Изучение новой сигнальной функции оксида азота - регуляции экспрессии гена aidB Ada-регулона Escherichia coli тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.02, кандидат наук Стрельцова, Дарья Александровна

• Стрельцова, Дарья Александровна
• кандидат наук
• 2013

Оглавление диссертации кандидат наук Стрельцова, Дарья Александровна

Содержание

Введение

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Алкилирование в биологии

1.1.1 .Типы алкилирующих агентов

1.1.2. Бифункциональные и монофункиональные агенты

1.1.3. SnI Sn2 нуклеофильные замещения

1.1.4. Мишени и биологические последствия

алкилирования ДНК

1.2. Защита клетки E.coli от алкилированных

повреждений ДНК. Адаптивный ответ

1.3. Сигнальные функции оксида азота

в E.coli и динитрозильные комплексы железа

1.4. Основной механизм регуляции анаэробного метаболизма

в E.coli. Белок Fnr[4Fe-4S]2+

1.4.1. Модели сборки

[4Fe-4S]2+ кластера белка Fnr in vitro

Глава 2. Материалы и методы исследования

2.1. Бактериальные штаммы и питательные среды

2.2. Оценка клеточного роста

2.3. Анаэробная инкубация E.coli

2.4. Экспрессия генов-репортеров

2.5. Синтез NO-доноров

2.6. Измерение NO-донирующей активности NO-доноров

2.7. Определение цитотоксической активности NO-доноров

2.8. Электронный парамагнитный резонанс

2.9. Определение продуктов распада железо-серных кластеров

[4Fe-4S]2+ в клеточных образцах

2.10. Изучение избирательности к источникам серы для

сборки кластера [4Fe-4S]2+ в клетках E.coli

Глава 3. Результаты и обсуждение

3.1. Взаимосвязь NO-донирующей и биологической активности изученных доноров оксида азота

3.2. Кинетика экспрессии гена Е.coli aidB в аэробных и анаэробных условиях культивирования

3.3. Избирательное ингибирование экспрессии гена E.coli aidB оксидом азота в анаэробных

условиях культивирования

3.4. Изучение зависимости экспрессии гена aidB от структуры железо-серного кластера

Fnr[4Fe-4S]2+ в E.coli

3.5. Изучение механизма конверсии [4Fe-4S]2+ кластера

при взаимодействии с N0

3.6. ЭПР-исследование механизмов нитрозилирования и реконструкции железо-серного кластера

Fnr[4Fe-4S]2+ в E.coli

3.7. ДНКЖ с персульфидными лигандами и реконструкция [4Fe-4S]2+ кластеров в Fnr E.coli. Источники железа и серы в механизме реконструкции Fe-S кластеров E.coli in vivo

Глава 4. Заключение

Выводы

Список сокращений

Список литературы

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Изучение новой сигнальной функции оксида азота - регуляции экспрессии гена aidB Ada-регулона Escherichia coli»

Введение

Актуальность работы. ДНК-репарационные системы - основные защитные механизмы клеток, сформировавшиеся в ходе эволюции и сохранившиеся общими, либо подобными для разных биосистем. История изучения репарации ДНК берет начало в пионерских работах середины XX века с использованием бактериальной клетки, а в качестве агентов воздействия на клеточную ДНК - факторов физической природы (УФ- и ионизирующее излучение) [1, 2]. Первым изученным механизмом репарации ДНК стал феномен ферментативной фотореактивации — процесс, в котором фермент ДНК-фотолиаза напрямую восстанавливает индуцированные УФ-излучением тиминовые димеры в ходе фотохимической реакции [3]. В середине 1960-ых американскими исследователями была описана независимая от видимого света эксцизионная репарация (контролируемая опероном UvrABC) в клетках Escherichia coli, экспонированных УФ-облучению [4, 5]. Практически одновременно это открытие было повторено на клетках млекопитающих [6]. Исследования, проведенные в последующее десятилетие, позволили сделать вывод о наличии в клетке альтернативных систем эксцизионной репарации нуклеотидов и эксцизионной репарации оснований ДНК [7-10]. Вместе с фундаментальными открытиями расширялось представление о роли адекватной работы ДНК-репарационных систем в поддержании целостности генотипа, а также опухолевой трансформации клеток [11, 12]. К концу 1970-х научное знание о механизмах репарации ДНК основывалось на двух принципах: эксцизия повреждения ДНК либо прямой возврат к незамещенной форме основания. Прогрессом в этой области исследований стало открытие систем пострепликативной репарации ДНК для преодоления повреждений, остающихся в ДНК [13]. Важнейшим вкладом в изучение репарации ДНК стала сформированная М. Радманом гипотеза о

функционировании в бактериальной клетке так называемого SOS-ответа -индуцибельного УФ-излучением мутагенного («error-prone») ДНК-репарационного механизма, предусматривающего возможность репликации поврежденной ДНК [14]. Предположительно, подобный механизм функционирует и в клетках млекопитающих, однако эти исследования требуют дальнейшего развития [15].

Открытие феномена мутагенной активности у химических соединений, совершенное одновременно советским и немецким исследователями И.А. Рапопортом и Ш. Ауэрбах привело к появлению нового направления в исследованиях репарации ДНК с использованием химических мутагенов различной природы — химического мутагенеза [16, 17]. Значительную группу соединений, обладающих высокой мутагенной активностью, составляют алкилирующие агенты, способные интенсивно взаимодействовать с структурами клеточной ДНК, вызывая токсическое, мутагенное, тератогенное и карциногенное действие. С другой стороны, алкилирующие соединения стали основой нового класса клинических лекарственных препаратов, высокоэффективных в химиотерапии злокачественных новообразований. Приоритетные работы по созданию ряда алкилирующих «супермутагенов» из класса нитрозоалкилмочевин и разработке методов их применения в клинике и в селекции микроорганизмов, а также сельскохозяйственных культур были инициированы и выполнены в Институте химической физики АН СССР [18-20]. Поскольку генетическая активность алкилирующих агентов абсолютно зависит от способности клетки репарировать поврежденную ДНК, были развернуты исследования по выявлению механизмов клеточного ответа на алкилирующие повреждения. Эти работы важны и актуальны и в настоящее время.

В E.coli системы защиты от алкилированных повреждений включают гены ogt и tag, экспрессирующиеся конститутивно, и ada, alkB, alkA и aidB, экспрессия которых, в основном, индуцибельна и связана с развитием в клетке так

называемого «адаптивного ответа». Феномен ДНК-репарационного «адаптивного ответа» (АО), был впервые описан в Е. coli [21]. АО выражается в ингибировании цитотоксического и мутагенного эффектов алкилирующих агентов при воздействии на клетки, предварительно обработанные сублетальными концентрациями этих же соединений.

Было установлено, что развитие АО контролируется белком Ada, который регулирует экспрессию 4-х генов Ada-регул она: ada, alkB, alkA и aidB [22]. В литературе описаны механизмы регуляции экспрессии генов ada, alkB, alkA, их продукты и функции [23-26]. Однако, очень долгое время оставался нерешенным вопрос о механизмах регуляции гена aidB, который значительно отличается от остальных механизмов регуляции генов Ada-регулона, и по-своему уникален. В аэробных условиях активация транскрипции aidB контролируется метилированным белком Ada (meAda), однако в стационарной фазе роста и в анаэробных условиях экспрессия aidB позитивно регулируется как meAda, так и РНК-полимеразой os (продукт гена rpoS) [27-29]. Структурный анализ белка AidB выявил его гомологию с белками семейства ацил-СоА-дегидрогеназ человека [30]. Были получены доказательства функционирования гена aidB в качестве «гена опасности», который включается в процесс репарации при очень высоком уровне алкилирования ДНК, когда экспрессия остальных генов Ada-регулона недостаточна для сохранения жизнеспособности клеток. Это важно при работе с известными высокоэффективными в онкотерапии бифункциональными хлорнитрозоалкилмочевинами - ACNU, BCNU [31].

В 2007 г. в работе [32] была опубликована структурная модель белка Fnr -единственного регулятора анаэробного метаболизма E.coli. Установлено, что активная форма этого белка содержит железо-серный кластер [4Fe-4S]2+, обладающий функциями сенсора. При анаэробном метаболизме железо-серные белковые кластеры составляют основную мишень для оксида азота (N0), накопление которого в этих условиях было установлены в работе [33].

Суммируя вышеизложенное, в лаб. теоретической генетики ИБХФ РАН было выдвинуто предположение о белке Бпг как МО-сенсоре и регуляторе экспрессии гена тс1В при анаэробном культивировании, и развернуты исследования для его экспериментального обоснования. В работе содержится теоретическое и экспериментальное обоснование новой сигнальной функции N0 - регуляции экспрессии уникального гена тйВ Ас1а-регулона факультативного анаэроба Е.соИ. Развитие работ этого направления внесет вклад и расширит понимание механизмов сигнальных функций N0 и связанных с ними путей метаболизма в условиях анаэробиоза.

Целью работы является получение теоретических и экспериментальных доказательств новой сигнальной функции оксида азота, как регулятора активности гена шс1В Аёа-регулона Е.соИ в анаэробных условиях, и выявление молекулярно-генетических механизмов процесса регуляции.

Для достижения указанной цели в работе были поставлены и решены следующие задачи:

1. Изучение кинетики экспрессии гена шйВ Аёа-регулона Е.соИ при культивировании в анаэробных условиях и получение молекулярно-генетических и биохимических доказательств регуляции процесса белком ¥пг [4Ре^8]2+.

2. Сравнительное изучение кинетики экспрессии гена тйВ при обработке клеток различными донорами оксида азота и выявление зависимости процесса от структуры N0-доноров;

3. Изучение интенсивности и формы сигналов ЭПР-спектров клеток Е.соИ, обработанных различными ]МО-донорами и корреляции этих параметров с уровнем экспрессии гена агс1В. Определение структуры ЫО-сигнальной молекулы.

4. Изучение роли клеточного железа в трансдукции сигнала оксидом азота.

5. Получение доказательств обратимости процессов распада и сборки [4Бе-4Б]2+ кластера белка-регулятора Бпг Е.соИ при нитрозилировании:

идентификация in vivo продуктов распада кластера [4Fe-4S]2+, изучение вклада белков IscA и SufA в процесс сборки кластеров. Определение источников серы (S) для процесса сборки [Fe-S] кластеров in vivo и in vitro. Научная новизна диссертации. Впервые выдвинута научная гипотеза и изучен молекулярно-генетический механизм регуляции экспрессии гена aidB Ada-регулона E.coli. В основе механизма регуляции - обратимая конверсия кластера белка анаэробиоза Fnr [4Fe-4S]2+, который является - NO-мишенью, сенсором и регулятором экспрессии гена E.coli aidB.

Установлена позитивная корреляция между параметрами анизотропного ЭПР спектра с g-фактором 2,03, формирующегося в клетках при обработке NO-донорами, и уровнем ингибирования экспрессии aidB в клетках. Выявлены механизмы и закономерности формирования «широкого» тиосульфатного и «узкого» дисульфидного сигналов ЭПР g=2,03 в клетке, связанные с внутриклеточным формированием сигнальных молекул динитрозильных комплексов железа с тиоловыми либо персульфидными лигандами, соответственно. Впервые in vivo изучен механизм распада [Fe-S] кластеров в белке Fnr[4Fe-4S]2+ E.coli и рассмотрена гипотеза о функции фермента цистеин-десульфуразы IcsS в реконструкции [Fe-S] кластеров. Впервые в экспериментах in vivo показано, что в качестве источников серы в процессе реконструкии [Fe-S] белковых кластеров в E.coli, наряду с органическими источниками, используется и неорганическая сера.

Практическая значимость работы. Представленные в диссертации собственные экспериментальные данные позволяют расширить понимание роли оксида азота и его доноров в процессах клеточного метаболизма и репарации ДНК. На основе описанных ранее в литературе фактов о 1) структурной и функциональной гомологии белка AidB с СоА-дегидрогеназами животных и человека; 2) аналогии димерных структур и функций у универсальных регуляторов анаэробного метаболизма в клетках E.coli и млекопитающих - белков Fnr[4Fe-4S]2+ и фактора HIF-la; и 3) функции продукта гена aidB в повышении

клеточной резистентности к генотоксической активности алкилирующих соединений (МННГ) - полученные нами результаты целесообразно использовать для оптимизации применения препаратов бифункциональных алкилирующих агентов (ACNU, BCNU) в клинике для лечения онкозаболеваний.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

1. Селективное ингибирование N0 экспрессии гена aidB Ada-регулона E.coli в

анаэробных условиях культивирования клеток.

2. Зависимость экспрессии гена aidB Ada-регулона E.coli в анаэробных условиях культивирования от активной димерной структуры белка-регулятора Fnr[4Fe-4S]2+: избыток/недостаток внутриклеточного Fe2+, как фактор железо-серного кластера [4Fe-4S]2+, приводил, соответственно, к стимуляции/ингибированию экспрессии гена aidB.

3. Изучение in vivo продуктов распада кластера [4Fe-4S]2+ белка Fnr E.coli при его взаимодействии с N0.

4. Экспериментальное доказательство возможности использования клеткой E.coli, наряду с L-цистеином, других органических соединений (1,4-ДТТ, N-ацетил-Ь-цистеин) и неорганического Na2S в качестве источников серы при реконструкции белковых железо-серных кластеров.

5. Изучение механизмов формирования «широкого» тиосульфатного и «узкого» дисульфидного сигналов ЭПР ДНКЖ g=2,03 в клетке, как показателей распада либо реконструкции железо-серных белковых кластеров, соответственно.

6. Экспериментальное подтверждение гипотезы о [Fe-Sj-кластерах железо-серных белков как основном субстрате при внутриклеточном формировании сигнальной молекулы ДНКЖ.

Апробация работы и публикации по теме исследования. Основные положения и результаты проведенных исследований были представлены на VIII Международной Молодежной конференции ИБХФ РАН-ВУЗы «Биохимическая физика» (Россия, г. Москва, 2009); V- VI- VII- VIII- IX- Московском Международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития»

(Россия, г. Москва, 2009-2013); Конференции молодых ученых с международным участием «Симбиоз Россия» (Россия, г. Пермь, 2009); Международном симпозиуме «Биология - наука XXI века» (Россия, г. Пущино, 2010); XVII и XX Международных конференциях студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Россия, г. Моска, 2010, 2013); VI Съезде по радиационным исследованиям (Россия, г. Москва, 2010); Международной конференции «Рецепторы и внутриклеточная сигнализация» (Россия, г. Пущино, 2011, 2013); 5th European Young Investigator Conference on Free Radical Chemistry, Radiation Chemistry, Photochemistry, Radiobiology, and Spectroscopy (Germany/Poland, Frankfurt-Oder/Slubice, 2011); Summer school of the Society for Free Radical Research - Europe (Greece, Spetses, 2012); V International Conference on Environmental, Industrial and Applied Microbiology «BioMicroWorld» (Spain, Madrid, 2013).

В рамках конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития» работа отмечена дипломом 2-ой степени (2009) и присуждением медалей (20092012) за лучшую исследовательскую работу; работа отмечена дипломом 1-ой степени за лучшую исследовательскую работу в рамках симпозиума «Симбиоз Россия» (2009), а также грамотой за лучшую исследовательскую работу на конференции «Ломоносов» (2013).

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 24 работы, из них 13 статей в журналах и сборниках научных трудов (в том числе 8 в изданиях, рекомендованных ВАК) и 11 тезисов докладов в сборниках материалов международных конференций.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на листах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов исследования и их обсуждения, общего заключения, выводов и списка литературы, включающего источников.

Диссертация иллюстрирована 25 рисунками и 6 таблицами. Работа выполнена при финансовой поддержке грантов РФФИ 08-04-00228-а, 11-04-00399-а и Программы Президиума РАН «Фундаментальные науки — медицине» 01-РАН-21.

Глава 1. Обзор литературы 1.1. Алкилирование в биологии

Алкилирующие агенты широко распространены в окружающей среде [34]. Они формируются в клетке эндогенно, в процессе клеточного метаболизма, а также поступают экзогенно [29; 35]. С участием различных алкилирующих агентов в организмах как про-, так и эукариот протекают многие биохимические процессы. В биологических системах особенно значительна роль метилирования в процессах регуляции экспрессии генов [36; 37], посттрансляционной модификации белков на завершающем этапе биосинтеза [38, 39], РНК-метаболизма [40], модификации тяжелых металлов, активации системы рестрикции-модификации с функциями клеточной защитой от чужеродной ДНК в бактериях и т.д. [41].

Источниками метилирующих соединений для микроорганизмов являются эндогенные Б-аденозилметионин [42], продукты перекисного окисления липидов и нитрозированные аминокислоты, пептиды и полиамины [43-45], а также формирующиеся экзогенно метилированные галогены [34]. Важно, что биологическая активность ряда препаратов химиотерапии , получивших широкое практическое применение, связана с их способностью алкилировать биологически важные макромолекулы, включая ДНК [46].

Основной мишенью для алкилирования являются нуклеиновые кислоты — ДНК и РНК, пуриновые и пиримидиновые основания. Алкилирующие соединения, будучи электрофилами, способны реагировать с нуклеофильными центрами ДНК/РНК, ковалентно связываясь с азотистыми основаниями. Такие модификации структуры ДНК, если они не вызваны активностью специальных ферментов (например, ДНК-метилаз), а являются продуктами спонтанного

взаимодействия, приводят к нарушению метаболизма ДНК (остановке репликации и образования РНК и белков), что часто приводит к гибели клетки либо индукции мутационных изменений. Структура сформированных ДНК-аддуктов зависит от свойств алкилирующего соединения: его реакционной способности (тип SN1 или Sn2) и числа активных сайтов в алкилирующей молекуле (моно- либо бифункциональной).

1.1.1. Типы алкилирующих агентов 1.1.2. Бифункциональные и монофункиональные агенты

Монофункциональные алкилирующие агенты содержат одну химически активную группу и способны к модификации единственного сайта в ДНК, в то время как бифункциональные агенты содержат две реакционно активные группы, которые связываются с различными основаниями ДНК, образуя меж- и внутринитевые сшивки ДНК-ДНК и ДНК-белок, приводящие к остановке репликации ДНК и летальному исходу (в отсутствие репарации этих повреждений) [47, 48]. Репарация таких повреждений значительно более сложна и включает в Е.соН, наряду с системой генов адаптивного ответа (Ас1а-регулон), также систему эксцизионной репарации ДНК — ИугАВС [49]. Большинство изученных алкилирующих агентов монофункциональны (темозоломид (TMZ), 14-метил-К'-нитро-М-нитрозогуанидин (МННГ), М-нитрозо-Ы'-метилмочевина (НММ), метилметансульфонат (ММС), дакарбазин и т. д.). Однако, именно бифункциональные агенты широко применяются в химиотерапии рака (хлорэтиламины, хлорамбуцил, циклофосфамид, нимустин - АС>Ш, кармустин -ВСШ, ломустин - ССИи, фотемустин - С>Ш) [50].

1.1.3. 8к1 нуклеофильные замещения

Монофункциональные алкилирующие соединения по типу реакции нуклеофильного замещения подразделяются на 8К1 (унимолекулярное нуклеофильное замещение) и (бимолекулярное нуклеофильное замещение) агенты [51; 52]. Для химии 8м1 агентов характерна реакция первого порядка, кинетика которой зависит от концентрации собственно алкилирующего соединения и скорости образования реакционно-активного интермедиата, а для 8к2 - реакция второго порядка, скорость которой определяется концентрациями электрофильного агента и нуклеофильного субстрата. При взаимодействии алкилирующих агентов каждого типа с нативными ДНК или РНК преобладающим аддуктом является Ш-алкилгуанин, в частности, Ш-МеГ (Рисунок 1). Различие в реакционной способности между БгЛ и 8М2 соединениями заключено в их способности взаимодействовать с экзоцикличным кислородом О6 (6,3% и 0,3% аддуктов, соответственно, Рисунок 1) с образованием 06-метилгуанина (Об-МеГ). Минорные ДНК-аддукты (Ш-аденин, Ш-аденин, N1-гуанин, N3-гуанин, N3-цитозин, 02-цитозин, №-тимин, 02-тимин, и 04-тимин) вместе составляют <5% от общего количества продуцируемых аддуктов. Различная активность БтЛ и 8М2 агентов проявляется и при метилировании остатков фосфорной кислоты с образованием фосфодиэфиров (0,8% и 12-17%, соответственно) [53]. Аддукты, формируемые на одноцепочечной ДНК, представлены на рис. 1. При сравнительном изучении различных метилирующих соединений типов 8>Л и 8М2 установлено, что -агенты значительно более токсичны и мутагенны, что привело к выводу об уникальной роли О-метилированных повреждений ДНК, в частности Об-МеГ [52, 54].

Используемые в клинике алкилирующие соединения могут быть Бм!, 8ы2 и

смешанного типов, поскольку терапевтический эффект не связан прямо с реакционной способностью, а определяется фармакокинетикой, проницаемостью гематоэнцефалического барьера, метаболизмом и т. д. [55].

1.1.4. Мишени и биологические последствия алкилирования ДНК

N- и О-метилированные повреждения ДНК интенсивно изучались на протяжении последних 30 лет в разных модельных системах.

Результаты исследований in vitro показали, что аддукты N3-MeA блокируют репликацию ДНК [56]; в экспериментах на эмбриональных стволовых клетках мышей наличие в ДНК N3-MeA приводило к остановке клеточного цикла в S-фазе в отсутствие репарации повреждений [57, 58], а изучение структуры ДНК-полимеразы в дальнейшем выявило роль N3-пуринов (наряду с 02-пиримидинами) в качестве полимеразных «контактов» при синтезе новых оснований [59].

N7-Mer, как доминирующий ДНК-аддукт, не приводит к остановке репликации ДНК или ошибочному спариванию оснований [56], однако вследствие лабилизации N-гликозидной связи на ДНК формируются апуриновые сайты (АР-сайты) и, в результате работы АР-эндонуклеаз, разрывы ДНК [60].

06-МеГ является мутагенным аддуктом, поскольку индуцирует транзиции Г:Ц —» А:Т за счет ошибочного спаривания модифицированного гуанина с тимином в процессе репликации ДНК [61, 62]. Такие повреждения, оставаясь нерепарированными, потенциально детальны [54, 63]. Предполагается, что токсичность 06-МеГ аддуктов может быть обусловлена 2 механизмами:

1) ингибированием ДНК и РНК-полимераз [64];

2) запуском системы репарации ошибочно спаренных оснований (mismatch repair) в паре 06-МеГ:Т, приводящей к удалению тимина; в следующем

цикле репликации ДНК 06-МеГ снова спаривается с тимином, что реинициирует mismatch репарацию и репликацию ДНК. Считается, что в результате повторов процессов эксцизии и синтеза в одной из цепей ДНК стабилизируется брешь, что приводит к запуску сигнальных путей развития ответа клетки на ДНК-повреждение (например, апоптоза) [65].

Именно формирование 06-МеГ принципиально важно при обсуждении и оценке токсичности и мутагенной активности алкилирующих соединений.

04-МеГ, формирующийся при алкилировании ДНК по SnI пути, является потенциально мутагенным повреждением, вызывая транзиции А:Т —> Г:Ц и трансверсии Т —> А, однако этот аддукт менее токсичен [66]. 02-МеЦ и 02-МеТ (snl-алкилирование) и №-МеГ, как это указывалось выше, возможно, являются ингибиторами ДНК-полимераз [59], однако изучение специфики этих аддуктов продолжается. Было показано, что Nl-МеГ, Nl-MeA, N3-MeT и №-МеЦ также потенциально мутагенны, поскольку вызывают остановку репликации ДНК [67, 68].

Итак, алкилирующие агенты представляют собой обширный класс химических соединений окружающей среды и обладают токсическим, мутагенным, тератогенным и карциногенным действием. Они широко используются в химиотерапии рака, и в большинстве своем являются либо метилирующими соединениями (например, темозоломид, стрептозотоцин) либо хлорэтилирующими (бифункциональными) агентами (например, кармустин, ломустин и фотемустин) [25]. Активность алкилирующих агентов определяется и модулируется способностью клетки репарировать поврежденную ДНК, поэтому выявление механизмов клеточного ответа на воздействие этих соединений очень важно.

SnI

н

n,1 Ich

l, « НСл ■ JCH N

H

I If -c " H

ДЦДНК

2%

6.3%

0.4%

Г2

„*C V-N N С 1 II CH

1 1

1 инк

9%

67%

I II CH HjN N j i ЦНК

0.8%

HN CH

I II «C„ ,CH o' N н

Sn2

17%

ДЦДНК

2%

Г*

С 7<-

НС^ЬС..

I

ПИК

0.3%

H,N

I 83% f 1 оцДНК 18% I

' t ь

i-^c-?, II сн * 1- NfC-CN, 1 II СН

1 ДНК 1 ЛНК

10%

fr-

Mi CM

13 (I

о M

I

пик

Репарирующие белки:

10%

0.6%

■ч»- гликозилазы

«■"•к- 06-алкилгуанин-ДНК- алкилтрансфераза N-Ada

Рис. 1. Алкилирование ДНК: основные мишени, процентное содержание алкильных аддуктов, типы алкилирования и ферменты репарации [53].

1.2. Защита клетки E.coli от алкилированных повреждений ДНК.

Адаптивный ответ

Все организмы — прокариоты, археи и эукариоты - обладают механизмами защиты клеток от токсических и генотоксических эффектов алкилирования [69]. Для борьбы с ДНК-алкилированными повреждениями в геноме живых систем в ходе эволюции сформировались гены, кодирующие белки со специфичными репарационными активностями, в зависимости от типа алкилированного ДНК-повреждения. Аналоги этих защитных систем обнаруживаются во всем живом мире, от бактерий до человека [22].

Основополагающие открытия при изучении этих защитных систем и механизмов репарации алкилированных повреждений ДНК были сделаны на бактериальной клетке, в частности Е. coli.

В E.coli системы защиты от алкилированных повреждений включают гены ogt и tag, экспрессирующиеся конститутивно, и ada, alkB, alkA и aidB, экспрессия которых индуцибельна и связана с развитием в клетке так называемого «адаптивного ответа» (АО). Феномен АО был впервые описан как высокоспецифичный ответ клеток E.coli на алкилирующие повреждения ДНК [21], и его открытие позволило выявить наличие комплексного многоэтапного механизма репарации алкилированных повреждений ДНК. Адаптивный ответ выражен в подавлении цитотоксического и мутагенного эффектов алкилирующих агентов при воздействии на клетки E.coli, предварительно обработанные сублетальными концентрациями алкилирующих соединений [21, 70].

Адаптивный ответ E.coli основан на усилении экспрессии 4-х генов: ada, alkA, alkB и aidB (Рисунок 2) [21]. Продукт гена ada является ключевым в развитии АО, поскольку представляет «первую линию защиты» алкилированной ДНК и включает две главные функции: репарацию главного потенциально-мутагенного повреждения — 06-метилгуанина; и позитивную транскрипционную

f

регуляцию AO. Многофункциональность белка обусловлена особенностями его структуры: в Ada-белке E.coli выделяют 2 независимых домена, каждый из которых обладает репарационной активностью. С-терминальный домен Ada (Ada-С) переносит алкильную группу с Об-МеГ или 04-МеТ на собственный цистеиновый остаток Cys321 в ходе необратимой, стойхиометрической реакции, в результате которой репарационный белок инактивируется («суицидная» реакция), а в ДНК восстанавливается нативная структура [71-73]. Таким образом, Ada-C функционирует как 06-алкил-ДНК-алкилтрансфераза. N-терминальный домен Ada (Ada-N), так же в ходе необратимой реакции, переносит метальную группу с метилированного фосфодиэфира в ДНК на собственный цистеиновый остаток Cys38 (ранее ошибочно принятый за Cys69 [74]). При метилировании Ada-N белок принимает такую конформационную форму, которая способна специфически связываться с промоторами генов ada, alkA, alkB и aidB - участников дальнейшей репарации алкилированных повреждений [73, 75, 76]. Как только Ada-N связывается с промотером, С-терминальный домен Ada взаимодействует с о70 субъединицей РНК-полимеразы, запуская транскрипционную активацию белка Ada в целом [77]. Необходимость взаимодействия meAda именно с о70 субъединицей РНК-полимеразы доказана экспериментально in vivo и in vitro снижением Ada-зависимой транскрипции при наличии мутаций, вызванных заменой нескольких аминокислот в С-терминальном домене а70 [78, 79]. Таким образом, функция транскрипционного регулятора реализуется Ada-белком избирательно при метилировании Cys38 в Ada-N-домене и последующей активации Ada-C-домена, независимо от метилированного состояния последнего. Именно этот процесс «транскрипционного усиления» генов Ada-регулона с последующей индукцией их белковых продуктов принято называть адаптивным ответом. Ранние исследования обнаружили также функцию Ada-белка в подавлении АО посредством регуляции собственного синтеза [80], т.е. Ada белок может выступать как позитивный и негативный регулятор АО одновременно. Тем не менее механизмы регуляции АО и природа индуцирующего АО сигнала не

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Стрельцова, Дарья Александровна, 2013 год

Список литературы

1. Kelner, A. Effect of visible light on the recovery of Streptomyces griseus conidia from ultraviolet irradiation injury / A. Kelner // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. - 1949. - V.35. - pp.7379.

2. Dulbecco, R. Reactivation of ultraviolet-inactivated bacteriophage with visible light / R. Dulbecco // Nature. - 1949. - V. 163. - pp.949-950.

3. Setlow, J.K. The wavelength-dependent fraction of biological damage due to thymine dimers and to other types of lesion in ultraviolet-irradiated DNA / J.K. Setlow // Photochem. Photobiol. - 1963. - V.2. - p.393.

4. Howard-Flanders, P. A genetic locus in E. coli K12 that controls the reactivation of UV-photoproducts associated with thymine in DNA / P. Howard-Flanders, R.P. Boyce, E. Simson, L. Theriot // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. - 1962. - V.48. -pp.2109-2115.

5. Setlow, R.B. The disappearance of thymine dimers from DNA: an error-correcting mechanism / R.B. Setlow, W.L. Carrier // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. - 1964. - V.51. - pp.226231.

6. Rasmussen, R.E. Evidence for repair of ultraviolet damaged deoxyribonucleic acid in cultured mammalian cells / R.E. Rasmussen, R.B. Painter // Nature. -1964. -V.203.-pp.l360-1362.

7. Friedberg, E.C. Endonucleolytic cleavage of UV-irradiated DNA controlled by the V+ gene in phage T4 / E.C. Friedberg, J.J. King // Biochim. Biophys. Res. Commun. - 1969. - V.37. -pp.646-651.

8. Kaplan, J.C. Enzymatic repair of DNA, 1. Purification of two enzymes involved in the excision of thymine dimers from ultraviolet-irradiated DNA / J.C. Kaplan, S.R. Kushner, L. Grossman // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. - 1969. - V. 63. -pp.144-151.

9. Yasuda, S. T4 endonuclease involved in repair of DNA / S. Yasuda, M. Sekiguchi // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. - 1970. -V.67. - pp. 1839-1845.

10. Lindahl, T. An N-glycosidase from Escherichia coli that releases free uracil from DNA containing deaminated cytosine residues / T. Lindahl // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. - 1974. - V.71. -pp.3649-3653.

11. Cleaver, J.E. Defective repair replication of DNA in xeroderma pigmentosum / J.E. Cleaver // Nature. - 1968. - V.218. - pp.652-656.

12. Setlow, R.B. Evidence that xeroderma pigmentosum cells do not perform the first step in the repair of ultraviolet damage to their DNA / R.B. Setlow, J.D. Regan, J. German, W.L. Carrier // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States ofAmerica. - 1969. - V.64. -pp.1035-1041.

13. Rupp, W.D. Discontinuities in the DNA synthesized in an excision-defective strain of Escherichia coli following ultraviolet irradiation / W.D. Rupp, P. Howard-Flanders // J. Mol. Biol. - 1968. - V.31. - №2. - pp.291-304.

14. Radman, M. Phenomenology of an inducible mutagenic DNA repair pathway in E. coli: SOS repair hypothesis. // In: Prakash, L., Sherman, F., Miller, M.W., Lawrence, C.W. and Taber, H.W., eds. Molecular and environmental aspects of mutagenesis, (6th Rochester Conf. on Environemental Toxicity, 1973). -Springfield, Illinois: C.C. Thomas Publ, 1974. - pp. 128-142.

15. Friedberg, E.C. DNA Repair and Mutagenesis / E.C. Friedberg, G.C. Walker, W. Siede, R.D. Wood, R.A. Schultz, T. Ellenberger. - Washington, DC: ASM Press, 2005.

16. Рапопорт, И.А. Карбонильные соединения и химический механизм мутаций / И.А. Рапопорт // Доклады Академии наук СССР. - 1946. - Т.54. - №1. - С. 65.

17. Auerbach, С. Chemical Production of Mutations / С. Auerbach, J.M. Robson // Nature. - 1946.-V. 157.-P. 302.

18. Рапопорт, И.А. 85% мутаций в половой хромосоме под влиянием N-нитрозоэтилмочевины / И.А. Рапопорт // Доклады Академии наук СССР. -1962. - Т.146. - №6. - С. 1418-1420.

19. Островская, JI.A. Противоопухолевое действие производных нитрозомочевины в эксперименте / JI.A. Островская, JI.M. Дронова, Е.М. Вермель // Материалы конференции по вопросам лекарственной терапии в онкологической клинике. - JL, 1964. - С. 119.

20. Эмануэль, Н.М. Нитрозоалкилмочевины - новый класс противоопухолевых препаратов / Н.М. Эмануэль, Д.Б. Корман, Л.А. Островская, Л.В. Горбачева, Н.П. Дементьева. - М.: Наука, 1978. - С. 295.

21. Samson, L. A new pathway for DNA repair in Escherichia coli / L. Samson, J. Cairns //Nature. - 1977. - V.267. - pp. 281-283.

22. Sedgwick, B. Recent progress on the Ada response for inducible repair of DNA alkylation damage / B. Sedgwick, T. Lindahl // Oncogene. - 2002. - V.21. - pp. 8886-8894.

23.Volkert, M.R. Adaptive response of Escherichia coli to alkylation damage / M.R. Volkert // Environ. Mol. Mutagen. - 1988. - V.l 1. - № 2. - pp. 241-55.

24. Landini, R Regulatory Responses of the Adaptive Response to Alkylation Damage: a Simple Regulon with Complex Regulatory Features / R Landini, M.R. Volkert // J. Bacteriol. - 2000. - V.l82. - № 23. - pp. 6543-6549.

25. Drablos, F. Alkylation damage in DNA and RNA—repair mechanisms and medical significance / F. Drablos, E. Feyzi, RA. Aas, C.B. Vaagbo, B. Kavli, M.S. Bratlie, J. Pena-Diaz, M. Otterlei, G. Slupphaug, H.E. Krokan. // DNA Repair. -2004.-V3.-pp. 1389-1407.

26. O'Brien, P.J. The Escherichia coli 3-methyladenine DNA glycosylase AlkA has a remarkably versatile active site / P.J. O'Brien, T. Ellenberger // J. Biol. Chem. -2004. - V. 279. - pp. 26876-26884.

27. Volkert, M.R. Induction of the alkylation-inducible aidB gene of Escherichia coli by anaerobiosis / M.R. Volkert, L.I. Hajec, D.C. Nguyen // J. Bacteriol. - 1989. -V. 171.- №2.-pp.1196-1198.

28. Volkert, M.R. Induction of the Escherichia coli aidB gene under oxygen-limiting conditions requires a functional rpoS (katF) gene / M.R. Volkert, L.I. Hajec, Z. Matijasevic, F.C. Fang, R. Prince // J. Bacteriol. - 1994. - V. 176. - № 24. - pp. 7638-7645.

29. Taverna, P. Generation of an endogenous DNA-methylating agent by nitrosation in Escherichia coli / P. Taverna, B. Sedgwick // J. Bacteriol. - 1996. - V. 178. — pp.5105-5111.

30. Landini, P. Structure and transcriptional regulation of the Escherichia coli adaptive response gene aidB / P. Landini, L.I. Hajec, M.R. Volkert // J. Bacteriol. - 1994. - V. 176. - pp.6583-6589.

31. Васильева, C.B. Новое явление квази - адаптивного ответа к алкилирующим агентам в Escherichia coli / C.B. Васильева, Е.Ю. Мошковская // Генетика. - 2005. - Т. 41. - №5. - С. 1-7.

32. Crack, J.C. Superoxide-mediated amplification of the oxygen-induced switch from [4Fe-4S] to [2Fe-2S] clusters in the transcriptional regulator FNR / J.C. Crack, J. Green, M.R. Cheesman, N.E. Le Brun, A.J. Thomson // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. - 2007. - V. 104. - № 7. - pp. 2092-2097.

33. Corker, H. Nitric oxide formation by Escherichia coli. Dependence on nitrite reductase, the NO-sensing regulator Fnr, and flavohemoglobin Hmp / H. Corker, R.K. Poole // J. Biol. Chem. - 2003. - V. 278. - № 34. - pp. 31584-92.

34. Vaughan, P. Induction of the adaptive response of Escherichia coli to alkylation damage by the environmental mutagen, methyl chloride / P. Vaughan, T. Lindahl, B. Sedgwick // Mutat. Res. - 1993. - V.293. - pp.249-257.

35. Rebeck, G.W. Increased spontaneous mutation and alkylation sensitivity of Escherichia coli strains lacking the ogt 06-methylguanine DNA repair methyltransferase / G.W. Rebeck, L.D. Samson // J. Bacteriol. - 1991. - V.173. -pp.2068-2076.

36. Razin, A. DNA methylation and gene expression / A. Razin, H. Cedar // Microbiol. Rev. - 1991. - V.55. -№3. -pp.451-8.

37. Phillips, T. The role of methylation in gene expression / T. Phillips // Nature Education. - 2008. - V.l. -№1.

38. Aletta, J.M. Protein methylation: a signal event in post-translational modification / J.M. Aletta, T.R. Cimato, M.J. Ettinger // Trends. Biochem. Sei. - 1998. - V.23. -№3. - pp. 89-91.

39. Walsh, С. Posttranslational modification of proteins :Expanding nature's inventory

/ C. Walsh // Englewood, Colo.: Roberts and Co. Publishers. - 2006. - pp. 490.

40. Motorin, Y. RNA nucleotide methylation / Y. Motorin, M. Helm // Wiley Interdiscip. Rev. RNA. - 2011.-V.2.-№5.-pp.611-31.

41. Wilson, G. Organization of Restriction-Modification Systems / G. Wilson // Nucleic Acids Research. - 1991. -V. 19. -pp.2539-2566.

42. Posnick, L.M. Imbalanced base excision repair increases spontaneous mutation and alkylation sensitivity in Escherichia coli / L.M. Posnick, L.D. Samson // J. Bacteriol. - 1999. - V. 181. - pp.6763-6771.

43. Lutz, W.K. Endogenous genotoxic agents and processes as a basis of spontaneous carcinogenesis / W.K. Lutz // Mutat. Res. - 1990. - V. 238. - pp. 287-295.

44. Harrison, K.L. Detection of concomitant formation of 06-carboxymethyl- and 06-methyl-2'-deoxyguanosine in DNA exposed to nitrosated glycine derivatives using a combined immunoaffmity/HPLC method / K.L. Harrison, R. Jukes, D.P. Cooper, D.E. Shuker // Chem. Res. Toxicol. - 1999. - V.12. -pp.106-111.

45. Sedgwick, B. Nitrosated peptides and polyamines as endogenous mutagens in 06-alkylguanine-DNA alkyltransferase deficient cells / B. Sedgwick // Carcinogenesis. - 1997. -V.l8. - pp.1561-1567.

46. Корман, Д.Б. Основы противоопухолевой химиотерапии / Д.Б. Корманю -М.: Практическая медицина, 2006. - 512 с.

47. Cole, R.S. Repair of DNA containing interstrand crosslinks in Escherichia coli: sequential excision and recombination / R.S. Cole // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. - 1973. - Y.70. -

pp.1064-1068.

48. Dronkert, M.L. Repair of DNA interstrand cross-links / M.L. Dronkert, R. Kanaar // Mutat. Res. - 2001. - V.486. - pp.217-247.

49. Van Houten, B. Repair of N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine-induced DNA damage by ABC excinuclease / B. Van Houten, A. Sancar // J. Bacteriol. - 1987. - V.169. -№2. - pp. 540-545.

50. Lawley, P.D. DNA adducts from chemotherapeutic agents / RD. Lawley, D.H. Phillips//Mutat. Res. - 1996,- V.355.-pp. 13-40.

51. Lawley, P.D. Reaction products from N-methyl-N-nitrosourea and deoxyribonucleic acid containing thymidine residues. Synthesis and identification of a new methylation product, 04-methyl-thymidine / P.D. Lawley, D.J. Orr, S.A. Shah, P.B. Farmer, M. Jarman // Biochem. J. - 1973. - V.135. - pp.193-201.

52. Wyatt, M.D. Methylating agents and DNA repair responses: methylated bases and sources of strand breaks / M.D. Wyatt, D.L. Pittman // Chem. Res. Toxicol. -2008.-V. 19. -№12. -pp. 1580-1594.

53. Beranek, D.T. Distribution of methyl and ethyl adducts following alkylation with monofunctional alkylating agents/ D.T. Beranek // Mutat. Res. - 1990. - V.231. -№1.-pp. 11-30.

54. Goldmacher, V.S. Isolation and partial characterization of human cell mutants differing in sensitivity to killing and mutation by methylnitrosourea and N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine / V.S. Goldmacher, R.A. Cuzick, W.G. Thilly // J. Biol. Chem. - 1986. - V.261. - pp. 12462-12471.

55. Ross, W. Alkylating agents. In: Biological alkylating agents / W. Ross. -London: Butterworths, 1962: Chapter 3.

56. Larson, K. Methylation-induced blocks to in vitro DNA replication / K. Larson, J. Sahm, R. Shenkar, B. Strauss // Mutat. Res. - 1985. -V. 150. - pp.77-84.

57. Engelward, B.R A chemical and genetic approach together define the biological consequences of 3-methyladenine lesions in the mammalian genome / B.R Engelward, J.M. Allan, J.A. Dreslin, J.D. Kelly, B. Gold, L.D. Samson // J. Biol. Chem. - 1998. - V.273. -pp.5412-5418.

58. Fronza, G., The biological effects of N3-methyladenine / G. Fronza, B. Gold // J. Cell. Biochem. - 2004. - V.91. - pp.250-257.

59. Doublie, S. Crystal structure of a bacteriophage T7 DNA replication complex at 2.2 A resolution / S. Doublie, S. Tabor, A.M. Long, C.C. Richardson, T. Ellenberger//Nature. - 1998. -V.391. - pp.251-258.

60. Safihill, R. Mechanisms of carcinogenesis induced by alkylating agents / R. Saffhill, G.P. Margison, P.J. O'Connor // Biochim. Biophys. Acta. 1985. - V.823. -pp. 111-145.

61. Loveless, A. Possible relevance of 0-6 alkylation of deoxyguanosine to the mutagenicity and carcinogenicity of nitrosamines and nitrosamides / A. Loveless // Nature. - 1969. - V.223. - pp.206-207.

62. Loechler, E.L. In vivo mutagenesis by 06-methylguanine built into a unique site in a viral genome / E.L. Loechler, C.L. Green, J.M. Essigmann // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. - 1984. -V.81. -pp.6271-6275.

63. Stojic, L. Mismatch repair-dependent G2 checkpoint induced by low doses of SN1 type methylating agents requires the ATR kinase / L. Stojic, N. Mojas, P. Cejka, M. Di Pietro, S. Ferrari, G. Marra, J. Jiricny // Genes Dev. - 2004. - V.18. -pp.1331—1344.

64. Snow, E.T. Base-pairing properties of 06-methylguanine in template DNA during in vitro DNA replication / E.T. Snow, R.S. Foote, S. Mitra // J. Biol. Chem. - 1984. - V.259. - pp.8095-8100.

65. York, S.J. Mismatch repair-dependent iterative excision at irreparable 06-methylguanine lesions in human nuclear extracts / S.J. York, P. Modrich // J. Biol. Chem. - 2006. - V.281. - pp.22674-22683.

66. Shrivastav, N. Chemical biology of mutagenesis and DNA repair: cellular responses to DNA alkylation / N. Shrivastav, D. Li, J.M. Essigmann // Carcinogenesis. - 2010. - V.31. - №1. - pp. 59-70.

67. Dinglay, S. Defective processing of methylated single-stranded DNA by E. coli AlkB mutants / S. Dinglay, S.C. Trewick, T. Lindahl, B. Sedgwick // Genes. Dev. - 2000. - V.14. - pp.2097-2105.

68. Delaney, J.C. Mutagenesis, genotoxicity, and repair of 1-methyladenine, 3-alkylcytosines, 1-methylguanine, and 3-methylthymine in alkB Escherichia coli / J.C. Delaney, J.M. Essigmann // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. - 2004. - V.101. - pp. 14051-14056.

69. Daniels, D.S. Conserved structural motifs governing the stoichiometric repair of alkylated DNA by 06-alkylguanine-DNA alkyltransferase / D.S. Daniels, J.A. Tainer // Mutation Res. - 2000. - V.460. - pp. 151-163.

70. Jeggo, R An adaptive response of.E. coli to low levels of alkylating agent: comparison with previously characterized DNA repair pathways / P. Jeggo, M. Defais, L. Samson, P. Schendel //Mol. Gen. Genet. - 1977. -V. 157. - P. 1.

71. Demple, B. Active-site and complete sequence of the suicidal methyltransferase that counters alkylation mutagenesis / B. Demple, B. Sedgwick, P. Robins, N. Totty, M.D. Waterfield, T. Lindahl // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. - 1985. - V.82. -pp.2688-2692.

72. Moore, M.H. Crystal structure of a suicidal DNA repair protein: the Ada O'-methylguaninc-DNA methyltransferase from E. coli / M.H. Moore, J.M. Gulbus, E.J. Dodson, B. Demple, P.C. Moody // EMBO J. - 1994. - V. 13. - pp. 14951501.

73. Verdemato, P. E. DNA-binding mechanism of the Escherichia coli Ada O6-alkylguanine-DNA alkyltransferase / P.E. Verdemato, J.A. Brannigan, C. Damblon, F. Zuccotto, P. Moody, L.-Y. Lian // Nucleic Acids Res. - 2000. - V.28. -№19.-pp. 3710-3718.

74. Sedgwick, B. Functional domains and methyl acceptor sites of the Escherichia coli Ada protein / B. Sedgwick, P. Robins, N. Totty, T. Lindahl // J. Biol. Chem. -1988.-V.263.-pp. 4430-4433.

75. Teo, I. The intracellular signal for induction of resistance to alkylating agents in E. coli /1. Teo, B. Sedgwick, M.W. Kilpatrick, T.V. McCarthy, T. Lindahl // Cell. - 1986.-V.45.-pp.315-24.

76. Nakamura, T. Expression of the ada gene of Escherichia coli in response to alkylating agents / T. Nakamura, Y. Tokumoto, K. Sakumi, G. Koike, Y. Nakabeppu, M. Sekiguchi // J. Mol. Biol. - 1988. - V.202. - pp.483-49.

77. Saget, B.M. The Ada protein acts as both a positive and a negative modulator of Escherichia coli's response to methylating agents / B.M. Saget, G.C. Walker // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. - 1994. - V.91. -pp.9730-9734.

78. Landini, P. Ada protein-RNA polymerase sigma subunit interaction and alpha subunit promoter DNA interaction are necessary at different steps in transcription initiation at the Escherichia coli ada and aidB promoters / P. Landini, J.A. Bown, M.R. Volkert, S.J.W. Busby//J. Biol. Chem. - 1998. - V.273. -pp.13307-13312.

79. Landini, P. The Escherichia coli Ada protein can interact with two distinct determinants in the q10 subunit of RNA polymerase according to promoter architecture: identification of the target of Ada activation at the alkA promoter / P. Landini, S.J.W. Busby // J. Bacteriol. - 1999. - V.181. - pp. 1524-1529.

80. Nakabeppu, Y. Regulatory mechanisms for induction of synthesis of repair enzymes in response to alkylating agents: ada protein acts as a transcriptional regulator / Y. Nakabeppu, M. Sekiguchi // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. - 1986. - V.83. -pp.6297-301.

81. Potter, P.M. Characterization and nucleotide sequence of ogt, the O6-alkylguanine-DNA-alkyltransferase gene of E. coli / P.M. Potter, M.C. Wilkinson, J. Fitton, F.J. Carr, J. Brennand, D.P. Cooper, G.P. Margison // Nucleic Acids Res. - 1987.-V. 15.-pp.9177-9193.

82. Margison, G.P. Alkyltransferase-like proteins / G.P. Margison, A. Butt, S.J. Pearson, S. Wharton, A.J. Watson, A. Marriott, C.M. Caetano, J.J. Hollins, N. Rukazenkova, G. Begum // DNA Repair (Amst). - 2007. - V.6. - pp. 1222-1228.

83. Glassner, B.J. DNA repair methyltransferase (Mgmt) knockout mice are sensitive to the lethal effects of chemotherapeutic alkylating agents / B.J. Glassner, G. Weeda, J.M. Allan, J.L. Broekhof, N.H. Carls, I. Donker, B.P. Engelward, R.J. Hampson, R. Hersmus, M.J. Hickman, R.B. Roth, H.B. Warren, M.M. Wu, J.H. Hoeijmakers, L.D. Samson // Mutagenesis. - 1999. - V.14. -pp.339-347.

84. Pegg, A.E. Repair of 0(6)-alkylguanine by alkyltransferases / A.E. Pegg // Mutat. Res. - 2000. - V.462. - pp.83-100.

85. Pegg, A.E. Multifaceted Roles of Alkyltransferase and Related Proteins In DNA Repair, DNA Damage, Resistance to Chemotherapy and Research Tools / A.E. Pegg // Chem. Res. Toxicol. - 2011. - V.24. - №5. - pp.618-639.

86. Aravind, L. The DNA-repair protein AlkB, EGL-9, and leprecan define new families of 2-oxoglutarate- and iron-dependent dioxygenases / L. Aravind, E.V. Koonin // Genome Biol. - 2001. - V.2. - №3: RESEARCH0007.

87. Trewick, S.C. Oxidative demethylation by Escherichia coli AlkB directly reverts DNA base damage / S.C. Trewick, T.F. Henshaw, R.P. Hausinger, T. Lindahl, B. Sedgwick//Nature. -2002. -V.419. -pp.174-178.

88. Falnes, P. Repair of 3-methylthymine and 1-methylguanine lesions by bacterial and human AlkB proteins / P. Falnes // Nucleic Acids Res. - 2004. - V.32. - №21. -pp. 6260-6267.

89. Chen, J.B. The Escherichia coli AlkB protein protects human cells against alkylation-induced toxicity / J.B. Chen, P. Caroll, L. Samson // J. Bacteriol. -1994.-V. 176.-pp.6255-6261.

90. Kataoka, H. A new gene (alkB) of Escherichia coli that controls sensitivity to methyl methane sulfonate / H. Kataoka, Y. Yamamoto, M. Sekiguchi // J. Bacteriol. - 1983. -V. 153. - pp. 1301-1307.

91. Volkert, M.R. Molecular analysis of the aidD6::MudI(bla lac) fusion mutation of Escherichia coli / M.R. Volkert, L.I. Hajec // Mol. Gen. Genet. -1991.-V.229.-pp.319-323.

92. Berdal, K.G. Release of normal bases from intact DNA by a native DNA repair enzyme / K.G. Berdal, R.F. Johansen, E. Seeberg // The EMBO Journal. -1998.-V.17.-pp. 363 — 367.

93. Rohankhedkar, M.S. The AidB component of the Escherichia coli adaptive response to alkylating agents is a flavin-containing, DNA-binding protein / M.S. Rohankhedkar, S.B. Mulrooney, W.J. Wedemeyer, R.R Hausinger // J. Bacteriol. - 2006. - V. 188. - pp.223-230.

94. Смирнова, Г.В. Влияние pH на экспрессию гена сеа у облученных УФ-светом и необлученных клеток Escherichia coli / Г.В. Смирнова, О.Н. Октябрьский // Генетика. - 1998. - Т. 34. - № 11. - С. 1480-1483.

95. Volkert, M.R. Induction of specific Escherichia coli genes by sublethal treatments with alkylating agents / M.R. Volkert, D.C. Nguyen // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. - 1984. -V.81. -№13. -pp.4110-4114.

96. Fram, R.J. Gene expression in E. coli after treatment with streptozotocin / R.J. Fram, M.G. Marinus, M.R. Volkert // Mutat. Res. - 1988. - V.198. - №1. -pp.45-51.

97. Lange, R. Identification of a central regulator of stationary-phase gene expression in Escherichia coli / R. Lange, R. Hengge-Aronis // Mol. Microbiol. -1991. - V.5. -pp.49-59.

98. Manchado, M. In vivo transcription of the Escherichia coli oxyR regulon as a function of growth phase and in response to oxidative stress / M. Manchado, G. Dorado, C. Pueyo // J. Bacteriol. - 1999. - V. 181. - pp.2759-2764.

99. Bordes, P. Involvement of differential efficiency of transcription by E<;S and Eq70 RNA polymerase holoenzymes in growth phase regulation of the Escherichia coli osmE promoter / P. Bordes, F. Repoila, A. Kolb, C. Gutierrez // Mol. Microbiol. - 2000. - V.35. - pp.845-853.

100. Lobysheva, I.I. Induction of the SOS DNA repair response in Escherichia coli by nitric oxide donating agents: dinitrosyl iron complexes with thiol-containing ligands and S-nitrosothiols / I.I. Lobysheva, M.V. Stupakova, V.D. Mikoyan, S.V. Vasilieva, A.F. Vanin // FEBS Lett. - 1999. - V.454. - №3. -pp. 177-80.

101. Ding, H. Direct nitric oxide signal transduction via nitrosylation of iron-sulfur centers in the SoxR transcription activator / H. Ding, B. Demple // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. -2000. -V.97. - pp.5146-5150.

102. Васильева, C.B. Траисдукция оксидом азота сигнала резистентности биосистем к стрессам / С.В. Васильева // Сборник трудов. - Пущино: Изд-во Пущинского научного центра. 2007. - с. 171-174.

103. Ignarro, L.J. Nitric oxide as a unique signaling molecule in the vascular system: a historical overview / L.J. Ignarro // J. Physiol. Pharmacol. - 2002. - V. 53.-pp. 503-514.

104. Moncada, S. Nitric oxide: physiology, pathophysiology, and pharmacology / S. Moncada, R.M.S. Palmer, E.A. Higgs // Pharmacol. Rev. -1991. -V. 43.-pp. 109-142.

105. Ignarro, L.J. Nitric oxide: biology and pathobiology / L.J. Ignarro. - San Diego: Academic Press, 2000.

106. van Faassen, E. E. Radicals for life: The various forms of Nitric Oxide / E.E. van Faassen, A.F. Vanin. - Amsterdam: Elsevier, 2007.

107. Граник, В.Г. Оксид азота (NO). Новый путь к поиску лекарств / В.Г. Граник, Н.Б. Григорьев. - М.: Вузовская книга, 2004. - 360 с.

108. Robinson, J.L. A Kinetic Platform to Determine the Fate of Nitric Oxide in Escherichia coli / J.L. Robinson, M.P. Brynildsen // PLoS Comput. Biol. - 2013. - V.9. -№5: el003049.

109. Reiter, T.A. NO* chemistry: a diversity of targets in the cell / T.A. Reiter // Redox Rep. - 2006. - V.ll. - pp. 194-206.

110. Vanin, A.F. Dinitrosyl iron complexes with thiolate ligands: Physico-chemistry, biochemistry and physiology / A.F. Vanin // Nitric Oxide. - 2009. -V21.-pp.l-13.

111. Ванин, А.Ф. Свободные радикалы нового типа в дрожжевых клетках / А.Ф. Ванин, P.M. Налбандян // Биофизика. - 1965. - Т.15. - С.167-168.

112. Reddy, Е. Nitrite inhibition of Clostridium botulinum: electron spin resonance detection of iron-nitric oxide complexes / E. Reddy, J.R. Lancaster, D.P. Cornforth// Science. - 1983. -V. 221. -№4612. - pp. 769-770.

113. Lancaster, J.R. EPR demonstration of iron-nitrosyl complex formation by cytotoxic activated macrophages / J.R. Lancaster, J.B. Jr. Hibbs // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. - 1990. -V.87.-pp. 1223-1227.

114. Drapier, J.C. Generation of EPR-detectable nitrosyl-iron complexes in tumor target cells cocultured with activated macrophages / J.C. Drapier, C. Pellat, Y. Henry // J. Biol. Chem. - 1991. - V.266. - pp. 10162-10167.

115. Васильева, C.B. Квази-адаитация к алкилирующим агентам E.coli и функции белка Ada / C.B. Васильева, Е.Ю. Мошковская // Генетика. - 2008. -Т.43. — №1. - С.1- 6.

116. Фролов, Е.Н. Новый тип парамагнитных нитрозильных комплексов негемового железа / Е.Н. Фролов, А.Ф. Ванин // Биофизика. - 1973. - Т. 18. -С.605-610.

117. Nunoshiba, Т. Negative autoregulation by the Escherichia coli SoxS protein: a dampening mechanism for the soxRS redox stress response / T. Nunoshiba, E. Hidalgo, Z.-W. Li, B. Demple // J.Bacteriol. - 1993. - V. 175. -pp.7492-7494.

118. Васильева, C.B. Активация SoxRS-регулона в E.coli оксидом азота и его физиологическими донорами / С.В. Васильева, М.В. Ступакова, И.И. Лобышева, В.Д. Микоян, А.Ф. Ванин // Биохимия. - 2001. - Т.66. - №6. -С.1209-1214.

119. Pullan, S. Т. Nitric oxide in chemostat-cultured Escherichia coli is sensed by Fnr and other global regulators: unaltered methionine biosynthesis indicates lack of S-nitrosation / S.T. Pullan, M.D. Gidley, R.A. Jones, J. Barrett, T.A. Stevanin, R.C. Read, J. Green, R.K. Poole // J. Bacteriol. - 2007. - V.189. - pp. 1845-1855.

120. Landry, A.P. Iron-sulfur proteins are the major source of protein-bound dinitrosyl iron complexes formed in Escherichia coli cells under nitric oxide stress / A.P. Landry, X. Duan, H. Huang, H. Ding // Free Radie. Biol. Med. -2011. - V.50. - №11. - pp. 1582-90.

121. Poole, R.K. Nitric oxide, nitrite, and Fnr regulation of hmp (flavohemoglobin) gene expression in Escherichia coli K-12 / R.K. Poole, M.F. Anjum, J. Membrillo-Hernández, S.O. Kim, M.N. Hughes, V. Stewart // J. Bacteriol. - 1996. - V.178. -№18. -pp.5487-92.

122. Unden, G. Alternative respiratory pathways of Escherichia coli: Energetics and transcriptional regulation in response to electron acceptors / G. Unden, J. Bongaerts // Biochim. Biophys. Acta. - 1997. -V. 1320. - pp. 217-234.

123. Korner, H. Phylogeny of the bacterial superfamily of Crp-Fnr transcription regulators: exploiting the metabolic spectrum by controlling alternative gene programs / H. Korner, H.J. Sofia, W.G. Zumft // FEMS Microbiol. Rev. - 2003. -V.27. - pp. 559-592.

124. Dufour, Y.S. Reconstruction of the core and ex- tended regulons of global transcription factors / Y.S. Dufour, PJ. Kiley, T.J. Donohue // PLoS Genetics. -2010. -V.6. - el001027.

125. Green, J. Characterization of the FNR protein of Escherichia coli, an iron binding transcriptional regulator / J. Green, M. Trageser, S. Six, G. Unden, J.R. Guest // Proc. Biol. Soc. - 1991. - V.244. - pp. 137-144.

126. Spiro, S. The FNR family of transcriptional regulators / S. Spiro // Antonie van Leeuwenhoek. - 1994. - V.66. -pp.23-36.

127. Schultz, S.C. Crystal-structure of a CAP-DNA complex - the DNA is bent by 90° / S.C. Schultz, G.C. Shields, T.A. Steitz // Science. - 1991. - V.253. -pp.1001-1007.

128. Green, J. Bacterial redox sensors / J. Green, M.S. Paget // Nat. Rev. Microbiol. - 2004. - V.2. - pp.954-966.

129. Kang, Y.S. Genome-wide expression analysis indicates that FNR of Escherichia coli K- 12 regulates a large number of genes of unknown function / Y.S. Kang, K.D. Weber, Q. Yu, P.J. Kiley, F.R. Blattner // J. Bacteriol. - 2005. -V.187. — pp.1135-1160.

130. Constantinidou, C. A reassessment of the FNR regulon and transcriptomic analysis of the effects of nitrate, nitrite, NarXL, and NarQP as Escherichia coli K12 adapts from aerobic to anaerobic growth / C. Constantinidou, J.L. Hobman, L. Griffiths, M.D. Patel, C.W. Penn, J.A. Cole, T.W. Overton // J. Biol. Chem. -2006. - V.281. -pp.4802-4815.

131. Grainger, D.C. Transcription factor distribution in Escherichia coli: studies with FNR protein / D.C. Grainger, H. Aiba, D. Hurd, D.F. Browning, S.J.W. Busby // Nucleic Acids Res. - 2007. - V.35. - pp.269-278.

132. Shaw, D.J. Nucleotide sequence of the Fnr gene and primary structure of the Fnr protein of Escherichia coli / D.J. Shaw, J.R. Guest // Nucleic Acids Res. -1982.-V. 10.-pp. 6119-6130.

133. Spiro, S. Interconversion of the DNA-binding specificities of two related transcription regulators, CRP and FNR / S. Spiro, K.L. Gaston, A.I. Bell, R.E. Roberts, S.J. Busby, J.R. Guest // Mol. Microbiol. - 1990. - V.4. - №11. -pp.1831-1838.

134. Sharrocks, A.D. In vivo and in vitro mutants of FNR the anaerobic transcriptional regulator of Escherichia coli / A.D. Sharrocks, J. Green, J.R. Guest // FEBS Lett. - 1990. - V.270. - pp.119-122.

135. Melville, S. Isolation of an oxygen sensitive FNR protein of Escherichia coli: interaction at activator and repressor sites of FNR controlled genes / S. Melville, R.R Gunsalus // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. - 1996. - V.93. - pp. 1226-1231.

136. Kiley, P.J. Oxygen sensing by the global regulator, FNR: the role of the iron-sulfur cluster / P.J. Kiley, H. Beinert // FEMS Microbiol. Rev. - 1999. -V.22. - pp. 341-352.

137. Lazazzera, B.A. DNA binding and dimerization of the Fe-S-containing FNR protein from Escherichia coli are regulated by oxygen / B.A. Lazazzera, H. Beinert, N. Khoroshilova, M.C. Kennedy, P.J. Kiley // J. Biol. Chem. - 1999. -V.271. - pp.2762-2768.

138. Dibden, D. P. In vivo cycling of the Escherichia colitranscription factor FNR between active and inactive states / D.P. Dibden, J. Green // Microbiology. -2005. - V. 151. - pp. 4063-4070.

139. Crack, J.J. Mechanism of oxygen sensing by the bacterial transcription factor fumarate-nitrate reduction (FNR) / J.J. Crack, J. Green, A.J. Thompson // J. Biol. Chem. -2004. -V.279. -pp.9278-9286.

140. Khoroshilova, N. Association of a polynuclear iron-sulfur center with a mutant FNR protein enhances DNA binding / N. Khoroshilova, H. Beinert, P.J. Kiley // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. - 1995. - V.92. -pp.2499-2503.

141. Sutton, V.R. Kinetic analysis of the oxidative conversion of the [4Fe-4S]2+ cluster of FNR to a [2Fe-2S]2+cluster / V.R. Sutton, E.L. Mettert, H. Beinert, P.J. Kiley // J. Bacteriol. - 2004. - V. 186. - №23. - pp.8018-25.

142. Crack, J.C. Reactions of nitric oxide and oxygen with the regulator of fumarate and nitrate reduction, a global transcriptional regulator, during anaerobic growth of Escherichia coli / J.C. Crack, N.E. Le Brun, A.J. Thomson, J. Green, A.J. Jervis // Methods Enzymol. - 2008. - V.437. - pp.191-209.

143. Crack, J.C. Detection of sulfide release from the oxygen-sensing [4Fe-4S] cluster of FNR / J.C. Crack, J. Green, N.E. Le Brun, A.J. Thomson // J. Biol. Chem. - 2006. - V.281. - № 28. - pp. 18909-13.

144. Green, J. Bacterial sensors of oxygen / J. Green, J.C. Crack, A.J. Thomson, N.E. LeBrun// Curr. Opin. Microbiol. -2009. - V. 12. - №2. - pp. 145-51.

145. Tolla, D.A. Regulation of aerobic-to-anaerobic transitions by the FNR cycle in Escherichia coli / D.A. Tolla, M.A. Savageau // J. Mol. Biol. - 2010. -V.397. - pp.893-905.

146. Malkin, R. The reconstitution of clostridial ferredoxin / R. Malkin, J.C. Rabinowitz // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 1966. - V.23. - №6. -pp.822-827.

147. Kampfenkel, K. Extraction and determination of ascorbate and dehydroascorbate from plant tissue / K. Kampfenkel, M. Van Montagu, D. Inze // Anal. Biochem. - 1995. - V.225. - pp. 165-167.

148. Dean, D.R. Nitrogenase metalloclusters: structures, organization, and synthesis / D.R. Dean, J.T. Bolin, L. Zheng // J. Bacteriol. - 1993. - V. 175. -№21. -pp.6737-44.

149. Zheng, L. Catalytic formation of a nitrogenase iron-sulfur cluster / L. Zheng, D.R. Dean // J. Biol. Chem. - 1994. - V.269. - pp. 18723-18726.

150. Takahashi, Y. Functional assignment of the ORF2-iscS-iscU-iscA-hscBhscA-fdx-ORF3 gene cluster involved in the assembly of Fe-S clusters in Escherichia coli / Y. Takahashi, M. Nakamura // J. Biochem. - 1999. - V.126. -pp.917-926.

151. Outten, F.W. A suf operon requirement for Fe-S cluster assembly during iron starvation in Escherichia coli / F.W. Outten, O. Djaman, G. Storz // Mol. Microbiol. - 2004. - V.52. - №3. - pp.861-72.

152. Tan, G. IscA/SufA paralogues are required for the [4Fe-4S] cluster assembly in enzymes of multiple physiological pathways in Escherichia coli under aerobic growth conditions / G. Tan, J. Lu, J.R Bitoun, H. Huang, H. Ding // Biochem. J. - 2009. - V. 420. - pp. 463-472.

153. Quillardet, R The screening, diagnosis and evaluation of genotoxic agents with batteries of bacterial tests / R Quillardet, M. Hofnung // Mut. Res. - 1988. -V. 205. -pp.107-118.

154. Васильева, С. В. Экспрессия и функции генов адаптивного ответа в Escherichiacoli при действии моно- и бифункциональных алкилирующих агентов. Интерференция с SOS-ответом / С.В. Васильева, Е.В. Махова, Е.Ю. Мошковская // Генетика. - 1999. - Т.35. - № 4. - С.444-449.

155. Miller, J.H. Experiments in Molecular Genetics / J.H. Miller. - Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory, 1972. - pp. 352-355.

156. Roudneva, T.N. Synthesis and structure of water-soluble nitrosyl iron complex with cysteamine ligand / T.N. Roudneva, N.A. Sanina, K.A. Lyssenko, S.M. Aldoshin, M.Y. Antipin, N.S. Ovanesyan // Mendeleev Communications. -2009. - V.19. -pp.253-255.

157. Severina, I.S. Activation of soluble guanylate cyclase by NO donors: S-nitrosothiols, and dinitrosyl-iron complexes with thiol-containing ligands / I.S. Severina, O.G. Bussygina, N.V. Pyatakova, I.V. Malenkova, A.R Vanin // Nitric Oxide Biol.Chem. - 2003. - V.8. - pp. 155-163.

158. Васильева, C.B. Белок Fnr - [4Fe-4S]2+ - регулятор экспрессии гена aidB Escherichia coli при анаэробном культивировании / C.B. Васильева, Д.А. Стрельцова, Е.Ю. Мошковская, Н.А. Санина, С.М. Алдошин // Доклады Академии наук. - 2010. - Т. 433. - № 3. - С. 1-4.

159. Ayala-Castro, С. Fe-S cluster assembly pathways in bacteria / C. Ayala-Castro, A. Saini, F.W. Outten // Microbiol. Mol. Biol. Rev. - 2008. - V. 72. - № 1.-pp. 110-25.

160. Smith, A.D. Sulfur transfer from IscS to IscU: the first step in iron-sulfur cluster biosynthesis / A.D. Smith, J.N. Agar, K.A. Johnson, J. Frazzon, I.J. Amster, D.R. Dean, M.K. Johnson // J. Am. Chem. Soc. - 2001. - V.123. -pp. 11103-11104.

161. Васильева, C.B. Источники неорганической серы в процессе реконструкции кластера белка FNR[4Fe-4S]2+ в клетках E.coli, культивируемых с NO-донорами / С.В. Васильева, Д.А. Стрельцова, А.В. Власкина, В.Д. Микоян, А.Ф. Ванин // Биофизика. - 2012. - Т. 57. - № 2. - С. 247-252.

162. Cruz-Ramos, Н. NO sensing by FNR: regulation of the Escherichia coli

NO-detoxifying flavohaemoglobin, Hmp / H. Cruz-Ramos, J. Crack, G. Wu, M.N. Hughes, C. Scott, A.J. Thomson, J. Green, R.K. Poole // EMBO J. - 2002. -V.21. -№13. -pp.3235-44.

163. Crack, J.C. Bacterial iron-sulfur regulatory proteins as biological sensorswitches / J.C. Crack, J. Green, M.I. Hutchings, A.J. Thomson, N.E. Le Brun // Antioxidants & Redox Signaling. -2012. -V. 17. - pp. 1215-31.

164. Greenberg, J.T. Positive control of a global antioxidant defense regulon activated by superoxide-generating agents in Escherichia coli / J.T. Greenberg, P. Monach, J.H. Chou, P.D. Josephy, B. Demple // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. - 1990. - V.87. -pp.6181-6185.

165. Tsaneva, I.R. soxR, a locus governing a superoxide response regulon in Escherichia coli K-12 / I.R. Tsaneva, B. Weiss // J. Bacteriol. - 1990. - V.172. -pp.4197-4205.

166. Hidalgo, E. An iron-sulfur center essential for transcriptional activation by the redox-sensing SoxR protein / E. Hidalgo, B. Demple // EMBO J. - 1994. -V.13. -pp.138-146.

167. Bowles, T. Structure and DNA binding of alkylation response protein AidB / T. Bowles, A.H. Metz, J. O'Quin, Z. Wawrzak, B.F. Eichman // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. - 2008. - V. 105. - №4 - pp. 15299-15304.

168. Горбачева, Л.Б. Противоопухолевая активность и механизм действия ^алкил-Ы-нитрозомочевин / Л.Б. Горбачева, Г.В. Кукушкина // Химико-фармацевтический журнал. - 1979. - Т. 4.

169. Igamberdiev, A.U. Plant mitochondrial function during anaerobiosis / A.U.

Igamberdiev, R.D. Hill //Ann Bot. - 2009. - V. 103. - №2. -pp.259-268.

170. Vaupel, P. Hypoxia in cancer: significance and impact on clinical outcome / P. Vaupel, A. Mayer // Cancer Metastasis Rev. - 2007. - V. 26. - pp.225-239.

171. Yang, Y.C. Topoisomerase II-mediated DNA cleavage and mutagenesis activated by nitric oxide underlie the inflammation-associated tumorigenesis / Y.C. Yang, H.Y. Chou, T.L. Shen, W.J. Chang, P.H. Tai, T.K. Li // Antioxid. Redox. Signal. - 2013. - V.l8. - №10. - pp. 1129-40.

172. Wang, G.L. Hypoxia-inducible factor 1 is a basic-helix-loop-helix-PAS heterodimer regulated by cellular 02 tension / G.L. Wang, B.-H. Jiang, E.A. Rue, G.L. Semenza // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. - 1995. -V.92. - pp.5510-5514.

173. Semenza, G.L. HIF-1: mediator of physiological and pathophysiological responses to hypoxia / G.L. Semenza // Journal of Applied Physiology. - 2000. -V.88.-№4.-pp. 1474-1480.

174. Quintero, M. Nitric oxide is a factor in the stabilization of hypoxia-inducible factor-1 alpha in cancer: role of free radical formation / M. Quintero, P.A. Brennan, G.L. Thomas, S. Moncada // Cancer Res. - 2006. - V.66. - №2. -pp.770-774.