритерпеновыми гликозидами падает в ряду: холестерин, ^-ситостерин, стигмастерин, эргостерин. Стерины голотурий в гликозилированной и сульфированной формах утрачивают эту способность.

7. Отмечена значительная корреляция мелщу действием тритерпеновых гликозидов на биологические и модельные липидные мембраны, содержащие стерины, на основании чего предложен способ тестирования новых гликозидов на предмет мембранотропной активности.

- 144 -ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Тритерпеновые гликозиды, выделенные из растений и морских огурцов класса Hoiothuroidea , составляют обширную группу мембрано-активных соединений / 3, 23, 26 /. Эти гликозиды обладают широким спектром медико-биологического действия, а некоторые из них успешно применяются в медицинской практике / 46, 56 /. Из всех видов активности, отмеченных для данных гликозидов, наибольшего внимания заслуживает антиопухолевое и антифунгаль-ное действие / 170, 193 /.

При изучении новых гликозидов, выделенных более чем из 20 различных представителей класса Hoiothuroidea было показано, что гликозиды отдельных видов голотурий семейств Но lothuriidae и stichopodidae перспективны для дальнейших исследований как потенциальные антифунгальные и противоопухолевые препараты (см. табл. 1-3). Голотурины А, полученные из разных видов морских огурцов, существенно отличаются по степени ингибирующего действия на дрожжевые и опухолевые клетки. Их эффективные концентрации варьируют от 1,5 до 100 мкг/мл. Активность голотуринов А и В, отличающихся только по количеству моносахаридов в углеводной цепи, уменьшается при переходе от голотурина А к голотурину В. Этот факт свидетельствует в пользу важного значения углеводной части молекулы для проявления биологического действия.

Сравнительное исследование спектра биологической активности гликозидов животного происхождения голотуринов А и В, стихопозида А, кукумариозида G и растительных гликозидов каулозида С и теасапонина выявило , что эти гликозиды помимо анти-фунгальной активности / 48, 49 / обладают цитостатическим, гемолитическим и цитотоксическим действием (табл. 4-6). Прослежива

-145 ется значительная корреляция между рассматриваемыми видами биологической активности у гликозидов из голотурий. Кроме того, ясно видно, что по сравнению с этими гликозидами активность растительных гликозидов каулозида С и теасапонина менее выражена. Наблвдается сходство в минимальных действующих концентрациях гликозидов в отношении эмбрионов морского ежа (табл.4), опухолевых клеток (табл. 5) и эритроцитов (табл. 6), что, очевидно, определяется высоким содержанием холестерина (от 20 до 40 мол.$) в плазматических мембранах этих биологических моделей / 33, 53, 54 /.

Действие исследуемых гликозидов на клетку обусловлено связыванием их с цитоплазматическими мембранами. Характерно, что кинетика связывания каулозида С, теасапонина, голотурина А и стихопозида А с клетками А дрожжей приблизительно одинакова, но по эффективности нарушения избирательной проницаемости данные гликозиды можно расположить в убывающий ряд: голотурин А, стихопозид А, каулозид С и теасапонин. При этом цроницаемость клеточных мембран изменяется пропорционально связыванию гликозидов с клетками (рис. 2).

Исследуемые тритерпеновые гликозиды оказывают влияние на внутриклеточный метаболизм. Причем, ингибирование включения 14с - уридина в РНК в присутствии каулозида С, стихопозида А и теасапонина происходит не за счет угнетения процесса биосинтеза этого биополимера, а посредством нарушения проницаемости цитоплазматических мембран (рис. 3).

Важную роль в активности гликозидов играют внешние факторы: температура, рН и ионный состав среды. С повышением температуры от 0°С до 30°С проницаемость клеточных мембран резко возрастает (рис. 5, 6). Причем гликозиды растений отличаются по мембранной активности от гликозидов из голотурий. Так, стихопозид

А и голотурин А вызывают изменение проницаемости мембран яйцеклеток морского ежа уже при 0°С, в то время как каулозид С и теасапонин при этой температуре подобного эффекта не проявляет (рис.5). Наиболее высокая активность каулозида С и теасапонина проявляется при рН около 5,0. Напротив, активность стихопозида А относительно слабо зависит от рН, но выше в нейтральной среде (рис.7 и табл.7). В среде, не содержащей ионов, мембра-нотропное действие тритерпеновых гликозидов менее выражено, чем в любом из исследованных солевых растворов. При этом стимулирующий эффект в присутствии одновалентных ионов к+, Na+, Li+ почти в 2 раза выше по сравнению с двухвалентными ионами Са2+, Mg2+ (рис.8).

Нарушение клеточной проницаемости тритерпеновыми гликози-дами имеет свои особенности. Исследуемые тритерпеновые гликозиды, за исключением каулозида С, в сравнительно низких концентрациях подобно амфотерицину В вызывают выход из эритроцитов (рис.9) и яйцеклеток морского ежа (рис.10) ионов К*". По мере увеличения концентрации гликозидов возрастает отток из клеток не только ионов К+, но и начинается выход и УФ - поглощающих веществ.

Этот факт свидетельствует о том, что голотурины А и В, стихопозид А, кукумариозид G и теасапонин в зависимости от концентрации в среде индуцируют образование в мембранах, содержащих холестерин, "отверстий" разного размера. Каулозид С в одних и тех же дозах вызывает утечку из клеток как ионов К+, так УФ - поглощающих веществ (рис.10).

Полиеновые антибиотики при малых и больших концентрациях индуцируют выход из яйцеклеток морского ежа, эритроцитов и клеток дрожжей только ионов К+ (рис.10, табл.10 и рис.11). Иная картина наблкщается при действии гликозидов на дрожжи.

- 147

В данном случае с увеличением концентрации гликозидов возрастает выход из клеток не только ионов К4", но и УФ-поглощающих веществ. Наблюдаемая картина изменения проницаемости возможно связана с тем, что тритерпеновые гликозиды индуцируют образование в мембранах клеток дрожжей сразу более крупных пор, чем в мембранах яйцеклеток морского ежа и эритроцитов. Наиболее вероятными акцепторами тритерпеновых гликозидов, являются стерины клеточных мембран. Вполне логично было предположить, что отмеченные различия в характере действия тритерпеновых гликозидов на дрожжи, содержащие эргостерин, и яйцеклетки морского ежа и эритроциты, содержащие холестерин, обусловлены особенностями взаимодействия гликозидов с этими стеринами и, следовательно, различием формирующихся в мембране проводящих комплексов. Это предположение подтвердили результаты дальнейших исследований.

При сравнении способности холестерина и эргостерина образовывать нейтральные комплексы с гликозидами (табл. 13 ) было обнаружено, что для нейтрализации цитостатического действия тритерпеновых гликозидов требуется приблизительно равное число молекул холестерина. Этот факт указывает на приблизительную эквимолярность комплексов гликозидов с холестерином. Эргостерин имеет меньшее сродство к гликозидам. Молярное отношение гликозид-эргостерин для каулозида С составляет приблизительно 1:8, для теасапонина - 1:5, а для голотурина А и стихопозида А - 1:2.

Включение экзогенного холестерина в структуру клеточной поверхности с помощью липосом существенно изменяет чувствительность опухолевых клеток к тритерпеновым гликозидам. Характер действия каулозида С и теасапонина зависит от рН среды. При нейтральной рН 7,4 эти гликозиды более активны в отношении модифицированных опухолевых клеток, а при снижении среды

- 148 рН 5,6) эффективнее действуют на обычные опухолевые клетки. Стихопозид А не проявляет видимых рН зависимых свойств и в обоих случаях дает более выраженный ингибирующий эффект в отношении обогащенных холестерином опухолевых клеток (рис. 12 и 13).

При изучении влияния гликозидов на стабильность липидных и липид-стериновых модельных мембран было показано (рис. 14), что введение стерина в мембрану резко увеличивает её чувствительность к дестабилизирующему действию голотурина А, стихопозида А и каулозида С. Эффективность действия в значительной мере зависит от вида стерина в мембране. Липид-стериновые пленки, содержащие холестерин, более чувствительны к действию гликозидов, чем плёнки с эргостерином. Мембраны с растительными стеринами (yS- ситостерином и стигмастерином занимают по чувствительности промежуточное положение. Активность растительного гликозида каулозида С зависит от рН среды, что согласуется с данными по его биологической активности.

Обращает на себя внимание отличие в дестабилизирующем действии голотурина В (рис. 15) на липидную матрицу по сравнению с голотурином А. Последний более чем на порядок эффективнее голотурина В действует на лшщдные плёнки, не содержащие стерина. Это наводит на мысль, что существует взаимосвязь медду длиной углеводной цепи молекулы гликозида и его эффективной концентрацией в отношении мембраны.

Изучение связывания гликозидов с липосомами позволило объяснить некоторые особенности их действия на биологические мембраны. Эффективность рецепции исследуемых гликозидов на холестеринсодержащие липосомы уменьшается й ряду: голотурин А, стихопозид А, теасапонин и каулозид С (рис. I6-A), что коррелирует с порядком их активности в отношении клеток, содержа

- 149 щих холестерин (табл. 4-6). Голотурин А и стихопозид А имеют высокое сродство к липосомальнотуу эргостерину (рис. I6-B) и высоко активны в отношении клеток дрожжей и грибов / 48 /. Напротив, каулозид С, хотя достаточно эффективно действует на клетки дрожжей (рис. 2), практически не реагирует на присутствие эргостерина в липосомальной мембране (рис. I6-B). Вместе с тем, этот гликозид при рН 5,6 (рН.оптимальная для развития дрожжей) интенсивно связывается с липосомами и в отсутствии стерина (рис. 17). Таким же свойством, но, в меньшей степени, характеризуется и теасапонин. Поэтоьду при рН^7,0 в мембранотропной активности этих гликозидов важную роль играет неспецифическое взаимодействие с липидной частью мембраны в целом. Действие гликозидов на проницаемость липосом (рис. 18) согласуется с их рецепцией на последние и порядком активности в отношении клеток.

При изучении .влияния голотурина А, каулозида С и теасапонина на интегральную проводимость плоских бислойных липидных мембран (БЛМ), в состав которых вводился холестерин или эргостерин, было обнаружено (рис. 20), что для этих гликозидов характерна крутая зависимость проводимости от концентрации вещества, равная для голотурина А около 4, каулозида С и теасапонина - 8. Такой характер зависимости проводимости от концентрации гликозидов предполагает канальный механизм изменения проницаемости бислойных липидных мембран, содержащих холестерин и эргостерин. Для голотурина А эффективная концентрация слабо зависит от вида используемого стерина (холестерин или эргостерин), а также от рН среды. Эффективные концентрации каулозида С и теасапонина уменьшаются в несколько раз при рН^ 7,0 и при замене в мембране эргостерина на холестерин ( рис. 20 ). Существует значительное сходство в действующих концентрациях гликозидов на БЛМ и биологические модели (табл. 1-6), что выгодно отличает эту модель от липосом.

При изучении трансмембранных флуктуаций тока через бислой-ные липидные мембраны, содержащие холестерин и эргостерин, были выявлены закономерности в действии голотурина А и каулозида С на эти мембраны.

При малых концентрациях голотурина А (0,1 нг/мл)по обе стороны липид-холестериновых мембран наблвдаются дискретные скачки проводимости, связанные с образованием и работой одиночных каналов (рис. 21-а, б). Спектр амплитуд проводимостей этих каналов имеет резко выраженный максимум в области 28+4 пСм, (рис. 22-А), а среднее время жизни составляет около 12 сек (рис. 22-В). Двухсторонний характер действия голотурина А на БЛМ указывает на то, что образуемый канал, как и амфотерициновый, складывается из двух полупор.

При концентрации голотурина А от 10 до 100 нг/мд характерными являются поры с уровнем проводимости от 4 до 8 нСм (рис.23). Большие каналы (поры) являются, по-видимому, результатом структурных кооперативных переходов в бислое. Регистрируемые флуктуации тока сравнимы по амплитуде с индуцируемыми аламетицином, приблизительно в 30 раз больше грамицидиновых каналов и примерно в 300 раз больше флуктуации тока в мембранах с полиеновыми антибиотиками / 27 /. Проведенный расчет наиболее вероятного радиуса пор, индуцированных голотурином А в холестерин-содержащих мем

О у бранах при этих концентрациях, дал величину порядка 14 А /II /.

Несколько отличный характер флуктуационных явлений наблюдается при действии голотурина А на липид-эргостериновые бислои (рис. 21-в,г), где с увеличением дозы гликозида с 0,1 до 1,0 нг/мл наблюдается резкий переход с спонтанным флуктуациям тока больших амплитуд (рис. 21-г). Это означает, что граница перехода от одиночных каналов проводимости, имеющих малые размеры, к порам больших размеров имеет в случае эргостерина более резкий характер, чем в случае холестерина. Это очевидно объясняется различием образующих в том и другом случае проводящих комплексов в мембране. Полученные результаты объясняют особенности проницаемости мембран клеток дрожжей, содержащих эргостерин, в присутствии голотурина А (см.раздел У-5).

Таким образом можно сказать, что ключевую роль при действии голотурина А на биомембраны играет образование динамического комплекса этого гликозида со стерином.

В действии разных гликозидов на мембраны помимо общих черт имеются существенные различия. В присутствии каулозида С на БЛМ без стерина наблюдаются дискретные изменения проводимости, уровень которых зависит от рН среды. С увеличением рН от 5,6 до 7,4 возрастает доза гликозида, начиная с которой регистрируются флуктуации тока; во-вторых, уменьшается вероятность появления уровней большой проводимости. Наблюдаемую рН зависимость можно объяснить наличием карбоксильной группы в положении 0-17 молекулы этого гликозида и ее протонированием при рН 5,6 , что облегчает проникновение гликозида в мембрану.

При введении в БЛМ холестерина при рН 5,6 и 7,4 проводимость регистрируемых уровней на мембранах, модифицированных каулозидом С, увеличивается на 2-3 порядка по сравнению с БЛМ без стерина. Характер флуктуанионных явлений предполагает образование в мембране проводящих гликозид-холестериновых комплексов большого размера. Введение эргостерина в структуру БЛМ оказывает слабое влияние на проявление мембранотропной активности каулозидом С по сравнению с БЛМ без стерина. Можно предположить, что в антифун-гальной активности этого гликозида важную роль играет неспецифическое рН-зависимое действие на мембрану.

Эффективность действия тритерпеновых гликозидов на проницаемость стерин-содержагцих мембран зависит от присутствия в молекуле стерина свободной 3 JB- ОН - группы. Естественное сульфатирование и гликозилирование этой гидроксильной группы стеринов в теле трепанга предотвращает их взаимодействие с тритерпеновыми гликозидами (рис. 26-28). Поэтому не исключена возможность, что устойчивость клеток и тканей трепанга к действию собственных гликозидов обусловлена наличием в мембранах стеринов в форме гликозидов и сульфатов.

Исходя из приведенных экспериментальных данных, можно высказать ряд общих соображений относительно механизма мембранотроп-ной активности тритерпеновых гликозидов. Поскольку тритерпено-вые гликозиды синтезируются живыми организмами и применяются как лекарственные препараты, механизм, с помощью которого эти вещества изменяют свойства мембран, представляет особый интерес. Этот интерес объясняется еще и тем, что затрагивает новые аспекты участия стеринов и липидов в мембранных транспортных процессах. Новым является то обстоятельство, что на биологических и модельных мембранах, содержащих стерины и модифицированных разными гликозидами, удается обнаружить образование малых и больших каналов (пор). Как видно из результатов, изложенных выше, динамика их образования зависит от структуры и концентрации гликозидов, имеющих разную относительную специфичность действия, и от стеринового состава мембран. Предложенная Глауэртом с соавторами / 107 / на основании данных электронной микроскопии модель поры(рис. I) не может объяснить особенностей действия исследованных нами гликозидов на мембранную проницаемость и требует уточнения.

При встраивании в мембранный бислой молекул тритерпеновых гликозидов их ориентации должна предопределяться ярко выраженными бифильными свойствами этих веществ: относительной гидро-фобностью агликона и гидрофильностыо сахарной цепи. Проникновению агликонной части молекулы в гидрофобную сердцевину бислоя, очевидно, способствует поверхностная активность гликозида, которая зависит от длины, состава и степени разветвленности сахарной цепи. Вместе с тем, агликоны большинства тритерпеновых гликозидов, проявляющих биологическую активность, имеют, как правило, гидрофильные функциональные группы. Поэтому только часть агликона будет соответствовать гидрофобному окружению и, надо полагать, комплементарна мембранному стерину. Другая, несущая ряд гидрофильных групп, должна вызывать дезорганизацию упаковки жирно-кислотных остатков фосфолипидов, разрывая гидрофобные связи между цепями жирных кислот в липидной фазе мембраны и уменьшая её структурированность. Учитывая различия в степени гидрофоб-ности агликонов, можно ожидать такую, агрегацию молекул гликозидов со стеринами, при которой его гидрофобная зона оказывается обращенной в сторону липидной фазы, а гидрофильная внутрь цилиндрического комплекса. Такой комплекс, пронизывающий бислой в случае биологических и липосомальных мембран, может быть гидрофильным "отверстием" (каналом), диаметр которого должен определяться числом входящих в агрегат субъединичных комплексов гликозид-стерин. В случае БЛМ с растворителем такой канал должен появляться только тогда, когда два агрегата оказываются расположенными один против другого. Отмеченное нами образование каналов малой проводимости в присутствии голотурина А, возможно, происходит, по описанному механизму, за счет гидрофильных функциональных групп агликонной части молекулы этого гликозида. По-видимому, аналогично идет процесс образования малых-каналов и при действии других исследованных гликозидов на мембраны, содержащие холестерин, исключая каулозид С.

С ростом концентрации гликозида в среде в стеринсодержа-щих мембранах наблюдается образование проводящих комплексов большого размера (пор). Хотя динамика перехода от малых каналов к высоко проводящим порам пока не ясна, в формировании последних, по-видимому, решающую роль играет соотношение размеров гидрофильной и гидрофобной части молекулы тритерпе-нового гликозида. Наличие сахарной цепи придает ей клиновидную форму. Поэтому в участках расположения малых гликозид-стериновых каналов, представляющих собой метастабильные образования в бислое, идет образование крупных стабильных пор, полость которых выстилают сахарные цепи. По-видимому, эти поры обнаруживаются электронно-микроскопически в виде сети гексагональных структур в мембранах, содержащих стерины / 96, 185, 191 /.

По нашему мнению, дальнейшие комплексные исследования динамики образования различных гликозид-стериновых проводящих комплексов в мембранах создадут необходимую основу для построения совершенной молекулярной модели, объясняющей механизм мембранотропного действия тритерпеновых гликозидов.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Попов, Александр Михайлович, 1984 год

1. Аминин Д.Л., Шенцова Е.Б., Анисимов М.М., Кузнецова Т.А. Спектрофотометрическое определение стихопозида А из голотурии Stichopus japonicus s. - Антибиотики, 1981. № 8, с.585-588.

2. Анисимов М.М., Стригина Л.И., Баранова С.И., Кульга А.Л., Четырина Н.С. Об антимикробной активности тритерпеновых гликозидов из Caulophyllum robustum Maxim. Антибиотики, 1972, № 9, с. 834-937.

3. Анисимов М.М., Чирва В.Я. О биологической роли тритерпеновых гликозидов. Успехи соврем, биол., 1980, т.90. вып.3 (б), с. 351-364.

4. Анисимов М.М., Щеглов В.В., Дзизенко С.Н. Влияние некоторых тритерпеновых гликозидов на биосинтез стеринов и жирных кислот у дрожжей. Приклад, биохим.микробиол., 1978, № 4, с. 573-582.

5. Анисимов М.М., Щеглов В.В., Киселева М.И. Влияние некоторых тритерпеновых гликозидов. на проницаемость плазматических мембран для аминокислот в дрожжевых клетках. Антибиотики, 1978, № I, с. 66-69.

6. Анисимов М.М., Щеглов В.В., Кузнецова Т.А., Еляков Г.Б., Чувствительность клеток Candida albicans к действию тритерпеновых гликозидов дальневосточного трепанга Stichopus ja-ponicus seienka. Микробиология, 1973, т. 42, с. 667-771.- 158

7. Анисимов М .М., Щеглов В.В., Стоник В.А., Кульга А.Л., Левина Э.В., Левин B.C., Еляков Г.Б. Сравнительное изучение антигрибковой активности тритерпеновых гликозидов тихоокеанских голотурий . Доклады АН СССР, 1972, т. 207, №3, с. 7II-7I3.

8. Анисимов М.М., Баранова С.И., Стригина Л.И., Четырина Н.С., Сокольский И.Н. Влияние некоторых тритерпеновых гликозидов на биосинтез РНК в культуре дрожжевых клеток Saccharomy- . ces carlsbergensis . Антибиотики, 1977, № 9, с. 837-841.

9. Антонов В.Ф., Иванов А.С., Корепанова Е.А., Петров В.В. Использование ионочувствительных электродов и модельных бислойных мембран для изучения пассивного транспорта ионов. В кн.: Биофизика мембран, вып. 5, М; ВИНИТИ АН СССР, 1975, с. 166-203.

10. Антонов В.Ф. Липиды и ионная проницаемость мембран. М.: Наука, 1982, 150 с.

11. Ахрем А.А., Титов Ю.А. Стероиды и микроорганизмы. М.: Наука, 1970, 526 с.

12. Белоусова И.И., Вирина A.M., Петров Л.Н., Терешин И.М. Изучение взаимодействия амфотерицина В со стеринами чувствительного и резистентного к полиеновым антибиотикамштаммов Candida albicans методом кругового дихроизма. -Антибиотики, 1982, №2, с. 95-98.

13. Бережевская Л.И., Улькина Ж.И., Глебко Л.И. Цветные реакции хедерагенина и его гликозидов. Химия природ, соедин., 1980, № 5, с. 643-646.

14. Биологически активные вещества гидробионтов новый источник лекарств. Под редакцией Саканделидзе О.Г. и Кипиани Р.Е. Кишинев: Штиинца, 1979, 248 с.

15. Биохимическое исследование мембран. Под редакцией Э. Мэдди. М.: Мир, 1979, 460 с.

16. Богатский А.В., Назарова Н.Ю., Бобейко В.А., Кинтя П.К. Модификаторы бислойных липидных мембран среди стероидных гликозидов. Доклады АН СССР, 1980, т. 252, с. 235-237.

17. Богатский А.В., Назарова Н.Ю ., Назаров Е.И., Кинтя П.К., Бобейко В.А. Дискретные флуктуации проводимости бислойных липидных мембран, вызванные стероидным гликозидом агавози-дом Е. Д оклады АН УССР, 1981, № I, с. 79-81.

18. Богословская Е.П., Каган В.Е., Глущенко Н.Н., Ерохин В.Н., Козлов Ю.П. Сравнительное изучение противоопухолевого действия полиненасыщенной жирной кислоты и продуктов её автоокисления. Известия АН СССР, сер. биол., 1976, № 3. с. 734741.

19. Бузников Г.А., Подмарев В.К. Морские ежи Strongylocentrotus drobachinensis, St. nudus, St. intermedius. В кн.: Методы биологии развития. М.: Наука, 1975, с. 188-223.

20. Вирина A.M., Фейгин A.M., Фатеева Л.И., Касумов Х.М., Бело-усова И.И., Терешин И.М. Взаимодействие полиеновых антибиотиков с чувствительными и резистентными штаммами Candida albicans . Химико-фармац. ж., 1976, № 7, с. 12-16.

21. Гуванов И.А., Либизов Н.И., Гладких А.С. Поиск сапонин-содержащих растений среди флоры Центральной Азии и южного Казахстана. Фармация, 1970, т. 19, с. 23-28.

22. Деканосидзе Г.Е., Чирва В.Я., Сергиенко Т.В., Уварова Н.И. Исследование тритерпеновых гликозидов. Установление строения и синтез. Тбилиси: Мецниереба, 1982, 151 с.

23. Еляков Г.Б., Мальцев И.И., Калиновский А.И., Стоник В.А. Строение голотоксина Aj(стихопозида А), основного тритерпенового гликозида тихоокеанской промысловой голотурии Sti-chopus japonicus. Биоорг. химия, 1983, т. 9, № 2, с. 280281.

24. Еляков Г.Б., Оводов Ю.С. Гликозиды аралиевых. Химия прир. соедин., 1972, № 6, с. 697-709.

25. Еляков Г.Б., Стоник В.А., Афиятуллов Ш.Ш., Калиновский А.И., Шарыпов В.Ф., Коротких Л.Ю. Агликоны гликозидов из морских огурцов. Доклады АН СССР, 1981, т. 259, № 6, с. 1367-1369.

26. Ермишкин Л.Н., Зильберштейн А.Я. Ионные каналы, образуемые антибиотиками. Структура и свойства. В кн.: Биофизика мембран. Итоги науки и техники. - ВИНИТИ АН СССР, 1982, т.2, с. 82-160.

27. Ивков В.Г., Берестовский Г.Н. Динамическая структура липид-ного бислоя. М.: Наука, 1961, 293 с.

28. Ивков В.Г., Берестовский Г.Н. Липидный бислой биологических мембран. М.: Наука, 1982, 224 с.

29. Зинкевич Э.П., Вечерко Л.Н. Тритерпеновые гликозиды (сапонины) В кн.: Лекарственные растения. М.: Колос, 1969, т. 15, с. 640-657.

30. Кейтс М. Техника липидологии. Выделение, анализ и идентификация липидов. М.: Мир, 1975, 322 с.

31. Кларксон Д. Транспорт ионов и структура растительной клетки. М.: Мир, 1978, 368 с.

32. Котык А., Янычек К. Мембранный транспорт. М.: Мир, 1980, 341 с.

33. Кругляков П.М., Ровин Ю.Г. Физико-химия углеводородных пленок. М.: Наука, 1978, 183 с.

34. Кузнецова Т.А., Калиновская Н.И., Калиновский А.И., Олейникова Г.К., Еляков Г.Б. Гликозиды морских беспозвоночных ХШ.- 161

35. Структура голотурина В из морского огурца Holothuria flo-ridana. Химия прир. соед. АН УзССР, 1982, № 4, с. 482484.

36. Лев А.А. Моделирование ионной избирательности клеточных мембран. М.: Наука, 1976, 208 с.

37. Мжельская Л.Г., Абубакиров Н.К. Тритерпеновые гликозиды Leontice eversmanii. У. Строение леонтозида Е. Химия природ. соед., 1968. в. 2, с. 216 - 219.

38. Овчинников Ю.А., Иванов В.Т., Шкроб A.M. Мембрано-активные комплексоны. М.: Наука, 1974, 463 с.

39. Ровин Ю.Г. Концентрация образования черных пятен и действие детергентов на черные липидные мембраны. Биофизика, 1978, т. 23, $ 4, с. 638-640.

40. Ровин Ю.Г., Колпаков А.Ф., Багавеев И.А. 0 критической концентрации образования черных пятен в микроскопических углеводородных эмульсионных пленках. Коллоид, ж., 1979, т. 41,с. 166-169.

41. Рокицкий П.Ф. Биологическая статистика. Минск: Вышейш. школа, 1973, 320 с.

42. Семенов А.А. Природные противоопухолевые соединения. Структура и механизм действия. М.: Наука, 1979, 243 с.

43. Стоник В.А., Чумак А.Д., Исаков В.В., Белогорцева Н.И., Чир-ва В.Я., Еляков Г.Б. Гликозиды морских беспозвоночных. Структура голотурина В из Holothuria atra . Химия природ, соед., 1979, № 4, с. 522-526.

44. Стоник В.А., Шарыпов В.Ф., Калиновский А.И., Еляков Г.Б. Структура агликонов и миграция двойной связи у тритерпеновых гликозидов из голотурий семейства Stichopodidae . Доклады АН СССР, 1979, т. 245, с. 1133 -1136.

45. Стригина Л.И., Четырина Н.С., Еляков Г.Б. Тритерпеновые гликозиды Caulophyllum robustum Maxim. Химия природ, соед., 1970, № 5, с. 522-555.

46. Турова А.Д., Гладких А.С. Экспериментальная и клиническая фармакология сапонинов. Фарм.токсикол., 1969, т. 27,2, с. 242-249.

47. Щеглов В.В., Анисимов М.М., Шенцова Е.Б. Распределение аккумулированных из среды тритерпеновых гликозидов в дрожжевой клетке и влияние их на выход из клеток ортофосфата и амин-ного азота. Приклад, биохим. микробиол., 1979, № 3,с. 375-379.

48. Щеглов В.В., Баранова С.И., Анисимов М.М., Антонов А.С., Афиятуллов Ш.Ш., Левина Э.В., Шарыпов В.Ф., Стоник В.А., Еляков Г.Б . Изучение антимикробного спектра действия некоторых тритерпеновых и стероидных гликозидов. Антибиотики, 1979, № 4, с. 270-273.

49. Щеглов В.В. Изучение антифунгальной активности тритерпенои-дов, стероидов и их гликозидов: Автореф. дис. канд. биол. наук. Владивосток, 1977.

50. Щербановский Л.Р. Антимикробные свойства сапонинов и стероидных гликоалкалоидов. Раст.ресурсы, 1971, т. УП, в. I, с. I33-I4I.

51. Фейгин A.M., Белоусова И.И., Терешин И.М. Роль структуры стерина в комплексообразовании с полиеновыми антибиотиками.-Антибиотики, 1978, № 12, с. 1079 -1082.

52. Фейгин A.M., Гианик Т., Пасечник В.И., Флеров М.Н., Богословский И.А., Литвинова Г.Е., Белоусова И.И., Терешин И.М. Роль стеринов во взаимодействии полиеновых антибиотиков с липидными мембранами. Антибиотики, 1981, № 7, с.522-526.

53. Холодова Ю.Д. Структурно-функциональные особенности мембран с различным содержанием холестерина. Укр. биохим. ж., 1981, т. 53, № 5, с. II4-I30.

54. Anisimov M.M., Prokofyeva N.G., Strigina L.I., Chetyri-na N.S., Aladina N.G. and Elyakov G.B. Cells from ratmarrow: sensitivity of effects of certain pentacyclic tri-terpenoids. Biochem. Pharmacol., 1977, v. 26, N 22, p. 2113-2116.

55. Anisimov M.M., Shentsova E.B., Shcheglov V.V., Shumilov Yu.N., Rasskazov V.A., Strigina L.I., Chetyrina N.S. and Elyakov G.B. Mechanism of cytotoxic action of some triter-pene glycosides. Toxicon, 1978, v. 16, p. 207-218.

56. Assa Y., Chet J., Gestetner В., Govin R., Birk Y. and Bon-di A. Effects of alfalfa saponins growth and lysis of Phy-sarum polycephalum. Archs. Microbiol., 1975» v. 103, p.77-81.

57. Assa Y., Gestetner В., Chet I., Henis Y. Fungistatic activity of lucerne saponins and digitonin as related to sterols. Life Sci., 1972, v. 11, N 13, p. 637-647.

58. Assa Y., Gestetner В., Henis Y., Birk Y., Bondi A. Alfalfa saponins. Relationship between their composition and biological activities. Isr. J. Chem., 1970, N 8, p. 155-160.

59. Assa Y., Shany S., Gestetner В., Tencer Y., Birk Y., Bondi A. Interaction of alfalfa saponins with components of the erythrocyte membrane in hemolysis.- Biochim. Biophys. Acta, 1973, v. 307, p. 83-91.

60. Bakus G.J. Defensive mechanisms and ecology of some tropical holothurians.- Marine Biol., 1968, v. 2, N 1, p. 23-32.

61. Bakus G.J. The biology and ecology of tropical holothurians. Biol. Geol. Coral Reefs., 1973, v. 2, p. 325-367.

62. Balansard J. and Pellessier P. Action de la saponine du qui-llaya sur le pouvoir absorbant des graines de Pisum. -Compt. Rend. Soc. Biol., 194-3, v. 137, p. 455-456.

63. Balansard J., Pellessier P. and Conil S. Action des saponines de quillaya et de Sapindus sur le pouvoir absorbant, la germination et la croissance de Zea mais L. Compt. Rend. Soc. Biol., 194-6, v. 14-0, p. 14-0-142.

64. Balansard J. and Pellessier F. Saponines et croissance chez Solanum lypopersicum L. Сотр. Rend. Soc. Biol., 194-5»v. 139, p. 1098-1100.

65. Bangham A.D. Lipid bilayers and biomembranes. Aanu. Rev. Biochem., 1972, v. 41, p. 753-776.

66. Bangham A.D. and Home R.W. Action of saponin on biological cell membranes. Nature, 1962, v. 196, p. 952-953.

67. Bangham A.D., Standish H.M., Watkins J.C. Diffusion of univalent ions across the lamellae of swollen phospholipids. -J. Mol. Biol., 1965, v. 13, p. 238-252.

68. Bangham J.A., Lea J.A. The interaction of detergents with bilayer lipid membranes. Biochim. Biophys. Acta, 1978, v. 511, N 3, p. 388-396.

69. Basu N. and Rastogi R.P. Triterpenoid saponins and sapoge-nins. Phytochemistry, 1967, v. 6, p. 1249-1270»

70. Benz R. and Hancock R.E.W. Properties of the large ion-permeable pores from protein P of Pseudomonas aeruginosa in lipid bilayer membranes. Biochim. Biophys. Acta, 1981, v.646, p. 297-303.

71. Bernard S. Influence de la lecithine sur 1*action hemoly-sante de la saponine. Compt- Rend. Soc. Biol., 1923»v. 89, p. 225-227.

72. Bleau G., Bodley P.H., Longpre J., Chapdelaine A. and Roberts K.D. Cholesterol sulphate. I. Occurence and possible biological fuction as on amphypathic lipid in the membrane of the human erythrocyte. Biochim. Biophys. Acta, 1974,v. 352, p. 1-9.

73. Bloj В., Zilversmit D.B. Complete exchangeability of cholesterol in phosphatidylcholine/cholesterol vesicles of different degrees of unsaturation. Biochemistry, 1977» v. 16, N 18, p. 394-3-394-8.

74. Bligh E.G. and Dyer W.I. A rapid method of total lipid extraction and purification. Can. J. Biochem. Physiol.,1959, v. 37, p. 911-917.

75. Boggs J.M. Intermolecular hydrogen bonding between lipids: influence on organization and function of lipid in membranes. Can. J. Biochem., 1980, v. 58, N 10, p. 755-770.

76. Boiteau P., Pasich B., Ratismanga A.R. The triterpenoids in plant and animal physiology. Paris, Gauthier-Villars, 1964-, 1360 p.

77. Bottomley M., Kramers M.T.C. and Chapman D. Cholesterol depletion from biomembranes of marine lymphocytes and human tonsil lymphocytes. -FEBS Lett., 1980, v. 119, N 2, p. 261264.

78. Brockerhoff H., Agengar W.K.N., Lipton L.C. The hydrogen belts of membranes: Effects of o-substituted cholesterol on membrane condensation and closure. Fed. Proc. Abstr., 1978, v. 37, p. 1725-1736.

79. Cass A., Finkelstein A., Krespi V. The ion permeability induced in thin lipid membranes by the polyene antibiotics nystatin and amphotericin B. J. Gen. Physiol., 1970,v. 56, p. 100-124.

80. Chanley J.D., Mezzetti T. and Sobotka H.- The holothurino-genins. Tetrahedron, 1966, v. 22, p. 1857-1884.

81. Cheeke P.E. Nutritional and physiological properties of saponins. Nutr. Rep. Int., 1976, v. 13, N 3, p. 315-324.- 168

82. Cheeke P.R. Nutritional and physiological implications of saponins. A review. Can. J. Anim. Sci., 1971» v. 51»p. 621-632.

83. Cowell J.L., Kim Kwang-Shin and. Bernkeimer A.W. Alteration by cereolysin of the structure of cholesterol-containing membranes. Biochim. Biophys. Acta, 1978, v. 507» P? 230241.

84. Cullis P.R. and De Kruijff B. Lipid polymorphism and the functional roles of lipids in biological membranes. -Biochim. Biophys. Acta, 1979, v. 559, P- 399-420.

85. Cullis P.R., De Kruijff В., Hope M.J., Nagar R., Scbmid S.L. Phospholipids and membrane transport. Can. J. Biochem., 1980, v. 58, № 10, p. 1091-1100.

86. Demel R.A., Bruckdorfer K.R., Van Deenen L.L.M. The effect of sterol structure on the permeability of liposomes to ' glucose, glycerol and Rb+. Biochim. Biophys. Acta, 1972, v. 255, P. 321-352.

87. Demel R.A., Jansen J.W.C.M., Van Dijck P.W.M. and Van Deenen L.L.M. The preferential interaction of cholesterol with different classes of phospholipids. Biochim. Biophys. Acta, 1977, v. 465, p.1-10.

88. Dourmashkin R.R., Dougherty R.M. and Harris J.C. Electronmicroscopic observations on rous sarcoma virus and cell membranes. Nature, 1962, v. 194, p.- 1116-1119.

89. Elyakov G.B., Kalinovskaya N.I., Stonik V.A., Kuznetsova T.A. Glycosides of marine invertebrates. VI. Steroid glycosides from holothurian Stichopus japonicus. - Сотр. Biochem. Physiol., 1980, v. 65 В, p. 309-314.

90. Ermishkin L.N., Kasumov Kh.M., Potseluev V.M. Single ionic channels induced in lipid bilayers by polyene antibiotic amphotericin В and nistatine. Nature, 1976, v. 262,p. 698-699.

91. Euler H. Einwirkung von Saponinen und Digitalis-glucosiden auf Samenkeimung und Mitose. Arkive Kemi. Mineral.Geol., 1946, v. A22, ГГ 14, p. 121-124.

92. Friess S.L. Mode od acfcion of marine saponins on neuromuscular tissues. Fed. Proceed., 1972, v. 31, N 3, p.1146-114-9.

93. Gestetner В., Assa Y., Henis Y., Birk Y., Bondi A. Lucerne saponins-. IV. Relationship between their chemical constitution and haemolytic and antifungal activities. J. Sci., Food. Agr., 1971, v. 22, N 4, p. 181-187.

94. Gestetner В., Assa Y., Henis Y., Tencer Y., Rotman M.,- 170

95. Birk Y. and Bondi A. Interaction of lucerne saponins with sterols. Biochim. Biophys. Acta, 1972, v. 270,p. 181-187.

96. Gestetner В., Assa Y., Rotman M. The effect of the carbohydrate moiety on biological activities of synthetic glycosides of medicagenic acid. Experientia, 1973, v. 29, N° 5, p. 529-530.

97. Gestetner В., Birk Y., Tencer Y. Soybean saponins. Rate of ingested soybean saponins and the physiological aspect of their hemolytic activity-. J. Agric. Food., Chem., 1968, v. 16, № 6, p. Ю31-Ю35.

98. Glauert A.M., Dingle J.T., Lucy J.A. Action of saponin on biological cell membranes. nature, 1962, v. 196, p. '953-955.

99. Goad L.J. The sterols of marine invertebrates. In Marine Natural Products, Chemical and Biological Perspectives. (Edited by Scheuer P.J.)» 1968, v. 2, p. 76-171.

100. Gorter E., Grendel P. and Seder W.A. Saponin hemolysis. Proc. Acad. Sci. Amsterdam, 1931» v. 34, p. 471473.

101. Gorshkov B.A., Gorshkova I.A., Stonik V.A. and Elyakov G.B. Effect of marine glycosides on adenosinetriphosphatase activity. Toxicon, 1982, v. 20, № 3» p. 655-658.

102. Goto M., Imai S., Murata P., Noguchi G. and Fujioka S. Antimicrobial glycosides of Euptelea poliandra Sieb. 1. Isolation, constitutions and antimicrobial activities of Eupteleoside A and Eupteleoside B. J. Pharm. Soc. Japan, 1970, v. 90, p. 736-741.

103. Grossert J.S. Natural products form echinoderms. Chem. Soc. Rev., 1972, v.1, № 1, p, 1-25.

104. Gruber K., Hein I., Bruchhangen F.V. Effects of aescin on glucose transport into adipose tissue and into Ascites Tumour cells. N.-S. Archiv. Pharm., 1971»v. 271, № 4, p. 361-369.

105. Gupta K.C. and Scheuer P.J. Echinoderm sterols. Tetrahedron, 1968, v. 74, p. 5831-5837117- Hadden J.W., Hadden E.M., Wilson E.E. and Good R.A*

106. Heftmann E. Functions of steroids in plants. Phytochemistry, 1975, v. 14, p,891-901.

107. Helmkamp G. and Bonner J. Some relationships of sterols to plant growth. Plant. Physiol., 1953, v. 28, p. 428-436.- 172

108. Hladky S.B., Haydon D.A. Ion transfer across lipid membranes in presence of gramicidin A. I. Studies of the unit conductance channel. Biochim. Biophys. Acta, 1972,v. 274, p. 294-312.

109. Hsia J.C., Long R.A., Hruska F.E., Gesser H.D. Steroid-phosphatidylcholine interactions in oriented multibi-layers. A spin label study. Biochim. Biophys. Acta, 1972, v. 290, p. 22-31.

110. Huang C.-H. Structural model for the cholesterol-phosphatidylcholine complexes in bilayer membranes. Lipids, 1977, v. 12, №4, p. 348-356.

111. Inbar M. and Shinitzky M. Increase of cholesterol level in surface membrane of lymphoma cells and its inhibitory effect on ascites tumor development. Proc. Hat. Acad. Sci. U.S., 1974, v. 71, № 5, p. 2128-2130.

112. Israelachvili J.IT., Mitchell D.J. and ITinham B.W. Theory of self-assembly of lipid'bilayers and vesicles. Biochim. Biophys. Acta, 1977, v. 470, p. 185-201.

113. Kalinovskaya N.I., Kuznetsova T.A. and Elayakov G.B. Sterol composition of pacific holothuiian Stichopas japonicus Selenka. Conrp. Biochem. Physiol., 1983, v. 74B, № 3,p. 597-601.

114. Kandutsch S.S. and Chen H.W. Consequences of blocked sterol synthesis in cultured cells. J. Biol. Chem., 1977, v. 252, p. 409-415.

115. B, С and D from sea cucumber Bohadschia bivittata. -Chem. Pharm. Bull., 1981, v. 29, № 1, p. 282-290.

116. Kruijff de В., Cullis P.R., Verkleij A.J f Van Echteld

117. C.J., Gerristen W.J., Hombers C., Noordam P.C., De Gier J. Structural and functional roles of lipids in model and biological membranes. Eur.j. Cell Biol., 1980, v. 22,1,p. 217-235.

118. Kwasniewski V. Discovery of saponin in Chelidonium majus L. Arch. Pharm., 1958, v. 291, № 4, p. 209-211.

119. Labelle E.F. and Racker E. Cholesterol stimulation of penetration of unilamellar liposomes by hydrophobic compounds. J. Membr. Biol., 1977, v. 31, № 3, p. 301-315.

120. Ladbrooke B.D., Chapman D. Thermal analysis of lipids, proteins and biological membranes. Chem. Phys. Lipids,- 175 1969» v. № 4, p. 304-356.

121. Lala A., Lin H.K. and Block K. The effect of some alkyl derivatives of cholesterol on the permeability properties and microviscosities of model membraiies.-Bioorg. Chem., 1978, v. 7, p. 4-37-442.

122. Lasley B.J. and Nigrelli R.E. The effects of crude holo-thurin on leucocyte phagocytosis. Toxicon, 1970, v. 10, p. 301-306.

123. Lowry O.U., Rosenbrough N.I., Parr A.L. and Randall P.J. -Protain measurement with the Polin phenol reagent. J. Biol. Chem., 1957, v. 193, p. 265 - 275.

124. Lucy J*A. Globular lipid micelles and cell membranes. -J. Theor. Biol., 1964, v. 7, p. 36O-369.

125. Mackie A.M., Singh H.T. and Owen J.M. Studies on the distribution, biosynthesis and function steroidal saponins in echinoderms. Сотр. Biochem. Physiol., 1977, v. 56B,p. 9-14*

126. Marchaim U., Birk Y., Doorat A., Berman T. Kinetics of the inhibition of cotton seeds germination by lucerne saponins. Plant. Cell Physiol., 1975, v. 16, № 5, p. 857-864.

127. Martin R.B., Yeagle P.L. Models for the lipid organization in cholesterol-phospholipid bilayers inducing cholesterol dimer formation. Lipids, 1978, v. 13, p. 594-597*

128. Meyer K. Die Einflub einiger EiweiBe und Anderer Kolloide auf die Hamolyse. Arch. Hug., 1908, v. 65, p. 293-304.

129. Mudd B.J. and McManns T.T. Effects of sterol glycosides on the phase transition of dipalmitoyl lecithin. Plant. Physiol., 198O, v. 65, p. 78-80.

130. Mueller P., Rudin D.O., Tien H.T., Wescott W.C. Reconstitu-tion of pell membrane structure in vitro and its transfor

131. Olsen R. Triterpene glycosides as inhibitors of fungal growth and metabolism. 2. Effect on leakage of inorganic ions. Physiol, plant., 1971, v. 25, № 2, p. 204-212.

132. Olsen R. Triterpene glycosides as inhibitors of fungal- 177 growth and metabolism. 3. Effect on uptake of patassium, magnesium and inorganic phosphate. Physiol, plant., 1971» v. 25, № 3» P* 503-508.

133. Olsen R. Triterpene glycosides as inhibitors of fungal growth and metabolism. 5« Role of the sterol contents of some fungi. Physiol, plant., 1973, v. 28, № 3, p. 507515.

134. Olsen R. Triterpene glycosides as inhibitors of fungal growth and metabolism. 7. Effect of aescin on the utilization of glucose and sucrose. Physiol, plant., 1974, v. 30,p. 279-282.

135. Olsen R. Triterpene glycosides as inhibitors of fungal growth and metabolism.8. Induced leakage of nucleotide materials. Physiol, plant., 1975, v. 33, P« 75-82.

136. Papahadjopoulos D., Cowden M., Kimelberg H. Role of cholesterol in membranes; Effects on phospholipid-protein interactions, membrane permeability and enzymatic activity. Biochim. Biophys. Acta, 1973, v. 330, № 1, p. 8-16.

137. Schlo'sser E. Interaction of saponins with cholesterol, lecithin and albumin. Canad. J. Physiol. Pharm., 1969,v. 47, 5, p. 487-490.

138. Schlosser E. and Wulff G. Uber die Structurspezifitat der- 179

139. Saponinhamolyse. I. Triterpen saponin und aglykone. Z.

140. Naturforschg., 1969, v. 24, p. 1284-1290.

141. Segal R. and Milo-Godzweig I. The susceptibility of cholesterol-depleted erythrocytes to. saponin and sapogenin hemolysis. Biochim. Biophys. Acta, 1978, v. 512, p.223-226.

142. Segal R., Milo-Godzweig I., Schupper H., Zaitscher D.V. Effect of ester groups on the heamolytic action of sapoge-nins. II. Esterification with bifunctional acids.- Biochem. Pharmacol., 1970, v. 19, № 8, p. 2501-2507.

143. Segal R. and Schlosser E. Role of glycosidases in the memb-ranlytic antifungal action of saponins. Arch. Microbiol., 1975, v. 104, № 2, p. 147-150.

144. Segal R., Shatkovski P., Milo-Codzweig I. On the mechanism of saponine hemolysis. I. Hydrolysis of the glycosidic bond. Biochem. Pharmacol., 1974, v. 23, p. 973-981.

145. Shah D.O., Schulman J.H. Influence of calcium, cholesterol and unsaturation on lecithin monolayers. J. Lipid Res.,180 1967, v. 8, 3, P. 215-226.

146. Shany S., Bernheimer A.W., Grushoff Ph. S. and Kim K.-S. Evidence for membrane cholesterol as the common binding site for cereolysin, streptolysin 0 and saponin. Mol. Cell Biochem., 1974, v. 3, p. 179-186.

147. Shinitzky M. and Inbar M. Difference in microviscosity induced by different cholesterol levels in the surface membrane lipid layer of normal lymphocytes and malignant lymphoma cells. J. Mol. Biol., 1979, v. 85, p. 6O3-615,

148. Siering H. Permeabilitatsstudien mit Aescin am Ehrlich-schen Mause Acites - Carcinome. - Naturwissen Shaften, 1964, v. 51, p. 273-278.

149. Ther., 1964, v. 145, p. 194-201.

150. Thron C.D., Durant R.C. and Friess S.L. Neuromuscular and cytotoxic effects of holothurin A and related saponins at low concentration levels. Toxicon. Appl., Pharmacol., 1964, v. 6, p.182-196.

151. Tschesche R., Weber A. and Wiilff G. Uber die Struktur des Theasaponins Eines demisehes von Saponinen aus Thea sinensis L. mit Stark Antiexudativer Wirkzamkeit justus. -Leib. Ann. Chem., 1969, v. 721, p. 209-216.

152. Tschesche R. and Wulff G. Chemic und Biologic der Saponine. В кн.: Progress in the chemistry of organic natural products", vol. 30, ed. by W. Herz, H. Grisebach and G.W. Kirby, Springer Verlag, Wien, 1973, Р? 461-606.

153. Tschesche R. and Wulff G. Constitution and properties of saponins. Planta Med., 1964, v. 12, p. 272-292.

154. Tschesche R. and Wulff G. Uber die antimikrobielle wirk-samkeir von saponinen. Z. Naturfors., 1965, v. 20 B, p. 543-550.

155. Tyrrell D.A., Heath T.D., Colley C.M. and Ryman B.E. New aspects of liposomes. Biochim. Biophys. Acta, 1976,v. 457, p. 259-302.

156. Vendrig J.C. Growth-regulating activity of some saponins.-Nature, 1964, v. 203, p. 1301-1302.

157. Vogel G. Pharmacology of saponins. Planta, Med., 1963,- 182 -v. 11, p. 362-376.

158. Voogt 0. Biosynthesis and composition of 3^-sterols in some holothurians. Сотр. Biochem. Physiol., 1973*v. B, p. 71-80.

159. Wolters B. Biological activity of saponins of digitalis. -Pharm. Ztg., 1966, v. 3, Р» 1826-1828.

160. Wolters B. Saponine als Pflanzliche Pilzabwehr-Stoffe zuz Antibiotishen Wirkung von Saponinen. Planta, 1968, v. 79» № 1» P- 77-83.

161. Worcester D.L., Pranks N.P. Structural analysis of hydra-ted egg lecithin and cholesterol bilayers. J. Mol. Biol., 1976, v. 100, № 3, P« 359-378.