Изучение некоторых особенностей экспрессии гена CFTR и разработка экспериментальных подходов к генотерапии муковисцидоза тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.15, кандидат биологических наук Глазков, Павел Борисович

• Глазков, Павел Борисович
• кандидат биологических наук
• 2000

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Глазков, Павел Борисович

ВВЕДЕНИЕ.

Глава I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Муковисцидоз, общие представления.

1.2. Клинические симптомы при муковисцидозе.

Респираторный тракт.

Поджелудочная железа.

Кишечный тракт.

Репродуктивная система.

1.3. Клонирование и структурный анализ гена СРТР . 1.3.1. Ген СРТ1Ч.

Клонирование гена СРТР

Структурный анализ гена СРТР . . . . . Л

Регуляция транскрипции.

Альтернативный сплайсинг.

1.4. Трансмембранный регуляторный белок муковисцидоза 1.4.1. Структура и функция СРТ!3.

Доменная структура СРТР

Функции СРТК.

Регуляция СРТ(Ч канала.

Консервативность последовательности гена СРТГЧ

1.5. Экспрессия СРТК.

Экспрессия в эпителии дыхательных путей.

Экспрессия в желудочно-кишечном тракте.

1.6. Мутации гена СЯТР.

Классификация мутаций.

Мутация с!е1Р

Некоторые другие мажорные мутации гена СРТ!Ч. Географическое распределение

1.7. Корреляция генотипа и фенотипа при муковисцидозе

1.8. Диагностика муковисцидоза.

Прямой метод МД муковисцидоза.■'•.•■■ ^

Непрямой метод МД муковисцидоза.".

1.9. Общие сведения о генной терапии МВ.

Основные способы доставки генетических конструкций при генотерапии МВ.

Вирусные способы доставки.

Аденовирусы.

Аденоассоциированные вирусы.

Ретровирусы.

Лентивирусы.

Невирусные способы доставки

Катионные липосомы.

1.9.1. Модельные СРТР мыши.

Эксперименты по генной терапии MB на модельных мышах.

1.9.2. Клинические испытания по генной терапии муковисцидоза.

Вирусные носители.

Невирусные носители.

Глава II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

11.1. Реактивы, биопрепараты, оборудование. Плазмиды.

Экспериментальные животны и способы введения генетических конструкций. Характеристика пациентов.

11.2. Методы.

11.2.1. Измерение разницы назальных потенциалов у человека.

11.2.2. Иммуногистохимическое выявление локализации CFTR на замороженных срезах биоптатов назального эпителия человека.

11.2.3. Приготовление синтетических микросфер.

11.2.4. Гистохимическое выявление (3-галактозидазы на замороженных криостатных срезах и на тотальных препаратах.

11.2.5. Методика обесцвечивания тотальных препаратов.

11.2.6. Количественная оценка активности (3-галактозидазы in vivo . . :

11.2.7. Экстракция ДНК из тканей мышей.

11.2.8. Проведение полимеразной цепной реакции.

11.2.9. Проведение гибридизации in situ.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Глава III. Корреляция иммуноцитохимических, электрофизиологических и молекулярных исследований у больных муковисцидозом

3.1. Измерение разности назальных потенциалов.

3.2. Анализ локализации белкового продукта гена CFTR в назальном эпителии

Глава IV. Характеристика взаимодействия полимера VSST-25 с плазмидными ДНК и анализ внутриклеточной локализации полученных комплексов in vitro.

4.1. Оптимизация упаковки плазмидной ДНК в полимер VSST-25.

4.2. Анализ внутриклеточной локализации комплексов flHK/VSSTв опытах in vitro.

Глава V. Доставка маркерного гена LacZ в легкие мыши при помощи Синтетического полимера VSST-25.

5.1. Анализ локализации конструкции VSST-25/pCMV-LacZ методом гибридизации in situ.

5.2. Доставка свободной (несвязанной) плазмиды pCMV-LacZ.

5.3. Доставка генетической конструкции VSST-25/pCMV-LacZ.

5.4. Доставка генетической конструкции VSST-25/pCMV-nlsLacZ .т.

Глава VI. Доставка плазмид pCMV-LacZ и pTG5985 беременным самкам мышей при помощи синтетического полимера VSST-25.

6.1. Анализ внутриклеточной локализации конструкции VSST-25/pCMV-LacZ в легком новорожденных мышей методом гибридизации in situ.

6.2. Внутриамниотическое введение генетической конструкции VSST-25/pCMV-LacZ/ pTG

6.3. Внутрибрюшинное введение генетической конструкции VSST-25/pCMV-LacZ/ PTG

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Изучение некоторых особенностей экспрессии гена CFTR и разработка экспериментальных подходов к генотерапии муковисцидоза»

Актуальность проблемы.

Муковисцидоз - MB (кистозный фиброз поджелудочной железы) - одно из наиболее распространенных, моногенных, наследственных заболеваний человека, наследуемое по аутосомно-рецессивному типу. Причиной MB являются нарушения транспорта ионов в эпителиальных клетках всех с экзокринных желез. MB характеризуется широкой вариацией клинических проявлений. В зависимости от тяжести поражении того или иного органа заболевание условно подразделяют на легочную, кишечную и смешанную формы (Чучалин и др., 1994). Причиной этих нарушений являются мутации гена трансмембранного регуляторного белка муковисцидоза (CFTR), которые вызывают частичное или полное нарушение регуляции хлорных каналов апикальной мембраны эпителиальных клеток (Cheng, et al., 1991). Хотя при MB поражены многие органы, смертельный исход в 95% случаев наступает вследствие поражения легких. Хронические воспаления, накопление слизи в бронхах и бронхиолах, постоянно сопутствующие бактериальные инфекции являются причиной тяжелых пневмоний и прогрессирующего ухудшения функции легких (Welsh, et al., 1995). В 1985 году ген MB Молекулярно-генетическими методами картирован на длинном плече хромосомы 7 (7q31.1), В конце 1989 года он был идентифицирован и выявлена наиболее частая мутация - delF508, приводящая к этому заболеванию, охарактеризован белковый продукт этого гена, получивший название трансмембранный регуляторный белок муковисцидоза (CFTR) (Riordan et al.,1989, Rommens et al.,1989, Kerem et al.,1989). На сегодняшний день в мире идентифицировано свыше 900 мутаций гена CFTR. В отличие от delF508 подавляющее большинство'этих мутаций представлено спорадическими случаями, т.е. встречается достаточно редко.

Частота заболевания в разных популяциях, нациях и этнических группах существенно варьирует, составляя в среднем 1 : 2-2500 новорожденных у представителей белой расы. Частота MB в России по данным разных авторов 8 » варьирует от 1 : 3860 до 1 : 12300 новорожденных (Капранов, Каширская, 1997., Желенина, 1998). По оценкам Всемирной Организации Здравоохранения в мире ежегодно рождается 45-50 ООО детей с MB, а число гетерозиготных носителей заболевания насчитывает многие десятки миллионов. Считается, что ежегодно в России рождается около 750 больных MB.

В последние годы, благодаря решающим успехам медицины, средняя продолжительность жизни больных MB прогрессивно возрастает, достигая в экономически развитых странах 30 и более лет, т.е. болезнь все чаще приобретает хронический характер и удельный вес числа больных MB в популяции быстро увеличивается.

Измерение уровня электролитов (СГ, Na+) потовой жидкости ("лотовый тест") до настоящего времени является одним из основных лабораторных методов диагностики MB. Нередко, однако, содержание хлоридов пота. находится в пределах нормы и при выраженных клинических проявлениях MB (Stewart, et al., 1995). Известно, что особенно тяжелое клиническое течение MB и высокий уровень хлоридов пота характерны для больных с мутацией delF508, которая, встречается у 52 % больных MB северо-западного региона России (Бакай, 1998). Однако, примерно у трети отечественных пациентов не удается идентифицировать мутаций в гене CFTR, а показатели потового теста у них неоднозначны (Капранов, Каширская, 1997., Желенина, 1998). Поэтому разработка новых лабораторных тестов для диагностики MB представляется весьма актуальным. В последнее время для этих целей, а так же в клинических испытаниях по генной терапии MB с успехом применяют иммуноцитохимические и электрофизилогические методы исследования -(Dupuit, et al., 1995; Wilson, et al., 1998).

Несмотря на существенные успехи медикаментозного лечения MB генная терапия является одним из перспективных и многообещающих способов лечения этого тяжелого и, зачастую, смертельного заболевания. Использование генотерапевтических подходов возможно благодаря наличию плазмидных конструкций с кДНК гена CFTR и созданию модели MB на лабораторных 9 животных (Crystal et.al.,1994; Caplen et al.,1995). В настоящее время исследования по генной терапии MB проводятся во -многих научных центрах, в 10-ти из которых они уже находятся на стадии клинических испытаний. Доставка экспрессирующих конструкций с кДНК гена CFTR осуществляется с помощью различных вирусных или невирусных (липосомных) носителей, каждый из которых имеет свои преимущества и недостатки (Boucher, 1999). Поэтому поиск новых носителей, обеспечивающих эффективную и безопасную доставку «ДНК гена CFTR в клетки дыхательного эпителия остается весьма актуальным.

Цели и задачи исследования.

Цель исследования: определить возможность использования иммуноцитохимических и электрофизиологических тестов для анализа экспрессии гена CFTR и синтетического полимера VSST-25 в качестве невирусного носителя при разработке экспериментальных подходов к генотерапии MB.

Для достижения данной цели были определены следующие задачи:

1. Методом иммуногистохимии изучить локализацию белкового продукта гена CFTR в клетках назального эпителия у здоровых индивидуумов и больных MB с различными мутациями этого гена.

2. Сравнить значения разности назальных потенциалов у больных MB и у больных с хроническими неспецифическими заболеваниями легких (контрольная группа).

3. Подобрать оптимальные условия для упаковки плазмидной ДНК при помощи синтетического полимера VSST-25 и проанализировать внутриклеточную локализацию комплексов flHK/VSST-25 б экспериментах in vitro.

10

4. Изучить возможность доставки маркерного reHa.LacZ в различные органы и ткани лабораторных мышей с помощью полимерного носителя -VSST-25 в экспериментах in vivo.

Научная новизна и практическая значимость.

Впервые в России у больных МВ с различными мутациями гена CFTR методом иммуногистохимии изучена локализация CFTR в клетках назального эпителия; установлено, что локализация этого белка у больных МВ отличается от таковой в контрольной группе; отмечена определенная корреляции концентрации и распределения этого белка в цитоплазме эпителиальных клеток в зависимости от типа мутационных повреждений гена CFTR.

Впервые проведены измерения назальных потенциалов у больных МВ России; показано, что значения разности назальных потенциалов у больных МВ достоверно отличаются от таковых у больных, страдающих хроническими неспецифическими заболеваниями легких.

Впервые в работах по генной терапии муковисцидоза изучена способность полимерного носителя VSST-25 служить средством доставки маркерного гена LacZ в клетки дыхательного эпителия легких мышей -в условиях внутриназального введения; впервые продемонстрирована доставка маркерного гена LacZ и кДНК гена CFTR в легкие и другие органы плодов мышей в условиях внутрибрюшинного введения беременным самкам и внутриамниатического введения зародышам.

Практическая значимость:

Согласно нашим данным гистохимический анализ белкового продукта гена CFTR в биоптатах назального эпителия, равно как и измерение разности назальных потенциалов могут служить дополнительными и высоко информативными лабораторными тестами для дифференциальной диагностики МВ, особенно в тех случаях, когда клиническое обследование, стандартные лабораторные тесты (значения хлоридов пота) и ДНК-анализ гена CFTR не дают однозначных результатов. Учитывая сравнительно низкую ч частоту выявляемости мутаций в гене CFTR у больных МВ в России (около 7075%), методы измерения РНП и анализ CFTR в биоптатах назалы/ого эпителия могут быть рекомендованы для уточнения диагноза МВ в спорных случаях.

Полученные в работе данные о направленной доставке в эпителиальные клетки бронхов и бронхиол мышей и продолжительной экспрессии (до двух месяцев) маркерных генов LacZ в составе синтетических микросфер после однократного внутриназального введения экспериментальным животным свидетельствуют о перспективности использования оригинального носителя VSST-25 для доставки генетических конструкций с целью лечения муковисцидоза.

Апробация работы.

Представленные в диссертации результаты были доложены на Международной конференции аспирантов и студентов «Ломоносов-98» (МГУ, 1998), XXII Европейской конференции по муковисцидозу (Берлин, ' 1998), Международной конференции молодых ученых (Люблин (Польша),998), VIII итоговой конференции «Геном человека-98» (Черноголовка,* 1998), VI совещании Европейской рабочей группы по изучению генной терапии человека (Иерусалим, 1998), II Американском ежегодном совещании по генной терапии (Вашингтон, 1999), IX итоговой конференции «Геном человека-99» (Черноголовка, 1999), IX Национальном конгрессе по болезням,- органов дыхания (Москва, 1999), II съезд Всероссийского общества генетиков и селекционеров (С-Петербург, 2000), Ежегодном совещании по генетике человека (Канада, 2000).

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 14 работ.

12

Структура и объем диссертации.

Заключение диссертации по теме «Генетика», Глазков, Павел Борисович

ВЫВОДЫ

1. Концентрация и распределение белка CFTR в цитоплазме клеток назального эпителия больных MB отличаются от нормы, и обнаруживают определенную корреляцию с типами мутационных повреждений гена GFTR.

2. Иммуногистохимический анализ белкового продукта гена CFTR в биоптатах назального эпителия и измерениё разности назальных потенциалов могут служить дополнительными высоко информативными тестами для дифференциальной диагностики MB.

3. Результаты опытов in vitro й in vivo по исследованию внутриклеточной локализации комплексов плазмидной ДНК в составе микросфер (МФ), полученных на основе синтетического полимера VSST-25, доказывают их высокую тропность к ядру.

4. Трансфекция клеток легкого и других органов у плодов лабораторных мышей может быть достигнута как при внутрибрюшинном введении генетических комплексов беременным* самкам, так и в условиях их внутриамниотического введения.

5. Локализация "и продолжительность экспрессии маркерных генов LacZ.B составе полимерного носителя VSST-25 в экспериментах in vivo свидетельствуют о • перспективности использования МФ для доставки генетических конструкций с целью лечения муковисцидоза и, возможно, других хронических заболеваний легких.

•с

ЗАКЛЮЧЕНИЕ ,

В настоящее время измерение хлоридов потовой жидкости остается лрактически единственным лабораторным тестом для диагностики МВ в ряде лечебных учреждений России. Принимая во внимание нередкие случаи нормальных или пограничных значений хлоридов потовой жидкости у больных со среднетяжелой клинической картиной МВ или повышений хлоридов пота у больных с хроническими неспецифическими заболеваниями ; лёгких, возникае-г необходимость дополнительных, более чувствительных диагностических тестов.

Нами проведены измерения хлоридов пота и разности назальных потенциалов, а также иммуногистохимически изучена особенность локализации белкового продукта гена СРТ1Ч в клетках назального эпителия у 13 больных МВ,в возрасте от 5 до 21 года с известным спектром мутаций гена СРТР. Хлориды пот^ у 6 пациентов из группы больных МВ имели нормальные .или пограничные значения (от 24 ммоль л"1 до 62 ммоль-л"1). Значения РНП у больных МВ составили в. среднем -44,7±2,2 т\/ (пределы от -32,5 тУ до -68,9 тУ), в контрольной группе -17,2±1,8 тУ (пределы от -6,8 т\/до -30,2 т\/), й отличались с высокой достоверностью при р<0,001.

Иммуногистохимически показано, что в норме СРТР бел<ак четко локализован на апикальной мембране назального эпителия. У больных МВ в зависимости от типа мутаций белковый продукт гена СЯТК либо отсутствует, либо равномерно распределен в цитоплазме и не концентрируется в апикальной мембране. Таким образом, измерение разности назальных потенциалов и анализ локализации белкового продукта гена СРТР в соскобах назального эпителия являются дополнительными, высоко информативными методами диагностики МВ. Уже сейчас благодаря этим методам удается решать спорные вопросы при диагностике МВ в случаях, когда клиническое обследование, стандартные лабораторные тесты

118 хлориды пота) и 'ДНК-анализ гена CFTR ;не дают однозначных результатов. Учитывая сравнительно низкую частоту выявляемости мутациТй при MB в России (около 70-75%), методы анализа РНП и иммунногистохимической локализации белкового продукта, гена CFTR в клетках назального эпителия пациентов могут быть рекомендованы для уточнения диагноза MB в спорных случаях.

В последние' годы, благодаря достижениям фармакотерапии и диагностики, средняя продолжительность • жизни больных MB . прогрессивно V возрастает, достигая в экономически развитых странах 30 и более лет. Бодезнь все чаще приобретает хрол'ический характер, 'лри этом удельный вес числа больных MB в популяции быстро увеличивается.

На сегодняшний день одним из перспективных и многообещающих

4 * способов лечения MB является генная терапия. Главной задачей в этом

Л , ( направлении является поиск новых носителей,, обеспечивающих эффективную и безопасную доставку кДНК гена CFTR в клетки-дыхательного эпителия больного. В данной работе предпринята попытка изучить способность оригинального полимера VSST-25 служить средством доставки экзогенной плазмидной ДНК в экспериментах in vitro и in \/ivo. Показано, что изучаемый нами оригинальный носитель обеспечивает, как в условиях in vitro, так и in vivo эффективную доставку чужеродных генных конструкций в ядра клеток, что является важнейшей проблемой генной терапии. Полученные результаты по локализации и продолжительности экспрессии маркерных генов LacZ в составе синтетических микросфер в опытах на мышах свидетёльствуют о перспективности использования оригинального полимера VSST-25 для доставки генетических конструкций с' целью лечения муковисцидоза, а возможно и других тяжелых хронических заболеваний легких.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Глазков, Павел Борисович, 2000 год

1. Бакай М.А. Молекулярно-генетическйй.*анализ гена трансмембранного регуляторного белка муковисцидоза у больных Санкт-Петербурга. Корреляция генотип-фенотип: Автореф. дисс. . канд. биол. наук,- Санкт-Петербург. 1998. '*"• •

2. Баранов В.С Ранняя диагностика -наследственных болезней в России (современное состояние и'перспективы) // Междунар. мед.обзоры. 1994. Т. 2. № 4. Р. 236-243. • :•.

3. Желенина Л .А. Муковисцидоз у • детей , (клинико-генетические особенности, инфекционный процесс в легких, лечение): Автореф. дисс. . д-ра мед. наук.

4. Санкт-Петербург. 1998. ■ ;• • •

5. Иващенко Т.Э. Идентификация мутаций при муковисцидозе. // Автореф. дис. канд. биол. наук. М. 1992. 22 с.

6. Капранов Н.И., Каширская Н.Ю. Актуальные проблемы муковисцидоза на современном этапе в России // Пульмонология. 1997. № 4. С.7-16.

7. Рыбчин В.Н. Основы генетической инженерии / Изд-во СПбГТУ, СПб. 19&9. 533 с. . '.

8. Чучалин А.Г., Воронина Л.М., Кронина Л.А., Самсонова М.В. Муковисцидоз у взрослых: этиология, патогенез", ' перспективы лечения // Пульмонология. 1994. №3. С.17-23: -••.•"'<*

9. AI-Jader J. N., Meredith A.L., Ryley H.'Q.-,-.et al. Severity of chest disease in cystic fibrosis patients in relation to their genotypes // Med. Genet. 1992. V.-29. № 12. P. 883-887. ~ •

10. Alton E.W. Currie D., Logan-SinclSirR; Warner J.O., Hodson M.E., Geddes D.M. Nasal potential difference: a clinical diagnostic test for cystic ^fibrosis // Eur. Respir. J. 1990. V. 8. № 3. P. 922-928?"

11. Alton E.W., Rogers D.F., Logan-Sinclair R., Yacoub M., Barnes P.J., Geddes• • •

12. D.M. Bioelectric properties of cystic fibrosis airways obtained at heart-lung transplantation //Thorax 1992 Dec-;47(12):1010-1014.

13. Alton E.W., Middleton P.G., Capleri N;J., £mith S.N., Steel D.M., Munkonge F.M., et al Non-invasive liposome-mediafedri|ene delivery can correct the ion transport defect in cystic fibrosis mutant mice //.Nature Genet. 1993. V.5. P. 135-142.

14. Alton E.W., Caplen N.J., Steel D.M?;; Middleton P.G. Lower airway potential difference measurements in non-CF and GF subjects // Pediatr. Pulrrionol. Suppl. 1996. V. 13. P. 276. .'.•

15. Alton E.W., Stern-M., Farley R., jaffi^Aj Chadwick S.L., Phillips J., Davies J.,

16. Smith S.N., Browning J., Davies M.G>; Hodson M.E., Durham S.R., Li D., Jeffery

17. P.K., Scallan M., Balfour R., Eastmans S.J., Cheng S.H., Smith A.E., Meeker D,.' v .

18. Geddes D.M. Catronic lipid-mediated CFTR gene transfer to the lungs and nose of patients with cystic fibrosis;' a doubje:bJind placebo-controlled trial // Lancet. 1999. V. 353. №.11. P. 947-954. .

19. Ameen NA, Ardito T, Kashgarian M;'$larino CR. A unique subset of rat and human intestinal villus cells express the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator// Gastroenterology, 1995. V.108. P. 1016-1023.

20. Ames G.F!, Mimura C.S. and Shyamala V. Bacterial periplasmic permeases belong to a family of transport proteins operating from Escherichia coli to human: traffic ATPases // FEM'S Microbiol. Rev. 1'9.90. V. 75. P. 429-446.

21. Anderson M.P., Gregory R.J., Thompsons.et al. Demonstration that CFTR is a chloride channel by alteration of its anion selectivity / /Science. 1991.V. 253. P.202-205.

22. Angelico M., Gandin C., Canuzzi P., B|rtasi S., Cantafora A., De Santis A. Quattrucci S. and Antonelli M. Galistones*fn cystic fibrosis: a critical reappraisal // Hepatology. 1991. V. 14. P. 768-775. . .

23. Anguiano A., Gates R.D., Amps J.A., "Dean M., Gerrard B., Stewart C., Maher T.A., White M.B. and Milunsky A:- Congenital bilateral absence' of the vas deferens. A primarily genital form of cystic fibrosis // JAMA. 1992. V. 267. P. 1794-1801.122 ;• 5;

24. Bals R., Weiner D.J., Wilson J.M. The innate immune system in cystic fibrosis lung disease//J Clin Invest. 1999. V.1G3. P.303-307.

25. Baranov V.S., Gorbunova V.N., Ivaschenko T.E. et al. Five years of prenatal diagnosis of cystic fibrosis in the former USSR // Pren.Diagn. 1992. V.12. P.1-12.

26. Baranov VS. • Molecular diagnosis of some common genetic diseases in Russia & in the former' USSR; Present & Future//J. Med. Genet. 1993. V.30. P.141-146

27. Bargon, J., Trapnell B.C.,. Chu C.S:, Rosenthal E.R., Yoshimura K., Guggino

28. W.B., Dalerhans W.,.Pavirani A., Lecocq J.P. and Crystal R.G. Down-regulation-of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator gene expression by agents that modulate intracellular divalent cations // Mol Cell Biol. 1992. V.12. P. 18721880.t' ,

29. Bargon J., Trapnell B.C., Yoshimura K., Dalemans W„ Pavirani A., Lecocq J.P. and Crystal R.G. Expression of. the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator gene can be regulated by protein kinase C // J Biol Chem. 1992. V.267. P. 16056-16060.

30. Bass S., Conno'n J.J. and Ho C.S Biliary tree in cystic Fibrosis. Biliary tract abnormalities in cystic fibrosis • demonstrated by endoscopic retrograde cholangiography//Gastroenterology. 198.3. V. 84. P. 1592-1598.

31. Besancon F., Przewlocki G., Baro L., tHongre A.S., Escande D. and:Edelman A. Interferon-gamma downregulates CFTR gene expression in epithelial cells //Am J Physiol.'1994. V.267. P. 1398-1404.

32. Bijman J, Dalemans W, Kansen M, Keulemans J, Verbeek E,-et al. Low-conductance chloride channels in IEC-6 and CF nasal cells expressing CFTft // Am J Physiol. 1993. V. 264. P. 229-35.

33. Boat T., Welsh M. and Beaudet A. Cystic fibrosis / A.L. Ed. 1989. P. 2649-2680:

34. Boucher R.C. Status of gene therapy for cystic fibrosis lung disease // J Clin Invest. 1999. V. 103. P.441-446. •

35. Boucher R.C., Knowles MiRf, Johnson L.G., Olsen J.C., Pickles R., Wilson J.M., Engelhardt.J., Yang Y., Grossman M; Gene therapy for cystic fibrosis using E1123 $deleted adenovirus: a phase I trial in the nasal cavity. The University of North

36. Carolina at Chapel Hill // Hum Gene Ther. 1994. V. 5. № 5. P. 615-639.

37. Boue A., Muller F., Nezelof C., Oury J.F., Duchatel F., Durnez Y., Aubry M.C. and Boue J. Prenatal diagnosis in 200 pregnancies with a l-in-4 risk of gystic fibrosis Hum Genet //1986. V.74. P. 288-297: :

38. Bremer S., HoofT., Wilke M., Busche-R., Scholte B., Riordain J.R., Maass G. and

39. Tummier B. Quantitative expressibn patterns of multidrug-resistance Pglycoprotein (MDRI) and differentially spliced cystic-fibrosis transmembra'neconductance regulator mRNA transcripts in human epithelia // Eur. J Biochem.t *1992. V.206. P. 137-149.

40. Brock D.J.H., A comparative study of microvillar enzyme activities in the prenatal diagnosis of cystic fibrosis // Prenat. Diagn. 1985. V.5. P. 129-135.

41. Bubien J.K., Kirk K.L., Rado T.A. and Frizzell R.A. Cell cycle dependence of chloride permeability in normal and cystic fibrosis lymphocytes // Science. 1990. V.248. P. 1416-1425. . /

42. Caplen N.J., Alton E.W., Middleton P.G., Dorin J.R., Stevenson B.J., Gao X.,r

43. Durham S.R., Jeffery P.K.; Hodson M.E., Coutelle C. Liposome-mediated CFTR gene transfer to the nasal epithelium of patients with cystic fibrosis // Nat Med. 1995,-V. 1. № 1. P. 39-46. . '

44. Carson MR, Travis. SM, Welsh MJ. Thejyvo nucleotide-binding domains of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) have distinct functions in controlling channel activity // J Biol Chem-. 1995. V. 270. P. 1711-1718.

45. McCray PB Jr/Wohlford-Lenane CL, Snyder JM Localization of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator mRNA in human fetal lung tissue by in situ hybridization // J Clin Invest. 1992. V.90. P.619-625.

46. Cheng P.W., Boat T.F., Cranfill K., Yankaskas J.R. and Boucher R.C. Increased sutfation of glycoconjugates by cultured nasal epithelial cells from patients with cystic fibrosis //J. Clm. Invest. 1989. V. 84. P. 68-72.

47. Cheng S.H., Gregory R.J., Marshall J., Paul S., Souza D.W., -White G.A., O'Riordan C.R,, Smith.A.E, Deffective intracellular transport and processing of CFTR is the molecular basis of most: cystic fibrosis//Cell. 1990. V.63. P.827-834.

48. Chou J.L.; Rozrhahel R. and Tsui L.C, Characterization of Jhe promoter region of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator gene // J * Biol Chem. 1991. V. 266. P. 24471-24477. ■

49. Chu C.S., Trapnell B.C., Curristin S., Cutting G.R. and Crystal R.G. Genetic basis of variable exon 9 . skipping in cystic fibrosis transmembrane conductance regulator mRNA // Nat Genêt. 1993. V.3. P.151-157.

50. Cohn, J.A., Meihus, 0., Page, L.J„ Dittrich, K.L. and Vigna, S.R. CFTR: development of high- affinity antibodies::and localization in sweat gland // Biochem Biophys Res Commun. 1991. V.181. P.36-43. . ••

51. Cohn J.A., Strong T.V.,-Picciotto'M.R., Nairn A.C., Collins F.S. and Fitz J.G.1.calization of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator in humanbile duct epithelial cells // Gastroenterology. 1993. V.105. P. 1857-1864.

52. Cotton C.U., Stutts M.J., Knowles M.R., Gatzy J.T., Boucher R.C. Abnormal apical cell membrane in cystic fibrosis respiratory epithelium. .An in vitro electrophysiologic analysis // J Clin Invest. 1987. V.79. P.8Q-85. •

53. Craig J.M. The pathologic changes in the liver in cystic fibrosis of the pancreas // Am. J. Dis. Child.1957. V. 93. P'375.

54. Crawford L., Malpney P.C., ZeitHn P.L., Guggino W.B., Hyde S.C., Turley H., Gatter K.C., Harris A. and Higgiris C.F. Immunocytochemical localization of the cystic fibrosis gene product CFTR// Proc Nail Acad Sci USA. 1991. V.88. P.9262-9268. .' "

55. Davies J.C., GeddeS D.M. and Alton, E. Prospects for gene therapy for cystic fibrosis // Molecular Medicine Today. 1998. № 7. P. 292-299.

56. Dechecchi MC, Tamanini A, Berton (5, 6abrini G. Protein kinase C activates chloride conductance in C127 cells stably expressing the cystic fibrosis gene // J Biol Chem." 1993. V. 25. P.11321-11326.

57. Denamur, E. and-Chehab, F-.F. Methytation status ofCpG sites in the mouse and human CFTR promoters//Dna Cell Biol. 1995. V. 14. P. 811-816.

58. Devuyst O, Burrow CR, Schwiebert EM,-Guggino WB, Wilson PD Developmental regulation of CFTR expression during human nephrogenesis // Am J Physiol. 1996. V.271. P.723-735.126 ' .

59. Dho S, Foskett JK. Optical imaging of C(- permeabilities in normal and CFTR-expressing mouse L cells // Biochim Biophys Acta. 1993. V.10. P. 83-90.

60. Diamond G., Scanlin T.F., Zasloff M.A: and Bevins C.L. A cross-species analysis of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Potential functional domains and regulatory sites //J Biol Chem. 1*991. V.266. P. 22761-22770.

61. Dorin JR, Dickinson P, Alton EW, Smith SN, Geddes DM, Stevenson BJ, Kimber WL, Fleming S, Clarke AR, Hooper ML,, et al Cystic fibrosis in the mouse by targeted insertional mutagenesis // Nature. 1992. V.359. P.211-217. •

62. Dorin J.R., Stevenson B.J., Flaming S.„ Alton E.W., Dickinson P., Porteous D.J.

63. Long-term survival <5f the exon 10 insertional cystic fibrosis mutant mouse is a consequence of low. level residual wild-type Cftr gene expression // Mamm Genome. 1994. V.8. P.465-472.

64. Duncan A., Buchwald M., Tsui L.-C.- Sublocalization of two cloned chromosome 7 sequence dosed linked to the cystic fibrosis Cytogenet. // Cell Genet. 1988. V.49. P. 309-310. '

65. Eiberg H., Morh J., Schmiegelow K.,.Nielsen L.S., Williamson R. Linkage relationship of paraoxonase (PON£with other markers: Indication of PON-cystic fibrosis syntheny // Clin:G6net. 1985. V. 28. P. 265-271.

66. Engelhardt J.F., Yankaskas J.R., Wilson J.M. In vivo retroviral gene, transfer into human bronchial epithelia of xenografts.// J. Clin. Invest. 1992. V.'90. № 6. P. 2598-2607.

67. Engelhardt JF, Yankaskas JR, Ernst.SA, Yang Y, Marino CR, Boucher RC, Cohn JA, Wilson JM. Submucosal glands are the predominant site of CFTR expression in the human bronchus // Nat Genet. :1992vV.2. P.240 248.

68. Engelhardt JF, Zepeda M, Cohn JA, Yankaskas JR, Wilson JM. Expression of the cystic fibrosis gene in' adujt human lung.// J Clin Invest. 1994. V.93. P.737-749.127 ï ;

69. Estivill X., Bancells C., Ranrios C., and the Biomed CF Mutation Analysis Consortium Geographic Distribution and Regional Origin of 272 Cystic Fibrosis Mutations in European Populations// Hum.Mutat. 1997. V.10. P. 135-154.

70. Faller, D.P„ Egan. D.A. and Ryan, M.P. Evidence for location of the CFTR in human placental apical membrane vesicles //Am J Physioi. 1995. V.269. P.148-155. '

71. Fiedler M.A., .Nemecz'Z.K. and Shull G.^. Cloning and sequence analysis of rat cystic fibrosis transmembrane conductance regulator//Am J Physioi.";1992. V.262. P. L779-784. •■

72. Finkbeine'r W.E., Shen B.Q:, Widdicombé J.H. Chloride secretion and function of serous and mucous cells of. human airway glands //Am J Physiol. T994. V.267. P.206-216.

73. Friend S.H., Bernards R.,-Rogelj S.„ Weinberg R.A., Rapaport JM., Albert D.M., and Dryja T.P. A human DNA segment with properties of thé gene that predisposes to retinoblastoma and osteosarcoma // Nature. 1986. V/323. P. 643649.

74. Gaillard D., Rliôcco.S., l-allémand A., Dalemans W., Hinnrasky J. and Puchelle E. Immunohistochemical localization of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator in hùman fetal-airway and digestive mucosa // Pediatr Res, 1994. V.36. P. 137-143.

75. Gao X., Huang L. Catioriic liposorpe-mediated gene transfer // Gene Ther. 1995. V.2. №10. P. 710-722'. '128 • *

76. Garry R., Cutting M.D. Implications of CE.TR functions on the understending of the relationship between genotipe/phenotype.// Pediatric Pulmonology 1995-Suppl.12 p.119-127.

77. GaspariniP., Borgo G., Mastella G. etal. Nine cystic fibrosis patients homozygous for the CFTR nonsense mutation R1162X have mild or moderate lung disease // J. Med. Genet. 1992. V. 29. № 8. P. 558:562.

78. Goldman M.J:, Anderson G.M., Stolzenberg E.D., Kari U.P., Zasloff M., Wilson J.M. Human beta-defensin-1 is a salt-sensitive antibiotic in lung that is inactivated in cystic fibrosis // Cell. 1997. V.88. № 4. P. 553-560.

79. Goldman M.J., Lee P.S., Yang J.S., Wilson J.M. Lentiviral vectors for gene therapy of cystic fibrosis// Hum Gene. Theiapy. 1997. V. 8.№ 10. P.2261-2269.

80. Gregory R.J., Cheng S.H., Rich D.R., Marshall J.,Paul S., Hehir K., Ostedgaard L., Klinger K.W., Welsh M.J. and Smith A-.E., Expression and characterization of the cystic fibrosis, transmembrane regulator// Nature. 1990. V.347. P(;382-386.

81. Grubb B., Pickles R., Yankaskas J., Vick R., Engelhardt J., et al. Inefficient gene transfer by adenovirus vector to cystic fibrosis airway epithelia of mice andhumans // Nature. 1994. V.371. P.802-808.• *

82. Halbert CL, 'Aitken ML, Miller AD Retroviral vectors efficiently transduce basal and secretory airway epithelial" cells in yitr© resulting in persistent gene expression in organotypic culture // Human Gene Therapy. 1996.V.7. № 10. P. 1871-1881.

83. Hamosh A. Preliminary results of cystic fibrosis genotype-penotype,consortiume study // Pediatric Pulmonology. 1992; Suppl.8. P.144-145,

84. Harris A., Chalkley G., Goodman S. and Coleman L. Expression of the cystic fibrosis gene in human development II Development. 1991. V. 113. P. 305-315.

85. Hasty P, O'Neal WK, Liu KQ, Morris AP; Bebok Z, Shumyatsky GB, Jilling T, Sorscher EJ, Bradley A, Beaudet AL Sevjere phenotype in mice with termination mutation in exon 2 of cystic fibrosis gene // Somat Cell Mol Genet. 1995. V.21. P. 177-187. ' ' .

86. Hyde K, Reid CJ, Tebbutt SJ, Weide:L, -tfollingsworth MX, Harris A The cystic fibrosis transmembrane conductanpe. re^tilator as a marker of human pancreatic duct development // Gastroenterology. 1997. V.113. P.914-923.

87. Hume J.R., Hart P., Levesque P.C., Collier M L., Geary Y., Warth J., Chapman T. and Horowitz B. Molecular physiology of. CFTR CI- channels in heart // Jpn J Physiol. 1994. V.44. P, 177-182. X

88. Hwang TC, Horie M, Gadsby DC. Functionally distinct phospho-forms underlie incremental activation of protein kinase-regulated CI- conductance in-mammalian heart//J Gen Physiol. 1993. V.101 P. 629-650.

89. Hyde S.C., Gill D.R., Higgins C.F., Trezise A.E., MacVinish L.J., Cuthbert A.W., et al. Correction of the ion transport'-defect in cystic fibrosis transgenic mice by gene therapy // Nature. 1993. V.362. P,250-255. ' :

90. Illek B, .Fischer H, Santos GF, Widdicombe JH, Machen TE, Reenstra WW. cAMP-independent activation of CFTR1 CI channels by the tyrosine kinase inhibitor genistein // Am J Physiol. 1995. V: 269. P.886-893.

91. Illek B, Fischer H,."Machen TE. Alternate stimulation of apical CFTR bygenistein in epithelia/AAm J Physiol.-1996: V. 270. P.265-275.*

92. Imundo L., Barasch J., Prince A. and,Al-Awqati Q. Cystic fibrosis epithelial cells have^ a receptor for pathogenic bacteria on their apical surface // Proc Nat Acad Sci USA. 1995. V. 92*. P. 3019-3023 • .

93. Ivaschenko T.E., White M.B., Dean M., Baranov V.S. A deletion of two nucleotides in exon '10 of the :CFTR gene in a soviet family with cystic fibrosis causing early infant death//Genomics-. 1991. V.10. P. 298-299.130

94. Ivaschenko T.E., Baranov V.S., Dean-M. Two new mutations and other CFTR gene molecular changes detected by SSCP analysis in CF-patients from the Russia//Hum.Genet. 1992. V.89. P.123-129. ;

95. Jiang, C.,. Finkbeiner W.E., Widdicombe J.H., McCray P. and Miller S.S. Altered fluid transport acrpss'airway epithelium in cystic fibrosis // Science. 1993. V. 262. P; 424-431.

96. Johnson L.G., Olsen J.C.V Sarkadi B., Moore K.L., Swanstrom R., Boucher R.C. Efficiency of gfene .transfer for'restoration of normal airway epithelial function in cystic fibrosis //.Nat Genet. 1992. V.2. P.21-26.

97. Effect of host modification and age on airway epithelial gene transfer mediated by a murine leukemia virus-derived vector. //J Virol 1998. V. 72. № 11. P. 88618872.

98. Jorde L.B. and Lathrop G.M. A test of the heterozygote-advantagfe hypothesis in cystic fibrosis carriers //Am. J. Hum- Genet. 1988. V.42. P.808-815.

99. Kartner N., Augustinas O., Jensen T.J., Naismith A.L., Riordan J.R. Mislocalization of delta F508 CFTR ip tystic fibrosis sweat ^land // Nature Genetics. 1992. V. 1. № 5. P. 321-328. '■

100. Katz, S.M. and Holsclaw .D.Jr. Ultrastructural features of respiratory cilia in cystic fibrosis // Am J Clin Pathol, 1980. V. 73. P. 682-687.

101. Kelley K.A., Stamm S. and Kozak C.A. Expression arid chromosome localization of the murine cystic fibrosis transmembrane conductance regulator // Genomics. 1992. V.13. P. 38Í-390. • "

102. Kerem B., Rommens J.M., Buchanan J.A., Markiewicz D., Cox T:K., Chakravarti A., Buchwald -M. and" Tsui LC. Identification of the cystic fibrosis gene: genetic analysis // Science. 1989. V: 245. P. 1073-1080. ■.

103. Kerem B., Kerem E'. The -Molecular Basis for Disease Variability in Cystic Fibrosis // Eur J Hum Genet. 1996. V.4. P.65-73.

104. Khan T.Z., Wagéne'r J.S.,-Bost T., Martinez J., Accurso F.J. and Riches D.W. Early pulmonary inflámmatióri in infants with cystic fibrosis // Am J Respir Crit Care Med.1995. V:'151. P. 1075r1Q82. '

105. Kiesewetter S.,-Macek M., Davis C., Curristin S.M., Chu CIS., Graham C., Shrimpton A.E., Cashman-S.M., Tsui i,C., Mickle J. A mutation in CFTR produces different phenotypes depending on chromosomal background // Nat Genet. 1993. V.5. P. 274-282. \

106. KlingerJ.D.-, Tandler B., Liedtke C.M. and Boat T.F. Proteinases of Pseudomonas aeruginosa evoke mucin release by tracheal epithelium // J Clin1.vest. 1984. V. 7-4. P. 1669-1678. ' '

107. Koh J., Sferra T.J. and Collins F.S. -Characterization^of tl»e cystic fibrosis transmembrane conductance regulator promoter region. Chromatin context and tissue-speciticity//- J Biol Chem. 1993. V. 268. P.15912-15921.

108. Kolls JK, Lei D, Odom G, Nelson S, Suijimer WR, Gerber MA, Shellito JE Use of transient CD4 lymphocyte depletion to prolong transgene expression of E1-deleted adenoviral vectors // Hum Gene Ther. 1996. V.7. Ns 4. P. 489-497.

109. Kopito L.E., Kosasky H.J. and Shwachman H. Water and electrolytes in cervical mucus from patients with cystiG fibrosis // Fertil Steril. 1973. V. 24. P. 512518. . "

110. Kotloff R.M., FitzSimmons S.C. and.Fiel S.B. Fertility and pregnancy in patients with cystic fibrosis // Clirr Chest M6d. 1992. V. 13. P. 623-635.

111. Levesque P.C., Hart P.J., Hume J.R., Kenyon J.L. and Horowitz B. Expression of cystic fibrosis transmembrane regulator CI- channels in heart //.Circ Res. 1992. V.71. P.1002-1009.": ' ' *

112. Marino C.R., Matoveik L.M., Gorelick F.S. and Cohn J.A. Localisation of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator in pancreas // J Clin Invest. 1991. V.88. P.712-718.

113. Marshall J., Martin K.A., Picciotto M., Hockfield S., Nairn A.C. and Kaczmarek■ ■ »

114. K. Identification and-localization of a dpgfish homolog of human cystic fibrosis transmembrane conductance, regulator // J Biol Chem. 1991. V.266. P. 2274922754. ' .

115. Middleton P.G., Geddes D.M., Alton B.W. Protocols for in vivo measurement of the ion transport defects in cystic fibrosis nasal epithelium // Eur. Respir. J. 1994. V.11. №7. P.2050-2056.

116. Morales MM-, Carroll TP, Morita T, Schwiebert EM, Devuyst O, Wilson PD, Lopes AG, Stanton BA, Dietz HC, -Cutting GR, Guggino WB Both the wild type and a functional isoform of CFTR are expressed in kidney // Am J Pbysiol. 1996. V.270. P. 1038-1048.

117. Mocral N., Nuries Y-, Casals T.; CA/GT microsatellite allele within the Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) gene are not generated by unequalcrossingovef// Qenomics. 1991. V, 10. P.692-698. # •

118. Mylona P, Glazier JD, Greenwood SL, Sides MK, Sibley CP Expression of the cystic fibrosis-(CF) and multidrug resistance (MDR1) genes during developmentand differentiation in the human placenta // Mol Hum Reprod. 1996. V.9. P.693-701»

119. Mylona P, Hoyland-JA, Sibley CP Sites of mRNA expression of the cystic fibrosis (CF) and multidrug resistance (MDR1) genes in the huhnan placenta of early pregnancy: No evidence for complementary expression // Placenta. 1999. V.20. P.493-498. . . J ;

120. Nakamura H., Yoshimura K., Bajocchi.G., Trapnell B.C., Pavirani A.'and Crystal R.G. Tumor necrosis factor modulation of expression of the cystic fibrosis transmembrahe conductance regulator gene // Febs Lett. 1992. V.314. P. 366370.

121. Naldini L, Blomer U., Gallay P.,. Ory D.; Mulligan R., Gage F.H., Verma I.M., Trono D, In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by alentiviral vector If Science. 1996. V.272. №'2. P. 263-270. ;' »

122. Niederman M.S., Me.r/ill W.W., Pojomski L.M., Reynolds H.Y. and Gee J.B. Influence of sputum IgA and elastase on tracheal cell bacterial adherence// Am Rev Respir Dis. 1986. V. 133. P. 255-260'.;

123. Nunes V., Casals T., Gaona A., Antinolo A. et al. Cystic'fibfosis patients with mutation 1949del84 in exo'n 13-of CFTR gene have a similar clinical severity as -F508 homozygotes // Hum.Mjut. 1992. V.I. № 4. P. 375-379

124. Oppenheimer E.H. and Esterly .J.R. Observations on cystic fibrosis of the pancreas. VlfThe uterine-cervix//J Pediatr. 1970. V. 77. P. 991-996.

125. Oppenheirrie.r E.H. and Esterly J.R. Cystic fibrosis of.';the pancreas. Morphologic findings in infants with and without diagnostic pancreatic lesions // Arch Pathol, 1973. V. 96. P.-149-154. \

126. Oppenheimer E.H. and Esterley. J.R. Hepatic changes in young, infants with cystic Fibrosis: Possible region to focai biliary cirrhosis // J. Pediatrics. 1975. V. 86. P. 683-689. •'

127. Ornoy A., Amon J., Katznelson D:, .Granat M., Caspi B. and Chemke J. Pathological confirmation of cystic fibrosis'in the fetus following prenatal diagnosis //Am J Med Genet. 1987. V. 28. P. 935-947. ' .134 ¿.• :.:

128. Pier G., Grout M., Zaidi T. Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator is- an epithelial cell receptor for clearance of Pseudomo'nas aeruginosa from the lung // Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 1997. V.94. P.12088-12093.

129. PritchaFd D.J. Cystic fibrosis frequency," Sex ratio anomalies-and fertility : a new theory for the dissemination of mutant alleles // Hum.Genet. 1991.V.87. P.671-676.

130. Poeschla E.M., Wong-Staal F., Lodhey D.J. Efficient transduction of nondividing human cells by ferine .immunodeficiency, tfirus lentiviral vectors IU Nat. Med. 1998. V.4. № 3. P. 354-357.

131. Quinton P.M. Missing CI conductance, in cystic fibrosis // Am J P.hysiol. 1966. V.251. №4. P. C649-C652.

132. Ratcliff R, Evans MJ, Cuthbert AW,. MacVinish LJ, Foster D, Anderson JR, Colledge WH Production of a severe cystic fibrosis mutation ifi mice by gene targeting // Nat Genet. 1993. V.4. P.35-41.

133. Reid I. Measurement of the bronchial layer: A-diagnostic yardstick in chronic bronchitis //Thorax, 1960. V. 15. P. 132.

134. Riordan J. R., Pind S„ Lukacs G.L. et al. Biosynthetic arrest ofdelF508 CFTR: characterization and manipulation // Pediatric Pulmonology^ 1994. V.10.

135. Rochwerger L. and Buchwald M. Stimulation of the cystic fibrosis transmembrane regulator expression by estrogen in vivo // Endocrinology. 1993. V.133. P. 921-930.

136. Romeo G., Devoto. M., Galietta L.j. Why is the cystic fibrosis gene so frequent? II Hum Genet :i989. V. 84. №>.1-, P. 1-5. ■ . . /.

137. Rommens J.M., lannuzzi. M.C., Kerem В., Drunim M.L., Melmer G., Dean M., Rozmahel R., Cofe J.L.-, Kennedy D., Hidaka N., et al. Identification of the cystic fibrosis gene: chromosome walking and/jumping // Science. 1989. V. 245. P. 1059-1065. •

138. Rosenfeld M.A., Collins F.S. Gene therapy for cystic fibrosis // Chest. 1996. V. 109. № 1, P. '241-252. • • " ; .V. '

139. Rutland J. and Cole P.J. Nasal mucociliary clearance and ciliary beat frequency in cystic fibrosis compared with sinusitis and bronchiectasis // Thorax. 1981. V. 36. P. 654-662.

140. Sears CL, Firoozmand F, Mellander .A, Chambers FG, Eromar IG, $ot AG, Scholte B- De Jonge HR', Donowjtz M. Genistein and tyrphostin 47 stimulate CFTR-mediated CI- secretion in T84 cell monolayers //Am J Physiol. 1995. V. 269. P.874-882.

141. Sheppard DN, Welsh MJ. Structure* and function of the CFTR chloride channel // Physiol Rev. 19.99. V:79. P.23-45. "'

142. Scheule R., George JM Bagley R., Marshall J. et al. Basis of pulmonary toxicity associated with cationic lipid-mediated gene transfer to the mammalian'lung // Human gene therapy, 1997, V.8^ p.689r707.

143. Skach W.R. CFTR mutants: G85E &.G91R insert charged residues into the first transmembrane segment and disrupt intracellutar trafficking but do not alter transmembrane topology // Pediatric Pulmonology. 1995. Suppl.12. P. 191.

144. Smyth R.L., van Velzen D,"Smyth A.R^ Lloyd D.A. and Heaf D.P. Strictures of ascending colon in cystic fibrosis ¡and high-strength pancreatic enzymes // Lancet. 1994. V. 343. P.85-91. ''

145. Smith A.N. and Wardle C.J. Characterization ofDNAse hypersensitive sites ini , ' ■;the 120 kb 5' to the CFTR gerie // Biochemical and Biophysical Research Communications. 1995. V. 21-1: P. 274-281.

146. Smith J.J.,.Travis S., Greenberg'E.P.' and Welsh M.J. Cystic fibrosis'airway epithelia fail to kill bacteria of abnormal airway surface // Cell. 1996- V. 85. P. 229137 ^ " '

147. Snouwaert-J.N., Brigman K.K.,.Latour A.M., Malouf N.N.,'-Boucher R.C., Smithies O. and Kolier B.H. An animal model for cystic Fibrosis, made by gene targeting // Science. 1992. V.257. P. 1083-1091.

148. Stewart B, Zabner J, Shuber A, Welsh M, McCray P. Normal sweat chloride values do not exclude the diagnosis of cystic fibrosis // Am J Respir Grit Care Med. 1995. V.151. P.899-903. •

149. Strandvik B., Bronnegard M., Gilljam H. and Carlstedt-Duke J. Relation between defective regulation of arachidoriic acid release and syTnptoms in cystic fibrosis // Scand J Gastroenterol Suppl. 1988. V. 143. P. 1-4.'

150. Strong-T.V., Boehm K.N and Collins F.S. Localization of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator m.RNA in the human gastrointestinal tract by in situ hybridization // J Clin Invest, 1994. V.93. P.347-354.

151. Sturgess, J. Fluid and Electrolyte Abnormalities in exocrine glands in cystic fibrosis. Sari Francisco Press: San Francisco. 1982. P. .254-261.

152. Sturgess J. ajnd.;.lmrie J. Quantitative evaluation of the development of tracheal# • *submucosal glands in infants with cystic fibrosis'and control infants // Am. J. Pathol. 1982: V. 106. P. 303-314: •

153. Stutts M.J., Qanessa C.M., Olsen J.'C.-, Hamrick M., Cohn J.A., Rossier B.C., Boucher R.C. CFTR as'a cAMP-dependent regulator of sodium chaonels // Science. 1995. V.269. P.847-850. . \ '

154. Tata F., Stanier P., Wicking C., HalfortfS., Kruyer H., Lench N;j., Scambler P.

155. J., Hansen C., Braman J.C., Williamson R. Cloning the m'ouse homolog of the human cystic fibrosis transmembrane conductance regulator gene // Genomics. 1991.'V.10 P. 301-308. "■•'■.

156. Taussig L.M., Lobeck C.C., SanfAgnese P.D., Ackerman D.R. and Kattwinkel^

157. J. Fertility in males with cystic fibrosis"// N Engi J Med. 1972. V. 287. P. 586-595.

158. Tebbutt S.J., Wardle C.J.C., Hill D.F. and Harris A. Molecular analysis of the ovine cystic Fibrosis transmembrane conductance regulator gene // Proc Nail Acad Sci USA. .1995. V.-92. P. 2293-2297.' * "

159. Thomaidis J.S. and Arey J.B. The'intestinal lesions in cystic fibrosis of the pancreas // Journal of Pediatrics. 1963. V.:-63. P. 444-453.

160. Tizzano E.F., Chitayat 0. and Buchwald M. Cell-specific localization oT CFTR mRNA shows developmental^ regulated expression in human fetal tissues // Hum Mol Genet. 1993: V.2. P,219-224.' . . ;

161. Tizzano E.F., Silver MM., Chitayat D., Benichou J.C. and Buchwald M.* '

162. Differential cellular expression, of cystic, fibrosis transmembrane regulator in. . V *• .human reproductive tissues. Clues for the infertility in patients with cystic fibrosis //Am J Pathol. 1994.V.144yP.906-914. ••

163. Trezise A.E. and Buchwald M. In .vivp cell-specific expression of the^ cystic fibrosis transmembrane conductance regulator // Nature. 1991. V!353. P.434-437.

164. Trezise A.E., Chaiinbers J.A.; Wardle C.J., Gould S. and Harris A. Expression of the cystic fibrosis gene in human foetal tissues V/ Hum Mgl Genet. 1993. V. 2. P.21.3-221. ' . . .

165. Tsui L.C. and Buchwald M. Biochemical and molecular genetics of cystic fibrosis //199.1. Adv Hum Genet. V. 20. P. 153-266.

166. Tsui L.C. Mutations and sequence variations detected in the cystic fibrosis transmenbrane conductance regulator gene: A report from the cystic fibrosis analysis consortium // Hum. Mutation. 1992. V.1. № 3. P.197-203.

167. Tucker'S.J,, Tannahill D. and Higgi.ns C.F. Identification and developmental expression ofthe Xenopus faevis cystic fibrosis transmembrane .conductance regulator gene // Hu.m Mol Genet. 1992. V.1. P. 77-82.

168. Vaandrager AB, de Jonge HR.Signalling by cGMP-dependent protein kinases // Mol Cell Biochem. 1996. V. 157. P.23-30.

169. Van Doornick H., French P., Verbeek E., Peters R., et al. A mouse model for cysi fibrosis delF508 miitation // EMBO. 1995. V.14. V.18. P.4403-4411. '

170. Wainwright B.J., Scambler P.J., Schmidtke J., Watson E.A., Law H.Y., Farrall M. Cooke F.J-., Eiberg H. and. Williamson R. Localization of cystic fibrosis locus to human chromosome 7cen-q22 // Nature. 1985. V. 318. P. 384-389.

171. Walters R.W., Grunst T., Bergelson J.M., Finberg R.W., Welsh M.J., Zabner J. Basolateral localization of-fiber receptors limits adenovirus infection from the apical surface of airway epithelia //J Biol Chem. 1999. V.274. № 15. P. 1021910226. ' '

172. Wang G. Keratinocyte growth factor induced epithelial proliferation facilitates retroviral-media^ed gene transfer to- pulmonary epithelia in vivo // J.: Gene Med. 1999. V.1:№1,'P. 22-30. ' . ' ' 'v

173. Watkins J.B-/, Tercyak-A.M., Szczepanik P. and Klein P.D Bile salt kinetics in cystic fibrosis: influence of pancreatic enzyme replacement II Gastroenterology. 1977. V. 3. P. 1023-1031. •. .' '

174. White R„ Woodward $., Leppert M.^O'Connell P., Hoff M„ Herbst J., Lalouel J.M., Dean M. and Vande Wou.de G. A closely linked genetic marker for cystic fibrosis// Nature. 1985.;V. 318. P. 38-2-386.f-140 ' *:

175. Weizman Z., Durie P.R., Kopelman H.'R., Vesely S.M. and Fcwstfier G.G. Bile acid secretion in cystic fibrosis: evidence for a defect unrelated to fat malabsorption // Gut. 1986. V. 27. P. 1043T1051.

176. Welsh M.J., Tsui L.C., Boat T.F. and Beaudet A.L. Cystic Fibrosis. I13 Sriver C.R., A.L Beaudet, W.S. Sly D. Valle (ed.). The Metabolic and Molecular Basis of Inherited Disease. 1995. P. 3799r3876.

177. Welsh M.J., Smith A.E. Molecular rrtechanisms of CFTR chloride channel dysfunction in cystic fibrosis // Cell. 1996. V.73. P. 1251-1254

178. Widdicombe J.H., Widdicornbe J.G. Regulation of human airway surface liquid // Respir Physiol 1995. V. 99. № .1. P. 3-12.

179. Will K., Stuhrmann M., Dean M. and Schmidtke J. Alternative splicing in thefirst nucleotide binding fold of CFTR // Hum Mol Genet. 1993. V.2. P. 231-236.

180. Wilson D., Ellis L, Corey M. Patients previously diagnosed with cistic fibrosis: value of nasal otervtial difference in borderline cases // Pediatric Pulmonology. 1995. V. 12. R. 11,5. ' '

181. Wilson D. 0-, Ellis L.fc Zielenski.J., et gl. Uncertainty in'the diagnosis of cysticfibrosis: Possible role o.f in vivo nasal potential difference measurements // The J.* *of Pediatrics. 1998. V. 132, №4. P.596-599.

182. Wine J.J. The genesis of cystic fibrosis lung disease // J C^i.n Invest. 1999. V.103. P309-312'. . . ' • v "

183. Wihpenny JP, McAlroy HL, Gray MA, Argent BE. Protein kinase C regulates the magnitude and stability of CFTR currents in pancreatic duct cells // Am J Physiol. 1995. V: 268. P.823-831.

184. Yang Y.,'.Raper S.E., Cohn J.A., Engelhardt J.F:, Wilson J.M. An approach fortreating the hepatobiliary disease of cystjc fibrosis by somatic .gene transfer //

185. Zabner J, Couture L.A., Gregory RJ.,graham S.M., Smith A.E., Welsh M.J.f

186. Adenovirus-mediated gene transfer transiently corrects the chloride transport defect in riasal epithelia of patients with cystic fibrosis // Cell. 1993. V.22. P.207-223. >

187. Zabner J., Couture L.A„ .'Smith' A.E., Welsh M.J. Correction of cAMP-stimulated -fluigl secretion in cystic'' fibrosis airway epithelia: efficiency of adenovirus-mediated gene? transfer-in.vitro // Hum. Gene Ther. 1994: V.5. P.585-593. • : • " • .

188. Zabner J., Fasbender /\.J., Moni.nger T.-, Poellinger K.A., Welsh M. J-Cellular and molecular barriers to gene transfer by a cationic lipid // J. Biol. Chem. 1995. V. 270 № 11. P. 18997-19007. . . ' . "

189. Clin Invest. 1996. V.-15. P. 1504-1511.«

190. Zabner J., Zeiher B.G„ Friedman E.-, Welsh M.J. Adenovirus-mediated genetransfer to ciliated airway epithelia requires prolonged incubation time // J Virol. 1996. V.70. P.6994-7003. '

191. Zabner J.,' Smith J.J., Karp P.H., Widdicombe J.H., Welsh M.J., Loss of CFTR chloride channels alters salt absorption by'cystic fibrosis airway epithelia in vitro // Molecular Cell 199'8, № 2, -V, 3. P., 397-403.

192. Zar H., Saiman I., QuitteLI L. and Prince A. Binding of pseudomonas aeruginosa to respiratory epithelial, cells from patients with various mutations in the cystic fibrosis transmembrane regulator // Journal of Pediatrics. 1995. V. 126. P. 230-233.

193. Zeiher B.G., Eichwald E.,' Zabner J.,'.Smith J.J., Puga A.P., McCray P.B., Capecchi M:R., Welsh M.J./Thomas K.R. A mouse model for the delta F508 allele of cystic-fibrosis // J Clin Invest. 1995. V.96. P.2051-2064

194. Zeitlin P.L., Crawford L., Lu L, Woel S., Cohen M.E., Donovyitz M., Montrose M.H., Hamosh A., Cutting G.R., Gruenert D., et al. CFTR protein expression in primary, and cultured epithelia // Proc Nail Acad Sci USA. 1992. V.89. P. 344-351.142 .

195. Zielenski J., Rozmahel R., Bozon D., Kerem B., Grzeiczak Z:, Riordan J.R., Rommens J. and Tsui L.C. Genomic DNA sequence of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) gene // Genomics.; 1991. V. 10. P. 214-228.

196. Zuelzer W.W. and Newton. W./y The .pathogenesis of fibrocystic disease of the pancreas. A study of 36 cases with special reference to the pulmonary lesions //Pediatrics. 1949. V. 4. P. 53-65. ? * .