Изучение реакций активных форм кислорода (супероксидных и гидроксильных радикалов, перекиси водорода, гипохлорита) и окиси азота с биологически важными соединениями тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.02, доктор биологических наук Осипов, Анатолий Николаевич

• Осипов, Анатолий Николаевич
• доктор биологических наук
• 1999

Оглавление диссертации доктор биологических наук Осипов, Анатолий Николаевич

ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ:

ВВЕДЕНИЕ

ЦЕЛИ РАБОТЫ

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. ГИПОХЛОРИТ И ЕГО МЕСТО В РЕАКЦИЯХ ОРГАНИЗМА.

1.1. Образование гипохпорита миелопероксидазой нейтрофилов.

1.2. Химические свойства гипохлорной кислоты и гипохпорита натрия.

1.3. Реакции гипохлорита с биологически важными соединениями.

1.4. Бактерицидные и цитотоксические свойства гипохлорита.

1.5. Образование свободных радикалов в реакциях гипохлорита.

2. ГЕМОГЛОБИН - РЕГУЛЯТОР СВОБОДНО-РАДИКАЛЬНЫХ ПРОЦЕССОВ В ОРГАНИЗМЕ.

2.1. Роль внеэритроцитарного гемоглобина в патологических процессах.

2.2. Взаимодействие гемоглобина с Н202 и органическими гидроперекисями.

2.3. Высвобождение ионов железа из гемопротеинов под воздействием Н202 и гипохлорита.

2.4. Изменение физико-химических свойств гемоглобина при образовании комплекса с гаптоглобином.

3. БИОЛОГИЧЕСКИЕ РЕАКЦИИ ОКИСИ АЗОТА.

3.1. Прямые реакции N0.

3.2. Опосредованные реакции N0. 48 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

1. МАТЕРИАЛЫ

1.1. Реактивы

1.2. Приготовление убихинола <2ю и К02-краун эфира

1.3. Получение гемоглобина

1.4. Получение гаптоглобина

1.5. Получение липопротеинов

1.6. Окисление липопротеинов

1.7. Выделение моноцитов

1.8. Выделение нейтрофилов 55 2. МЕТОДЫ:

2.1. Измерение концентраций гипохлорита и перекиси водорода

2.2. Измерение концентрации ионов железа (II)

2.3. Измерение концентрации гемоглобина

2.4. Модификация гемоглобина Н2О2 или НОС

2.5. Изучение влияния гаптоглобина и альбумина

2.6. Регистрация спектров ЭПР

2.7. Измерение хемилюминесценции реакции Н0С1+Ре

2.8. Измерение хемилюминесценции МеШЬ+1ВиООН

2.9. Измерение хемилюминесценции клеток крови

2.10. Исследование взаимодействия гемоглобина с гипохпоритом и перекисью водорода

2.11. Измерение хемилюминесции анион-радикалов супероксида

2.12. Измерение ТБК-реактивных продуктов

2.13. Определение продукции 02'

2.14. Измерение концентрации N0 методом ЭПР

2.15. Измерение концентрации N0 методом Гриса

2.16. Измерение флуоресценции цис-паринариевой кислоты

2.17. Масс спектрометрический анализ

2.18. Измерения ВЭЖХ аскорбата, убихинона и а-токоферол а

2.19. Статистический анализ 65 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ИЗУЧЕНИЕ МЕХАНИЗМА ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ

ГИПОХЛОРИТА С ИОНАМИ МЕТАЛЛОВ

1.1. Образование гидроксильных радикалов при взаимодействии гипохпорита с ионами железа (II). Метод ЭПР.

1.2. Образование гидроксильных радикалов при взаимодействии гипохлорита с ионами титана. Метод ЭПР.

1.3. Образование гидроксильных радикалов при взаимодействии гипохлорита с ионами железа (II). Метод хемилюминесценции.

ГЛАВА 2. ИССЛЕДОВАНИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ГИПОХЛОРИТА С ГЕМОГЛОБИНОМ И ЛИПОПРОТЕИДАМИ

2.1. Изучение механизма взаимодействия гипохлорита с оксигемоглобином.

2.1.1. Спектрофотометрическое исследование взаимодействия гипохлорита и перекиси водорода с оксигемоглобином.

2.1.2. Изучение образования свободных радикалов в системе гипохпорит - гемоглобин методом хемилюминесценции.

2.2. Влияние гипохлорита и перекиси водорода на способность гемоглобина стимулировать перекисное окисление липидов липопротеинов низкой плотности.

2.2.1. Индукция ПОЛ липопротеинов гемоглобином, модифицированным гипохпоритом и Н202.

2.2.2. Влияние перехватчиков свободных радикалов и хелаторов ионов железа на перекисное окисление липидов липопротеинов низкой плотности.

2.2.3. Влияние гаптоглобина и альбумина на способность гемоглобина стимулировать перекисное окисление липидов липопротеинов низкой плотности.

2.3. Генерация свободных радикалов моноцитами и нейтрофилами - возможная причина модификации липопротеинов.

2.3.1. Активация моноцитов в присутствии липопротеинов.

2.3.2. Перекисное окисление липопротеинов в присутствии моноцитов.

2.3.3. Активация нейтрофилов в присутствии липопротеинов.

2.3.4. Перекисное окисление липопротеинов в присутствии нейтрофилов.

ГЛАВА 3. ИЗУЧЕНИЕ ПРО- И АНТИОКСИДАНТНЫХ

РЕАКЦИЙ ОКИСИ АЗОТА

3.1. Восстановление феррилмиоглобина и феррилгемоглобина окисью азота.

3.1.1. Спектрофотометрическое исследование взаимодействия те(МЬ/теШЬ с гидроперекисью трет-бутила и N0.

3.1.2. Спектры ЭПР радикалов, образующиеся при взаимодействии те!МЬ с ^ВиООН и N0.

3.1.3. Влияние феррилгемоглобина на концентрацию N0.

3.1.3. Обнаружение спиновых аддуктов в присутствии

1-ВиООН и МеЖЬ.

3.1.4. Масс спектрометрический анализ взаимодействия гти^МЬ/теШЬ с 1-ВиООН и N

3.1.5.Влияние N0 на люминол-зависимую хемилюминесценцию в системе те1МЬ/теШЬ и ЬВиООН.

3.1.6. Ингибирование перекисного окисления липидов, индуцированного в системе системе те1МЬ/теЖЬ и 1-Ви00Н, N0.

3.1.7. Механизм антиоксидантного действия N0.

3.1.8. Механизм восстановления МЬ-Ре|У=0/НЬ-4Ре|У= радикалов N

3.2. Окислительно-воссановительный парадокс окиси азота: прямое окисление а-токоферола и опосредованное а-токоферолом окисление аскорбата

3.2.1. Изучение взаимодействия а-токоферола и N0 методом ЭПР.

3.2.2. Исследование взаимодействия аскорбата и N0 методом ЭПР.

3.2.3. Циклическое восстановление радикалов а-токоферола аскорбатом в присутствии N

3.2.4. Изучение методом ВЭЖХ а-токоферолопосредованного окисления аскорбата окисью азота.

3.2.5. Физиологическое значение исследованных реакций.

ГЛАВА 4. ИЗУЧЕНИЕ РОЛИ УБИХИНОНОВ В РЕАКЦИЯХ ОКИСЛЕНИЯ-ВОССТАНОВЛЕНИЯ ВИТАМИНА Е

4.1. Убихинон Ою-зависимое восстановление радикалов витамина Е супероксидными радикалами.

4.1.1. Окисление а-токоферола в присутствии и в отсутствие убихинона Ою

4.1.2. Изучение методом ЭПР супероксид-зависимого взаимодействия а-токоферола и убихинона Q10.

4.1.3. Спектрофотометрическое исследование образования убисемихинона Q10 в присутствии супероксида и а-токоферола.

4.2. Убихинон Qo-зависимое восстановление радикалов Тролокса супероксидными радикалами, в системе ксантин-ксантиноксидаза.

4.2.1. Влияние Тролокса и убихинона Q0 на интенсивность хемилюминесценции.

4.2.2. Обнаружение радикалов убихинона методом ЭПР.

4.2.3. Изучение продуктов окисления Тролокса методом ВЭЖХ.

4.2.4. Изучение взаимодействия убихинона Q0 с радикалами Тролокса методом ЭПР.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Изучение реакций активных форм кислорода (супероксидных и гидроксильных радикалов, перекиси водорода, гипохлорита) и окиси азота с биологически важными соединениями»

Современную медицинскую и биологическую науку сегодня трудно представить без исследований механизмов свободно-радикальных реакций в физиологических и патологических процессах. Действительно, сегодня уже никто не сомневается, что свободнорадикальное перекисное окисление липидов биологических мембран и липопротеинов - один из основных механизмов повреждения липидного бислоя, который лежит в основе многих заболеваний. Образование активных форм кислорода фагоцитами общепризнано как один из главных механизмов антибактериальной защиты организма. Список подобных примеров можно было бы продолжать. Тем не менее, несмотря на обилие исследований свободнорадикальных реакций в понимании общей картины свободнорадикальных процессов остается еще немало белых пятен.

До недавнего времени большая часть исследований свободнорадикальных процессов касалась радикалов кислорода супероксидного и гидроксильного радикалов и перекиси водорода, т.е. продуктов последовательного одноэлектронного восстановления молекулярного кислорода. Сегодня к этим соединениям присоединились гипохлорит и окись азота. Эти два соединения роднит тот факт, что оба они образуются при активации фагоцитов. Известно, что гипохлорит является продуктом миелопероксидазной реакции и образуется этим ферментом из перекиси водорода и анионов хлора. Окись азота в клетках получается при работе МО-синтетазы, использующей 1-аргинин в качестве субстрата.

Химические свойства гипохлорита изучены достаточно хорошо. Что же касается его реакций с биологически важными соединениями, то сведения, имеющиеся здесь, носят отрывочный характер. Известно, что гипохлорит является сильным окислителем и его взаимодействие с другими соединениями приводит к окислению или хлорированию последних. Взаимодействие гипохлорита с аминокислотами приводит к образованию хлораминов, которые спонтанно распадаются на 1ЧН3 , С02 , СГ и соответствующий альдегид [310]. Поскольку гипохлорит способен легко реагировать с сульфгидрильными группами, то можно ожидать, что белки, и в том числе ферменты, содержащие цистеиновые остатки, могут эффективно модифицироваться гипохлоритом [52]. Взаимодействие сывороточных белков с гипохлоритом является неспецифическим и приводит к деградации белков, наиболее сильно подвержены деградации церулоплазмин и трансферрин [35]. Тем не менее остаются малоизученными реакции гипохлорита с гемовыми белками. Одним из вопросов имеющих важное биологическое значение - это вопрос об освобождении ионов металлов переменной валентности при деградации гемопротеинов.

Последнее время биологическая активность окиси азота (N0) привлекает все большее внимание [153]. Предполагается, что N0' является медиатором воспаления, нейротрансмиттером в центральной и периферической нервной системе и участвует в образовании соединений, расслабляющих мускулатуру кровеносных сосудов и воздухопроводящих путей [123,221]. N0' благотворно влияет на предотвращение сосудистого тромбоза [309], повреждения клеток при воспалении [88] и реперфузии [187]. Химическими реакциями, ответственными за биологическую активность N0' являются связывание ионов Fe и Си в металлопротеинах и ковалентное связывание с SH-группами в белках [153,154,265].

Одна из наиболее важных реакций N0' - взаимодействие с супероксидным радикалом, дающее пероксинитрит ("00N0), который при разложении образует гидроксильный радикал. Эту реакцию считают ответственой за окислительные повреждения в присутствии N0" [62]. Недавно были продемонстрированы антиоксидантные свойства N0' в процессах перекисного окисления липидов в мембранах и липопротеидах. Механизм антиоксидантного действия в этом случае заключается во взаимодействии N0' со свободными радикалами липидов [157,249] или хелатировании каталитически активных ионов металла [157,175]. Антиоксидантные же свойства N0', связанные с взаимодействием последнего с оксоферрильными состояниями гемопротеинов в литературе не обсуждались. Немалый интерес вызывает и взаимодействие окиси азота с витаминами С и Е, являющимися основными водо- и жирорастворимыми антиоксидантами.

Цели работы

Основной целью работы было изучение механизма свободно-радикальных реакций, протекающих при участии активных радикалов кислорода (супероксидных и гидроксильных радикалов), перекиси водорода, гипохлорита и окиси азота в биологических системах, содержащих гемопротеиды (гемоглобин и миоглобин), витамины С и Е и липоротеины, и участия этих соединений в про- и антиоксидантных процессах.

Научная новизна

В диссертации впервые показано, что взаимодействие гипохлорита и ионов металлов переменной валентности (железа и титана) приводит к генерации свободных радикалов, строение, которых идентично или очень близко гидроксильным радикалам.

Обнаружено, что гипохпорит в 10 и более раз эффективней по сравнению с перекисью водорода, модифицирует гемоглобин, и приводит к его разрушению и освобождению железа в каталитически активной форме.

Впервые обнаружено, что в зависимости от условий окись азота может проявлять про- или антиоксидантные свойства, если в системе присутствуют а-токоферол или феррил-гемопротеид соответственно.

Кроме того, защитные свойства по отношению к окислению а-токоферола супероксидом обнаружены и у молекулы убихинона О10, которая поддерживает постоянной концентрацию витамина Е при его окислении супероксидными радикалами в апротонных или водных средах.

Практическая значимость

Работа является фундаментальным исследованием, углубляющим научные представления о механизмах образования и превращений свободных радикалов в биологических системах. Все результаты, приведенные в диссертационной работе, используются при чтении лекций и проведении практических занятий по курсу "Молекулярная и клеточная биофизика" со студентами Медико-биологического факультета Российского Государственного Медицинского Университета и по курсу "Основы физико-химической биологии и медицины" со студентами Факультета фундаментальной медицины в Московском Государственном Университете.

Некоторые результаты работы могут иметь и практическое приложение. Так обнаружение образования радикалов в реакциях гипохпорита и ионов металлов переменной валентности, а также роль гемоглобина как источника каталитически активного железа позволяют глубже понять патогенез заболеваний, в развитии которых принимают участие воспалительные и геморрагические процессы, и целенаправленно изменить тактику их лечения.

Экспериментальное обоснование образования "порочного круга" при активации фагоцитов окисленными липопротеидами, который ведет к еще большему окислению липопротеидов и последующему усилению активации клеток позволит целенаправленно использовать лекарственные средства, снижающие активацию клеток и воспалительную реакцию организма при некоторых случаях атерогенеза.

Было установлено, что окись азота может играть роль антиоксиданта, в реакциях с участием феррил-гемопротеинов. Этот факт может позволить разработку новых лекарственных средств, содержащих окись азота, и оказывающих защитное действие при окислительных стрессах.

С другой стороны, участие окиси азота в реакциях окисления а-токоферола и защитное действие аскорбата этом случае, дают возможность снижать нежелательные побочные эффекты окиси азота путем применения витамина С.

Работа выполнялась на кафедре биофизики Российского Государственного Медицинского Университета (Москва), заведующий кафедрой - академик РАМН, профессор Ю.А. Владимиров и в Отделе по изучению воздействий окружающей среды на здоровье человека Университета г. Питтсбург (Пеннсильвания, США), заведующий лабораторией профессор В.Е. Каган.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

В обзоре литературы основное внимание уделено трем аспектам проблемы образования и превращений свободных радикалов в биологических системах: рассмотрению (1) химических свойств гипохлорита, путям его образования в биологических системах, и механизму образования свободных радикалов, (2) рассмотрению свойств гемоглобина, как основного участника взаимодействия с гипохлоритом в его радикал-продуцирующих реакциях и (3) основным химическим и биологическим реакциям окиси азота.

1, Гипохлорит и его место в реакциях организма.

Проблемы, связанные с источниками свободных радикалов в организме имеют первостепенное значение. Образование органических и неорганических радикалов в биологических системах очень часто происходит при участии ионов железа и других ионов переменной валентности [134,138,139]. Наиболее известны две радикал-продуцирующие реакции ионов железа в водных растворах: одноэлектронное восстановление молекулы кислорода (1) и образование гидроксильного радикала из перекиси водорода по реакции Фентона (2):

Яе2+ + 02 Ре3+ + 02" (1)

Ре2+ + Н202 -> Ре3+ + ОН" + ОН (2)

Существуют ли другие реакции, приводящие к образованию свободных радикалов в биологических системах? Среди соединений привлекающих особое внимание исследователей находятся гипохлорная кислота и ее соль -гипохлорит. Гипохлорная кислота образуется фагоцитами в катализируемой миелопероксидазой реакции перекиси водорода и ионов хлора, образующийся гипохлорит является сильным окислителем и служит для защиты клеток и тканей организма. Представлялось интересным изучить механизм реакции взаимодействия гипохлорита с ионами железа.

Проблема взаимодействия гипохлорита с ионами железа в биологических системах включает в себя и вопрос об источниках железа.

Известно, что около 70% железа организма человека содержится в гемоглобине [138]. В последние годы появились работы, посвященные изучению механизма токсичности гемоглобина в живых системах [146,147,241,277]. Может ли гипохлорит взаимодействовать с железом, входящим в состав гемоглобина, и каков механизм этого взаимодействия.

1.1. Образование гипохлорита миелопероксидазой нейтрофилов.

В организме гипохлорная, или хлорноватистая, кислота (HOCI) вырабатывается фагоцитирующими клетками. При респираторном взрыве примерно 28% от общего количества кислорода, потребляемого нейтрофилами, расходуется на образование HOCI [117]. В 1972 году Agner [38] предположил, что гипохлорная кислота является основным продуктом каталитического действия миелопероксидазы (МПО, донор: Н202 оксидоредуктаза, КФ 1.11.1.7). Им было показано, что сульфаниламид образует идентичные продукты при взаимодействии с системой МП0/Н202/СГ и при взаимодействии с гипохлоритом. В начале 70-х годов Zgliczynsky et al. [310] исследовали свойства системы МПО и обнаружили, что декарбоксилирование аминокислот идет через образование соответствующих хлораминов. Однако, непосредственно образование HOCI в реакции МПО было показано лишь в 1976 г. Harrison et al. [148].

МПО катализирует реакцию образования гипохлорной кислоты из перекиси водорода и хлорида:

Н202 + СГ HOCI + ОН

МПО содержится в азурофильных гранулах полиморфноядерных лейкоцитов и составляет примерно 5% сухого веса нейтрофилов [38]. Этот фермент в концентрациях примерно в 3 раза меньших содержится и в моноцитах [69]. Активация клеток ведет к дегрануляции и освобождению МПО внутрь фагосомы и во внеклеточное пространство. Таким образом, HOCI может вырабатываться как внутри, так и вне клетки. Было показано, что 5*106 активированных нейтрофилов человека могут продуцировать 88.3 + 23.6 нмоль HOCI за 2 часа при 22 °С [173]. Именно этому соединению в настоящее время приписывается основная роль в бактерицидном действии нейтрофилов.

МПО является тетрамером и содержит а и р-субъединицы с молекулярным весом 140 ООО дальтон, содержащие два гема [49,148]. В ходе каталитического цикла железо в геме подвергается последовательному окислению и восстановлению.

Нативная МПО, содержащая железо в форме Fe(lll), реагирует с Н202, образуя соединение I, железо при этом переходит в состояние Fe(V). Отнимая по одному электрону от двух молекул субстрата, МПО образует соединение II и возвращается в исходное состояние. Однако, МПО в отличие от других пероксидаз, способна катализировать двухэлектронное оксиление ионов галогенов Г , Вг" или СГ , но не F" [293], в результате чего образуются гипогалоидные кислоты. При исследовании способности МПО в присутствии Г, Вг" и СГ убивать микроорганизмы и при сравнении концентраций ионов галогенов в плазме крови было установлено, что бактерицидное действие МПО обеспечивают в первую очередь HOCI и в меньшей степени HOI [49].

1.2. Химические свойства гипохлорной кислоты и гипохлорита натрия.

В биологических исследованиях in vitro чаще всего используют гипохлорит натрия (NaOCI), основные физические и химические свойства которого представлены ниже.

HOCI - слабая кислота, имеющая константу диссоциации 3*10"8 [105], рКа 7,5 [215]. Гипохлорная кислота может существовать в газообразном состоянии и в водных растворах, причем максимально возможная концентрация составляет около 30%. Растворы хлорноватистой кислоты окрашены в слабый зеленовато-желтый цвет и обладают своеобразным запахом. HOCI и почти все гипохлориты - неустойчивые соединения. Для водного раствора HOCI характерны равновесия:

HOCI -> н+ + осг

2HOCI о Cl20+ Н20

Скорость и направление распада HOCI и гипохлоритов в водных растворах зависят от рН, температуры, концентрации, наличия примесей и освещения. В очень кислой среде (рН<3) при комнатной температуре происходит медленный распад

4HOCI 2CI2 + 02 + 2Н20

Если для подкисления использована соляная кислота, то наблюдается быстрая реакция, равновесие которой сдвинуто вправо:

HOCI + HCI <-> Cl2 + Н20

В интервале рН 3-7.5 идет автокаталитический процесс

2HOCI 02 + 2HCI

Освещение ускоряет эту реакцию, причем видимый свет оказывает более сильное влияние, чем ультрафиолетовый. При рН 6-8, когда в растворе присутствуют HOCI и ОСГ в соизмеримых количествах, идет диспропорционирование

2HOCI + ОСГ СЮз' + 2Н+ + га

Ниже 70 °С вклад этой реакции невелик, однако при более высоких температурах она становится преобладающей.

Существует множество методов для качественного обнаружения и количественного определения HOCI и OCI-: титримитрические, нефелометрические, потенциометрические, полярографические, амперографические, кулонометрические и др. Описание этих методов можно найти в книгах Фруминой [32] и Уильямса [30]. Однако в биологических исследованиях чаще всего используют спектрофотометрические и люминесцентные методы. Наиболее простой метод измерения концентрации гипохлорита - измерения спектра поглощения в ультрафиолетовом диапазоне. Поскольку при физиологических рН гипохлорит существует как смесь HOCI и OCI- и их спектры поглощения различны, то сначала увеличивают рН до 12, когда происходит полное депротонирование, затем измеряют оптическую плотность при 292 нм. Концентрацию гипохлорита определяют, используя коэффициент молярной экстинкции е292=350.4 М"1см"1 [215]. В основе остальных спектрофотометрических методов лежит способность гипохлорита окислять различные вещества, которая проявляется как в кислой, так и в щелочной среде. Например, в результате реакций ОСГ с такими веществами как о-толуидин [148], монохлородимедон, KI [188] и др. образуются окрашенные вещества, концентрацию которых определяют по оптическому поглощению.

Еще одним часто используемым методом изучения реакций гипохлорита является хемилюминесцентный метод. Добавление гипохлорита в раствор люминола вызывает сильное свечение, интенсивность которого пропорциональна концентрации гипохлорита, причем в присутствии перекиси водорода интенсивность свечения увеличивается на 1-2 порядка [53,73].

Изучению реакций гипохлорита с различными биологическими соединениями посвящено множество работ, где в большинстве случаев исследователи констатируют факт взаимодействия гипохлорита с различными веществами, не определяя механизм этих реакций. Так, например, взаимодействие OCI- с ферментами изучалось с помощью измерения спектров поглощения белков и/или определения степени уменьшения их ферментативной активности [44,56,208]. В работе Winterbourn et al. [302] реакционная способность гипохлорита по отношению к различным соединениям оценивалось по ингибированию реакций гипохлорита с монохлородимедоном. Аналогичный прием применялся в работе Говоровой и соавт. [2], в которой измеряли степень тушения хемилюминесценции, возникающей при взаимодействии гипохлорита с люиминолом.

Гипохлорная кислота и гипохлорит натрия, будучи сильными окислителями, способны реагировать со многими органическими соединениями различной природы. Не представляется возможным перечислить все известные в настоящее время реакции в данном обзоре. Описание большого числа реакций гипохлорита с органическими и неорганическими соединениями приведены в книгах [105,113].

1.3. Реакции гипохлорита с биологически важными соединениями.

Гипохпорная кислота обладает высокой реакционной способностью по отношению к очень многим видам биомолекул. Гипохлорит быстро реагирует с первичными аминами (Р1ЧН2 ), такими как таурин, этаноламин, аминокислоты, и с множеством других соединений [57,269,275,310]. При этой реакции образуются произ водные - хпорамины (1Ч1\1НС1). Результатом взаимодействия ОСГ с таурином, веществом часто используемым в качестве акцептора для НОС1, является хлорамин таурина. Это соединение достаточно стабильное. Его образование в гипохпорит-содержащей системе можно наблюдать по спектру поглощения в ультрафиолетовой области. В работе [269]с применением изотопа 36С1 было показано, что в системе МПО/Н2О2/СГ образуются два вещества с различными спектрами поглощения, одно с максимумом поглощения 254 нм, другое при 300 нм, причем соотношение между концентрациями этих соединений зависело от рН среды. При взаимодействии НОС! и таурина при эквимолярном соотношении образовывалось вещество, поглощающее в более коротковолновой области - хлорамин таурина. Если же концентрация НОС1 увеличивалась, то возрастало количество вещества с максисмумом поглощения при 300 нм. Это соединение было идентифицировано как дихлорамин таурина (Р1ЧС12).

Гипохлорит легко реагирует и с другими аминами, например, этаноламином, аланином, диэтаноламином. Алании и этаноламин при взаимодействии с гипохлоритом дают хпорамины, подобные тем, которые образуются из таурина - моно- и дихлорамины. Диэтаноламин дает только монохлорамин [310].

В отличие от выше перечисленных случаев, в результате взаимодействия аминокислот с гипохлоритом образуются нестабильные хлорамины, которые спонтанно распадаются на 1МН3 , С02 , СГ и соответствующий альдегид [310]:

НОС1 + СООНСНСН3МН2 н+ + Н20 + СООНСНСНзГМНС!

СООНСНСНзМНС! + н2о сн3сно + ын4+ + со2 + сг

Скорости реакций декарбоксилирования и дезаминирования хлораминов зависят от аминокислоты, из которой они образовались. Однако, окисление аминокислот, по-видимому, может протекать и без образования хлораминов в качестве промежуточного продукта.

При инкубации дипептидов с МПО в присутствии Н202 и ОСГ происходит хлорирование аминогрупп на 1Ч-конце до монохлораминов и/или Ы-дихлораминов. Однако не происходит хлорирование азота, участвующего в пептидной связи [270]. Образующиеся хлорпептиды являются нестабильными соединениями, они распадаются на ЫН3 и соответствующую 1\1-(2-оксоацил)аминокислоту в случае М-монохлорпетида, и на нитрил (14-С=К1) и свободную аминокислоту в случае М-дихлорпептида.

Среди аминокислот повышенной реакционной способностью по отношению к гипохлориту отличаются серусодержащие аминокислоты -метионин и цистеин [12,51]. Если в растворах валина и лизина окисление аминогрупп происходит при эквимолярном соотношении концентраций ОСГ и соответствующей аминокислоты, то в цистеине и метионине взаимодействие гипохлорита с аминогруппами начинается только после того, как окислятся все сульфгидрильные и тиоэфирные группы [51]. При сравнении степени ингибирования реакции гипохлорита с монохлородимедоном различными веществами было показано, что тиоловые соединения (цистеин и восстановленный глутатион) и метионин на два порядка более эффективны в качестве ингибиторов, чем другие аминокислоты [302]. Константы скорости реакций гипохлорита с восстановленным глутатионом, окисленным глутатионом, аланином, серином и билирубином соотносятся, как 48:6,9:5,5:2,4:1 [28]. Как было показано авторами работы [12], исследовавшими тушение хемилюминесценции, возникающей при взаимодействии ОСГ с люминолом, реакционная способность серусодержащих соединений зависит от наличия БН-групп и тиоэфирных связей. Так, сульфоксиды (>8=0), например ДМСО, и соединения, содержащие дисульфидную связь (-Б-Б-) гораздо слабее тушат хемилюминесценцию люминола, вызванную гипохлоритом, чем соединения с БН-группами или тиоэфирными связями.

Поскольку ОСГ способен очень легко реагировать с сульфгидрильными группами, то можно ожидать, что белки, и в том числе ферменты, содержащие цистеиновые остатки, могут эффективно модифицироваться гипохлоритом. Действительно, как показано в работе [52], при инкубации сывороточного альбумина человека с гипохлоритом в первую очередь окисляются именно сульфгидрильные и тиоэфирные группы и затем аминогруппы. Измерение степени инактивации гипохлоритом ферментов с сульфгидрильными группами, таких как папаин, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа, алкогольдегидро-геназа, лактатдегидрогеназа, показало, что гипохлорит способен инактивировать эти ферменты, причем чувствительность к НОС1 зависит от нуклеофильности сульфгидрильных групп [44].

В активном центре ои-антипротеазы также содержится вН-группа. Обнаружено, что стимулированные нейтрофилы способны инактивировать агантипротеазу и инактивация этого фермента опосредована действием системы МП0/Н202/СГ , а именно окислением метиониновых остатков под действием гипохпорной кислоты [209]. Оксипуринол, мочевая и аскорбиновая кислоты, взаимодействуя с гипохлоритом, могут защитить аг антипротеазу, при этом фермент сохранияет свою эластазоингибиторную способность [130,142].

Изучению действия гипохпорита на белки посвящено большое количество работ [35,44,52,56,115,137,209,294,304,306] и др. В работе [56] изучали влияние гипохпорита на защитные антиокислительные ферменты каталазу, глутатионпероксидазу и супероксиддисмутазу. Из них наиболее чувствительной к гипохлориту оказалась глутатионпероксидаза. Каталаза тоже инактивировалась быстро, но при этом требовались большие концентрации гипохпорита, чем в случае глутатионпероксидазы. Инактивация СОД была значительно слабее.

Исследуя способность основных белков сыворотки (альбумина, иммуноглобулина в) и белков "антиоксидантов" (церулоплазмина, СОД, трансферрина) реагировать с ОСГ , Шаронов и соавт. [35] установили, что взаимодействие сывороточных белков с ОСГ является неспецифическим и приводит к деградации белков. Обнаружено, что наиболее сильно деградируют церулоплазмин и трансферрин. На основании полученных результатов авторы заключили, что среди белков сыворотки именно церулоплазмин играет главную роль в защите от активных форм кислорода, продуцируемых нейтрофилами. В работах [303,306] приводятся данные о том, что у трансферрина и лактоферрина при инкубации с 20-кратным избытком гипохлорной кислоты уменьшается способность связывать железо на 70% и 30% соответственно. Менее подверженным действию гипохлорита оказался церулоплазмин: уменьшение ферроксидазной активности белка происходило лишь на 31: при 100 - 200 кратном избытке гипохлорита [137].

Взаимодействие гемовых белков, таких как цитохром с, каталаза, МПО с гипохлорной кислотой приводит к значительным изменениям в спектрах поглощения гемопротеинов [44,56,208,209]. Уменьшение поглощения в полосе Соре свидетельствует о разрушении гемовой структуры. Изучение влияния НОС1 на каталазу позволило авторам [56] предположить возможность освобождения ионов железа из гемопротеина.

Освобождение ионов металлов из белков при реакции с гипохлоритом было показано в работе [142]. При физиологических концентрациях НОС1 (0.05-0.2 мМ) способна вытеснять ионы цинка из металлопротеинов, таких как металлотионеин и алкогольдегидрогеназа, в которых металл связан с атомами серы тиолатной связью, однако из СОД, где 2п не связан с цистеином, цинк не мобилизуется [115].

Среди соединений чрезвычайно чувствительных к гипохлориту оказались железосерные белки [44]. НОС1 с очень большой скоростью приводит к выцветанию ферредоксинов. При этом, по-видимому, происходит потеря ионов железа, поскольку спектр поглощения ферредоксина после реакции с НОС1 совпадает со спектром апофермента [44].

С другой стороны, НОС1 в некоторых случаях приводит не к деградации ферментов, а к активации. Например, активация латентной коллагеназы, фермента специфических гранул нейтрофилов, происходит под действием гипохлорной кислоты [294]. Таким образом, гипохлорит способен модифицировать ферменты, в подавляющем большинстве случаев приводя к их частичной или полной инактивации. Исключением являются протеазы нейтрофилов, находящиеся в латентном состоянии, которые при взаимодействии с гипохлоритом активируется. Механизмы реакций ферментов с гипохлоритом зависят от структуры белков, а именно от количества БН-групп, аминогрупп, строения активных центров и других факторов.

Гипохпорная кислота и ее соли способны взаимодействовать с большим числом низкомолекулярных органических соединений различной природы. Например, гипохлорит реагируя с фенолом, образует целый ряд соединений таких как хлорфенолы, хлорбензохиноны и др. [229]. При взаимодействии гипохлорита с индолами происходит их хлорирование [113]. Известны реакции гипохлорита со спиртами [113]:

С6Н5СН2ОН + ОС1 С6Н5СНО + СГ + Н20

Среди низкомолекулярных соединений, активно реагирующих с НОС1, можно выделить аскорбиновую кислоту, НАДФН и мочевую кислоту. Мочевая и аскорбиновая кислоты могут играть роль физиологических перехватчиков гипохлорита, поскольку они способны эффективно ингибировать окисление гипохлоритом различных соединений даже в концентрациях ниже физиологических [12,142,302]. Способность НАДФН и мочевой кислоты ингибировать реакцию монохлородимедона экзогенным гипохлоритом и НОС1, продуцируемой системой МПО, сравнима с активностью аминокислот, не содержащих серы, тогда как бензоат, ДМСО и формиат гораздо менее эффективны [302].

Гипохлорит может реагировать и с основаниями нуклеиновых кислот [27,56]. Например, полная деградация АМФ наблюдается примерно при 10 кратном избытке HOCI, при этом сначала происходит хлорирование молекулы АМФ, а затем разрушение гетероцикла [56].

Гораздо меньшее число работ посвящено реакциям гипохпорита с другими видами биологически важных соединений, такими как липиды и углеводы. Albrich et al. [42-44] обнаружили, что соединения, входящие в состав клеточной стенки N-ацетилглкжозамин, N-ацетилмурамовая кислота, глюкоза и манноза (за исключением этаноламина, который образует этанолхлорамин) и вещества, представляющие мембранные компоненты фосфатидилхолин, холин, глицерол практически не реагируют с гипохлоритом. С другой стороны, в работе Sepe et al. [254] было показано, что инкубация липосом из фосфатидилхолина с МП О в присутствии Н202 и С Г или Г или Вг" или с экзогенным гипохлоритом приводило к лизису липосом. В обзоре Ю.Б.Васильева и соавт. [3] описаны результаты экспериментов по действию ОСГ на модельные бислойные липидные мембраны (БЛМ). Оказалось, что во-первых, ОСГ увеличивает проводимость БЛМ, причем увеличение проводимости может достигать нескольких порядков, во-вторых, модификация БЛМ гипохлоритом приводит к образованию в мембране больших пор, в-третьих, ОСГ усиливает действие антибиотика нонактина на проводимость бислойных мембран.

В работе Henderson et al. [151] было показано, что HOCI и ОН , продуцируемые нейтрофилами, могут вызывать деградацию лейкотриенов. Продукты деградации лейкотриенов типа 1ТС4 включают в себя трансизомеры LTB4. Система МП0/Н202/СГ может модифицировать простагландины [237], инактивировать хемоаттрактанты нейтрофилов [91].

Таким образом, из приведенных в этом разделе обзора данных, видно, что гипохпорит способен участвовать в широком спектре реакций с биологически значимыми соединениями. Все эти взаимодействия могут вносить свой вклад в бактерицидное и цитотоксическое действие гипохлорита.

1.4. Бактерицидные и цитотоксические свойства гипохлорита.

Гипохлорная кислота, продуцируемая нейтрофилами в очагах воспаления, может усугублять повреждение тканей инактивируя щ-антипротеазу [130,142] и этим допуская неконтролируемую протеазную активность, атакуя молекулы эластина [92], утилизируя аскорбиновую кислоту [12,31,142,302], активируя латентную коллагеназу [294]. С другой стороны, гипохлорит может способствовать ослаблению воспаления убивая бактерии [148,160,254] и грибки [191], инактивируя хемоаттрактанты [91]. Миелопероксидазная система нейтрофилов обладает также антивирусными свойствами [63]. В 1975 году Clark et al. [90] показали, что способность нейтрофилов разрушать чужеродные клетки обеспечивается миелопероксидазной системой. С тех пор в большом числе работ была продемонстрирована способность гипохлорита ингибировать деление бактерий и вызывать их гибель [144,160,254], разрушать клетки опухолей [89,262], повреждать клетки разных типов [89]. Поскольку гипохлорит является сильным окислителем и способен модифицировать многие виды биомолекул, в частности инактивировать ферменты [35,44,56,115,209], повреждать системы транспорта электронов [43], разрушать мембранные структуры [18,254] и оболочки бактерий [42], то можно предположить, что все эти процессы играют определенную роль в бактерицидном действии гипохлорита. Однако, было показано, что потеря способности к размножению E.coli наступает при гораздо меньших концентрациях гипохлорита, чем ингибирование синтеза протеинов и деградация белков бактерий [210]. Эти данные говорят о существовании специфического механизма воздействия гипохлорита на клетки бактерий, что не согласуется с представлением о неселективности взаимодейстивия гипохлорита с широким рядом биомолекул. Как отмечалось во многих работах последних лет [160,210], до настоящего времени механизм, обеспечивающий ингибирование роста бактерий и их гибель при действии гипохлорита, остается невыясненным.

1.5. Образование свободных радикалов в реакциях гипохлорита.

Возможность образования свободных радикалов в реакции гипохлорита обсуждалось в работах [17,66,73,164,173,199]. Поскольку гипохлорит является сильным окислителем, то, как было показано в работе Thomas et al. [276], практически все соединения, обычно используемые в качестве перехватчиков гидроксильных радикалов, окисляются гипохлоритом, поэтому использование ингибиторного анализа для доказательства образования радикалов из гипохлорита весьма проблематично.

Среди методов, используемых для изучения радикальных реакций, благодаря высокой чувствительности, особое место занимает хемилюминесценция [21,23]. Известны несколько реакций гипохлорита, сопровождающиеся хемилюминесценцией. Реакция Н202 с OCI-сопровождается свечением в длинноволновой области [176]. В 1964 году Khan et al. [178] измерили спектр этого свечения и предположили, что оно обусловлено образованием синглетного кислорода.

Н202 + ОСГ -» 1о2 + сг + Н202

Эта реакция проходит без участия свободных радикалов путем двухэлектронного окисления перекиси водорода гипохлоритом [17]. Allen [45] изучал хемилюминесценцию нейтрофилов при их акгивациии и показал, что именно МП0/Н202 /СГ система отвечает за наблюдаемое свечение.

Гипохлорит взаимодействует с супероксидным радикалом, причем эта реакция сопровождается слабым свечением [199]. Предполагается, что в результате этого взаимодействия образуется гидроксильный радикал:

HOCI + 02' ОН + 02 + сг

Известно, что добавление гипохлорита в раствор люминола вызывает яркое свечение, которое на несколько порядков усиливается в присутствии Н202 [53,73]. Механизм этих реакций до настоящего времени неизвестен [53].

Еще одним методом, широко применяемым для обнаружения свободнах радикалов, является метод спиновых ловушек [14,75,114,163]. Принцип метода заключается в следующем. Спиновая ловушка, являющаяся диамагнитным соединением, взаимодействует с изучаемым короткоживущим радикалом, давая при этом относительно долгоживущие радикалы -спиновые аддукты, которые можно изучать, измеряя его спектры ЭПР. Сверхтонкое расщепление линий в спектре спинового аддукта позволяет получить информацию об изучаемом радикале, в некоторых случаях по параметрам спектров удается идентифицировать радикал.

В работе [173] было показано, что гипохлорит, экзогенный или продуцируемый нейтрофилами, способен образовывать свободные радикалы из некоторых ксенобиотиков. Образование радикальных продуктов было продемонстрировано методом спектроскопии ЭПР непосредственно при измерении спектров радикалов, получающихся из хлорпромазина и аминопирина, и с помощью спиновой ловушки ДМПО в случае радикала, продуцируемого из фенилгидразина.

Запгеп а1. [164] изучали механизм образования спинового аддукта ДМПО-ОН спиновой ловушки ДМПО и ОН радикала, образующегося в суспензии активированных нейтрофилов. Они показали, что ДМПО-ОН возникает в системе, содержащей НОС1 в диапазоне концентраций 0,1-0,7 мМ. Авторы полагают, что образование этого спинового аддукта происходит в результате гидролиза продуктов взаимодействия НОС1 и ДМПО. В связи с этим Веп^вку а1. [66] методом ЭПР изучали продукты реакции ДМПО с гипохпоритом. Используя этанол и формиат в качестве перехватчиков гидроксильных радикалов, авторы пришли к заключению, что ДМПО-ОН образуется скорее в результате гидролиза ДМПО, чем в результате взаимодействия спиновой ловушки с ОН-радикалом.

В 1981 году была опубликована работа Ю.Н. Козлова и соавт. [16] в которой описаны эксперименты по изучению реакции окисления Т1(1П)ЭДТА и Ре(СМ)64+ хлорноватистой кислотой с помощью установки непрерывной струи. В качестве ловушки была использована малеиновая кислота. Основываясь на полученных данных авторы предположили, что первичным продуктом окисления Ре(С1М)б4+ гипохлоритом является соединение, содержащее ион железа в состоянии окисления Ре(1\/), которое затем реагирует с малеиновой кислотой, превращая ее в радикальный продукт. В случае же реакции 0С1- с комплексом трехвалентного титана с ЭДТА, по мнению авторов, образуется гидроксильный радикал по следующему механизму:

ТЦШрДТА + НОС1 Т1(М)ЭДТА + ОН + С1

Это предположение подтверждалось тем, что добавление этанола и метанола в систему приводило к появлению спектров ЭПР радикалов спирта.

Таким образом, подводя итог можно сказать, что до настоящего времени механизм реакций гипохлорита со многими видами молекул не установлен. Также остается много невыясненных вопросов, касающихся возможности и механизмов образования радикалов в реакциях гипохлорита.

2. Гемоглобин - регулятор свободно-радикальных процессов в организме.

В норме гемоглобин находится внутри эритроцитов и окружен ферментами, препятствующими образованию свободных радикалов -супероксиддисмутазой, каталазой, ОЭН-пероксидазой [98]. При гемолизе эритроцитов гемоглобин может попадать в кровяное русло, где концентрация антиоксидантных ферментов мала и являться источником ионов железа. Железо в нативном оксигемоглобине каталитически неактивно [122]. Перекись водорода, гипохлорная кислота, органические гидроперекиси липидов могут модифицировать оксигемоглобин с образованием более реакционноспособных соединений - феррил и перферрилгемоглобина [122]. Избыток окислителей по сравнению с оксигемоглобином приводит к деградации гемовой молекулы и высвобождению железа [29,134]. Продукты модификации гемоглобина окислителями способны вызывать перекисное окисление липидов липопротеинов крови [258], липидов биомембран [172,244,268] и других важных биомолекул организма [133,166], являясь причиной возникновения и развития различных заболеваний.

Для удаления свободного гемоглобина из русла крови служит белок-гаптоглобин, образующий стабильный комплекс с гемопротеином [70,240]. Определение уровней гаптоглобина в плазме крови может иметь большое диагностическое значение, так как концентрация гаптоглобина снижается при гемолитических состояниях организма, при заболеваниях печени и увеличивается при неопластических заболеваниях, воспалении [233,240,250]. Кроме того, связывание гемоглобина гаптоглобином предотвращает участие гемоглобина в свободно-радикальных реакциях организма - разложении перекиси водорода радикальным путем и окислении липопротеинов.

2.1. Роль внеэритроцитарного гемоглобина в патологических процессах.

Свободный гемоглобин, как источник каталитически активного железа, может служить причиной возникновения и развития многих заболеваний. Так, окисление ЛНП гемоглобином может быть вовлечено в начальные стадии атероскперотического повреждения [258]. In vivo прооксидантом в артериях может служить высвобожденный из лизированных эритроцитов гемоглобин. В работе [218] изучали взаимодействие гемоглобина в гемолизате эритроцитов с липопротеинами низкой плотности. Авторы показали, что гемоглобин взаимодействует с гидроперекисями липидов и инициирует окислительную модификацию липопротеинов. Окислительная модификация липопротеинов проявляется в перекисном окислении полиненасыщенных жирных кислот и изменении поверхностного заряда, влияющего на электрофоретическую подвижность липопротеинов. Причем, для модификации липопротеинов гемоглобином не обязательно требуется присутствие экзогенных оксидантов, таких как например, перекись водорода. Гидроперекиси липидов могут взаимодействовать с оксигемоглобином (НЬ

Fe"-02) подобно перекиси водорода, формируя феррилгемоглобин (НЬ

IV

Fe =0). Добавление антиоксиданта ионола предотвращает быстрый переход оксиНЬ в феррил гемоглобин и ингибирует перекисное окисление липопротеинов. Эта реакция приводит к перекисному окислению липидов и окислению оксигемоглобина в более реакционноспособные состояния.

Гемоглобин, стимулируя ПОЛ, повреждает ткани. In vitro стимуляция гемоглобином ПОЛ рассматривалась в работе [132]. Автор изучал систему гемоглобин и мицеллы жирных кислот. Было показано, что гемоглобин стимулирует окисление липидов, которое регистрировалось как образование диеновых конъюгатов и ТБК активных продуктов. Гемоглобин слабо стимулирует ПОЛ при рН 7,4, но скорость значительно возрастает при рН 6,5. Первая начальная фаза ПОЛ (15-20 мин) не ингибировалась хелаторами свободного железа - трансферрином или десфералом. Однако, вторая медленная фаза ПОЛ частично ингибировалась трансферрином или десфералом. Gutteridge et al. [132] предположили, что гемоглобин стимулирует ПОЛ в первую фазу, разлагая перекиси липидов присутствующие во всех препаратах липидов). Образуются R02 радикалы, продолжающие развитие реакций ПОЛ, затем продукты ПОЛ разрушают гемоглобиновую молекулу и высвобождают железо, которое связывается с трансферрином.

Присутствие гемоглобина в центральной нервной системе может приводить к развитию таких заболеваний как паралич или эпилепсия [186,243]. In vitro микроинъекции гемоглобина в гомогенаты головного или спинного мозга продуцируют десферал-ингибируемое перекисное окисление липидов, предполагающее, что железо, освобождаемое из гемоглобина, действует как катализатор этого процесса в ЦНС [246]. В работе [236] изучали низкоинтенсивную хемилюминесценцию гомогенатов мозга крыс при добавлении к ним аскорбата и гемоглобина. Добавление гемоглобина в концентрациях 15-75 мкМ приводит к увеличению хемилюминесценции. Причем эта хемилюминесценция ингибировалась десфералом. Это свидетельствует о том, что не гем, а железо высвобождаемое из гемоглобина, ответственно за окислительные реакции, приводящие к испусканию света в системе. Результаты этой работы сходны с результатами работы Gutteridge et al. [124], который показал, что гемопротеины могут образовывать десферал-ингибируемые флюоресцирующие липидные комплексы. Также было предположено участие свободного железа, освобождаемого из гема, в реакциях приводящих к ПОЛ. Добавление аскорбата к гомогенатам мозга в концентрациях 1 и 2 мМ приводило к увеличению хемилюминесценции. При больших концентрациях аскорбата происходило уменьшение хемилюминесценции. Преинкубация гомогенатов мозга с аскорбатоксидазой ингибирует и спонтанную ХЛ и гемоглобин-зависимую хемилюминесценцию, что свидетельствует о том, что аскорбат необходим для реакций перекисного окисления. Сходные процессы могут происходить in vivo в головном мозге Некроз тканей головного мозга встречается, когда гемоглобин проходит через гемато-энцефалический барьер. Некроз есть следствие железо-зависимого окислительного повреждения, вызванного высоким содержанием аскорбиновой кислоты в мозге. Авторы предложили следующие реакции, вовлеченные в окислительный процесс: Аскорбиновая кислота может начать реакцию с низкими концентрациями хелатированнного железа, генерируя перекись водорода.

3+ 2+

Аскорбат + Fe > Fe + радикал семидегидроаскорбата (1)

Также может происходить окисление аскорбиновой кислоты:

Аскорбат + 02 02 + радикал семидегидроаскорбата (2)

В результате восстановления 02 " аскорбиновым радикалом или в результате спонтанной дисмутации супероксидного анион-радикала образуется перекись водорода. радикал семидегидроаскорбата + 02 Н202 + дегидроаскорбат (3)

202 + 2Н+ ->• Н202 + 02 (4)

Перекись водорода может реагировать с восстановленным железом или метгемоглобином, приводя к образованию более сильных оксидантов (реакции 5 и 7). н202 + (НЬ-Ре2+) -> (НЬ-Ре3+) + ОН + ОН' (5)

2Н202 + НЬ'" -> НЬ'У + 2Н20 + 02 (6)

ОН может вызывать освобождение добавочного железа из гемоглобина, а также окислять жирные кислоты.

1*Н + ОН I* + н20 (7)

IV III

14Н + НЬ -> + НЬ (8) К- + 02 140, (9)

Столкновение двух пероксильных радикалов может генерировать синглетный кислород и невозбужденные карбонилы или молекулярный кислород и триплетные карбонилы (реакции 10 и 11).

2Я02 -> 102 + ROH + ^"СО (10)

2РЮ2 302 + КОН + ^"СО* (11)

Синглетный кислород при добавлении к ненасыщенным жирным кислотам продуцирует диоксиэтаны с дальнейшим образованием триплетных карбонилов (реакции 12 и 13).

КСНяСШ?" + 102 -> ^СНО-ОСН!*" (12)

СНО-ОСНР" Р'СНО* + 1*" +СНО (13)

Усиление ХЛ при добавлении энергетических акцепторов дибромоноантрацена (ДБА) и дифенилантрацена (ДФА) свидетельствует о том, что и триплетные и синглетные возбужденные вещества являются ответственными за испускание света.

Токсичность свободного гемоглобина в головном мозге рассматривалась также в работе [228]. Экспериментальные результаты показали, что высокий уровень гемоглобина может быть соотнесен с развитием эпилепсии, так как гемоглобин способствует окислению липидов мозга. Интерстинальный гемоглобин действует как начало энцефалического воспаления.

2.2. Взаимодействие гемоглобина с Н202 и органическими гидроперекисями.

2+

Исследования последних лет показали, что железо (Ре ) в нативном оксигемоглобине каталитически неактивно, т.е. не может разлагать перекись водорода радикальным путем. Однако, перекись водорода и органические гидроперекиси могут модифицировать оксигемоглобин с образованием более реакционноспособных соединений - феррилНЬ и перферрилНЬ [122]. Оксигемоглобин автоокисляется с относительно медленной скоростью в метгемоглобин и супероксид-анион радикал, который дисмутирует в перекись водорода [284,285].

В последнее время интерес к механизмам повреждения тканей активными формами кислорода был сфокусирован на взаимодействии гемопротеинов с Н202. Изучались реакции гемопротеинов, активированных перекисью водорода, с различными субстратами. Было показано, что реакционноспособные вещества, образующиеся при взаимодействии гемопротеинов с перекисью водорода, способны вызывать перекисное окисление жирных кислот, окисление 0-каротина, аскорбиновой кислоты, метионаля [166], мочевой кислоты [37], фенолов [205], а также окисление стирена с образованием эпоксидов [219]. В работе [244] изучали образование гидроксильного радикала при взаимодействии гемоглобина с перекисью водорода и с супероксид-анион радикалом, образующимся в ксантиноксидазной системе. Авторы показали, что в обеих реакциях образуется эквивалентное количество гидроксильного радикала. По мнению авторов потенциальный оксидант - гидроксильный радикал образуется в результате реакции, похожей на реакцию Фентона, между гемовым железом

2+

Ре и перекисью водорода. В этой реакции образуется метгемоглобин, гидроксильный радикал, гидроксильный анион. Было также показано, что гемоглобин в присутствии супероксидгенерирующей системы вызывает окисление арахидоновой кислоты и полиненасыиценных жирных кислот мембран эритроцитов и накопление МДА. Причем, замена шестой координационной связи железа СО или предварительное окисление гемоглобина в метНЬ блокирует этот процесс. С другой стороны, ЗиКепйде а1. [134] показали , что при тех концентрациях перекиси водорода, которые использовали авторы, происходит быстрое разрушение молекулы гемопротеина и высвобожденное железо участвует в реакции каталитического разложения перекиси водорода. В работе [268] было показано, что ПОЛ мембран эритроцитов может быть вызвано гемоглобином в присутствии бутилгидроперекиси, причем карбоксигемоглобин и оксигемоглобин оказались более эффективными активаторами ПОЛ, чем метгемоглобин. Результаты работы [87] показали, что гемоглобин -необходимый компонент для ПОЛ мембран эритроцитов в присутствии перекиси водорода. Гемовое железо, чтобы быть эффективным катализатором ПОЛ, должно быть в восстановленной форме. Перекисное окисление липидов, инициированное гемоглобином, активированным перекисью водорода, изучалось также в работах [101,241].

Также пристальное внимание исследователей было сосредоточено на количественных соотношениях гемоглобин/перекись водорода в окислительных реакциях. В работе [172] было показано, что метмиоглобин и метгемоглобин, активированные низкими концентрациями перекиси водорода, инициируют ПОЛ мембран. Причем, наибольший прооксидантный эффект был достигнут при соотношении метгемоглобина и перекиси водорода 1:1. В тоже время в отсутствии перекиси водорода метгемоглобин не инициировал ПОЛ. Перехватчики гидроксильных радикалов, такие как этанол, ДМСО, бензоат, не ингибируют эту реакцию. Если добавить каталазу в начале реакции, то прекращалась активация метмиоглобина перекисью водорода. При добавлении каталазы через 3 минуты после взаимодействия метмиоглобина с перекисью водорода, ингибирующего эффекта не наблюдалось. Авторы считают, что активатором ПОЛ выступает интермедиат, катион-радикал порфирина, образующийся при взаимодействии метмиоглобина или метгемоглобина с перекисью водорода.

Порфирин катион-радикал имеет сходство с соединениями I и II пероксидазы [84].

Низкие концентрации перекиси водорода, активирующие гемопротеины, могут образовываться при автоокислении гемоглобина в метгемоглобин с образованием супероксид-анион радикала. Супероксид-анион радикал дисмутирует в перекись водорода. При взаимодействии метгемоглобина с перекисью водорода внутри эритроцитов образуется оксидант, который атакует мембраны изнутри. Также такие активные формы кислорода, как супероксид-анион радикал или перекись водорода, могут образовываться в очагах воспаления активированными нейтрофилами. Авторы предложили следующую схему ПОЛ гемоглобином и миоглобином.

1) Автоокисление и кислородная активация [56]

Hb-Fe"=02 н+'рь2+'анионы' фагоцит°3 > Hb-Fe" + 02

Hb-Fe" +02 и+'рь2+анионы> Hb-Fe" + 02"

02 +02 Н202 + 02

2) Каталитическая активация I [205].

Hb-Fe'" + Н202 Hb-Fe ' -O-OH Hb-Fe "-0-0-H Hb-Fe'V-0 + Н20

IV - + IV

Hb-Fe -О Hb "Fe =0

3) Инициирование окисления липидов.

Hb+-Fe'V=0 + LH -> Hb-Fe'V=0 +L + Н+ L + 02 LOO

LOO + LH LOOH + L

Hb-Fe'V=0 + LOOH Hb-Fe'" + LOO + OH'

LOO + LH LOOH + L

4) Каталитическая активация II [167,274].

Hb-Fe'" + LOOH P-FeIH-0-0-L

Hb-Fe" -0-0-L Hb+-Fe'V=0 + LOH

В работе Harel et al. [136] изучали окисление 2-кето-4-тиометилмасляной кислоты (КТМК) и метионина гемопротеинами, активированными низкими концентрациями перекиси водорода. Перекись водорода генерировалась в ферментной системе. Также было изучено ПОЛ мембран, инициированное активированными гемопротеинами. Авторы показали, что перехватчики гидроксильных радикалов частично уменьшают окисление КТМК, а СОД и ЭДТА не ингибируют реакцию. Также не ингибировал ЭДТА ПОЛ, инициированное гемопротеинами активированными перекисью водорода. Метионин окислялся в этилен системой генерирующей гидроксильные радикалы, но не окислялся метмиоглобином, активированным перекисью водорода. Было сделано заключение, что феррил-ион железа находящийся в составе гема, а не гидроксильный радикал является важнейшим оксидантом в системах, содержащих миоглобин и гемоглобин, активированные низкими концентрациями перекиси водорода. Только высокие концентрации перекиси водорода (в 10-30 раз большие, чем концентрации гемопротеина) разрушают молекулу гемопротеина и освобождают железо, формируя систему окисления, зависимую от свободного железа и гидроксильного радикала.

Аналогичные механизмы реакции гемовых соединений с гидроперекисями были предложены Davies et al. [98], изучавшим эти реакции методом спиновых ловушек. Было показано, что в присутствии ДМПО при взаимодействии оксигемоглобина, метгемоглобина, метмиоглобина, цитохрома с, каталазы или пероксидазы хрена с гидроперекисью третбутила или кумила образуются спиновые аддукты алкоксильных и пероксильных радикалов. Проанализировав эксперименты с различными ингибиторами гемовых ферментов (CN", N3", СО,имидазолом), автор предположил, что реакции гемолитического разрыва связи 0-0 в гидропероксидах происходят в гораздо меньшей степени, чем реакции образования радикалов с участием порфирин катион-радикала:

Hb-Fe111 + ROOH Hb-Felv-OH +R0 Hb-Felv-OH +ROOH -> P-Fe(lll) +R00- +H20

Hb-Fe111 + ROOH Hb+-Felv=0 + ROH

Hb+-Felv=OH + ROOH Hb-Felv=0 + ROO + H+

Образование феррилгемоглобина изучалось также в работе [266]. Использовались концентрации гемоглобина 60 мкМ и перекиси водорода 50500 мкМ. Окисление гемоглобина перекисью водорода протекает в 2 шага. Сначала образуется феррил-Hb и затем формируется гемихром. Последний процесс не зависит от перекиси водорода, так как реакция запущена. Этот процесс отличается от того, что получено для изолированных субъединиц. Цепи непосредственно окисляются в гемихром, тогда как гемоглобин первоначально окисляется в феррил форму. Это свидетельствует о том, что ассоциация а и ß цепей в тетрамер действует как защитный механизм против атаки оксидантов, таких как перекись водорода или супероксид-анион радикал, присутствующих в эритроцитах. Weiss и соавт. [292] показали, что микросомальное ПОЛ может играть значительную роль в воспалении. Используя гемоглобин-катализируемое перекисное окисление фосфо-липидов, как модель окислительного повреждения мембран, была исследована способность противовоспалительных лекарств ингибировать эту реакцию. Было найдено, что гемоглобин, взаимодействуя с перекисью водорода, образует радикальные и нерадикальные формы, например феррил гемоглобин (Hblv), которые способны инициировать ПОЛ. И это взаимодействие не является результатом перекись-зависимого освобождения железа из гемопротеина.

Феррил-НЬ является сильнейшим оксидантом, который усиливает окисление различных биомолекул [72]. В работе [122] было рассмотрено

IV образование феррилгемоглобина (НЬ-Ре -ОН), который образуется в ш реакции между оксигемоглобином (НЬ-Ре ) и Н202 в эритроцитах. Авторы предложили схемы реакций взаимодействия оксигёмоглобина с перекисью водорода.

Н+ + НЬ-Ре"02 + Н202 НЬ-Ре^-ОН + 02 + Н20 (1)

Эта реакция характеризует первоначальное окисление НЬ-Ре"о2 перекисью водорода с образованием феррил соединения и кислорода. 1, 2 и 3 реакции будут протекать при низких концентрациях гемопротеина и при некотором избытке перекиси водорода.

НЬ-Ре^-ОН + Н202 НЬ-Ре" + Н20 + Н02 (2) где Н02 гидродиоксильный радикал.

НЬ-Ре" + Н202 + Н+ Н20 + НЬ-Ре^-ОН (3)

При высокой концентрации гемоглобина большая часть перекиси водорода будет израсходована в реакции 1. При этих условиях будет протекать реакция 4.

НЬ-Ре'У-ОН + НЬ-Ре"о2 2НЬ-Ре"' + 02 (4)

Эта реакция может иметь большое значение в эритроцитах (где высокая концентрация гемопротеина) для удаления такого сильного оксиданта, как феррилгемоглобин [289].

Взаимодействие перекиси водорода изучалось также с другим гемопротеином - миоглобином [107]. Представляло интерес определить природу веществ генерируемых в результате реакции между метмиоглобином и избытком перекиси водорода. Авторы показали, что в результате реакции образуются продукты, которые гидроксилируют салицилат, окисляют холестерол с формированием гидропероксида и генерируют электронно-возбужденные состояния, регистрируемые методом хемилюминесценции. Также эти продукты вовлечены в инициирование перекисного окисления полиненасыщенных жирных кислот. Возможными i кандидатами могут быть, по мнению авторов, синглетный кислород [ 02], НО

IV IV или высокоокисленные состояния миоглобина (Mb или Mb ). Могут иметь место следующие реакции:

Mb'"(Fel") + Н202 MbV(FeV=0) + Н20 (1) MbV(FeV=0) +Н202 -> Mb ^Fe" ) + Н20 + Ъ2 (2)

2Н202 2Н20 + 102 (3)

Синглетный кислород реагирует с линолеатом с формированием соответствующих гидроперекисей

LH + 102 LOOH (4)

Далее гидроперекиси разлагаются высокоокисленными состояниями

IV . IV V метмиоглобина (Mb , Mb , Mb ), которые могут формироваться в реакциях:

Mbm(Fe") + Н202 MbIV(Fe'V-OH) + ОН или

Mb'^Fe") + Н202 Mb'V( globin-Fe'V-OH) + Н20

LOOH + Mb'V(FeIV-OH) LOO + ОН + Mb'^Fe'") (5)

В результате реакции диспропорционирования липидных пероксильных радикалов формируются электронновозбужденные состояния, дающие хемилюминесценцию.

LOO + LOO LOH + LO* + Ог(6)

LOO + LOO LOH + LO- + 102 (7)

2.3. Высвобождение ионов железа из гемопротеинов под воздействием Н202 и гипохлорита.

Впервые механизм разрушения перекисями молекулы гемопротеинов и высвобождение железа было рассмотрен в работе [134]. Железо высвобождается из гемоглобина при инкубации его с перекисью водорода или органическими гидроперекисями. И именно это железо, а не гемовое железо способно участвовать в образовании гидроксильного радикала. Высвобождаемое железо может быть измерено феррозиновым или блеомициновым методом. Каталаза предотвращает высвобождение железа из гемопротеина. Высвобожденное железо вызывает деградацию дезоксирибозы и это может быть измерено, используя флюорометрическую ТБК реакцию. Высвобожденное железо также стимулирует ПОЛ мицелл линоленовой кислоты. ПОЛ и деградация дезоксирибозы ингибируются апотрансферрином, десфералом, пропилгаллатом и церулоплазмином. Высвобождение железа из гемопротеинов изучалось также в работе [143]. Были применены спектроскопические методы для регистрации реакции перекиси водорода с метмиоглобином, метгемоглобином, цитохромом с. Высвобождение железа из гемопротеинов было изучено в ферментной системе, генерирующей перекись водорода, или при добавлении больших количеств перекиси водорода. В ферментной системе, которая генерирует низкие концентрации перекиси водорода, метмиоглобин и метгемоглобин разрушались значительно быстрее, чем цитохром с. В системе, содержащей большие количества перекиси водорода, цитохром с разрушался и железо высвобождалось более быстро, чем это происходило с метгемоглобином и метмиоглобином. Метгемоглобин и метмиоглобин - молекулы, где железо имеет пять заполненных кординационных связей, взаимодействуют с перекисью водорода, формируя комплекс в котором железо находится в состоянии Ре(1\/). Этот активный продукт может взаимодействовать с другими темами, продуцируя порфирин-радикал, который дестабилизирует молекулу.

Интересно, что механизмы взаимодействия окси и метгемоглобина с перекисью водорода различны. Способность окси- и метНЬ генерировать гидроксильный радикал из перекиси водорода изучалась в работе [239]. Для регистрации гидроксильного радикала была использована реакция деградации дезоксирибозы и ароматического гидроксилирования фенилаланина. 10-кратный избыток перекиси водорода по сравнению с гемом разрушает гем и высвобождает железо из белка. Ионы железа затем реагируют с перекисью водорода, давая гидроксильный радикал в реакции Фентона. Если недостаточное количество перекиси водорода для деградации метгемоглобина было использовано, наблюдалась незначительная деградация дезоксирибозы или гидроксилирование фенилаланина. При взаимодействии избытка перекиси водорода с оксигемоглобином образовывался метгемоглобин и освобождались из него ионы железа. При взаимодействии с оксигемоглобином эквимолярных количеств перекиси, образовывались некоторые активные продукты, которые могли разлагать дезоксирибозу, но не гидроксилировать фенилаланин. Вероятно, что это могли быть феррил-соединения.

В супероксидгенерирующих системах содержащих миелопероксидазу образуется и другой сильный окислитель-гипохлорная кислота (НОС1) или гипохлорит (ОС1) [290]. Это вещество, продуцируемое нейтрофилами, является более сильным окислителем, чем перекись водорода и способно реагировать со многими субстратами, в том числе с аминокислотами и протеинами [50,198]. В работе [12] было продемонстрировано высвобождение железа из гемоглобина при инкубации его с 20-кратным избытком гипохлорита. Взаимодействие гемоглобина с гипохпоритом приводило к изменению спектра поглощения гемоглобина, которое выражалось в уменьшении поглощения в области полосы Соре. Разрушение гемоглобина сопровождалось высвобождением ионов железа, концентрацию которых оценивали по образованию окрашенного комплекса железо-о-фенантролин. Как было показано, высвободившееся железо каталитически активно. Так, инкубация гемоглобина с избытком перекиси водорода или гипохлорита приводит к увеличению Н202 - хемилюминесценции гемоглобина. Способность модифицированного гемоглобина образовывать свободные радикалы из перекиси водорода происходит не только за счет освобождения из него ионов железа. Причем гипохлорит оказался более эффективен в повреждении гемопротеина, чем перекись водорода. Таким образом, механизм взаимодействия гипохлорита с гемоглобином в отличие от его реакций с негемовыми протеинами заключается не только в хлорировании аминокислотных остатков, но и в освобождении из гемоглобина железа.

Можно видеть, что приведенные выше данные подтверждают важную роль гемоглобина в инициировании реакций ПОЛ как in vivo, так и in vitro. Для защиты от повреждающего действия гемоглобина в эритроцитах существуют - ферменты СОД, каталаза, GSH-пероксидаза. При гемолизе эритроцитов гемоглобин попадает в плазму, где концентрация этих ферментов значительно ниже. Для защиты от внеэритроцитарного гемоглобина служит белок плазмы - гаптоглобин, удаляющий свободный гемоглобин из циркуляции.

2.4. Изменение физико-химических свойств гемоглобина при образовании комплекса с гаптоглобином.

Одна из функциональных задач гаптоглобина в организме состоит в удалении свободного гемоглобина из плазмы крови [70,240]. В норме концентрация гаптоглобина постоянна. Но концентрация белка изменяется у пациентов с различными заболеваниями. Высокие уровни гаптоглобина найдены при воспалительных и неопластических заболеваниях, тогда как гемолитические состояния и заболевания печени сопровождаются уменьшением плазменных уровней белка [233,240,250]. Если в организме одновременно происходит внутрисосудистый гемолиз и воспаление, то комплексование Hp с гемоглобином и уменьшение уровня плазменного гаптоглобина случается быстрее, чем увеличение концентрации гаптоглобина, как белка острой фазы [288]. Недавние исследования показали, что гаптоглобин имеет иммуномодуляторные свойства, которые могут быть более физиологически важные, чем удаление гемоглобина [215].

Хорошо известно, что при связывании с гаптоглобином изменяются некоторые свойства гемоглобина. Так, например, сродство гемоглобина к кислороду увеличивается в 30 раз при связывании с гаптоглобином. Увеличение сродства гемоглобина к кислороду в Нр-НЬ комплексе может отражать конфигурационные изменения в молекуле гемоглобина. Кроме того кривая связывания кислорода с гемоглобином, образовавшим комплекс, имеет не сигмовидный характер, как следствие отсутствия гем-гемовых взаимодействий [85]. Были описаны конформациооные изменения молекулы гемоглобина, связанной с гаптоглобином, которые могут быть сравнены с конформационными различиями между окси и дезоксигемоглобином [146]. Известно, что существуют два конформационных состояния гемоглобина с высоким и низким (Т) сродством к молекулярному кислороду. (Ч-Т переход случается в оксигемоглобине наряду с выделением С>2 и формированием дезоксигемоглобина. Существуют некоторые низкомолекулярные аллостерические эффекторы, осуществляющие [Ч-Т переход гемоглобина. Например, в эритроцитах находится 2,3-диглицерофосфат, который фиксирует Т состояние гемоглобина, при этом происходит высвобождение кислорода в ткани. Атом железа в каждом геме дезоксигемоглобина формирует пять координационных связей и способен связывать другой лиганд (02, С1Ч~, СО) с формированием октатедрального комплекса с координационным числом 6. В дезоксигемоглобине атом железа присутствует в высокоспиновом состоянии и выдается из плоскости порфиринового кольца в направлении проксимального гистидина. В оксигемоглобине атом железа находится в низкоспиновом состоянии и находится в плоскости порфиринового кольца. Было показано, что при связывании с гаптоглобином в гемоглобине происходят такие конформационные изменения, что формируется Т состояние гемоглобина [103]. При применении спектрофотометрических измерений было продемонстрировано для Нр-НЬ комплекса появление через несколько часов полос поглощения при 500 нм и 630 нм, свидетельствующих о переходе из 14 в Т состояние. Сходные изменения в спектрах были получены при добавлении к гемоглобину или к комплексу белков дитионита натрия, при этом формируется дезоксигемоглобин. Однако при образовании комплекса с гаптоглобином, у гемоглобина увеличивается сродство к кислороду, поэтому, возможно, 1Ч-Т переход не связан с высвобождение кислорода из гемоглобина. Авторы предположили, что имеет место медленное высвобождение кислорода из гемоглобина комплекса. Связывание Нр с НЬ02 вызывает медленные изменения третичной и четвертичной структуры глобиновой части оксигемоглобина. Конформация глобиновой части приводит в движение проксимальный гистидин с которым связан центральный атом железа. Связь эта сильная и длина ее одинакова в окси и дезоксигемоглобине. Поэтому, как предполагают авторы, атом железа следует за проксимальным гистидином, выдвигаясь из плоскости порфиринового кольца. Это может приводить к изменению в структуре гема, которое может быть ответственно за изменение спинового состояния железа.

Также изменяются спектры кругового дихроизма гемоглобина в области полосы Соре при связывании гемоглобина с Нр 2-2 или с Нр 2-1 [283]. Сходные результаты были получены в работе [139]. Спектры кругового дихроизма обеспечивают информацию о локальном окружении гемового хромофора. Спектры кругового дихроизма в полосе Соре Нр-НЬ комплекса отличаются от спектров гемоглобина. Это свидетельствует, что окружение гема гемоглобина меняется при связывании с гаптоглобином. Кроме того, авторами было показано, что обмен гема между гемоглобином и альбумином блокируется при образовании Нр-НЬ комплекса. Не было обнаружено существенных отличий между спиновым состоянием и лигандным полем железа в свободном гемоглобине и гемоглобине связанном с гаптоглобином. Исследованию влияния гаптоглобина на гемоглобин была также посвящена работа [33]. Так наблюдались изменения в полосе Соре оксигемоглобина (максимум поглощения сдвигался в коротковолновую область), которые свидетельствовали об окислении оксигемоглобина в метгемоглобин. Для комплекса Нр-НЬ изменений в спектре в полосе Соре не наблюдалось, вероятно, гаптоглобин оказывает защитное влияние на молекулу гемоглобина. Однако, это стабилизирующее влияние проявлялось при рН>4. При рН<4 оксигемоглобин, связанный в комплексе с гаптоглобином также быстро превращался в метгемоглобин, что приводило к сдвигу максимума его спектра от 415 нм до 405 нм. Как известно, гемоглобин кислотолабильный белок. При рН<4 происходят существенные изменения на спектре гемоглобина, что проявляется в исчезновении максимума в полосе Соре. Максимум на спектре комплекса сохраняется даже через час инкубации при рН = 3,5. Таким образом, комплексование гемоглобина с гаптоглобином препятствует кислотной денатурации гемоглобина. Более того, как показали авторы, после инкубации денатурированного метгемоглобина с гаптоглобином. в его спектре вновь появляется максимум, характерный для нативного метгемоглобина и его комплекса с гаптоглобином. Ренатурация метгемоглобина в этих условиях не наблюдалась. Гаптоглобин способен связывать в комплекс и метгемоглобин денатурированный при рН=3,5.

Как известно, гемоглобин может проявлять ферментативную активность. Гемоглобин может катализировать пероксидазную реакцию, то есть окисление субстрата в присутствии Н2О2. Интересно, что более высокая пероксидазная активность гемоглобина наблюдается в комплексе с гаптоглобином. Этот феномен был использован для аналитического определения гаптоглобина со времен его открытия. Исследованию ферментативной активности свободного и связанного гемоглобина была посвящена работа [133]. Было показано, что в пероксидазной реакции, катализируемой метгемоглобином или метНЬ-Нр (флюоресцеин был использован как субстрат) генерируются электронно-возбужденные продукты реакции, которые можно регистрировать с помощью метода хемилюминесценции. При реакции метгемоглобина с перекисью водрода образуется промежуточный окисленный продукт-метНЬ-пероксид (метНЬ-Р). МетНЬ-Р может принимать два электрона от субстрата, который окисляется. В этой реакции один электрон восстанавливает катион-радикал белковых аминокислотных остатков, в то время как другой электрон восстанавливает феррил ион железа до трехвалентного состояния. Электронно-возбужденные состояния формируются при восстановлении катион-радикала метНЬ-Р в соединение метНЬ-П (сходное с соединениями пероксидазы II), которое не является радикалом.

Гемоглобин может также катализировать оксидазную реакцию, как например окисление 2-метилпропанола в присутствии кислорода. При этой реакции также формируются электронно-возбужденные состояния. Но в этом случае, как показали исследования авторов, интенсивность хеми-люминесценции одинакова для метгемоглобина и метНЬ-Нр. Применение акриламида,как тушащего агента триплетного ацетона в оксидазной реакции, приводило к большему тушению хемилюмисценции в случае метгемоглобина, чем в случае метНЬ-Нр. Авторы сделали предположение, что при образовании комплекса происходят конформационные изменения гемового окружения метгемоглобина. Эти конформационные изменения мешают проникать тушащей молекуле в гемовую полость в метНЬ-Нр комплексе, где генерируются электронно-возбужденные продукты.

Влияние гаптоглобина на ПОЛ было исследовано в работе [244]. Было показано, что связывание свободного гемоглобина гаптоглобином приводит к значительному уменьшению гидроксильных радикалов, генерируемых свободным гемоглобином. Гаптоглобин также уменьшает гемоглобин-зависимое ПОЛ в липосомах. Возможно, антиоксидантные свойства гаптоглобина имеют место вследствии стабилизации гемовых групп [161]. Очевидно, что наиболее сильное повреждающее действие гемоглобина должно быть выражено у индивидуумов с низким уровнем плазменного гаптоглобина. Так в работе [228] авторы соотносят наследственную или приобретенную гипогаптоглобинемию с эпилепсией. Свободный гемоглобин действует как начало энцефалического воспаления. И повреждающее действие гемоглобина наиболее сильно выражено вследствии его слабой элиминации гаптоглобином. Дальнейшие исследования антиоксидантных свойств гаптоглобина были проведены СиИепс1де а1. [132]. ПОЛ, инициированное гемоглобином значительно ингибировалось гаптоглобином. Контрольный белок альбумин не ингибировал эту реакцию вовсе. Гемоглобин, денатурированный нагреванием при 100°С, также стимулировал ПОЛ. Но в этом случае ПОЛ не ингибировалось гаптоглобином. Автор сделал вывод, что гаптоглобин является эффективным антиоксидантом ¡п vivo, быстро удаляющим гемоглобин, предотвращая радикал-продуцирующие реакции гемоглобина.

3. Биологические реакции окиси азота.

Обнаружение генерации окиси азота в организме привело к всплеску исследований, посвященных изучению роли N0 в организме. Как позднее оказалось N0 оказалась вовлечена в многочисленные физиологические реакции начиная от регуляции сердечно-сосудистой системы и до повреждения функций нейронов [96,162,214]. Исследователи обнаружили, что N0, не только участвует в поддержании гомеостаза, но и является участником патогенеза многих заболеваний, таких как артрит, атеросклероз, рак, диабет, множества дегенеративных заболеваний, шок и инфаркт миокарда [96,131]. Однако, такое множество функций в организме вызывает споры о конкретном механизме участия N0 в реакциях организма. Известно, что N0 и ее производные могут ингибировать ферменты, повреждать ДНК и индуцировать перекисное окисление липидов, N0 обладает антиоксидантными свойствами. Чтобы понять действительные механизмы в которых N0 участвует в организме, следует познакомиться с основными известными химическими реакциями N0.

Все реакции N0 можно условно разделить на две категории: прямые и опосредованные [297-299]. К прямым реакциям N0 относятся такие, где N0 непосредственно взаимодействует с биологическими молекулами, напротив к опосредованным реакциям можно отнести такие, где участвуют т.н. "активные формы N0", например, продукты взаимодействия N0 с супероксидными радикалами, кислородом и т.д. [297]. Прямые и опосредованные реакции N0 могут быть также различены и на основании концентрации N0: прямые реакции обычно имеют место при низких концентрациях N0 - 1 цМ и ниже. В то же время, опосредованные реакции N0 протекают при концентрациях N0 1 цМ и выше. Опосредованные реакции N0 могут быть даллее разделены на следующие группы: реакции окисления, нитрозилирования и нитрования. Эти группы включают реакции одно- или двухэлектронного окисления, аналогично реакциям гидроксилирования или присоединения NO+ (например присоединения NO+ к аминам, тиолам илиоксисоединениям) или присоединение N02+ (например, присоединение N02+ к молекуле тирозина) соответственно.

3.1. Прямые реакции N0.

К прямым реакциям N0 можно отнести три группы реакций - 1) непосредственное взаимодействие N0 с металлокомплексами, 2) взаимодействие N0 с металлокомплексами, содержащими молекулу кислорода и 3) реакции с оксокомплексами высоких валентностей. Самой распространенной реакцией N0 с металлопротеинами является реакция N0 с гемопротеинами (например, гуанилатцикпазой или цитохромом Р450). Взаимодействие N0 с гуанилатциклазой приводит к активации фермента в результате образования Fe-нитрозильного комплекса [217]. Концентрация N0 необходимая для активации гуанилатцикпазы, весьма невелика и составляет 100 нМ. В противоположность взаимодействию N0 с гуанилатциклазой, взаимодействие N0 с цитохромом Р450 приводит к ингибированию последнего [301]. Ингибирование цитохрома Р450 может иметь важные патофизиологические последствия. При хронической инфекции или септическом шоке N0 образуется в больших количествах и таким образом может заингибировать цитохром Р450, отвечающий за детоксикацию лекарств, применяемых для борьбы с инфекцией, и тем самым увеличить их лечебный эффект [179].

Важной реакцией N0 с оксокомплексами металлов является его реакция с оксигемоглобином, в результате которой образуется метгемоглобин и нитрат [106,112]:

Hb(Fe2+-02) + N0 MetHb(Fe3+) + N03"

Благодаря высокой концентрации гемоглобина в организме эта реакция является основной реакцией детоксикации N0 в организме и самой вероятной судьбой образовавшегося NO in vivo.

Взаимодействие NO с оксометаллокомплексами высоких валентностей, т.е. с феррил гемопротеинами, приводит к деактивации этих комплесов и снижению их окислительных свойств [127,175]:

Fe2+(or Fe3+) + Н202 -> Fe4+(or Fe6>0 + Н20

Fe4+=0 + NO Fe3+ + N02"

Дезактивация металлокомплексов высоких валентностей - одна из важных физиологических функций N0, защищающая организм от повреждений. Взаимодействие N0 с каталазой приводит к восстановлению оксокомплексов соединения I и II и т.о. N0 ингибирует утилизацию Н202 клетками, и повышает противоопухолевую активность макрофагов [110]. N0 в концентрации 10-15 цМ ингибирует примерно 80% потребления Н202 клетками.

Еще одним проявлением прямой реакции N0 является ее взаимодействие со свободными радикалами. Например, тирозильные радикалы, образующиеся при работе рибонуклеотид редуктазы легко реагируют с N0 [192], что в конечном итоге приводит к инактивации фермента. Эту реакцию N0 можно отнести к цитостатическим свойствам N0, т.к. она блокирует синтез ДНК.

Перекисные радикалы липидов могут реагировать с N0 со скоростями близкими к диффузионным [238,296]:

LOO + N0 -> LOONO

В общей схеме реакций перекисного окисления липидов эта реакция N0 относится к реакциям обрыва цепей, и является механизмом защищающим клетки от повреждающего действия перекисного окисления липидов. Эта реакция играет важную роль в защите липопротеидов низкой плотности от окисления, что особенно важно при атерогенезе.

3.2. Опосредованные реакции N0.

В отличие от прямых реакций, где N0 непосредственно взаимодействует с другими молекулами, в опосредованных реакциях принимают участие т.н. "активные формы N0", т.е. продукты реакций N0/02 или N0/02".

Взаимодействие N0 и 02 - одна из самых распространенных реакций N0 в организме. N0 является нестабильной молекулой в атмосфере кислорода и претерпевает превращения по реакциям, продукты которых (N02 и М203) обладают сильным повреждающим действием [253]:

2 N0 + Ог -» 2 N02

N02 + N0 N203

Реакция окисления N0 молекулярным кислородом имеет второй порядок относительно N0. Это означает, что если начальная концентрация N0 составляет 1 дМ, то время полупревращения молекулы N0 будет около 800 с, однако, если концентрация N0 увеличится до 100 цМ, то время полупревращения упадет до 8 с. Эти расчеты показывают, что при низких концентрациях и в отсутствие перехватчиков N0 может диффундировать на весьма большие расстояния даже в атмосфере кислорода, а при высоких концентрациях N0 реакции N0 замещаются реакциями ее производных (N02 или N203). Интересно, что растворимость N0 в гидрофобных растворителях более чем в 20 раз выше чем в воде, и хотя константы скорости автоокисления N0 кислородом близки между собой в липидной и водной фазах, благодаря разнице в растворимости, скорость автоокисления в мембране существенно выше. N203 - основной продукт автоокисления N0 в биологических системах, его редокс потенциал составляет 0,8 В, что свидетельствует о том ,что N203 является окислителем средней силы по сравнению, скажем, с гидроксильным радикалом [129]. Основная реакция N203 - это нитрозилирование, и в первую очередь аминов до нитрозаминов и тиолов до Б-нитрозотиолов.

Реакция между N0 и супероксидом протекает со скоростями близкими к диффузионным. Продуктом этой реакции является сильный окислитель -пероксинитрит:

N0 + 02' ©N00"

Образование пероксинитрита в организме ограничено двумя факторами: 1) концентрациями участвующих в реакции молекул и 2) наличием в окружении молекулы пероксинитрита перехватчиков, способных реагировать с пероксинитритом. Обычно, концентрация супероксида в тканях, в нормальных физиологических условиях не првышает нескольких наномолей, благодаря высокой скорости реакции дисмутации. Концентрации же N0 в организме составляют доли микромолей, что существенно выше концентрации супероксида. Таким образом, взаимодействие N0 и супероксида в тканях будет реакцией псевдопервого порядка, где порядок определяется высокой концентрацией N0, а количество пероксинитрита будет зависеть от концентрации супероксида. Соединением успешно конкурирующими с N0 за супероксид является супероксид дисмутаза, константа скорости взаимодействия которой с супероксидм близка по величине таковой у N0 [224]. Если СОД регулирует концентрацию супероксида в тканях, то концентрацией N0 управляет оксигемоглобин. Недавно обнаружено, что перксинитрит может образовывать аддукт с С02, который обладает высокой окислительной и нитрующей способностью [200].

Еще одним фактором, ограничивающим концентрацию пероксинитрита в биологических системах, является реакция последнего с N0 или 02~, дающая двуокись азота [213]:

01\Ю0" + N0 -> N02 + N02"

N00' + 02" -> N02 + 02 + N02"

Нодд а1. [157] обнаружили, что пероксинитрит способен индуцировать перекисное окисление липидов. Исследования показали, что наибольшая скорость перекисного окисления липидов достигается при одинаковых концентрациях супероксида и N0, однако избыток N0 снижает скорость перекисного окисления за счет перехватывания пероксинитрита.

Наиболее вероятным местом образования пероксинитрита являются клеточные органеллы, в которых могут образовываться супероксидные радикалы - митхондрии, микросомы. Кроме того, образование пероксинитрита весьма вероятно при активации фагоцитирующих клеток, т.к. их активация напрямую связана с повышенной продукцией супероксидных радикалов. Благодаря различной растворимости кислорода и супероксида в воде и апротонных растворителях можно предположить, что источником 1Ч203 в водных растворах является реакция N0 с 02", а в апротонных растворителях - N0 с 02.

ДНК и РНК могут быть удобными мишенями для "активных форм N0". Существует три основных механизма по которым N0 может разрушать нуклеиновые кислоты. Первый - непосредственное взаимодействие N0 и ее производных с ДНК. Второй - это торможение процессов восстановления ДНК N0. И, наконец, третий - это увеличение образования N0 генотоксичных соединений (алкилирующих агентов и перекиси водорода). Известны факты, когда взаимодействие N0 с ДНК в аэробных условиях приводило к дезаминированию цитозина, аденина и гуанина по реакциям [223,300]:

1ЧН2-Р1 + Ы203 -> 1ММНМ0 + М02"

Р-ЫНКЮ К-МОН 1*-0Н + Ы2

Т.о. дезаминирование происходит в два этапа, сначала образуется первичный нитрозамин, который затем быстро дезаминируется и превращается в оксисоединение с выделением свободного азота.

В зависимости от условий N0 может выступать как про- или антиоксидант. Так Каппег а1. [175] обнаружили, что если в клетках млекопитающих образуются высокоактивные оксо-комплексы гемопротеинов, то N0 может их дезактивировать. Более того N0 может индуцировать синтез белков защищающих клетки от окислительного стресса, вызванного перекисью водорода [225]. С другой стороны, в культуре кишечной палочки N0 сильно увеличивал токсическое действие перекиси водорода [231].

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

1. Материалы

1.1. Реактивы

В работе использовали следующие реагенты: гипохлорит натрия Laborchemie (Германия), о-фенантролин, каталаза и таурин - Serva (Германия), фиколл 400 (Pharmacia, Швеция), люминол (LKB, Швеция), 2-тиобарбитуровая кислота (Merck, Германия).

Миоглобин сердца лошади и гемоглобин эритроцитов крови человека, гидроперекись трет-бутила, диолеил-Ьа-фосфатидилхолин, 5,5-диметил-1-пирролин N-оксид (ДМПО), N-трет-бутил-С-фенил нитрон, форбол-миристат ацетат (ФМА), люминол, десфериоксамин мезилат, 1,1 -дифенил-2-пикрил гидразил (ДФПГ), сульфаниламид, Ы-(1-нафтил)этилендиамин гидрохлорид, аскорбиновая кислота, 0,1-а-токоферол, гексадецил триметил аммоний бромид, фосфат натрия и нитрит натрия были получены от фирмы Sigma (St. Louis, МО). 9-цис, 11 -цис, 13-цис, 1 б-цис-октадекатетраеновая кислота (цис-паринариевая кислота) были получены от Molecular Probes Inc. (Eugene, OR).

Высокочистые газообразные NO' и N2 были поставлены Matheson Co. (Newark, CA). 4,4,5,5-Тетраметил-2-[4-(триметиламмоний)фенил]-3-оксо-2-имидазолин-1-илоксил метил сульфат (нитронил нитроксильный радикал, NNR) был любезно предоставлен Др. И. Григорьевым. Проницаемые для газа тефлоновые трубки (0,8 мм внутр. диаметр, 0,013 мм толщина стенки) предоставлены Alpha Wire Co. (Elizabeth, NJ).

Метанол, этанол и ацетонитрил были получены от Fisher Scientific (Питтсбург, Пеннсильвания). Для экспериментов использовали воду дистиллированную в стеклянной посуде. Буферные растворы очищали с помощью смолы Chelex-100 (Bio-Rad, Геркулес, Калифорния).

1.2. Приготовление убихинола Q10 и К02-краун эфира

Растворы убихинола Q10 и К02 приготавливали как описано в работе [216] с небольшими модификациями: убихинон Q10 (0,5 мМ) восстанавливали

NaBH4 (0,1 г/мл) в этаноле в потоке азота. После закисления полученный бесцветный раствор убихинола Ою экстрагировали гексаном. Экстракт хранили при -20 °С; при хранении убихинола в этих условиях в течение нескольких месяцев окисления последнего не обнаружено.

Раствор прекиси калия (7,1 мг) и дициклогексано-18-краун-6 (80 мг) готовили растворяя порошок в ДМСО (1 мл) при постоянном перемешивании в течении 1 часа в атмосфере азота [280]. Полученный раствор хранили при -20 °С и использовали в течение суток после получения.

1.3. Получение гемоглобина

Гемоглобин выделяли из крови здоровых доноров [50]. Кровь получали венепункцией и собирали в пробирку, содержащую гепарин (10 ед. на 1 мл крови). Эритроциты осаждали центрифугированием в течении 10 минут при 350 д. Затем проводили отмывку эритроцитов от белков плазмы. Для этого к эритроцитам добавляли 10-ти кратный объём физраствора и центрифугировали при 350 g в течение 10 минут. Затем супернатант удаляли, а осадок ресуспендировали. Эту процедуру повторяли трижды.

Лизис эритроцитов проводили добавлением 10-ти кратного объема холодной дистиллированной воды. Полученный гемолизат центрифугировали 20 минут при 14000 g для удаления теней эритроцитов. Дальнейшую очистку гемоглобина проводили методом гель-хроматографии. Для этого использовали колонку длиной 50 см с гелем Sepharose 4B/CL. В качестве элюента использовали 10 мМ фосфатный буфер, pH 7,4. Полученный раствор гемоглобина хранился при температуре 4°С.

1.4. Получение гаптоглобина

Гаптоглобин (смешанный тип) был выделен кооперативом "Микрофлора" при МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского. Выделение проводилось по следующей методике: асцитическую жидкость больных раком желудка III-IV стадии обрабатывали полиэтиленгликолем 6000, затем 2 часа перемешивали на холоду для осаждения aß-глобулиновой фракции. После центрифугирования пробы 20 минут при 14000 д, супернатант подвергался ионобменной хроматографии на ДЭАЭ целлюлозе. В качестве элюента использовали 0,01 М фосфатный буфер, pH 7,0. Связавшийся гаптоглобин удаляли из колонки с помощью буфера, содержащего 1 М NaCI. Затем проводили диализ пробы против 0,01 М фосфатного буфера. Для удаления альбумина проводили аффинную хроматографию на голубой Sepharose ("Pharmacia"). Полученный раствор гаптоглобина диализовали против воды. Содержание примесей определяли методом иммуноэлектрофореза с использованием в качестве реагентов антисыворотки ко всем белкам сыворотки крови и моноспецифической антисыворотки к гаптоглобину и к другим белкам (орозомукоиду, а<|ингибитору протеиназ, трансферрину, а2-макроглобулину, альбумину, а<|-антихимотрипсину, церуллоплазмину). Кроме гаптоглобина конечная проба содержала около 50% примесей белков: ai-ингибитора протеиназ, орозомукоида, альбумина. Гемоглобинсвязывающая способность раствора гаптоглобина составила 0,2 мг гемоглобина на 1 мг белка.

1.5. Получение липопротеинов

ЛОНП (d<1.006 г/см ), ЛНП (1.006<d<1.065 г/см), ЛВП (1.065<d<1.210 г/см ) выделяли из сыворотки здоровых доноров последовательным препаративным ультрацентрифугированием в солевых растворах NaBr определенной плотности [196]. ЛП, которые в дальнейшем не подвергались окислению, выделяли в присутствии 0.01% этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА). Выделенные с ЭДТА ЛП диализовали отдельно против 150 мМ NaCI, 10 мМ трис-HCI, pH 7,4 при 4 °С в течение 15-18 час. Гомогенность и чистоту полученных фракций ЛП контролировали методом электрофореза в полиакриламидном геле. На электрофореграмме присутствовали только узкие полосы, соответствующие гомогенным фракциям ЛОНП, ЛНП и ЛВП. Выделенные ЛП использовали для работы в течении суток. Концентрацию ЛП выражали через содержание в них фосфолипидов [285].

1.6. Окисление липопротеинов

Для окисления ЛНП (0.3-1.5 мг фосфолипидов/мл) помещали по 3-5 мл в круглодонные колбы объемом 25 мл и проводили окисление при доступе воздуха и постоянном легком перемешивании в течение 4-6 час. при 37 °С. Степень окисления ЛНП определяли по накоплению в них продуктов, реагирующих с 2-тиобарбитуровой кислотой (ТБК-реактивных продуктов), выраженных в мкмоль малонового диальдегида (МДА) на 1 г фосфолипидов [278].

1.7. Выделение моноцитов

Моноциты выделяли по методике, описанной в работе [32] с некоторыми модификациями. Мононукпеарные клетки получали из крови здоровых доноров (антикоагулят - ЭДТА) центрифугированием в градиенте плотности (1.077 г/см ), создаваемой в смеси верографина (Spofa, ЧССР) и фиколла 400 (Pharmacia, Швеция), при 400д в течение 40 мин. Фракцию мононукеарных клеток отмывали центрифугированием при 400д в течение 10 мин в растворе 150 мМ NaCI, 10 мМ трис-HCI, 5 мМ глюкозы, 1 мМ ЭДТА, рН 7,4. Далее клетки ресуспендировали в среде 199, содержащей 5 об.% аутологичной сыворотки и антибиотики (пенициллин 100 ед/мл, стрептомицин 100 ед/мл), и доводили концентрацию мононуклеарных клеток до 2*106 кл/мл. Адгезию моноцитов проводили в термостате при 37 °С в течение 1 час. С прилипших на дне колбы клеток сливали среду инкубации и слой клеток споласкивали трижды 5 мл среды 199. Количество живых клеток, оцениваемое с помощью окраски трипановым синим, составляло 96-98% от общего числа прилипших клеток.

1.8. Выделение нейтрофилов

Нейтрофилы выделяли согласно методике, предложенной в работе [71]. К донорской крови, содержащей 10 ед. гепарина на 1 мл, добавляли декстран Т-500 (М.м. 500 000) в концентрации 1% для ускорения осаждения эритроцитов. Надосадочную жидкость, содержащую лейкоциты и тромбоциты, наслаивали на градиент фиколл-верографин (1,078 г/см ) и центрифугировали 25 мин при 400д. К осадку, содержащему лейкоциты и следы эритроцитов, добавляли 1 мл дистилированной воды на 20-25 с для лизиса эритроцитов, после чего восстанавливали осмотичность среды раствором Хенкса (не содержащего Са2+ и Мд2+). Клетки центрифугировали при 400д 10 мин и проводили повторную отмывку, при необходимости повторяя лизис эритроцитов. Суспензия полиморфоядерных лейкоцитов, содержала не менее 90% нейтрофилов с жизнеспособностью 95%, определяемой по трипановому синему.

2. Методы:

2.1. Измерение концентраций гипохлорита и перекиси водорода

Концентрации ОСГ и Н202 определяли спектрофотометрически [215], измеряя оптическую плотность при 290 нм и 240 нм соответственно, используя коэффициенты молярной экстинкции е29о=350,4 М"1 см"1 для гипохлорита при рН=12 и е24о =43,6 М"1 см'1 для Н202. Измерения проводили на спектрофотометре Вескплап 011-7 (США).

2.2. Измерение концентрации ионов железа (II)

Количество свободного двухвалентного железа измеряли по его реакции с о-фенантролином. Для этого к 500 мл раствора, содержащего 10.2 мМ НЬ и 100 мМ фенантролина. добавляли 10 мл Н202 или ОСГ и инкубировали 20 минут при комнатной температуре и затем регистрировали спектры поглощения. В качестве контроля брали точно такой же образец, но не содержащий гемоглобин. Для расчета концентрации комплекса Ре2+ -фенантролин использовали коэффициент молярной экстинции 8510 =10 931 М"1 см"1.

2.3. Измерение концентрации гемоглобина

Концентрацию гемоглобина измеряли спектрофотометрически по поглощению в области полосы Соре (415 нм) против 20 мМ фосфатного буфера. Коэффициент молярной экстинкции для полосы Соре принимали равным 8415= 125 000 М~1 см"1 (в расчете на 1 гем) [50]. Измерения проводили на спектрофотометре Вескплап 011-7 (США). Содержание оксиили метгемоглобина (в относительных единицах) в растворе определяли, используя методику [305], по следующим формулам:

ОксиНЬ = 26,7 х 0577 - 7,8 х 063о - 20,1 х 0560

МетНЬ = 5,7 х 0577 - 71,6 х 0630 - 12,1 х 05&0, где 0„„ 0„7, - оптическая плотность при 560 нм, 577 нм и 630 нм, эои) э» I о«эи соответственно.

В экспериментах с Н202 использовали трис-(оксиметил) аминометановый 20 мМ буфер рН 7,4, а эксперименты с ОСГ выполнены в присутствии фосфатного 20 мМ буфера рН 7.4.

2.4. Модификация гемоглобина Н2О2 или НОС1

Гемоглобин (40 цМ по гему) инкубировали с гипохлоритом или перекисью водорода (20 цМ-2 мМ), при 37°С в течение 0,5 ч. Из проинкубированных проб отбирали аликвоты для спектрофотометрического определения относительного количества метгемоглобина по методике [305].

2.5. Изучение влияния гаптоглобина и альбумина

Гемоглобин (40 |аМ по гему), нативный и предварительно модифицированный 0,2 мМ гипохлоритом, инкубировали с гаптоглобином (0,4 или 0,7 мг/мл) или бычьим сывороточным альбумином (0,4 или 0,7 мг/мл) при комнатной температуре в течение 10 мин. Затем, если необходимо, добавляли ЛНП и инкубацию продолжали при 37 °С в течение 1 ч. После завершения инкубации измеряли содержание ТБК-реактивных продуктов.

2.6. Регистрация спектров ЭПР

Для измерения спектров ЭПР использовали радиоспектрометры \/апап Е-4, иЕО! РЕ-2ХО или иЕ01-КЕ1Х с модуляцией магнитного поля 100 кГц. Спектры ЭПР регистрировали при комнатной температуре при следующих условиях: магнитное поле 335,5 мТ, микроволновая мощность 10 мВт, частота СВЧ 9,44 ГГц, амплитуда модуляции 1,6 мТ, постоянная времени

0,01 с. g-Фактор и интенсивность сигнала ЭПР определяли относительно стандарта, содержащего Мп2+ в МдО или ДФПГ. Моделирование спектров ЭПР производили при помощи программы WinSim, созданную Д.Р. Дулингом (Лаборатория молекулярной биофизики, Национальный институт экологического здоровья, США).

Для регистрации спектров ЭПР спиновых аддуктов раствор двухвалентного железа добавляли в образец, содержащий ФБН (ЗОтМ), фосфатный буфер (4тМ, рН 7,4), ОСГ или Н202 и в некоторых случаях также таурин (2 тМ) или каталазу (500 ед\мл) или фенантролин (0 - 2тМ) или этанол (0 - 1.2 М). Кювету с образцом помещали в резонатор ЭПР-спектрометра и регистрировали спектры ЭПР при комнатной температуре

Для измерения спектров ЭПР в системе, содержащей гемоглобин и гидроперекись трет-бутила, образцы помещали в проницаемую для газов полиэтиленовую трубку диаметром 0,8 мм. В трубку наливали 30 мкп образца, складывали вчетверо и помещали в кварцевую трубку, с помощью которой образец крепился в резонаторе радиоспектрометра.

УФ облучение: Образцы в кварцевой трубке помещали в резонатор ЭПР спектрометра и облучали через отверстие в передней стенке. Для облучения использовали ксеноновую лампу (модель 6251, Oriel Corp., Стратфорд, Коннектикут) при напряжении 120 В. , на расстоянии от образца около 20 см. Для окисления аскорбата и а-токоферола использовали интерференционные фильтры имеющие максимум пропускания вблизи пиков поглощения облучаемых веществ (260+4,5 нм для аскорбата и 290+5,0 нм для а-токоферола).

Образцы, содержащие 0,1 мМ а-токоферола (солюбилизированного в мицеллах додецилсульфата натрия (СДС), при молярном соотношении СДС:а-токоферол 1000:1 ) и/или 0,5 мМ аскорбата в 100 мМ фосфатном буфере были подвержены окислению УФ-светом или NO в аэробных или анаэробных условиях. Окисление NO проводили продувая газ через резонатор радиоспектрометра ЭПР в котором находился образец в проницаемой для газа тефлоновой трубочке. Перед продуванием NO образец продували 15 мин. азотом. Отсутствие кислорода подтверждалось по отсутствию радикалов семидегидроаскорбата в присутствии аскорбиновой кислоты и N0 [77].

2.7. Измерение хемилюминесценции реакции HOCI+Fe

Проводили на хемилюминометре ХЛМ-3, изготовленном в ИРЭ АН СССР. Реакционная смесь содержала кроме гипохлорита или перекиси водорода 0,9% раствор NaCI. Спектры хемилюминесценции измеряли с помощью набора граничных светофильтров как это описано в работе [34]. Светосумму ХЛ измеряли в течение 2 минут.

2.8. Измерение хемилюминесценции MetHb+tBuOOH

Измерения проводили на хемилюминометре Coral Chemiluminescence Analyser 633, оснащенном самописцем WR 3101 Graphtec при комнатной температуре. Для обнаружения хемилюминесценции использовали 2 мкМ metHb (1 мл в 100 мМ фосфатном буфере, рН 7,4) и раствор гидроперекиси трет-бутила в присутствии люминола (100 цМ).

2.9. Измерение хемилюминесценции клеток крови

Хемилюминесценцию лейкоцитов регистрировали на хемилюминометре LKB (Швеция). В кювету помещали 1,5*10® моноцитов или 106 нейтрофилов в среде Хенкса (рН 7.4) содержащей 1мМ Са2+, добавляли 100 мкМ люминола и регистрировали о кинетику спонтанной люминесценции клеток при 37 °С. После того, как спонтанное увеличение хемилюминесценции клеток выходило на плато, в кювету добовляли 200 мкл ЛП (конечная концентрация при добавлении к моноцитам 0,57 мг фосфолипидов/мл, к нейтрофилам - 0,20 мг фосфолипидов/мл), суспендированных в растворе 150 мМ NaCI, 10 мМ трис-HCI ,рН 7,4, и продолжали регистрировать хемилюминесценцию до тех пор, пока не прекращалось увеличение ее интенсивности. В ряде экспериментов вместе с ЛП в кювету добавляли активатор клеток - зимозан (100 частиц на клетку). Результаты экспериментов представляли в виде кинетических кривых изменения интенсивности хемилюминесценции.

2.10. Исследование взаимодействия гемоглобина с гипохлоритом и перекисью водорода

В раствор гемоглобина (0,5 ц,М по гему) добавляли гипохлорит (11 цМ) или перекись водорода (200 р,М). После инкубации смеси в течении 60 минут при комнатной температуре измеряли спектр оптического поглощения образца в диапазоне длин волн 200 нм - 700 нм. При дальнейшей инкубации изменений в спектре поглощения гемоглобина не происходило.

2.11. Измерение хемилюминесции анион-радикалов супероксида

Образование анион-радикалов супероксида измеряли по люцигенин-зависимой хемилюминесценции [111]. Реакцию проводили в 1 мл 0,1 M фосфатного буфера (рН 7,4-8,0) или Na0H/NaHC03 буфера (рН 8,0-12,0), содержащим 0,05 мМ люцигенина. Хемилюминесценцию измеряли на Coral Biomedical Analyser хемилюминометре (Сан-Диего, Калифорния), оснащенном диспенсером BioOrbit.

2.12. Измерение ТБК-реактивных продуктов

При измерении ТБК-реактивных продуктов мы опирались на методику, описанную в работе [13]. В пробирки, содержащие 1,5 мл 1% Н3РО4 и 25 мкл

0,02 M раствора ионола в этаноле, добавляли равные (0,4 мл) аликвоты исследуемых растворов и 0,5 мл 0,5% 2-тиобарбитуровой кислоты (ТБК).

Пробы инкубировали 45 мин при 100 °С, быстро охлаждали до комнатной температуры, добавляли по 2 мл бутанола, интенсивно встряхивали и для ускорения расслоения фаз центрифугировали при 1800 g в течение 10 мин. Записывали спектры поглощения верхней, бутанольной фракции в диапазоне длин волн 510-560 нм. Оптическую плотность в максимуме поглощения (532 нм) рассчитывали с использованием двух базовых длин волн - 515 и 550 нм. Количество ТБК-реактивных продуктов выражали через эквивалентное количество малонового диальдегида (МДА), считая коэффициент молярной экстинкции для продуктов реакции ТБК с альдегидными группами равным 156 000 Л/Мсм""!.

2.13. Определение продукции 02

Проводили по восстановлению цитрохрома с согласно методу [59]. Для этого к раствору цитохрома с (100 мкМ) ("Sigma", США) добавляли суспензию моноцитов (8*105 кл/мл) в растворе Хенкса (не содержащего Са2+, Мд2+) и определяли изменение оптической плотности при 550 нм по сравнению с 536 нм. Клетки активировали добавлением нативных или окисленных ЛНП (0.4 мг фосфолипидов/мл). Все операции по измерению образования 02" проводили при 37 °С.

2.14. Измерение концентрации N0 методом ЭПР

Метод основан на взаимодействии нитронил-нитроксильного радикала (NNR) с N0' в результате которого образуется иминонитроксильный радикал (INR), имеющий спектр ЭПР отличный от спектра нитронил-нитроксильного радикала. Определенные количества фосфатного буфера, содержащего растворенный NO' добавляли к раствору NNR (250 мкМ) и регистрировали спектр ЭПР. Исходный 5-компонентный спектр превращался в 9-компонентный спектр, соответствующий смеси NNR и INR радикалов (Рис. 1, спектры а и б). Отношение низкопольного сигнала INR (сигнал 6 на Рис. 1) к сумме низкопольных сигналов NNR и INR (величина а+b на Рис. 1,) была пропорциональна концентрации N0' в растворе. Растворы N0' приготавливали насыщая предварительно деоксигенированный N2 100 мМ фосфатный буфер газообразной окисью азота. Концентрация N0' в растворе определялась (1) с помощью нитронил нитроксильных радикалов (NNR) [169] и (2) по реакции Гриса [287].

2.15. Измерение концентрации N0 методом Гриса

Метод основан на измерении концентрации N02" анионов, являющихся продуктами окисления N0' в водных растворах. N0' окисляли продувая раствор кислородом. Объем 0,5 мл буферного раствора, содержащий анионы N02" инкубировали с 0,5 мл раствора, содержащего 1% сульфаниламида в 2,5% Н3Р04, в течение 5 мин.

Рис. 1. Спектры ЭПР нитронил-нитроксильного радикала (NNR) в присутствии и в отсутствие N0'. Инкубационная среда содержала: (а) NN 0,25 мМ в 100 мМ фосфатном буфере, pH 7,4; (б) NNR 0,25 мМ и NO' 0,12 мМ а- низкополевая компанента NNR, b- низкополевая компанента INR; (в NNR 0,25 мМ в присутствии metHb 0,1 мМ, t-BuOOH 10 мМ и NO' 0,12 мМ;

Полученный раствор диазония инкубировали с 0,5 мл 1% нафтилэтилендиамин гидрохлорида в 2,5% Н3Р04 в течение 10 мин.

Концентрация NO' определялась спектрофотометрически, используя коэффициент молярной экстинкции е54о = 58 ООО М"1с1 и сравнение со стандартом.

2.16. Измерение флуоресценции цис-паринариевой кислоты

Для измерения скорости окисления цис-паринариевой кислоты в липосомах под действием гемового железа использовали метод, предложенный Van den Berg et al. [282]. Метод основан на измерении флуоресценции цис-паринариевой кислоты при 415 нм, при возбуждении в диапазоне 250-350 нм. Измерения проводили на спектрофлуориметре Shimadzu RF-5000 (Япония). Липосомы приготавливали из маточного раствора 25,4 мМ диолеил-фосфатидилхолина в хлороформе (0,16 мл), содержащего 0,25 мМ цис-паринариевой кислоты. Растворитель упаривали в токе азота на льду, добавляли фосфатный буфер (100 мМ, pH 7,4, 2 мл) и озвучивали образовавшуюся суспензию троекратно по 30 сек. с интенсивностью 65 Вт на ультразвуковом дезинтеграторе Cole-Parmer Instrument Co. 4710 (Chicago,IL). Липосомы выдерживали в темноте, в атмосфере азота при -80 °С. Эксперименты по окислению цис-паринариевой кислоты проводили в атмосфере азота. Липосомы (конечная концентрация липидов 100 (iM, в том числе 1 цМ цис-паринариевой кислоты) вводили в измерительную кювету, содержащую 4 цМ МетМЬ/МетНЬ и 16 jjM гидроперекиси трет-бутила в 100 мМ фосфатном буфере, pH 7,4.

2.17. Масс спектрометрический анализ

Все буферы были очищены от металлов и приготовлены на деионизованной бидистиллированной воде в кварцевой посуде. Вода перемешивалась на мешалке в присутствии ионообменной смолы Chelex-100 (Bio-Rad, Richmond, CA) в течение 12 часов. Mb и Hb использовали после дополнителльной очистки на колонке PD-10 с Sephadex G-25 (Pharmacia LKB, Uppsala, Sweden) с 100 мМ фосфатным буфером, pH 7,4.

Для получения апоМЬ для масс-спектроскопических измерений, растворы MetMb (1 мМ, 1 мл) были охлаждены до 4 °С и затем по каплям добавлены к 50 мл быстро перемешиваемого ацетона, содержащего 0,8 мл концентрированной HCl, нахдящейся при -20 °С в NaCI/ледяной бане. После окончания добавок смесь оставляли стоять 10 мин., затем центрифугировали (15 мин. при 3000 д) и собирали преципитированный белок. Осадок промывали охлажденным подкисленным ацетоном (-20 °С), высушивали под струей N2 и растворяли в 1 мл воды или 2 мМ NH4OOCCH3, pH 7,4.

Измерения проводили на масс спектрометре с пневматической подачей образца фирмы Perkin Elmer/Sciex API 1 и присоединенном к нему жидкостном хроматографе Hewlett Packard 1090, содержащем диодный оптический UV/Vis детектор. Напряжение разряда составляло 5 кВ. Образцы вводились в масс спектрометр через жидкостный хроматограф со скоростью 40 |!л/мин, используя в качестве подвижной фазы смесь вода-метанол 1:1 и содержала 0,05% уксусной кислоты. Разрешение отношения m/z составляло 0,1. Реконструкцию спектров проводили используя алгоритм Фенна [95]. В масс спектрометрических экспериментах были использованы следующие концентрации реагентов: metMb 1мМ, гидроперекись трет-бутила 4мМ. Раствор metMb инкубировали 3 мин. с гидроперекисью трет-бутила в атмосфере азота, а затем продували NO' со скоростью 1 мл/мин. Для хранения образцы замораживали в жидком азоте или предварительно профильтровывали на колонке с Sephadex G-25 для приготовления апоМЬ.

2.18. Измерения ВЭЖХ аскорбата, убихинона и а-токоферола

Образцы измеряли на установке высокоэффективной жидкостной хроматографии (Shimadzu LC-10A) с насосом (LC-600) и фотодиодным детектором (М10А). Вытекающий образец фотометрировали в диапазоне 240-500 нм. Продукты разделяли на колонке с обратной фазой С18 (Ultrasphere ODS, диам. частиц 0,005 мм, размер колонки 4,6x250 мм). Образцы объемом 0,1 мл, взятые через определенные промежутки времени, вводили в приемную петлю диаметром 0,02 мл через инжектор (Rheodine). Для анализа продуктов окисления а-токоферола использовали подвижную фазу метанол-вода 9:1, протекающую со скоростью 1 мл/мин (время

65 удерживания 6 мин.). Для анализа продуктов окисления аскорбата подвижная фаза представляла смесь ацетонитрил-вода 7:1 и содержала 4,3 мМ двузамещенного фосфата натрия и 1,1 мМ триметил аммония бромида, рН 5,5. Время удерживания аскорбата в этих условиях 7 мин.

2.19. Статистический анализ

Полученные данные являются результатом трехкратных измерений и представлены как среднее ± среднее квадратичное отклонение. Уровень значимости р<0,05 считали достоверным.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Раздел посвящен анализу основных экспериментальных результатов и состоит из 4 основных глав. Во всех главах рассматриваются механизмы реакций образования и превращения свободных радикалов, которые могут генерироваться активированными фагоцитирующими клетками, т.е. супероксидных и гидроксильных радикалов и окиси азота. Большое внимание уделено реакциям таких важнейших соединений, как перекись водорода и гипохпорит, которые являются предшественниками свободных радикалов или при участии которых, происходит образование соединений, обладающих сильным прооксидантным действием, например, феррил-гемопротеинов. Рассмотрены реакции свободных радикалов с соединениями, выполняющими жизненно-важные функции организма -гемоглобином, липопротеидами, убихинонами, токоферолом и аскорбатом.

Первая глава посвящена изучению образования гидроксильных радикалов, образующихся в реакциях гипохпорита с ионами металлов соединения, образуюемого активированными фагоцитами. Вторая глава касается рассмотрения реакций гипохлорита и гемоглобина с точки зрения изменения прооксидантных свойств гемоглобина и его роли в индукции перекисного окисления липидов в липопротеинах. В третьей главе рассматриваются реакции окиси азота с феррил-гемопротеинами, образующимися в реакции мет-форм гемопротеинов с гидроперекисями, и витаминами С и Е, демонстрирующие про- и антиоксидантные свойства окиси азота. В последней, четвертой главе описаны исследования роли убихинонов Ою и О0 в реакциях окисления а-токоферола и его водорастворимого аналога - Тролокса супероксидными радикалами.

Заключение диссертации по теме «Биофизика», Осипов, Анатолий Николаевич

ВЫВОДЫ

1. Взаимодействие ионов Ре2+ с гипохпоритом приводит к образованию свободных радикалов сходных с радикалами, образующимися в реакции Ре2+ с Н202, т.е. с гидроксильными радикалами. Исследование методами ЭПР спиновых ловушек и хемилюминесценции показало, что образование радикалов в системе Ре2+ + гипохлорит происходит более интенсивно, чем в реакции Ре2+ с Н202. Этанол, акцептор гидроксильных радикалов, добавленный к смеси Ре2+ и гипохпорита, образует гидроксиэтильные радикалы, что также свидетельствует об образовании гидпроксильных радикалов в изучаемой системе.

2. При исследовании взаимодействия гемоглобина с гипохлоритом и Н202 обнаружено, что гипохлорит более эффективно повреждает гемоглобин. Н202 и гипохлорит приводят к модификации гемоглобина, в результате которой увеличивается его каталитическая активность. Измерение количества свободного железа с помощью о-фенантролина показало, что при разрушении гемоглобина, по крайней мере часть освободившегося железа находится в восстановленной форме.

3. Взаимодействие гемоглобина с Н202 или гипохлоритом приводит к образованию высокореакционных интермедиатов, таких как метгемоглобин, феррилгемоглобин и в дальнейшем свободного железа, которые являются эффективными прооксидантами, и могут индуцировать перекисное окисление липидов в липопротеинах. При индукции перекисного окисления липидов в ЛНП гемоглобином, модифицированным перекисью водорода и гипохлоритом, ингибирующим эффектом обладали о-фенантролин и десферриоксамин, что подтверждает участие свободного железа в этих реакциях. Сильным ингибирующим эффектом на перекисное окисление липидов, вызываемое гемоглобином, обладает гаптоглобин. Причем его действие эффективно, как в случае нативного, так и модифицированного гипохлоритом гемоглобина.

4. ЛНП, модифицированные окислением, в отличие от нативных, активируют моноциты человека, что сопровождается секрецией последними активных форм кислорода. Эксперименты, проведенные в присутствии различных ингибиторов перекисного окисления липидов, дают основание полагать, что процесс интенсификации перекисного окисления липидов как активированными нейтрофилами, так и моноцитами протекает по свободно-радикальному механизму, поскольку полностью (в случае нейтрофилов) или в значительной степени (в случае моноцитов) предотвращается ионолом.

5. Изучение взаимодействия окиси азота с оксоферрильными состояниями гемопротеинов (НЬ-4Ре|У=0 или МЬ-Ре|У=0), образующимися при взаимодействии МеШЬ или 1\/ЫМЬ с гидроперекисью трет-бутила показало, что окись азота восстанавливает оксоферрильные радикалы в ферри-состояние (Ме^форму) и ингибирует вызываемое этими частицами окисление ^¿/с-паринариевой кислоты и люминола, а также разложение гидроперекиси трет-бутила до трет-бутоксильных радикалов. Нитрозилирования глобина в этом процессе не обнаружено. Таким образом, можно говорить об антиоксидантном действии окиси азота, которое выражается в снижении концентрации МЬ-Ре|Х/=0 или НЬ-4Ре|У=0, обладающих сильным прооксидантным эффектом.

6. Изучение взаимодействия окиси азота, витамина С и витамина Е показало, что окись азота непосредственно не окисляет аскорбат, но может окислять а-токоферол до а-токофероксильного радикала в анаэробных условиях. Если действию окиси азота подвергались и аскорбат и а-токоферол одновременно, то образующиеся а-токофероксильные радикалы восстанавливались аскорбатом. Эти реакции окиси азота лежат в основе механизма её прооксидантного действия.

7. Исследование окисления а-токоферола супероксидными радикалами показало, что в присутствии убихинона О10 необратимого окисления а-токоферола не происходит из-за циклического восстановления феноксильных радикалов а-токоферола убисемихинонными радикалами

172 и убихинолом Ою до исходной молекулы а-токоферола. Изучение окисления водорастворимого аналога а-токоферола - Тролокса показало, что феноксильные радикалы Тролокса, образующиеся при окислении Тролокса супероксидом, также могут быть легко восстановлены семихинонными радикалами убихинона О0, которые в свою очередь являются продуктами восстановления убихинона О0 супероксидными радикалами. Таким образом, в системах, где происходит постоянное образование супероксидных радикалов, одноэлектронное восстановление убихинона до убисемихинона может служить механизмом регенерации а-токофероксильных радикалов, т.е. антиоксидантным механизмом.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

На начальном этапе работы мы провели изучение механизма взаимодействия гипохлорита с ионами металлов переменной валентности (в наших исследованиях - ионов железа и титана) методом спиновых ловушек показало, что в результате этой реакции происходит образование спиновых аддуктов гидроксильных радикалов. Этот факт является необходимым условием присутствия гидроксильных радикалов в изучаемой системе. Однако, поскольку спиновые аддукты радикалов не всегда образуются путем присоединения свободного радикала к спиновой ловушке, но и путем внутримолекулярных перестроек, мы предприняли еще несколько попыток для проверки нашей гипотезы. Мы предположили, что если гидроксильные радикалы действительно образуются в изучаемой системе, то добавив вещество хорошо взаимодействующее с гидроксильными радикалами, мы должны обнаружить радикалы (и соответствующие спиновые аддукты) этого перехватчика. В нашем случае в качестве перехватчика выступал этанол. Известно, что взаимодействие этанола с гидроксильными радикалами приводит к образованию гидроксиэтильных радикалов взамен гидроксильных. Добавление этанола в систему, содержащую гипохлорит и ионы железа, привело к тому, что по мере увеличения концентрации этанола в системе, интенсивность сигнала ЭПР СА гидроксильных радикалов стала снижаться, а СА гидроксиэтильных радикалов - возрастать. Этот факт однозначно свидетельствует о существовании гидроксильных радикалов в системе. Более того, когда ионы железа были заменены на ионы титана, то картина не очень сильно изменилась: в системе, содержащей только гипохлорит и ионы титана наблюдались сигналы ЭПР СА гидроксильных радикалов, а при добавлении этанола и сигналы ЭПР СА гидроксиэтильных радикалов. Независимо от нас непосредственно образование гидроксильных радикалов в системе гипохлорит-ионы титана было обнаружено методом непрерывной струи Ю.Н. Козловым и соавт. [16]. Еще одним доказательством присутствия гидроксильных радикалов в системе гипохлорит + ионы железа явились результаты измерения хемилюминесценции. Обнаружено, что свечение, возникающее при смешивании гипохлорита и железа, имеет те же спектральные характеристики, что и свечение в реактиве Фентона, где образование гидроксильных радикалов не вызывает сомнения. Таким образом изучение взаимодействия гипохлорита с ионами железа и титана показало, что образование гидроксильных радикалов этой системе весьма вероятно.

Следующим этапом исследований было изучение взаимодействия гипохлорита с гемоглобином и липопротеинами, молекулами и частицами имеющими важное значение для жизнедеятельности организма. Сравнение реакций гемоглобина с гипохлоритом и перекисью водорода показало, что в обоих случаях происходит окислительная модификация гемоглобина и последующее его разрушение с освобождением ионов железа в каталитически активной форме. Однако, эффективность взаимодействия гипохлорита и перекиси водорода с гемоглобином оказалась различной. Так для 50% разрушения гемоглобина (разрушение определялось по убыли поглощения в области полосы Соре) было необходимо около 5 мМ перекиси водорода, в то время как гипохлорит оказался почти в 10 раз более эффективным окислителем, его требовалось добавить только 0,5 мМ. Представляет интерес тот факт, что при разрушении гемоглобина гипохлоритом или перекисью водорода происходило освобождение части ионов железа в восстановленной форме, причем общее количество свободного железа составляло около 10% от общего количества. Хемилюминесцентные исследования этого взаимодействия показали также, что инкубация гемоглобина приводит к увеличению его прооксидантных свойств - увеличению и ускорению вспышки хемилюминесценции. Таким образом, очевидно, что взаимодействие гемоглобина с гипохлоритом или перекисью водорода приводит к образованию соединений (метгемоглобина, феррилгемоглобина и свободного железа) обладающих более сильными прооксидантными свойствами, чем исходный гемоглобин.

Возникает вопрос, может ли гемоглобин, модифицированный перекисью водорода или гипохлоритом индуцировать и перекисное окисление липидов в липопротеинах? Проведенные эксперименты показали, что окислительная модификация гемоглобина гипохлоритом или перекисью водорода почти вдвое увеличивает скорость перекисного окисления липидов липопротеинов низкой плотности. Весьма вероятно, что индуктором реакций перекисного окисления являются ионы железа, освобождающиеся в результате окисления гемоглобина, т.к. сильным ингибирующим действием на перекисное окисление обладали хелаторы свободного железа - о-фенантролин и десферриоксамин. ). Сильным ингибирующим эффектом на ПОЛ, вызываемое гемоглобином, обладал и гаптоглобин. Причем его действие было эффективно, как в случае нативного, так и модифицированного гипохлоритом гемоглобина. Представляет интерес и тот факт, что липопротеиды, подвергшиеся окислению, способны активировать фагоцитирующие клетки - моноциты и нейтрофилы периферической крови человека. Таким образом, возникает "порочный круг" в котором гемоглобин может играть роль запускающего механизма: гемоглобин будучи окислен радикалами, продуцируемыми фагоцитами, вызовет окисление липопротеинов, а те в свою очередь опять, ещё в большей степени будут активировать фагоциты.

Каким же образом можно избежать развития такого порочного круга, регулируемого различными продуктами окисления гемоглобина? Ответ на этот вопрос можно найти в следующей главе, посвященной взаимодействию окиси азота с феррил-гемопротеинами (феррил-гемоглобином и феррил-миоглобином). Как было показано выше взаимодействие гемопротеидов (гемоглобина или метгемоглобина) с перекисью водорода или органическими гидроперекисями приводит к их окислительной модификации и образованию высокореакционных оксоферрильных соединений (НЬ-4Ре|У=0 или МЬ-Ре|у=0), обладающих сильным прооксидантным действием. Мы обнаружили, что окись азота может полностью тормозить окисление фус-паринариевой кислоты или люминола, вызываемую феррил-гемоглобином или феррил-миоглобином, т.е. легко дезактивировать эти соединения, переводя оксоферрил-соединения в соответствующую мет-форму. Масс-спектрометрические исследования продуктов взаимодействия феррил-гемопротеинов с окисью азота показали, что это взаимодействие не приводит к нитрозилированию последних. Таким образом очевидны антиоксидантные свойства окиси азота в отношении сильных окислителей, каковыми являются феррил-гемоглобин и феррил-миоглобин.

Однако, окись азота может выступать и в роли прооксиданта, например, в отношении а-токоферола и аскорбата. Нами обнаружено, что анаэробная инкубация окиси азота и а-токоферола приводит к окислению последнего с образованием соответствующих феноксильных (а-токофероксильных) радикалов. Сохранить неизменной концентрацию а-токоферола в присутствии окиси азота может аскорбат. Сам аскорбат в анаэробных условиях не реагирует с окисью азота, но в отсутствие кислорода в системе, содержащей а-токоферол и окись азота может выступать в роли восстановителя феноксильных радикалов а-токоферола до исходной молекулы а-токоферола. Сам аскорбат в этой реакции подвергается одноэлектронному окислению до семидегидроаскорбата. Таким образом, можно видеть, что N0-зависимое, а-токоферол-опосредованное циклическое восстановление радикалов а-токоферола приводит к расходованию аскорбата. Можно думать, что присутствие водорастворимого антиоксиданта - аскорбата является гарантией того, что до тех пор пока он полностью не исчерпается, концентрация а-токоферола будет поддерживаться постоянной, и постоянными будут антиоксидантные свойства системы.

Однако, не только окись азота, но и супероксидные радикалы могут окислять а-токоферол. В заключительной главе рассмотрены механизмы реакций окисления а-токоферола (и его водорастворимого аналога -Тролокса) с супероксидными радикалами в присутствии убихинона О10 (или его водорастворимого аналога убихинона О0). Проведенные эксперименты показали, что окисление а-^окоферола супероксидом может быть приостановлено в присутствии убихинона О10. Механизм этого явления следующий: супероксидные радикалы окисляют а-токоферол до соответствующих феноксильных (а-токофероксильных) радикалов и одновременно восстанавливает убихинон О10 до соответствующего убисемихинона О10. Образовавшийся убисемихинон О10 может восстановить феноксильный радикал а-токоферола до исходной молекулы а-токоферола,

169 а сам окислиться до убихинона О10. Таков механизм защитного действия убихинона при окислении а-токоферола супероксидом. Мы показали также, что эти эффекты убихинона справедливы и в отношении водорастворимого аналога а-токоферола - тролокса, если взять водорастворимый аналог убихинона О10 - убихинон О0. Т.е. защитные свойства убихинонов по отношению к окислению а-токоферола или его аналогов можно наблюдать как в апротонных растворителях (например, ДМСО) так и в водной супероксид-генерирующей системе, содержащей систему ксантин ксантиноксидаза.

Список литературы диссертационного исследования доктор биологических наук Осипов, Анатолий Николаевич, 1999 год

1. Бейсембаева Р.У., Джусупова Р.Ж.: Влияние гаптолобина овцы на молекулу гемоглобина в Нр-НЬ комплексе. Биохимия. 28-32, 1986

2. Владимиров Ю.А., Азизова O.A., Деев А.И., Козлов A.B., Осипов А.Н., Рощупкин Д.И.:Свободные радикалы в живых системах. In: Биофизика, Москва, Итоги науки и техники, ВИНИТИ, 1991,

3. Владимиров Ю.А., Арчаков А.И.: Перекисное окисление липидов биологических мембран. М., Наука, 1972.

4. Владимиров Ю.А., Шерстнев М.П.: Хемилюминесценция клеток животных. In: Биофизика, Москва, Итоги науки и техники, ВИНИТИ, 1989,

5. Владимиров Ю.А.: Биологические мембраны и патология клетки. Природа. № 3, 36-48, 1987

6. Владимиров Ю.А.: Свободно радикальное окисление липидов и физические свойства биологических мембран. Биофизика. 32, 830-844, 1987

7. Ю.Воскресенский О.Н.: Свободнорадикальное окисление, антиоксиданты и атеросклероз. Кардиология. 21, ? 6, 118-123, 1981

8. Говорова Н.И., Лызлова С.Н., Шаронов Б.П., Янковский О.И.: Характеристики люминольной хемилюминесценции, индуцируемой каталитическим действием миелопероксидазы. Биохимия. 52, 1670-1676, 1987

9. Говорова Н.И., Шаронов Б.П., Лызлова С.Н.: Влияние низкомолекулярных соединений на хемилюминесценцию люминола, обусловленную действием продуктов миелопероксидазного катализа и экзогенного гипохлорита. Биохимия. 53, 2025-2031, 1988

10. Егоров Д.Ю., Козлов A.B.: Природа продуктов перекисного окисления липидов определяемая в сыворотке крови по реакции с 2-тиобарбитуровой кислотой. Биофизика,Деп. ВИНИТИ № 6766-В88. 11,1988

11. Зубарев В.Е.: Метод спиновых ловушек. Применение в химии, биологии и медицине. Издательство Московского университета, 1984.

12. Козлов Ю.Н., Воробьева Т.П., Пурмаль А.П.: Элементарные реакции при окислении титана(Ш) этилендиаминтетераацетата и гексацианоферрата(М) гипохлорной кислотой. Журнал физической химии. 55, 2279-2284, 1981

13. Козлов Ю.Н., Моравский А.П., Пурмаль А.П., Шувалов В.Ф.: О природе и механизме возникновения свободных радикалов в процессах окисления Ti(lll)3flTA и Fe(CN)64- хлорноватистой кислотой. Журнал физической химии. 55, 764-766, 1981

14. Козлов Ю.Н., Пурмаль А.П., Усков А.М.: Двухэлектронный механизм окисления перекиси водорода хлорноватистой кислотой. Журнал физической химии. 54, 1745-1749, 1980

15. Маянский А.Н., Маянский Д.Н.: Очерки онейтрофиле и макрофаге. Новосибирск, Наука, 1989.

16. Мурина М.А., Кузнецов В.А., Рощупкин Д.И.: Противоагрегационное действие гипохлорита на тромбоциты. Бюлл. эксп. биол. мед. 12, 676678, 1986

17. Мурина М.А., Сергиенко В.И., Рощупкин Д.И.: Прямое и косвенное противоагрегационное действие гипохлорита натрия на обогащенную тромбоцитами плазму крови. Бюлл. эксп. биол. мед. 12, 702-704, 1989

18. Осипов А.Н.: Изучение свободных радикалов, образующихся при перекисном окислении методом ЭПР. Диссертация уч. степ. канд. биол. наук. 1983

19. Панасенко О.М., Азизова O.A., Борин М.Л., Арнольд К: Изменение поверхностного заряда липопротеинов плазмы при их автоокислении. Бюлл. эксп. биол. мед. 101, ? 1, 24-26, 1986

20. Панасенко О.М., Борин М.Л., Азизова O.A., Арнольд К.: Определение поверхностного потенциала и заряда липопротеинов при перекисном окислении. Биофизика. 30, 822-827, 1985

21. Панасенко О.М., Вольнова Т.В., Азизова O.A., Владимиров Ю.А.: Перекисное окисление липидов изменяет перенос холестерина между липопротеинами низкой плотности и биологическими мембранами. Биологические мембраны. 4, 875-881, 1987

22. Панасенко О.М., Вольнова Т.В., Азизова O.A., Владимиров Ю.А.: Перекисное окисление липидов изменяет перенос холестерина между липопротеинами высокой плотности и биологическими мембранами. Биологические мембраны. 4, 1319-1324, 1987

23. Панасенко О.М., Вольнова Т.В., Азизова O.A., Владимиров Ю.А.: Перекисное окисление липидов фактор способствующий накоплению холестерина в клетках при атерогенезе. Бюлл. эксп. биол. мед. 106, ? 9, 277-280, 1988

24. Панасенко О.М., Вольнова Т.В., Азизова O.A., Владимиров Ю.А.: Изучение методом спинового зонда структурных перестроек липопротеинов низкой плотности на различной глубине после их перекисного окисления. Биологические мембраны. 5, 1186-1191, 1988

25. Панасенко О.М., Евгина С.А., Дрёмина Е.С., Шаров B.C., Сергиенко В.И., Владимиров Ю.А.: Роль Fe(ll) в перекисном окислении липидов липосомальных мембран, инициированном гипохпоритом натрия. Биологические мембраны. 12, 191-199, 1995

26. Панасенко О.М., Сергиенко В.И.: Свободнорадикальная модификация липопротеинов крови и атеросклероз. Биологические мембраны. 10, 341382, 1993

27. Уильяме У.Дж.: Определение анионов. Москва, Химия, 1982.

28. Усков A.M., Козлов Ю.Н., Пурмаль А.П.: Кинетика и механизм реакций окисления гидрохинона и аскорбиновой кислоты хлорноватистой кислотой. Журнал физической химии. 1677-1682, 1984

29. Фрумина Н.С., Лисенко Н.Ф., Чернова М.А.: Хлор. Москва, Наука, 1983.

30. Хейфиц Л.Б., Абалкин В.А.: Выделение клеток крови на градиенте плотности фиколл-верографин. Лабораторное дело. 10, 579-581, 1973

31. Шаров B.C., Владимиров Ю.А.: Хемилюминесценция липосом активированная ионами редкоземельных металлов. Биофизика. 27, 327329, 1982

32. Шаронов Б.П., Говорова Н.И., Лызлова С.Н.: Антиокислительные свойства и деградация белков АФК (02",0СГ) генерируемыми стимулированными нейтрофилами. Биохимия. 816-825, 1988

33. Шпикитер В.О.: Роль модификации липопротеинов при атерогенезе. Вопр. мед. химии. 33, ? 4, 5-9, 1987

34. Якутова Э.Ш., Осипов А.Н., Костенко О.В., Арнхольд И., Арнольд К., Владимиров Ю.А.: Взаимодействие гипохлорита с оксигемоглобином приводит к освобождению железа в каталитически активной форме. Биофизика. 37, 1021-1028, 1992

35. Agner, K.: Biological effects of hypochlorous acid formed by "MPO"-peroxidation in the presence of chloride ions. In: Akenson,A., ed., Structure and function of oxidation-reduction enzymes, New York, Pergamon Press, 1972, p. 329

36. Alayash, A.I., Fratantoni, J.C., Bonaventura, C., Bonaventura, J., Cashon, R.E.: Nitric oxide binding to human ferrihemoglobins cross-linked between either alpha or beta subunits. Arch. Biochem. Biophys. 303, 332-338, 1993

37. AI brich, J.M., Gilbaugh, J.H.,III, Callahan, K.B., Hurst, J.K.: Effects of the putative neutrophil generated toxin hypochlorous acid on membrane-permeability and transport systems of Escherichia coli. J. Clin. Invest. 78, 177-184, 1986

38. Albrich, J.M., Hurst, J.K.: Oxidative inactivation of escherichia coli by hypochlorous acid rates and differentiation of respiratory from other reaction sites. FEBS Lett. 144, 157-161, 1982

39. Albrich, J.M., McCarthy, C.A., Hurst, J.K.: Biological reactivity of hypochlorous acid implications for microbicidal mechanisms of leukocytes myeloperoxidase. Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 78, 210-214, 1981

40. Allen, R.C.: Halid dependence of the myeloperoxidase- mediated antimicrobial system of the polymorphonuclear leukocyte in the phenomenon of electronic exitation. Biochem. Biophys. Res. Commun. 63, 675-683, 1975

41. Allen, R.C., Stjernholm, R.L., Steele, R.H.: Evidence for the generation of an electronic exitation states in human polymorphonuclear leukocytesand itsparticipation in bactericidal activity. Biochem. Biophys. Res. Commun. 47, 679-684, 1972

42. Allentoff, A.J., Bolton, J.L., Wilks, A., Thompson, J.A., Ortiz de Montellano, P.R.: . J. Amer. Chem. Soc. 114, 9744-9749, 1992

43. Andersen, B.R., Harvath, L.: Light generation with Fenton's reagent. Its relationship to granulocyte chemiluminescence. Biochim. Biophys. Acta. 584, 164-173, 1979

44. Andrews, P.C., Krinsky, N.I: Myeloperoxidase activity. In: Greenwald,R.A., ed., Handbook of methods for oxygen radical research, CRC Press, 1987, p. 297

45. Antonini, E., Brunori, M.: Hemoglobin and myoglobin in their reactions with ligands. Amsterdam, London, North-Holand Publishing Company, 1971.

46. Arnhold, J., Hammerschmidt, S., Arnold, K.: Roie of functional groups of human plasma and luminol in scavenging of NaOCI and neutrophil-derived hypochlorous acids. Biochim. Biophys. Acta. 1097, 145-151, 1991

47. Arnhold, J., Hammerschmidt, S., Wagner, M., Mueller, S., Arnold, K., Grimm, E: On the action of hypochlorite on human serum albumin. Biomed. Biochim. Acta. 49, 991-997, 1990

48. Arnhold, J., Muller, S., Arnold, K, Grimm, E: Chemiluminescence intensities and spectra of luminol oxidation by sodium hypochlorite in the presence of hydrogen peroxide. J. Biolum. Chemilum. 6, 189-192, 1991

49. Arnhold, J., Wiegel, D., Richter, O., Hammerschmidt, S., Arnold, K., Krumbiegel, M.: Modification of low-density lipoproteins by sodium hypochlorite. Biomed. Biochim. Acta. 50, 967-973, 1991

50. Arroyo, P.L., Hatch-Pigott, V., Mower, H.F., Cooney, R.V.: Mutagenicity of nitric oxide and its inhibition by antioxidants. Mutat. Res. 281, 193-202, 1992

51. Aruoma, O.I., Halliwell, B.: Action of hypochlorous acid on the antioxidant protective enzymes superoxide dismutase, catalase, and glutathione peroxidase. Biochem. J. 248, 973-976, 1987

52. Aruoma, O.I., Halliwell, B., Hoey, B.M., Butler, J.: The antioxidant action of taurine hypotaurine and their metabolic precursors. Biochem. J. 256, 251-255, 1988

53. Azizova, O.A., Panasenko, O.M., Vol'nova, T.V., Vladimirov, Y.A.: Free radical lipid oxidation affects cholesterol transfer between lipoproteins and erythrocytes. Free Radic. Biol. Med. 7, 251-257, 1989

54. Babior, B.M., Kipnes, R.S., Curnutte, J.: The production by leukocytes of superoxide. A potential bactericidal agent. J. Clin. Invest. 52, 741-744, 1973

55. Badwey, J.A., Karnofsky, M.L.: Active oxygen species and the functuins of phagocytic leukocytes. Ann. Rev. Biochem. 49, 695-726, 1980

56. Barclay, L.R.C., Locke, S.J., MacNeil, J.M., Van Kessel, J., Burton, G.W., Ingold, K.U.: . J. Amer. Chem. Soc. 106, 2479-2481, 1984

57. Beckman, J.S., Beckman, T.W., Chen, J., Marshall, P.A., Freeman, B.A.: Apparent hydroxyl radical production by peroxynitrite: implications for endothelial injury from nitric oxide and superoxide. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87, 1620-1624, 1990

58. Belding, M.E., Klebanoff, S.J., Ray, C.G: Peroxidase-mediated virucidal systems. Science. 167, 195-207, 1970

59. Bellavite, P.: The superoxide-forning enzymatic system of phagocytes. Free Radic. Biol. Med. 4, 225-261, 1988

60. Bensasson, R., Land, E.J.: Optical and kinetic properties of semireduced plastoquinone and ubiquinone: electron acceptors in photosynthesis. Biochim. Biophys. Acta. 325, 175-181, 1973

61. Bernofsky, C., Bandara, B.M.R., Hinojosa, O.: Electron spin resonance studies of the reaction of hypochlorite with 5,5 -dimetyl -1- pyrroline -N- oxide. Free Radic. Biol. Med. 8, 231-239, 1990

62. Beyer, R.E.: The participation of coenzyme Q in free radical production and antioxidation. Free Radic. Biol. Med. 8, 545-565, 1990

63. Bisby, R.H., Parker, A.W.: The reactions of the alpha-tocopheroxyl radical in micellar solutions studied by nanosecond laser flash photolysis. FEBS Lett. 290, 205-209, 1991

64. Bos, A., Wever, R., Roos, D.: Characterization and quatification of peroxidase in human monocytes. Biochim. Biophys. Acta. 525, 37-44, 1978

65. Bowman, B.H., Kurosky, A.: Haptoglobin: the evolutionary product of duplication, unequal crosssing over, and point mutation. Adv. Human Genet. 12, 189-454, 1982

66. Brandslund, I., Rasmussen, J.M., Svehag, S.E.: Stimultaneous quantitation of free haptoglobin and haemoglobin complexes by double-decker rocket immunoelectrophoresis. Clin. Chim. Acta. 134, 177-188, 1983

67. Brestel, E.P.: Co-oxidation of luminol by hypochlorite and hydrogen peroxide. Implication for neutrophil chemiluminescence. Biochem. Biophys. Res. Commun. 126, 482-488, 1985

68. Brown, M.S., Goldstein, J.L.: Lipoprotein metabolism in the macrophage: implications for cholesterol deposition in atherosclerosis. Ann. Rev. Biochem. 52, 223-261, 1983

69. Buettner, G.R.: The spin trapping of superoxide and hydroxy! free radicals. In: Oberley,L.W., ed., Superoxide dismutase, Boca Raton, CRC press, 1982, p. 63

70. Buettner, G.R.: Spin trapping: ESR parameters of spin adducts. Free Radic. Biol. Med. 3, 259-303, 1987

71. Buettner, G.R.: Ascorbate oxidation: UV absorbance of ascorbate and ESR spectroscopy of the ascorbyl radical as assays for iron. Free Radic. Biol. Med. 10, 5-9, 1990

72. Burkart, V., Gross-Eik, A., Bellman, K., Radons, J., Kolb, H.: Suppression of nitric oxide toxicity in islet cells by alpha-tocopherol. FEBS Lett. 364, 259-263, 1995

73. Burton, G.W., Ingold, K.U.: Vitamin E as in vitro and in vivo antioxidant. Ann. N. Y. Acad. Sci. USA. 570, 7-22, 1989

74. Cadenas, E., Meremyi, G., Lind, J.: Pulse radiolysis study of the reactivity of Trolox C phenoxyl radical with superoxide anion. FEBS Lett. 253, 235-238, 1989

75. Catalano, C.E., Choe, Y.S., Ortiz de Montellano, P.R.: Reactions of the protein radical in peroxide-treated myoglobin. Formation of a heme-protein cross-link. J. Biol. Chem. 264, 10534-10541, 1989

76. Cathcart, M.K., Morel, D.N., Chisolm, G.M.: Monocytes and neutrophils oxidize low density lipoproteins making it cytotoxic. Journal of Leukocyte Biology. 38, 341-350, 1985

77. Cathcart, R.F.: A unique function for ascorbate. Medical Hypothesis. 35, 3237, 1991

78. Cerda, S., Oh, S.K.: Methods to quantitate human haptoglobin by complexation with hemoglobin. J. Immun. Methods. 134, 51-59, 1990

79. Chance, M., Powers, L., Kumar, C., Chance, B.: X-ray absorption studies of myoglobin peroxide reveal functional differences between globins and heme enzymes. Biochem. 25, 1259-1265, 1986

80. Choe, Y.S., Rao, S.I., Ortiz de Montellano, P.R.: Requirement of a second oxidation equivalent for ferryl oxygen transfer to styrene in the epoxidation catalysed by myoglobin-H202. Arch. Biochem. ^ophys. 314, 126-131, 1994

81. Claiborne, A.: Catalase activity. In: Greenwald,R.A., ed., Handbook of methods of oxygen radical research, Boca Raton, CRC Press, 1987, p. 283

82. Clancy, R.M., Leszcyllska-Pitiak, J., Abramson, R.B.: Nitric oxide, an endothelial cell relaxation factor, inhibits neutrophil superoxide anion production via a direct action on the NADPH oxidase. J. Clin. Invest. 90, 1116-1121, 1992

83. Clark, R.A.: Extracellular effects of the myeloperoxidase hydrogen peroxide -system. In: Weissmann,G., ed., Advances in inflammation research, New York, Raven Press, 1983, p. 107

84. Clark, R.A., Klebanoff, S.J.: Neutrophil-mediated tumor cell cytotoxicity role of peroxidase system. J. Exp. Med. 141, 1442-1447, 1975

85. Clark, R.A., Klebanoff, S.J.: Chemotactic-factor inactivation by the myeloperoxidase hydrogen peroxide halid system inflammatory control mechanism. J. Clin. Invest. 64, 913-920, 1979

86. Clark, R.A., Szot, S., Williams, M.A., Kagan, H.M: Oxidation of lysine side-chains of elastin by the myeloperoxidas system and by stimulated human neutrophils. Biochem. Biophys. Res. Commun. 135, 451-457, 1986

87. Clemens, M.R., Einsele, H., Remmer, H., Waller, H.D.: An essential requirement for ferrous-haemoglobin in the hydrogen peroxide stimulated oxidation of red blood cell membrane lipids. Biochem. Pharm. 34, 1339-1341, 1985

88. Cohen, M.S., Britigan, B.E., Pou, S., Rosen, G.M.: Application of spin trapping to human phagocytic cells: insight into conditions for formation and limitation of hydroxyl radical. Free Radic. Res. Commun. 12-13, Pt.1, 17-25, 1991

89. Covey, T.R., Bonner, R.F., Shushan, B.I., Henion, J.: The determination of protein, oligonucleotide and peptide molecular weights by ion-spray mass-spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. 2, 249-256, 1988

90. Culotta, E., Koshland, D.E.: NO news is good news. Science. 258, 1862-1865, 1992

91. Das, M.R., Connor, H.D., Leniart, D.S., Freed, J.H.: An electron nuclear double resonance and electron spin resonance study of semiquinons related to vitamins К and E-1a. J. Amer. Chem. Soc. 92, 2258-2268, 1970

92. Davies, M.J.: Detection of peroxyl and alkoxyl radicals produced by reaction of hydroperoxides with heme-proteins by electron spin resonance spectroscopy. Biochim. Biophys. Acta. 964, 28-35, 1988

93. Davies, M.J.: Direct detection of peroxyl radicals formed in the reactions of metmyoglobin with t-butyl hydroperoxide. Free Radic. Res. Commun. 7, 2732, 1989

94. Davies, M.J.: Identification of a globin free radical in equine myoglobin treated with peroxides. Biochim. Biophys. Acta. 1077, 86-90, 1991

95. Dee, G., Rice-Evans, C., Obeyesekera, S., Meraji, S., Jacobs, M., Bruckdorfer, K.R.: The modulation of ferryl myoglobin formation and its oxidative effects on low density lipoproteins by nitric oxide. FEBS Lett. 294, 38-42, 1991

96. Downs, A.J., Adams, C.J: Hypohalous acids and hypohalites. In: Bailar,J.C.J., Emeleus,H.J., eds., Comprehensive inorganic chemistry, New York, Pergamon Press, 1975, p. 1399

97. Doyle, M.P., Hoekstra, J.W.J.: Oxidation of nitrogen oxides by bound dioxygen in hemeproteins. Inorg. Biochem. 14, 351-356, 1981

98. Dvorankova, B., Pavlicek, Z.: The conformational changes of hemoglobin on its binding to haptoglobin. Collect. Czech. Chem. Commun. 46, 1288-1295, 1981

99. Elsayed, N.M., Dodd, K.T., Fitzpatric, T.M.: . Am. J. Respir. Crit. Care Med. 149, A1029-A1029, 1994

100. Farias-Eisner, R., Chaudhuri, G., Aeberhard, E., Fukuto, J.M.: The chemistry and tumoricidal activity of nitric oxide hydrogen peroxide and the implications to cell resistance susceptibility. J. Biol. Chem. 271, 6144-6151, 1996

101. Faulkner, K., Fridovich, I.: Luminol and lucigenin as detectors for 02.-. Free Radic. Biol. Med. 15, 447-451, 1993

102. Feelish, M.: The bichemical pathways of nitric oxide formation from nitrovasodilators: appropriate choice of exogenous NO donors and aspects of preparation and handling of aqueous NO solutions. J. Cardivasc. Pharmacol. 17, S25-S33, 1991

103. Fieser, M., Fieser, L.F: Reagents for organic synthesis. Wiley -Interscience Publication Jonh Wiley & sons., 1967.

104. Finkelstein, E., Rosen, G.M., Rauckman, E.J.: Spin trapping of superoxide and hydroxyl radicals: practical aspects. Arch. Biochem. Biophys. 200, 1-18, 1980

105. Fliss, H., Menard, M: Hypochlorous acid-induced mobilization of zinc from metalloproteins. Arch. Biochem. Biophys. 287, 175-179, 1991

106. Florenta, J., Hamalainen, E.S., Salo, E., Makela, R., Kekalainen, E.: . Acta Chem. Scand. A37, 383-391, 1983

107. Foote, C.S., Goyne, Т.Е., Lehrer, R.I: Assessment of chlorination by human neutrophils. Nature. 301, 715-716, 1983

108. Frei, В., Kim, M.C., Ames, B.N.: Ubiquinol-10 is an effective lipid-soluble antioxidant at phisiological concentrations. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87, 4879-4883, 1990

109. Fukuzawa, K., Gebicki, J.M.: Oxidation of alpha-tocopherol in micelles and liposomes by the hydroxyl, perhydroxyl, and superoxide free radicals. Arch. Biochem. Biophys. 226, 242-251, 1983

110. Galaris, D., Edy, L., Arduini, A., Cadenas, E., Hochstein, P.: Mechanisms of reoxygenation injury in myocardial infarction: implications of a myoglobin redox cycle. Biochem. Biophys. Res. Commun. 160, 1162-1168, 1989

111. Galaris, D., Mira, D., Sevanian, A., Cadenas, E., Hochstein, P.: Co-oxidation of Salicylat and Cholesterol during the Oxidation of Metmyoglobin by H202. Archiv. Biochem. Biophys. 262, 221-231, 1988

112. Gaston, B., Drazen, J.M., Loscalzo, J., Stamler, J.S.: The biology of nitrogen oxides in the airways. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 149, 538-551, 1994

113. Giulivi, C., Davies, K.J.A.: A novel antioxidant role for the hemoglobin. The comproportionation of ferrylhemoglobin with oxyhemoglobin. J. Biol. Chem. 265, 19453-19460, 1990

114. Giulivi, C., Romero, F.J., Cadenas, E.: The integration of Trolox C, a water-soluble vitamin E analog, with ferrylhemoglobin: reduction of the oxoferryl moiety. Arch. Biochem. Biophys. 299, 302-312, 1992

115. Gorbounov, N.V., Esposito, E.: . Int. J. Immunopathol. Pharmacol. 6, 6775, 1993

116. Graver, E.R., Beale, R., Smithies, M., Bihari, D.: . Anaesth. Int. Care. 22, 312-313, 1994

117. Grisham, M.B., Miles, A.M.: Effects of aminosalicylatesand immunosupressive agents on nitric oxide dependent N-nitrosation reactions. Biochem. Pharm. 47, 1897-1902, 1994

118. Grootveld, M., Halliwell, B., Moorhouse, C.P: Action of uric acid,allopurinol and oxypurinol on the myeloperoxidase-derived oxidant hypochlorous acid. Free Radic. Res. Commun. 4, 69-76, 1987

119. Gross, S.S., Wolin, M.S.: Nitric oxide: pathophysiological mechanisms. Ann. Rev. Physiol. 57, 737-769, 1995

120. Gutteridge, J.M.C.: Iron promoters of the Fenton reaction and lipid peroxidation can be released from haemoglobin by peroxides. FEBS Lett. 201, 191-295, 1986

121. Gutteridge, J.M.C.: The antioxidant activity of haptoglobin towards haemoglobin-stimulated lipid peroxidation. Biochim. Biophys. Acta. 917, 219223, 1987

122. Gutteridge, J.M.C., Westermarck, T., Halliwell, B.: Oxygen radical damage in biological system. In: Johnson,J.E.Jr., ed., Free radicals, aging and degenerative diseases, New York, Alan R.Liss Inc., 1986, p. 77

123. Gwost, D., Cauton, K.G.: . Inorg. Chem. 12, 2095-2099, 1973

124. Halliwell, B.: Albumin an important extracellular antioxidant. Biochem. Pharmacol. 37, 569-571, 1988

125. Halliwell, B., Aruoma, O.I., Wasil, M., Gutteridge, J.M.C.: The resistance of transferrin lactoferrin and ceruloplasmin to oxidative damage. Biochem. J. 256, 311-311, 1988

126. Halliwell, B., Gutteridge, J.M.C.: Oxygen toxicity, oxygen radicals transition metals and disease. Bichem. J. 219, 1-14, 1984

127. Halliwell, B., Gutteridge, J.M.C.: The importance of free radicals and catalitic metal ions in human diseases. Molec. Aspects Med. 8, 89-193, 1985

128. Halliwell, B., Gutteridge, J.M.C.: Oxygen free radicals and iron in relation to biology and medicine: some problems and concepts. Arch. Biochem. Biophys. 246,501-514,1986

129. Halliwell, B., Gutteridge, J.M.C.: Role of free radicals and catalytic metal ions in human disease: an overview. Meth. Enzymol. 186, 1-85, 1990

130. Hamaguchi, H., Isomoto, A., Miyake, Y., Nakajima, H.: Some Spectral Properties of the Human Hemoglobin-Haptoglobin Complex. Biochemistry. 10, 1741-1745, 1971

131. Hamers, M.N., Bot, A.A.M., Weening, R.S., Sips, H.J., Roos, D.: Kinetics and mechanism of the bactericidal action of human neutrophyls aganist Escherichia coli. Blood. 64, 635-641, 1984

132. Harel, S., Avior, M., Kanner, J.: . Free Radic. Res. Commun. 5, 11-19, 1987

133. Harel, S., Kanner, J.: The generation of ferryl or hydroxyl radicals during interaction of hemoproteins with hydrogen peroxide. Free Radic. Res. Commun. 5, 21-23, 1988

134. Harel, S., Salan, M.A., Kanner, J.: Iron release from metmyoglobin, methaemoglobin and cytochrom c by a system generating hydrogen peroxide. Free Rad. Res. Commun. 5, 11-19, 1988

135. Harrison, J.E., Schultz, J.: Studies on chlorinating activity of myeloperoxidase. J. Biol. Chem. 251, 1371-1374, 1976

136. Hartung, H.-P., Kladetzky, R.G., Melnik, B., Hennerici, M.: Stimulation of the scavenger receptor on monocytes-macrophages evokes release of arachidonic acid metabolites and reduced oxygen species. Labor. Invest. 55, 209-216, 1986

137. Heales, S.J., Bolanos, J.P., Land, J.M., Clark, J.B.: Trolox protects mitochondrial complex IV from nitric oxide-mediated damage of astrocytes. Brain Research. 668, 243-245, 1994

138. Henderson, W.R., Klebanoff, S.J.: Leukotriene prodaction and inactivation by normal chronic granulomatous disease and myeloperoxidase-deficient neutrophils. J. Biol. Chem. 258, 13522-13527, 1983

139. Henry, J-P-, Michelson, A.M.: Superoxide and chemiluminescence. In: Michelson,A.M., McCord,J.M., Fridovich,!., eds., Superoxide and superoxide dismutases, London, Academic Press, 1977, p. 283

140. Henry, Y., Ducrocq, C., Drapier, J.-C., Servent, D., Pellat, C., Gussiani, A.: Nitric oxide, a biological effector. Electron paramagnetic resonance detection of nitrosyl-iron-protein complexes in whole cells. Eur. Biophys. J. 20, 1-15, 1991

141. Henry, Y., Lepoivre, M., Drapier, J.-C., Ducrocq, C., Boucher, J.-L., Gussiani, A.: EPR characterisation of molecular targets for NO in mammalian cells and organelles. FASEB J. 7, 1124-1133, 1993

142. Hibbs, J.B.Jr.: Synthesis of nitric oxide from L-arginine: a recently discovered pathway induced by cytokines with antitumor and antimicrobal activity. Res. Immunol. 142, 565-569, 1991

143. Hiramatsu, K., Rosen, H., Heinecke, J.W., Wolfbauer, G., Chait, A.: Superoxide initiates oxidation of low density lipoprotein by human monocytes. Arteriosclerosis. 7, 55-60, 1987

144. Hogg, N., Darley-Usmar, V.M., Wilson, M.T., Moncada, S.: The oxidation of alpha-tocopherol in human low density lipoprotein by the simultaneous generation of superoxide and nitric oxide. FEBS Lett. 326, 199-203, 1993

145. Hogg, N., Rice-Evans, C., Darley-Usmar, V.M., Wilson, M.T., Paganga, G., Dourne, L.: The role of lipid hydroperoxides in the myoglobin-dependent oxidation of LDL. Arch. Biochem. Biophys. 314, 39-44, 1994

146. Hunsberger, J.F.: Handbook of Chemistry and Physics. CRC Press, 1974.

147. Hurst, J.K., Barrette, W.C.,Jr., Michel, B.R., Rosen, H.: Hypochlorous acid and myeloperoxidase-catalyzed oxidation of iron-sulfur clusters in bacterial respiratory degydrogenases. Eur. J. Biochem. 202, 1275-1282, 1991

148. Hwang, P.K., Greer, J.: Interaction between Hemoglobin Subunits in the Hemoglobin- Haptoglobin Complex. J. Biol. Chem. 255, 3038-3041, 1980

149. Ignarro, L.J.: Endothelium-derived nitric oxide: pharmaology and relationship to the actions of organic esters. Pharm. Res. 6, 651-659, 1989

150. Janzen, E.G.: A critical review of spin trapping in biological systems. In: Pryor,W.A., ed., Free Radicals in Biology and Medicine, New York, Academic Press, 1980, p. 116

151. Janzen, E.G., Jandrisits, L.T., Barber, D.L.: Studies on the origin of the hydroxyl spin adducts of DMPO produced from the stimulation of neutrophils by phorbol-12- myristate-13-acetate. Free Radic. Res. Commun. 4, 115-123, 1987

152. Janzen, E.G., Wilcox, A.L., Manoharan, V.: . J. Org. Chem. 58, 3597-3599, 1993

153. Javid, J.: Human haptoglobins. Curr. Top. Hematol. 1, 151-192, 1978

154. Javid, J., Liang, J.C.: The Hemoglobin-Haptoglobin bond. Disssociation of the complex and recovery of the native Hp in an affinity chromatography system. J. Labor. Clin. Med. 82, 991-1002, 1973

155. Johnson, G., Tsao, P.S., Lefer, A.M.: Cardioprotective effects of authentic nitric oxide in myocardial ischemia with reperfusion. Crit. Care Med. 19, 244252, 1991

156. Joseph, J., Kalyanaraman, B., Hyde, J.S.: Trapping of nitric oxide by nitronyl nitroxides: an electron spin resonance investigation. Biochem. Biophys. Res. Commun. 192, 926-934, 1993

157. Kagan, V.E., Witt, E., Goldman, R., Scita, G., Packer, L.: . Free Radic. Biol. Med. 16, 385-397, 1992

158. Kalyanaraman, B., Mason, R.P., Tainer, B., Eling, T.E.: The free radical formed during the hydroperoxide - mediated deactivation of ram seminal-vesicles is hemoprotein-derived. J. Biol. Chem. 257, 4764-4768, 1982

159. Kalyanaraman, B., Sohnie, P.G.: Generation of free radical intermediates from foreign compounds by neutrophil- derived oxidants. J. Clin. Invest. 75, 1618-1622, 1985

160. Kanner, J., Harel, S.: Initiation of membrananl lipid peroxidation by activated metmyoglobin and methemoglobin. Arch. Biochem. Biophys. 237, 314-321, 1985

161. Kanner, J., Harel, S., Granit, R.: Nitric oxide as an antioxidant. Arch. Biochem. Biophys. 289, 130-136, 1991

162. Kasha, M., Khan, A.U.: The physics chemistry and biologyof singlet molecular oxygen. Ann. N. Y. Acad. Sei. USA. 171, 5-23, 1970

163. Kerwin, J.F.J., Lancaster, J.R.Jr., Feldman, P.L.: Nitric oxide: a new paradigm for second messengers. J. Med. Chem. 38, 4343-4362, 1995

164. Khan, A.U., Kasha, M.: Rotational structure in chemiluminescence spectrum of molecular oxygen in aqueous systems. Nature. 204, 241-246, 1964

165. Khatsenko, O.G., Gross, S.S., Rifkind, A.B., Vane, J.R.: Nitric oxide is a mediator of the decrease in cytochrome P450-dependent metabolism caused by immunostimulants. Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 90, 11147-11151, 1993

166. King, K.N., Winfield, M.E.: The mechanism of metmyoglobin oxidation. J. Biol. Chem. 238, 1520-1528, 1963

167. Klebanoff, S.J.: Oxygen metabolism and the toxic properties of phagocytes. Ann. Intern. Med. 393, 480-489, 1980

168. Klebanoff, S.J., Clark, R.A.: Neutrophil: Function and Clinical Disorders. Amsterdam New York Oxford, North-Holland Publishing Company., 1978.

169. Konishi, Y., Feng, R.: Conformational stability of heme proteins vacuo. Biochemistry. 33, 9706-9711, 1994

170. Koppenol, W.H., Butler, J.: Energetics of interconversion reaction of oxyradicals. Adv. Free Rad. Biol. Med. 1, 91-131, 1985

171. Korytowsky, W., Kalyanaraman, B., Menon, I.A., Sama, T., Sealy, R.C.: . Biochim. Biophys. Acta. 882, 145-153, 1986

172. Kozlov, A.V., Panasenko, O.M., Yegorov, D.Y., Vol'nova, T.V., Azizova, O.A.: Antioxidant properties of albumin during the oxidation of linolenic acid and low-density lipoproteins in the presence of ferrous ions. Biomed. Science. 2, 530-535, 1991

173. Kubes, P.: Ischemia-reperfusion in feline small intestine: a role for nitric oxide. Am. J. Physiol. 264, GI43-GI49, 1993

174. Kumar, K., Day, R.A., Margerum, D.W: Atom- transfer redox kinetics: general-acid-assisted oxidation of iodide by chloramines and hypochlorite. Inorg. Chem. 25, 4344-4350, 1986

175. Lancaster, J.R.Jr.: Simulation of the diffusion and reaction of endogenously produced nitric oxide. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91, 8137-8141, 1994

176. Lee, Y.S., Wurster, R.D.: Potentiation of antiproliferative effect of nitroprusside by ascorbate in human brain tumor cells. Cancer Lett. 78, 19-23, 1994

177. Lehrer, R.I: Antifungal effects of peroxidase systems. J. Bacterid. 99, 361370, 1969

178. Lepoivre, M., Fieschi, F., Coves, J., Thelander, L., Fontecave, M.: Inactivation of ribonucleotide reductase by nitric oxide. Biochem. Biophys. Res. Commun. 179, 442-448, 1991

179. Lepoivre, M., Flaman, J.-M., Henry, Y.: Early loss of the tyrosyl radical in ribonucleotide reductase of adenocarcinoma cells producing nitric oxide. J. Biol. Chem. 267, 22994-23000, 1992

180. Li, A.S.W., Cummings, K.B., Roethling, H.P., Buettner, G.R., Chignell, C.F: A spin-trapping database implemented on the IBM PC/AT. J. Magn. Reson. 79, 140-142, 1988

181. Liebler, D.C.: Tocopherone and epoxytocopherone products of vitamine E oxidation. Meth. Enzymol. 234, 310-317, 1990

182. Lindgren, F.T.: Preparative ultracentrifugal laboratory procedures and suggestions for lipoprotein analysis. In: Perkins,E.G., ed., Analysis of Lipids and Lipoproteins, Chemists' Society, 1975, p. 204

183. Loiseau, P., Jallon, P.: Post-traumatic epilepsy. Prog. Neurol. Surg. 10, 323-343, 1981

184. Long, C.A., Belski, B.H.J.: Rate of reaction of superoxide radical with chloride-containing species. J. Phys. Chem. 84, 555-557, 1980

185. Lymar, S.V., Hurst, K.: Rapid reaction between peroxynitrite ion and carbon dioxide: implications for biological activity. J. Amer. Chem. Soc. 290, 52-57, 1995

186. Mac Gregor, R.R., Spagnuolo, P.J., Lentnek, A.L.: Inhibition of granulocyte adherence by ethanol, prednisone, and aspirin, measured with an assay system. New Engl. J. Med. 291, 642-646, 1974

187. Maguire, J.J., Wilson, D.S., Packer, L.: Mitochondrial electron transport-linked tocopheroxyl radical reduction. J. Biol. Chem. 264, 21462-21465, 1989

188. Maiorino, M., Ursini, F., Cadenas, E.: Reactivity of metmyoglobin towards phospholipid hydroperoxides. Free Radic. Biol. Med. 16, 661-667, 1994

189. Makinen, M.W., Milstien, J.B., Kon, H.: Specificity of Interaction of Haptoglobin with Mammalian Hemoglobin. Biochemistry. 11, 3851-3859, 1972

190. Malinski, T., Taha, Z., Grunfeld, S., Patton, S., Kapturczak, M., Tomboulian, P.: Diffusion of nitric oxide in the aorta wall monitored in situ byporphyrinic microsensors. Biochem. Biophys. Res. Commun. 193, 1076-1082, 1993

191. Maris, M.A., Brown, C.W., Lavery, D.S.: . Anal. Chem. 55, 1694-1694, 1983

192. Mashino, T., Fridovich, I.: Reactions of hypochlorite with catalase. Biochim. Biophys. Acta. 956, 63-69, 1988

193. Matheson, N.R., Travis, J.: Differential effects of oxidising agents on human plasma a1- protease inhibitor and human neutrophils myeloperoxidase. Biochemistry. 24, 1941-1945, 1985

194. McKenna, S.M., Davies, K.J.A.: The inhibition of bacterial growth by hypochlorous acid. Possible role in the bactericidal activity of phagocytes. Biochem. J. 254, 685-692, 1988

195. Mehlhorn, R.J., Fuchs, J., Sumida, S., Packer, L.: Preparation of tocopheroxyl radicals for detection by electron spin resonance. Meth. EnzymoL 186, 197-205, 1990

196. Miles, A.M., Bohle, D.S., Glassbrenner, P.A., Hansert, B., Wink, D.A., Grisham, M.B.: Modulation of superoxide dependent oxidation and hydroxylation reactions by nitric oxide. J. Biol. Chem. 271, 40-47, 1996

197. Moncada, S., Palmer, R.M.J., Higgs, E.A.: Nitric oxide:physiology, pathophysiology and pharmacology. Pharmacol. Rev. 43, 109-142, 1991

198. Morris, J.C.: The acid ionisation constant of HOCI from 5 to 35 oC. J. Phys. Chem. 70, 3798-3805, 1966

199. Mukai, K., Kikushi, S., Urano, S.: Stopped-flow kinetic study of the regeneration reaction of tocopheroxyl radical by reduced ubiquinone-10 in solution. Biochim. Biophys. Acta. 1035, 77-82, 1990

200. Murad, F.: The nitric oxide-cyclic GMP signal transduction system for intracellular and intracellular communications. Recent Progr. Horm. 49, 239248, 1994

201. Nagel, R.L., Gibson, Q.H.: Kinetics and Mechanism of Complex Formation between Hemoglobin and Haptoglobin. J. Biol. Chem. 242, 3428-3434, 1967

202. Nagel, R.L., Rothman, M.C., Bradley, T.B.: Comparative Hp-binding properties of oxyHb and desoxyHb. J. Biol. Chem. 240, 4543-4545, 1965

203. Nani, A.E.J., Stallings, M., Sawer, D.T.: . J. Amer. Chem. Soc. 102, 44814485, 1985

204. Nathan, C.F.: Nitric oxide as a secretory product of mammalian cells. FASEB J. 6, 3051-3064, 1992

205. Neuzil, J., Stocker, R.: Free and albumin-bound bilirubin are efficient co-antioxidants for alpha-tocopherol, inhibiting plasma and low density lipoprotein lipid peroxidation. J. Biol. Chem. 269, 16712-16719, 1994

206. Nguyen, T., Brunson, D., Crespi, C.L., Penman, B.W., Wishnok, J.S., Tannenbaum, S.R.: DNA damage and mutation in human cells exposed to nitric oxide. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89, 3030-3034, 1992

207. Nikano, M., Kimura, H., Hara, M., Kuroiwa, M., Kato, M., Totsune, K., Yoshikawa, T.: A highly sensitive method for determining both Mn- and Cu-Zn SOD activities in tissues and blood cells. Analit. Biochem. 187, 277-280, 1990

208. Ninoshiba, T., DeRojas-Walker, T., Wishnok, J.S., Tannenbaum, S.R., Demple, B.: Activation by nitric oxide of an oxidative stress responce that defends Escherichia coli against macrophages. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90, 9993-9997, 1993

209. Nohl, H., Jordan, W.: The mitochondrial site of superoxide formation. Biochem. Biophys. Res. Commun. 138, 533-539, 1986

210. Nohl, H., Stolze.K.: Chemiluminescence from activated heme compounds detected in the reaction of various xenobiotics with oxyhemoglobin: comparison with several heme/hydrogen peroxide systems. Free Radic. Biol. Med. 15, 257-263, 1993

211. Oh, S.K., Very, D.L., Walker, J., Raam, S., Ju, S.-T.: An analogy between fetal haptoglobin and a potent immunosuppressant in canaer. Cancer Res. 47, 5120-5125, 1987

212. Ozawa, T., Hanaki, A.: . Biochem. Biophys. Res. Commun. 126, 873-878, 1992

213. Pacelli, R., Wink, D.A., Cook, J.A., Krishna, M.C., DeGraff, W., Friedman, N., Tsikos, M., Samuni, A., Mitchell, J.B.: Nitric oxide potentiates hydrogen peroxide-induced killing of Escherichia coli. J. Exp. Med. 182, 1469-1479, 1995

214. Packer, L., Slater, T.F., Wilson, R.L.: Direct observation of a free radical interaction between vitamin E and vitamin C. Nature. 278, 737-738, 1979

215. Paganga, G., Rice-Evans, C., Rule, R., Leake, D.: The interaction between ruptured erythrocytes and low-density lipoproteins. FEBS Lett. 303, 154-158, 1992

216. Panasenko, O.M., Arnhold, J., Schiller, J., Arnold, K., Sergienko, V.I.: Peroxidation of egg yolk phosphatidylcholine liposomes by hypochlorous acid. Biochim. Biophys. Acta. 1215, 259-266, 1994

217. Panter, S.S., Sadrzadeh, S.M.H., Hallaway, P.E., Haines, J.L., Anderson, V.E., Eaton, J.W.: Hypohaptoglobinemia associated with family epilepsy. J. Exp. Med. 161, 748-754, 1985

218. Paredes, J.-M., Weiss, S.J.: Human-neutrophils transform prostaglandins by a myeloperoxidase- dependent mechanism. J. Biol. Chem. 257, 27382740, 1982

219. Pdmaja, S., Huie, R.E.: The reaction of nitric oxide with organic peroxy radicals. Biochem. Biophys. Res. Commun. 195, 539-544, 1993

220. Peacock, A.C., Pastewka, J.V., Reed, R.A., Ness, AT.: Haptoglobin-Hemoglobin Interaction. Stoichiometry. Biochemistry. 9, 2275-2278, 1970

221. Pintera, J.: Haptoglobin. Ser. Haematol. 4, 1-183, 1971

222. Puppo, A., Halliwell, B.: Formation of hydroxyl radicals from hydrogen peroxide in the presence of iron. Is haemoglobin a biological Fenton reagent? Biochem. J. 249, 185-190, 1988

223. Puppo, A., Halliwell, B.: Oxidation of dimethylsulphoxide to formaldehyde by oxyhaemoglobin and oxyleghaemoglobin in the presence of hydrogen peroxide is not mediated by "free" hydrohyl radicals. Free Radic. Res. Commun. 5, 277-281, 1989

224. Putnam, F.W.: Haptoglobin. In: Putnam,F.W., ed., The plasma proteins, New York, Academic Press, 1975, p. 1

225. Rafowicz, S., Lavergne, J.-M.: Determination rapide des groupes d'haptoglobine par electrophorese en gel d'agarose. Ann. Biol. Clin. 32, 439441, 1974

226. Rao, S.I., Wilks, A., Hamberg, M., Ortiz de Montellano, P.R.: The lipoxygenase activity of myoglobin. Oxidation of linoleic acid by the ferryl oxygen rather than protein radical. J. Biol. Chem. 269, 7210-7216, 1994

227. Rice-Evans, C., Okunade, G., Khan, R.: . Free Rad. Res. Commun. 7, 4554, 1989

228. Rosen, G.M., Cohen, M.S., Britigan, B.E., Pou, S.: Application of spin traps to biological systems. Free Radic. Res. Commun. 9, 187-195, 1990

229. Rosen, G.M., Finkelstein, E., Rauckman, E.J.: A method for the detection of superoxide in biological systems. Arch. Biochem. Biophys. 215, 367-378, 1982

230. Sadrzadeh, S.M.H., Graf, E., Panter, S.S., Hallaway, P.E., Eaton, J.W.: Hemoglobin. A biologic Fenton reagent. J. Biol. Chem. 259, 14354-14356, 1984

231. Schaich, K.M., Borg, D.C: EPR studies in autoxidation. In: Simic,M.G., Karel,M., eds., Autoxidation in food and biologycal systems, New York, Plenum Press, 1980, p. 45

232. Schmidt, J.M.: . J. Respir. Care Pract. 7, 37-44, 1994

233. Schwartz, S.E., White, W.H.: Kinetics of reactive dissolutions of nitrogen oxides into aqueous solutions. In: Trace atmospheric constitutents. Properties, transformation and fates, New York, John Wiley & Sons, 1983, p. 1

234. Sepe, S.M., Clark, R.A.: Oxidant membrane injury by the neutrophil myeloperoxidase system. 1.Characterization of aliposome model and injury by myeloperoxidase, hydrogen peroxide and halides. J. Immunol. 134, 18881895, 1985

235. Sharma, M., Buettner, G.R.: Interaction of vitamin C and vitamin E during free radical stress in plasma: an ESR study. Free Radic. Biol. Med. 14, 649653, 1993

236. Shaw, A.W., Vosper, A.J.: . J. Chem. Soc. ,Faraday Trans. 8, 1239-1244, 1977

237. Shiga, T., Imaizumi, K.: Electron spin resonance study on peroxidase- and oxidase-reactions of horse radish peroxidase and methemoglobin. Arch. Biochem. Biophys. 167, 469-479, 1975

238. Shim, B.-S., Jue, D.-M.: Simple spectrophotometric determination of haptoglobin level in serum. Clin. Chim. Acta. 136, 145-153, 1984

239. Shinar, E., Rachmilewitz, E.A.: Oxidative denaturation of red blood cells in thalassemia. Semin. Hematol. 27, 70-82, 1990

240. Simic, J.L., Swallow, A.J.: . Biochim. Biophys. Acta. 226, 230-240, 1971

241. Simic, M.G.: Pulse radiolysis in study of oxygen radicals. Meth. Enzymol. 186, 89-100, 1990

242. Slivka, A., LoBuglio, A.F., Weiss, S.J.: A potential role of hypochlorous acid in granulocyte-mediated tumor cell cytoxicity. Blood. 55, 347-350, 1980

243. Squadrito, G.L., Jin, X., Pryor, W.A.: Stopped-flow kinetic study of the reaction of ascorbic acid with peroxinitrite. Arch. Biochem. Biophys. 322, 5359, 1995

244. Sridhar, R., Beaumont, P.C., Powers, E.L.: Fast kinetics of the reaction of hydroxyl radicals with nitrone spin traps. J. Radio Nucl. Chem. 101, 227-237, 1986

245. Stamler, J.S., Singel, D.J., Loscalzo, J.: Biochemistry of nitric oxide and its redox-activated forms. Science. 258, 1898-1902, 1992

246. Standing, S., Price, C.P.: A kinetic method for the determination of Haptoglobin as HbBC. Clin. Chim. Acta. 66, 393-403, 1976

247. Stauff, J., Sander, U., Jaeshke, W.: Chemiluminescence of perhydroxyl-and carbonate-radicals. In: Cormier, M., Hercules,D., Lee,J., eds., Chemiluminescence and bioluminescence, New York, Plenum Press, 1973, p. 136

248. Steinbrecher, U.P., Zhang, H., Lougheed, M.: Role of oxidatively modified LDL in atherosclerosis. Free Rad. Biol. Med. 9, 155-168, 1990

249. Stelmaszynska, T., Zgliczynski, J.M.: Myeloperoxidase of human neutrophilic granulocytes chlorinating enzyme. Eur. J. Biochem. 45, 305-312, 1974

250. Stelmaszynska, T., Zgliczynski, J.M.: N-(2-oxocyl) aminoacid and nitriles as a final products of dipeptide chlorination. Eur. J. Biochem. 92, 301-308, 1978

251. Tajima, K., Shigematsu, M., Jinno, J., Kawano, Y., Mikami, K., Ishizu, K., Ohya-Nishiguchi, H.: A possible model of hemoprotein-fatty acid peroxide complex demonstrated by electron spin resonance. Biochem. Biophys. Res. Commun. 166, 924-930, 1990

252. Thillet, J., Michelson, A.M.: Oxidation and cross-linking of human hemoglobins by activated oxygen species. Free Rad. Res. Commun. 1, 89100, 1985

253. Thomas, E.L., Grisham, M.B., Jefferson, M.M.: Myeloperoxidase-dependent effect of amines on fuctions of isolated neutrophils. J. Clin. Invest. 72, 441454, 1983

254. Thomas, M.J., Smith, S., Pang, J.: The use of water- soluble radical scavengers to detect hydroxyl radical formation by polymorphonuclear leukocytes. Free Radic. Res. Commun. 12, 53-57, 1991

255. Uchiyama, M., Michara, M.: Determination of malonaldehyde precursor in tissues by thiobarbituric acid test. Analit. Biochem. 86, 271-278, 1978

256. Valentine, J.S., Miksztal, A.R., Sawer, D.T.: Methods for the study of superoxide chemistry in nonaqueous solutions. Meth. Enzymol. 105, 71-81, 1984

257. Van den Berg, J.J.M., Kuypers, F.A., Lubin, B.H., Roelofsen, B., Op den Kamp, J.A.F.: The cooperative action of vitamin E and C in the protection of parinaric acid in human erythrocyte membrane. Chem. Phys. Lipids. 53, 309320, 1990

258. Van den Berg, J.J.M., Kuypers, F.A., Lubin, B.H., Roelofsen, B., Op den Kamp, J.A.F.: Direct and continuos measurement of hydroperoxide-induced oxidative stress on the membrane of intact erythrocytes. Free Radic. Biol. Med. 11, 255-261, 1991

259. Van Rijn, H.J.M., Sanderink, G.J.C.M.: Haptoglobin a useful laboratory parameter? Neth. J. Med. 29, 16-22, 1986

260. Van-Rijn, H.J., Van-der-Wilt, W., Stroes, J.W., Schrijver, J.: Is the turbidimetric immunoassay of haptoglobin phenotype- dependent? Clin. Biochem. 20, 245-248, 1987

261. Vaskovsky, V.E., Kostetsky, E.J., Vasendin, I.M.: A universal reagent for phospholipid analysis. J. Chromat. 114, 129-141, 1975

262. Vladimirov, Y.A.: Free radical lipid peroxidation in biomembranes: mechanism, regulation, and biological consequences. In: Johnson,J.E.Jr., ed., Free radicals, aging, and degenerative disease, New York, Alan R. Liss, 1986, p. 141

263. Vogel, A.I.: Textbook of Quantitative Inorganic Analysis. London, Book Society, 1969.

264. Waks, M., Kahn, P.C., Beychok, S.: Studies on the structures of Hp 1-1 and Hb in the Hp-Hb complex. Biochem. Biophys. Res. Commun. 45, 1232-1239, 1971

265. Wallace, W.J., Houtchens, R.A., Maxwell, J.C., Caudhey, W.S.: Mechanism of autoxidation for hemoglobin and myoglobins promotion ofsuperoxide production by protons and anions. J. Biol. Chem. 257, 4966-4977, 1982

266. Wallace, W.J., Maxwell, J.C.: Mechanisms of hemoglobin autoxidation evidence for proton- assisted nucleophilic displacement of superoxide by anions. Biochem. Biophys. Res. Commun. 57, 1104-1110, 1974

267. Walter, T.H., Bancroft, E.E, Mclntire, G.L., Davis, E.R., Gierasc, L.M., Blount, H.N., Stronks, H.J., Janzen, E.G.: Spin trapping in heterogenous electron transfer processes. Can. J. Chem. 60, 1621-1623, 1982

268. Weiss, S.J., Klein, R., Slivka, A., Wei, M.J.: Chlorination of taurin by human neutrophils.Evidence for hypochlorous acid generation. J. Clin. Invest. 70, 5098-5607, 1982

269. Weiss, S.J., LoBuglio, A.F.: Phagocyte-generated oxygen. Metabolism and cellylar injury. Labor. Invest. 47, 5-18, 1982

270. Weiss, S.J., Peppin, G., Ortiz, X., Ragsdale, C., Test, S.T.: Oxidative autoactivation of latent collagenase by human neutrophils. Science. 227, 747749, 1985

271. Wink, D., Hanbauer, I., Krishna, M.C., DeGraff, W., Gamson, J., Mitchell, J.B.: Nitric oxide protects against cellular damage and cytotoxicity from reactive oxygen species. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90, 9813-9817, 1993

272. Wink, D.A., Feelish, M., Vodovotz, Y., Fukuto, J., Grisham, M.B.: The chemical biology of NO. An update. Reactive Oxygen Species in Biological systems. In Press, 1998

273. Wink, D.A., Grisham, M., Mitchell, J.B., Ford, P.C.: Direct and indirect effects of nitric oxide. Biologically relevant chemical reactions in biology of NO. Methods Enzymol. 268, 12-31, 1996

274. Wink, D.A, Osawa, Y., Darbyshire, J.F., Jones, C.R., Eshenaur, S.C., Nims, R.W.: Inhibition of cytochrome P450 by nitric oxide and a nitric oxide releasing agent. Arch. Biochem. Biophys. 300, 115-123, 1993

275. Winterbourn, C.C.: Comparative reactivities of various biological compounds with myeloperoxidase-hydrogen peroxide-choride and similarity of the oxidant to hypochlorite. Biochim. Biophys. Acta. 840, 204-210, 1985

276. Winterbourn, C.C.: Myeloperoxidase as an effective inhibitor of hydroxyl radical production.Implication for the oxidative reactions of neutrophils. J. Clin. Invest. 78, 545-550, 1986

277. Winterbourn, C.C.: The resistance of transferrin, lactoferrin and caeruloplasmin to oxidative damage: a reply. Biochem. J. 256, 311-312, 1988

278. Winterbourn, C.C.: Oxidative reactions of hemoglobin. Meth. Enzymol. 186, 265-272, 1990

279. Winterbourn, C.C., Molly, A.L.: Susceptibilities of lactoferrin and transferrin to myeloperoxidase-dependent loss of iron-binding capacity. Biochem. J. 250, 613-616, 1988

280. Wu, F., Altura, B.T., Gao.J., Barbour.R.L., Altura, B.M.: Ferrylmyoglobin formation induced by acute magnesium deficiency in perfused rat heart causes cardiac failure. Biochim. Biophys. Acta. 1225(2), 158-164, 1994

281. Yamamoto, Y., Komuro, E., Niki, E.: Antioxidant activity of ubiquinol in solution and phosphatidylcholine liposome. J. Nutr. Sci. &Vitamin. 36, 505511,1990203

282. Zgliczynski, J.M., Stelmaszynska, T., Domanski, J., Ostrowski, W.: Chloramines of oxidation reaction of amino acids by myeloperoxidase. Biochim. Biophys. Acta. 235, 419-424, 1971