Изучение термостабильности и эластичности элементов вторичной структуры ряда белков методом молекулярной динамики тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.02, кандидат физико-математических наук Оршанский, Игорь Александрович

• Оршанский, Игорь Александрович
• кандидат физико-математических наук
• 2009

Оглавление диссертации кандидат физико-математических наук Оршанский, Игорь Александрович

Список сокращений.

Введение.

Глава 1. Элементы вторичной структуры белковых молекул.

1.1. р-структуры — типичный мотив укладки белков паутинного волокна.

1.1.1.Химия, структура и функция.

1.1.2.Источники и клонирование белков паутинного волокна.

1.2.Сигнальные пептиды — участки белка с конформацией а-спирали.

1.2.1.Классы N-концевых сигнальных пептидов.

1.2.2.Внутренние сигнальные последовательности.

1.2.3.Сигнальные пептиды и функционирование белков вируса гепатита С.

1.3. Постановка задачи исследования.

Глава 2. Метод молекулярной динамики.

2.1.Физические основы метода МД.

2.2 Валентные взаимодействия.

2.3. Невалентные взаимодействия.

2.4 Численное интегрирование.

2.5 Поддержание постоянной температуры.

2.5.1 Термостат Берендсена.

2.5.2 Столкновительный термостат.

2.5.3 Стохастическая динамика.

2.6. Поддержание постоянного давления.

2.7. Неравновесная молекулярная динамика.

Глава 3. Динамика пептидных молекул в конформации а-спирали.

3.1.2. Молекулярная динамика а-спиралей при температуре 300 К.

3.2. Оценка стабильности вторичной структуры пептидов.

3.2.1. Молекулярная динамика а-спирали полиаланина.

3.2.2. Молекулярная динамика а-спирали сигнального пептида 1.

3.2.3. Молекулярная динамика а-спирали сигнального пептида II.

Глава 4. Динамика элементов паутинного волокна.

4.1. Молекулярная динамика отдельных полиаланиновых пептидов в столкновительной среде.:.

4.1.1.Протокол молекулярной динамики.

4.1.2 Конформационное поведение отдельных полиаланиновых пептидов в столкновительной среде.

4.1.3. Молекулярная динамика надмолекулярных комплексов из пяти пептидов поли-А.

4.2. Управляемая молекулярная динамика надмолекулярных комплексов из пяти полиаланиновых пептидов.

4.2.1 Исследуемая система и протокол моделирования.

4.2.2. Управляемая молекулярная динамика комплексов полиаланиновых пептидов.

4.4. Молекулярная динамика внутреннего пептида.

4.4.2 Молекулярная динамика отдельных внутренних пептидов.

4.4.3. Молекулярная динамика комплекса из пяти внутренних пептидов.

4.5. Управляемая молекулярная динамика комплекса из пяти внутренних пептидов.

4.5.1. Исследуемая система и протокол моделирования.

4.5.2 Управляемая молекулярная динамика надомолекулярного комплекса межаланиновых пептидов паутинного волокна.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Изучение термостабильности и эластичности элементов вторичной структуры ряда белков методом молекулярной динамики»

Благодаря достижениям биоинженерии и нанобиотехнологий белки и полипептиды вызывают все больший интерес как конструкционный материал. Поэтому большой интерес представляет разработка методов оценки механических и тепловых свойств этих объектов. Следует принять во внимание, что экспериментальные измерения этих свойств трудно доступны. Молекулярная динамика дает здесь уникальную возможность развить методы оценки таких важнейших конструкционных параметров полипептидов как эластичность и термостабильность. Как известно, механические свойства макромолекулярной системы определяются многомерной поверхностью потенциальной энергии. Попадание системы в тот или иной энергетический минимум соответствует различным ее состояниям. Изучение термостабильности и эластичности молекул позволяет также получить сведения о существенных особенностях динамики многоатомной системы. Изучение эластичности характеризует поведение системы в области локального минимума, а термостабильность отражает возможные надбарьерные переходы.

С прикладной же точки зрения изучение механических свойств элементов вторичной структуры интересно для новой и только зарождающейся промышленности, основанной на нанобиотехнологии. В частности, идет поиск способов производства новых типов нановолокон пептидной природы. К таким относится, к примеру, паутинное волокно, которое обладает рядом замечательных свойств: по прочности намного превосходит сталь, по эластичности сравнимо с резиной, является биосовместимым и биодеградабельным. Свойства волокна напрямую зависят от состава, потому изучение механических свойств отдельных элементов волокна позволит осуществлять дизайн новых типов волокон с заданными свойствами. В связи с этим, изучение методами полноатомного молекулярного моделирования механических свойств элементов вторичной структуры является актуальным как с фундаментальной, так и с прикладной точек зрения.

Целью настоящей работы было исследование динамики, термостабильности и эластичности таких элементов вторичной структуры, как а-спирали (на примере сигнальных пептидов и полиаланина) и (3-листы (на примере полиаланина) в полноатомном приближении методами равновесной и управляемой молекулярной динамики (МД).

В качестве объектов для сравнительного изучения термостабильности были выбраны достаточно разнообразные структуры. Полиаланиновые пептиды и структуры, представленные в сигнальных пептидах белка NS2 вируса гепатита С, которые представляют большой интерес как с точки зрения изучения свойств собственно сигнальных пептидов, так и с точки зрения поиска локальных дефектов, оказывающих существенное воздействие на механизм их встраивания в мембрану. Объектами для изучения поведения упругих свойств пептидных молекул являлись полиаланиновые фрагменты белка спидроина, которые, с одной стороны, являются хорошим модельным объектом, а с другой стороны, представляют большой практический интерес как элементы белка, формирующего волокно паутины.

Заключение диссертации по теме «Биофизика», Оршанский, Игорь Александрович

Выводы

1. Термостабильность а-спиралей, сформированных сигнальными пептидами, ниже, чем у модельных гомополимерных спиралей типа полиаланина. Дестабилизация вторичной структуры а-спирали начинается локально, в-местах дефектов. Для гомополимерной спирали такими дефектами являются концевые остатки, обладающие большей подвижностью, для гетерополимерной - определенные элементы аминокислотной последовательности. В основе дестабилизации структуры гетерополимерных пептидов' могут лежать как стерические причины - наличие 2х отстатков глицина в аминокислотной последовательности, так и электростатические — взаимодействия заряженных аминокислотных остатков.

2. Сочетание жестких участков а-спиралей и нестабильных участков позволяет формировать шарнирные структуры, которые могут иметь большое значение в механизме проникновения сигнального пептида в мембрану.

3. Полиаланиновые участки спидроина, формируя стопки параллельных Р-нитей имеют тенденцию к формированию правой суперспирали. Для стабилизации суперспирали критическое число р-нитей в стопке — 5, критическая длина Р-нитеи — 8 остатков.

4. Растяжение суперспирали происходит в три этапа, на каждом из которых определяющую роль играет суперспиральная структура, далее деформация водородных связей вторичной структуры, далее деформация валентных углов и связей. Межаланиновые пептиды, богатые остатками глицина формируют более рыхлые и эластичные структуры.

5. Вязкоупругие свойства суперспирали (протофибриллы) не укладываются в рамки модели линейного вязкоупругого тела (модели Зинера). Необходимыми элементами усложнения реологической модели являются введение зависимости упругости и вязкости максвелловского элемента от напряжения и удлинения, а также введение нового максвелловского элемента с большой жесткостью и пороговым возрастанием внутренней вязкости от очень низких до очень больших значений при удлинении фибриллы выше критического значения.

6. Значения модуля Юнга суперспирального фрагмента протофибриллы при небольших нагрузках и небольших удлинениях немного выше, чем у резины. При увеличении нагрузки и удлинения модуль Юнга быстро возрастает, приближаясь при удлинениях порядка 75% к значениям, типичным для упругих тел.

Благодарности.

Хочу выразить искреннюю признательность научному руководителю, д.ф.-м.н., профессору К.В. Шайтану за неоценимый вклад в развитие идей, излагаемых в диссертации и помощь в работе. Хочу поблагодарить весь коллектив кафедры биоинженерии биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова, во главе с заведующим кафедрой, академиком М.П. Кирпичниковым, за создание благоприятных условий для выполнения данной работы. Особую признательность хочу выразить сотрудникам группы молекулярного моделирования за помощь в работе и плодотворные обсуждения.

Отдельную признательность хочется выразить аспиранту кафедры биофизики В.Э. Загидуллину за полезные советы по обработке части результатов, к.ф.-м.н. О.В. Левцовой и к.ф.-м.н. М.Ю. Антонову за внимание к работе и возможность использования их неоценимого опыта.

Заключение.

Элементы вторичной структуры: а-спирали и (3-листы, обладают определенной жесткостью, которая обеспечивает выполнение ими различных функций. В случае сигнальных пептидов повышенная жесткость отдельных а-спиральных участков в сочетании с участками пониженной, стабильности I позволяет формировать шарнироподобные структуры, облегчающие встраивание в мембрану сигнальных пептидов и, как следствие, трансмембранных белков.

В структуре как первого, так и второго сигнальных пептидов белка NS2 содержатся протяженные, относительно стабильные а-спиральные элементы, разделенные короткими участками с пониженной стабильностью вторичной структуры.

Причина дестабилизации структуры пептидов может быть различной^ так как аминокислотные последовательности шарниров значительно отличаются. Так, для сигнального пептида 1 имеется влияние заряженных t аминокислотных остатков (ARG 14 для»первого шарнира, ARG 32 и ASP 33 для второго), для второго пептида — наличие остатков глицина GLY 15 и GLY 19, расположенных по обе стороны от шарнирного элемента.

Таким образом, помимо классического случая потери стабильности' вторичной структуры за счет наличия в аминокислотной последовательности » остатков глицина, мы наблюдали дестабилизацию а-спирали и за счет вклада заряженных аминокислотных остатков.

Эксперименты по молекулярной динамике с понижением парциального заряда на остатке ARG приводили к стабилизации вторичной структуры на этом участке, что подтверждает роль заряда данного аминокислотного остатка в формировании локального дефекта вторичной структуры.

Следует также отметить различия в стабильности а-спиральных структур сигнальных пептидов. Сигнальный пептид 2 является менее жестким, чем сигнальный пептид 1. Участок нестабильности проявляется во втором сигнальном пептиде при более низкой энергии, а длина этого участка существенно больше, чем для пептида 1. Таким образом, а-спиральные структуры, обладающие большим внешним сходством, обладают различной стабильностью как структуры в целом, так и на отдельных ее участках. Причем механизмы, дестабилизирующие структуру, могут быть различны даже в случае а-спиралей, входящих в состав одного белка (в данном случае - белка NS2 вируса гепатита С).

Что касается конформации Р-листа, то на примере пептидов паутинного волокна можно показать, что стабильность вторичной структуры зависит как от аминокислотной' последовательности (наличие остатков аланина способствует формированию вторичной структуры, остатки глицина вносят дестабилизирующее воздействие), так и от молекулярного окружения (комплексы из нескольких пептидов обладают более устойчивой вторичной структурой как в случае полиаланиновых пептидов, так и в случае межаланиновых пептидов).

Комплексы полиаланиновых пептидов обладают стабильной вторичной структурой и высокой жесткостью, которая возрастает по мере увеличения длины пептидов, формирующих комплекс. В отличие от них, пептиды с аминокислотной последовательностью, соответствующие последовательности спидроина в межаланиновых участках, не обладают высокой стабильностью вторичной структуры, как в форме одиночных пептидов, так и в форме надмолекулярных комплексов. Однако эти комплексы обладают более высокой эластичностью. Комбинация полиаланиновых участков с участками, богатыми глицином (каковыми являются внутренние пептиды), позволяет добиваться уникального сочетания прочности и эластичности паутинного волокна.

Механизм растяжения пептидов указывает на участие в формировании жесткости структуры как третичной, так и вторичной структуры. Также следует учитывать вклад валентных углов и связей. Эффективный модуль Юнга для системы зависит от натяжения. В целом, фрагмент протофибриллы паутинного волокна проявляет'достаточно сильно нелинейные свойства и не может быть описан простой моделью Зинера. Необходимо принимать во внимание зависимость упругих констант и эффективной вязкости от нагрузки и от относительного удлинения.

Список литературы диссертационного исследования кандидат физико-математических наук Оршанский, Игорь Александрович, 2009 год

1. A.N. Lupas, The long coming of computational structural biology, J. Struct. Biol. 163 (2008) 254-257.

2. R.V. Lewis, Spider silk: ancient ideas for new biomaterials, Chem Rev. 106(2006)3762-3774.

3. S. Winkler, S.Szela, P.Avtges, R.Valluzzi, D.A.Kirschner, and D.Kaplan, Designing recombinant spider silk proteins to control assembly, Int. J. Biol. Macromol. 24 (1999) 265-270.

4. T. Scheibel, Spider silks: recombinant synthesis, assembly, spinning, and engineering of synthetic proteins, Microb. Cell Fact. 3 (2004) 14.

5. J.D. van Beek, S.Hess, F.Vollrath, and B.H.Meier, The molecular structure of spider dragline silk: folding and orientation of the protein backbone, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 99 (2002) 10266-10271.

6. C.Y. Hayashi, N.H.Shipley, and R.V.Lewis, Hypotheses that correlate the sequence, structure, and mechanical properties of spider silk proteins, Int. J. Biol. Macromol. 24 (1999) 271-275.

7. S. Arcidiacono, C.Mello, D.Kaplan, S.Cheley, and H.Bayley, Purification and characterization of recombinant spider silk expressed in Escherichia coli, Appl. Microbiol. Biotechnol. 49 (1998) 31-38.

8. S.R. Fahnestock, Z.Yao, and L.A.Bedzyk, Microbial production of spider silk proteins, J. Biotechnol. 74 (2000) 105-119.

9. J.T. Prince, K.P.McGrath, C.M.DiGirolamo, and D.L.Kaplan, Construction, cloning, and expression of synthetic genes encoding spider dragline silk, Biochemistry 34 (1995) 10879-10885.

10. J. Scheller, K.H.Guhrs, F.Grosse, and U.Conrad, Production of spider silk proteins in tobacco and potato, Nat. Biotechnol. 19 (2001) 573-577.

11. J. Yang, L.A.Barr, S:R.Fahnestock, and'Z.B-Eiu; High;yield recombinant . silk-like protein production in transgenic plants through protein- targeting, Transgenic Res. 14 (2005) 313-324.

12. C.Z. Zhou, F.Confalonieri, M.Jacquet, R.Perasso, Z.G.I-i, and J.Janin, Silk fibroin: structural implications of a remarkable, amino acid'sequence; Proteins 44 (2001) 119-122.

13. N.A. Ayoub, J.E.Garb, R.M.Tinghitella, M.A.Collin, and C.Y.Hayashi, Blueprint for a high-performance biomaterial: full-length spider dragline silk genes, PLoS. ONE. 2 (2007) e514.

14. N.A. Ayoub and CY.l-Iayashi, Multiple recombining loci encode MaSpl, the primary constituent of dragline silk, in widow spiders (Latrodectus: Theridiidae), Mol. Biol. Evol. 25 (2008) 277-286.

15. J. Gatesy, C.Hayashi, D.Motriuk, J.Woods, and R.Tewis, Extreme diversity,conservation, and convergence of spider silk fibroin sequences, Science 2912001)2603-2605.

16. P.A. Guerette, D.G.Ginzinger, B.I I.Weber, and J.M.Gosline, Silk properties determined by gland-specific expression of a spider fibroin gene family, Science 272 (1996) 112-115.

17. B.D. Lawrence, J.K.Marchant, M.A.Pindrus, F.G.Omenetto, and

18. D.L.Kaplan, Silk film biomaterials for cornea tissue engineering^ Biomaterials (2008).

19. M. Xu and R.V.Lewis, Structure of a protein superfiber: spider dragline silk, . Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 87 (1990) 7120-7124.

20. M.B. Hinman, J.A.Jones, and R.V.Lewis, Synthetic spider silk: a modular . fiber, Trends Biotechnol. 18 (2000) 374-379.

21. S.R. Eahnestock and S.L.Irwin, Synthetic spider dragline silk proteins and their production in Escherichia coli; Appl. Microbiol. Biotechnol. 47 (1997)• ' 23-32.

22. S.R. Fahnestock and L.A.Bedzyk, Production of synthetic spider dragline silk protein in Pichia pastoris, Appl: Microbiol. Biotechnol. 47 (1997) 33-39:

23. D. Huemmerich, T.Scheibel, F.Vollrath, S.Cohen, U.Gat, and S.Ittah, Novel assembly properties of recombinant spider dragline silk proteins, Curr. Biol. 14(2004) 2070-2074.

24. K.S. Lee, B.Y.Kim, Y.H.Je, S.D.Woo, H.D.Sohn, and B.R.Jin, Molecular cloning and expression-of the C-terminus of spider flagelliform silk protein from Araneus ventricosus, J. Biosci. 32 (2007) 705-712.

25. Y. Miao, Y.Zhang, K.Nakagaki, T.Zhao, A.Zhao, Y.Meng, M.Nakagaki,

26. E.Y.Park, and K.Maenaka, Expression of spider flagelliform silk protein in Bombyx mori cell line by a novel Bac-to-Bac/BmNPV baculovirus expression system, Appl. Microbiol. Biotechnol. 71 (2006) 192-199:

27. Y.S. Chung and D.Dubnau, ComC is required for the processing and translocation of comGC, a pilin-like competence protein of Bacillus subtilis, Mol. Microbiol. 15 (1995) 543-551.

28. Y.S. Chung and D.Dubnau, All seven comG open reading frames are ' required for DNA binding during transformation of competent Bacillus subtilis, J. Bacterid. 180 (1998) 41-45.

29. A.P. Pugsley, The complete general secretory pathway in gram-negative bacteria, Microbiol. Rev. 57 (1993) 50-108.

30. N. Bradshaw, S.B.Neher, D.S.Booth, and P.Walter," Signal sequences activate the catalytic switch of SRP RNA, Science 323 (2009) 127-130.

31. P. Walter and A.E.Johnson, Signal sequence recognition*and protein • targeting,to the endoplasmic reticulum membrane, Annu. Rev. Cell Biol. 10 (1994) 87-119.

32. S. Panzner, L.Dreier, E.Hartmann, S.Kostka, and T.A.Rapoport, Posttranslational protein transport in yeast reconstituted with a purified complex of Sec proteins and Kar2p, Cell 81 (1995) 561-570.

33. E. Vrontou and A.Economou, Structure and function of SecA, the preprotein translocase nanomotor, Biochim. Biophys. Acta 1694 (2004) 67-80.

34. D.W. Hoyt and L.M.Gierasch, Hydrophobic content and lipid interactions of wild-type and mutant OmpA signal peptides correlate with their in vivo function, Biochemistry 30 (1991) 10155-10163.

35. B. Martoglio, M.W.Hofmann, J.Brunner, and B.Dobberstein, The protein-conducting channel in the membrane of the endoplasmic reticulum is open laterally toward the lipid bilayer, Cell 81 (1995) 207-214.

36. T.A. Rapoport, Extensions of the signal hypothesis—sequential insertion-model versus amphipathic tunnel hypothesis, FEBS Lett. 187 (1985) 1-10.

37. H.P. Wessels and M.Spiess, Insertion of a multispanning membrane protein occurs sequentially and requires only one signal sequence, Cell 55 (1988) 61-70.

38. R.N. Thrift, D.W.Andrews, P.Walter, and A.E.Johnson, A nascent membrane protein is located adjacent to ER membrane proteins throughout its integration and translation, J. Cell Biol. 112 (1991) 809-821.

39. I. Nilsson, P.Whitley, and H.G.von, The COOH-terminal' ends of internal signal and signal-anchor sequences are positioned, differently in the ER translocase, J. Cell Biol. 126 (1994) 1127-1132.

40. E. Hartmann, T.A.Rapoport, and H.F.Lodish, Predicting the orientation of eukaryotic membrane-spanning proteins, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 86(1989)5786-5790.

41. I: Nilsson and H.G.von, Fine-tuning the topology of a polytopic membrane protein: role of positively and negatively charged amino acids, Cell 62, (1990) 1Л 35-1141.

42. M. Hijikata, N.Kato, Y.Ootsuyama, M.Nakagawa, and K.Shimotohno, Gene mapping of the putative structural region of the hepatitis С virusgenome by in vitro processing analysis, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 88 (1991) 5547-5551.

43. P. Hussy, G.Schmid, J.Mous, and H.Jacobsen, Purification and in vitro-phospholabeling of secretory envelope proteins El and E2 of hepatitis С virus expressed in insect cells, Virus Res. 45 (1996) 45-57.

44. P. Hussy, H.Langen, J.Mous, and H.Jacobsen, Hepatitis С virus core protein: carboxy-terminal boundaries of two processed species suggest cleavage by a signal peptide peptidase, Virology 224 (1996) 93-104.

45. P. Hussy, H.Faust, J.C.Wagner, G.Schmid, J.Mous, and H.Jacobsen, Evaluation of hepatitis С virus envelope proteins expressed in E. coli and insect cells for use as tools for antibody screening, J. Hepatol. 26 (1997) 1179-1186.

46. Q. Liu, C.Tackney, R.A.Bhat, A.M.Prince, and P.Zhang, Regulated processing of hepatitis С virus core protein is linked to subcellular localization, J. Virol. 71 (1997) 657-662.

47. S.Y. Lo, M.Selby, M.Tong, and J.H.Ou, Comparative studies of the core gene products of two different hepatitis С virus isolates: two alternative forms determined by a single amino acid substitution, Virology 199 (1994) 124-131.

48. S.Y. Lo, M.J.Selby, and J.H.Ou, Interaction between hepatitis С virus core protein and El envelope protein, J. Virol. 70 (1996) 5177-5182.

49. K. Yasui, T.Wakita, K.Tsukiyama-Kohara, S.I.Funahashi, M.Ichikawa, T.Kajita, D.Moradpour, J.R.Wands, and M.Kohara, The native form and maturation process of hepatitis С virus core protein, J. Virol. 72 (1998) 6048-6055.

50. C.T. Yeh, S.Y.Lo, D.I.Dai, J.H.Tang, C.M.Chu, and Y.F.Liaw, Amino acid substitutions in codons 9-11 of hepatitis С virus core protein lead to the synthesis of a short core protein product, J: Gastroenterol. Hepatol; 15■ (2000) 182-191. . ' ■

51. S. Harada, Y.Watanabe, K.Takeuchi, T.Suzuki, T.Katayama, Y.Takebe, LSaito, and T.Miyamuraj .Expression of processed core protein of hepatitis С vims in mammalian cells, J. Virol. 65 (1991) 3015-3021.

52. E. Santolini, G.Migliaccio, and M.N.La, Biosynthesis and biochemical properties of the hepatitis С virus core protein; J. Virol. 68 (1994) 36313641,

53. S.Y. Lo, F.Masiarz, S.B.Hwang, M:M;Eai, and J.H.Ou, Differential, subcellular localization of hepatitis С virus .core gene products^ Virology 213 (1995)455-461. .'

54. S.C. Chang, J.H.Yen, H.Y.Kang, M.H.Jang, and M.F.Chang, Nuclear localization signals in the core protein of hepatitis; С virus, Biochem. Biophys. Res. Commun. 205 (1994) 1284-1290.

55. R. Suzuki, Y.Matsuura, T.Suzuki, A.Ando, J^Chiba, S.Harada, I.Saito, and T.Miyamuraj Nuclear localization of the truncated hepatitis С virus core protein with-its hydrophobic С terminus deleted, J. Gen. Virol: 76 ( Pt 1) (1995) 53-61.

56. L.R. You, C.M.Chen, I'.S.Yeh, T.Y.Tsai, R.T.Mai, C.H.Lin, and Y.H.Lee, Hepatitis С virus core protein interacts with cellular putative RNA helicase, J. Virol. 73 (1999) 2841-2853.

57. F. Wang, I.Yoshida; M.Takamatsu, S.Tshido, T.Fujita, K.Oka, and H.Hotta, Complex formation between hepatitis С virus core protein andp21 Wafl/Cipl/Sdil, Biochem. Biophys. Res. Commun. 273 (2000) 479484: • . .

58. R.E. Lanford, L.Notvall, D.Chavcz, R.White, G.Frenzel, C.Simonsen, and J.Kim, Analysis of hepatitis С virus capsid, E1, and E2/NS1 proteins expressed in insect cells, Virology 197 (1993) 225-235.

59. H. Mizushima, M.Hijikata, Y.Tanji, K.Kimura, and K.Shimotohno, Analysis of N-terminal processing of hepatitis С virus nonstructural protein 2, J.

60. Virol. 68 (1994) 2.731-2734.

61. V. Deleersnyder, A.Pillez, C.Wychowski, K.Blight, J.Xu, Y.S.Hahn, C.M.Rice, and J.Dubuisson, Formation of native hepatitis С virus glycoprotein complexes, J. Virol. 71 (1997) 697-704.

62. J. Dubuisson and C.M.Rice, Hepatitis С virus glycoprotein folding: disulfide bond formation and association.with calnexin, J. Virol. 70 (1996) 778-786.

63. Y. Matsuura, T.Suzuki, R.Suzuki, M.Sato, H.Aizaki, I.Saito, and T.Miyamura, Processing of El and E2 glycoproteins of hepatitis С virusexpressed in mammalian and insect cells, Virology 205 (1994) 141-150.t

64. L. Cocquerel, S.Duvet, J.C.Meunier, A.Pillez, R.Cacan, C.Wychowski, and J.Dubuisson, The transmembrane domain of hepatitis С virus glycoprotein El is a signal-for static retention in the endoplasmic reticulum, J.' Virol. 73 (1999) 2641-2649.

65. V. Agnello, G.Abel, M.Elfahal, G.B.Knight, and Q.X.Zhang, Hepatitis С virus and other flaviviridae viruses enter cells via low density lipoprotein receptor, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 96 (1999) 12766-12771.

66. С. Chan-Fook, W.R.Jiang, B:E.Clarke, N.Zitzmann; C.Maidens, J.A.McKeating, and I.M.Jones, Hepatitis С virus glycoprotein E2 binding to CD81: the role of E1E2 cleavage and protein glycosylation in bioactivity^ Virology 273 (2000) 60-66.

67. M. Monazahian, I.Bohme, S.Bonk, A.Koch, C.Scholz, S.Grethe, and .' \ R.Thomssen, Low density lipoprotein receptor as a candidate receptor for hepatitis С virus, J. Med. Virol. 57 (1999) 223-229.

68. S. Wunschmann, J.D.Medh, D.Klinzmann, W.N.Schmidt, and J.T.Stapleton, ; Characterization of hepatitis С virus (HCV) and HCV E2 interactions with

69. CD81 and the low-density lipoprotein receptor, J. Virol. 74 (2000) 1005510062.

70. E. Liberman, Y.L.Fong, M.J.Selby, Q.L.Choo, L.Couscns, M.Houghton, and T.S.Yen, Activation of the grp78 and grp94 promoters by hepatitis C virus E2 envelope protein, J. Virol. 73 (1999) 3718-3722.

71. D R. Taylor, S.T.Shi, P.R.Romano, G.N.Barber, and M.M.Lai, Inhibition of the interferon-inducible protein kinase PKR by HCV E2 protein, Science 285(1999) 107-110; .

72. A. Cochrane, A.Orr, M.L.Shaw, P.R.Mills, and E.A.McCruden, The amino acid sequence of the PKR-eIF2alpha phosphorylation homology domain of hepatitis С virus envelope 2 protein and response to interferon-alpha, J. Infect. Dis. 182 (2000) 1515-1518.

73. A.K. Yamaga and J.H.Ou,3 Membrane topology of the hepatitis С virus NS2 protein, J. Biol. Chenr277 (2002) 33228-33234.

74. Y. Gwack, D.W.Kim, J.H.Han, and J.Choe, Characterization of RNA binding activity and RNA helicase activity of the hepatitis С virus NS3 protein, Biochem. Biophys. Res. Commun. 225 (1996) 654-659.

75. D.W. Kim, Y.Gwack, J.H.Han, and J.Choe, C-terminal domain of the hepatitis С virus NS3 protein contains an RNA helicase activity, Biochem. Biophys. Res. Commun. 215 (1995) 160-166.

76. F. Preugschat, D.R.Averett, B.E.Clarke, and D.J.Porter, A steady-state and' pre-steady-state kinetic analysis of the NTPase activity associated with the hepatitis С virus NS3 helicase domain, J. Biol. Chem 271 (1996) 2444924457.

77. C.L. Tai, W.K.Chi, D.S.Chen, and L.H.Hwang, The helicase activity associated with hepatitis С vims nonstructural protein 3 (NS3), J. Virol. 70 (1996) 8477-8484.

78. D. Sakamuro, T.Furukawa, and T.Takegami, Hepatitis С virus nonstructural protein NS3 transforms NIH 3T3 cells, J. Virol. 69 (1995) 3893-3896.

79. T. Fujita, S.Ishido, S.Muramatsu, M.Itoh, and H.Hotta, Suppression of actinomycin D-induced apoptosis by the NS3 protein of hepatitis С virus, Biochem. Biophys. Res. Commun. 229 (1996) 825-831.

80. P. Borowski, M.Heiland, K.Oehlmann, B.Becker, L.Kornetzky, H.Feucht, and R.Laufs, Non-structural protein 3 of hepatitis С virus inhibits phosphorylation mediated by cAMP-dependent protein kinase, Eur. J. Biochem. 237 (1996) 611-618.

81. P. Borowski, K.Oehlmann, M.Heiland, and R.Laufs, Nonstructural protein 3 of hepatitis'C virus blocks the distribution of the free catalytic subunit of cyclic AMP-dependent protein kinase, J. Virol. 71 (1997) 2838-2843.

82. P. Borowski, W.J.Schulze zur, K.Resch, H.Feucht, R.Laufs, and H.Schmitz, Protein kinase С recognizes the protein kinase A-binding motif of nonstructural protein 3 of hepatitis С virus, J. Biol. Chem 274 (1999) 3072230728.

83. S. Ishido, S.Muramatsu, T.Fujita, Y.Iwanaga, W.Y.Tong, Y.Katayama, M.Itoh, and H.Hotta, Wild-type, but not mutant-type, p53 enhances nuclear accumulation of the NS3 protein of hepatitis С vims, Biochem. Biophys. Res. Commun. 230 (1997) 431-436.

84. S. Muramatsu, S.Ishido, T.Fujita, M.Itoh, and H.Hotta, Nuclear localization of the NS3 protein of hepatitis С vims and factors affecting the localization, J. Virol. 71 (1997) 4954-4961.

85. S. Ishido and H.Hotta, Complex formation of the nonstructural protein 3 of hepatitis С virus with the p53 tumor suppressor, FEBS Lett. 438 (1998) 258262.

86. J.O. Koch, V.Lohmann, U.Herian, and R.Bartenschlager, In vitro studies on the activation of the hepatitis С virus NS3 proteinase by the NS4A cofactor,

87. Virology 221 (1996) 54-66.i

88. C. Lin, B.M.Pragai, A.Grakoui, J.Xu, and C.M.Rice, Hepatitis С virus NS3 serine proteinase: trans-cleavage requirements and processing kinetics, J. Virol. 68 (1994) 8147-8157.

89. C. Lin and C.M.Rice, The hepatitis С virus NS3 serine proteinase and NS4A cofactor: establishment of a cell-free trans-processing assay, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 92 (1995) 7622-7626.

90. Y. Shimizu, K.Yamaji, Y.Masuho, T.Yokota, H.Inoue, K.Sudo, S.Satoh, and K.Shimotohno, Identification of the sequence on NS4A required for enhanced cleavage of the NS5 A/5B site by hepatitis С virus NS3 protease, J. Virol. 70(1996) 127-132.

91. Y. Tanji, M.Hijikata, S.Satoh, T.Kaneko, and K.Shimotohno, Hepatitis С virus-encoded nonstructural protein NS4A has versatile functions in viral protein processing, J. Virol. 69 (1995) 1575-1581.

92. C. Failla, L.Tomei, and F.R.De, An amino-terminal domain of the hepatitis С virus NS3 protease is essential for interaction with NS4A, J. Virol. 69 (1995) 1769-1777.

93. S. Satoh, Y.Tanji, M.Hijikata, K.Kimura, and K.Shimotohno, The N-terminal region of hepatitis С virus nonstructural protein 3 (NS3) is essential for stable complex formation with NS4A, J. Virol. 69 (1995) 4255-4260.

94. J.S. Park, J.M:Yang,,and M'K.Min, Hepatitis С virus nonstructural protein ' NS4B transforms NIH3T3 cells in cooperation with the Ha-ras oncogene,

95. Biochem. Biophys. Res. Commun. 267 (2000) 581-587.

96. D, Egger, B.Wolk, R.Gosert, L.Bianchi, H.E.Blum, D:Moradpour, and; K.Bienz, Expression of hepatitis С virus proteins induces distinct membrane alterations including a.candidate viral replication complex, J. Virol. 76 (2002) 5974-5984.'

97. T. Hugle, F.Eehrmann, E.Bieck„M.Kohara, HlG.Krausslich, C.M.Rice,

98. И.E.Blum, and D.Moradpour, The hepatitis.С virus nonstructural protein 4B . is an integral;endoplasmic reticulum membrane protein, Virology 284? (2001)70-81.110: R. Gosert, D.Egger, V.Lohmann, R.Bartenschlager, H.E.Blum, K.Bienz, and

99. D.Moradpour, Identification of the hepatitis С virusTINA replicationt ' complex in Huh-7 cells harboring subgenomic replicons, J. Virol. 77 (2003)5487-5492.i

100. S. Satoh, M'Hirota, T.Noguchi, M.Hijikata; Il.Ilanda, and K.Shimotohno, Cleavage of hepatitis С virus, nonstructural protein^^5A by a caspase-like protease(s) in mammalian cells, Virology 270 (2000) 476-487.

101. T.L. Tellinghuisen and: C.M.Rice, Interaction between hepatitis С virus proteins and host cell factors, Curr. Opin. Microbiol.'5 (2002) 419-427.

102. N. Enomoto, I.Sakuma, Y.Asahina, M.Kurosaki, T.Murakami, C.Yamamoto, N.Izumi, F.Marumo, and C.Sato, Comparison of full-length sequences of interferon-sensitive and resistant hepatitis С virus lb.

103. Sensitivity to interferon is conferred by amino acid substitutions in the NS5A region, J. Clin. Invest 96 (1995) 224-230.

104. G. Squadrito, F.Leone, M.Sartori, B.Nalpas, P.Berthelot, G.Raimondo, S.Pol, and C.Brechot, Mutations in the nonstructural 5A region of hepatitis С virus and response of chronic hepatitis С to interferon alfa, Gastroenterology 113 (1997) 567-572.

105. S. Zeuzem, J.H.Lee, and W.K.Roth, Mutations in the nonstructural 5A gene of European hepatitis С virus isolates and response to interferon alfa, Hepatology 25 (1997) 740-744.

106. V. Brass, E.Bieck, R.Montserret, B.Wolk, J.A.Hellings, H.E.Blum, F.Penin, and D.Moradpour, An ammo-terminal amphipathic alpha-helix mediates membrane association of the hepatitis С virus nonstructural protein 5A, J. Biol. Chem 277 (2002) 8130-8139.

107. T.L: Tellinghuisen, K.L.Foss, J.C.Treadaway, and G.M.Rice, Identification of residues required for RNA replication in domains II and III of the hepatitis С virus NS5A protein, J. Virol. 82 (2008) 1073-1083.

108. N. Ivashkina, B.Wolk, V.Lohmann, R.Bartenschlager, H.E.Blum, F.Penin, and DMoradpour, The hepatitis С virus RNA-dependent RNA polymerase membrane insertion sequence is a transmembrane segment, J. Virol. 76 (2002); 13088-13093:

109. D. Moradpour, V.Brass, E.Bieck, P.Friebe, R.Gosert, H.E.Blum, R.Bartenschlager, F.Penin, and V.Lohmann, Membrane association of the RNA-dependent RNA polymerase is essential for hepatitis С virus RNA replication, J. Virol. 78 (2004) 13278-13284.

110. J. Schmidt-Mende, E.Bieck, T.Hugle, F.Penin, C.M.Rice, H.E.Blum, and D.Moradpour, Determinants for membrane association of the hepatitis С virus RNA-dependent RNA polymerase, J. Biol. Chem 276 (2001) 4405244063.

111. T.L. Tellinghuisen, J.Marcotrigiano, and C.M.Rice, Structure of the zinc-binding domain of an essential component of the hepatitis С virus replicase, Nature 435 (2005) 374-379.

112. F.R. De and G.Migliaccio, Challenges and successes in developing new therapies for hepatitis C, Nature 436 (2005) 953-960.

113. D. Lu, A.Aksimentiev, A.Y.Shih, E.Cruz-Chu, P.L.Freddolino, A.Arkhipov, and K.Schulten, The role of molecular modeling in bionanotechnology, Phys. Biol. 3 (2006) S40-S53. '

114. J. Martini, W.Hellmich, D.Greif, A.Becker, T.Merkle, R.Ros, A.Ros, K.Toensing, and D.Anselmetti; Systems nanobiology: from quantitative single molecule biophysics to microfluidic-based single cell analysis, Subcell. Biochem. 43 (2007) 301-321.

115. G.D. Scholes and G.Rumbles, Excitons in nanoscale systems, Nat. Mater. 5 (2006) 683-696.

116. Alder B.J. and Wainwright Т.Е., Phase Transition for a Hard Sphere . System, J. Chem. Phys. 27 (1957) 1208-1209.

117. Rahman A., Correlations in the Motion of Atoms in Liquid Argon,

118. Phys. Rev. 136 (1964) 405-411.

119. McCammon J.A., Celin B.R., and Karplus G.M., Dynamics of folded proteins, Nature 267 (1977) 585-590.

120. M. Karplus and J.A.McCammon, Protein structural fluctuations during a period of 100 ps, Nature 277 (1979) 578.

121. Rossky P.J. and Karplus M., Solvation. A molecular dynamics study of a dipeptide in water, J. Am. Chem. Soc. 101 (1979) 1913-1937.

122. B.R. Gelin and M.Karplus, Side-chain torsional potentials: effect of dipeptide, protein, and solvent environment, Biochemistry 18 (1979) 12561268.

123. J.A. McCammon and M.Karplus, Dynamics of activated processes in globular proteins, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 76 (1979) 3585-3589.

124. D.A. Case and M.Karplus, Dynamics of ligand binding to heme proteins, J. Mol. Biol. 132 (1979) 343-368.

125. B. Lesyng and J.A.McCammon, Molecular modeling methods. Basic techniques and challenging problems, Pharmacol. Ther. 60 (1993) 149-167.

126. Jorgensen W.L., Maxwell D.S., and Tirado-Rivers J., Development and testing of the OPLS all-atom force field on conformational energetics and properties of organic liquids, J. Am. Chem. Soc. 118 (1996) 1122511236.

127. Miyamoto S. and K.Komagoe, Settle: An analytical version of the shake and rattle algorithm for rigid water models., J. Comput. Chem. 13 (1992) 952962.

128. Hess В., Bekker H., H.J.Berendsen, and Fraaije J.G.E.M., Lines: A linear constrant solver for molecular simulation., J. Comput. Chem. 18 (1997) 1463-1472.

129. Симонетта M., Гавезотти A., and Кучицу К., Молекулярные структуры. Прецизионные методы исследования, Мир, Москва, 1997, 671 pp.

130. J. Seelig, P.M.Macdonald, and P.G.Scherer, Phospholipid head groups as sensors of electric charge in membranes, Biochemistry 26 (1987) 75357541.

131. M. Pasenkiewicz-Gierula, Y.Takaoka, H.Miyagawa; K.Kitamura, and A.Kusumi, Charge pairing of headgroups in phosphatidylcholine membranes: A molecular dynamics simulation study, Biophys. J. 76 (1999) 1228-1240.

132. K. Tu, D.J.Tobias, J;K.Blasie, and M.L.Klein, Molecular dynamics investigation of the stmcture of a fully hydrated gel-phase dipalmitoylphosphatidylcholine bilayer, Biophys. J: 70 (1996) 595-608.

133. Allen M.P. and Tildesley D. J., Computer simulation of liquids, Oxford University Press, Oxford, New York, 1989, 408 pp.

134. Dardcn Т., York D., and Pedersen L.G., Particle mesh ewald: An n log(n) method for ewald sums in large systems, J. Chem. Phys. 98 (1993) 10089-' 10092.

135. Saito M., Molecular dynamics simulations of proteins in water without the truncation of long-range Coulomb interaction, Mol. Simul. 8 (1992) 321333.

136. Jorgensen W.L., Chandrasekhar J:, and Madura J.D., Comparison of simple potential function for simulation liquid water, J. Chem. Phys. 79 (1983) 926935.' '

137. M. Patra, M.Karttunen, M.T.Hyvonen, E.Falck, P.Lindqvist, and

138. I.Vattulainen, Molecular dynamics simulations of lipid bilayers: major artifacts due to truncating electrostatic interactions, Biophys. J. 84 (2003) 3636-3645.

139. Verlet L., Computer "experiments" on classical fluids, i.thermodynamical properties of lennard-jones molecules, Phys. Rev. 159 (1967) 98-103.

140. Голо В.JI. and Шайтан K.B., Динамический аттрактор в термостате Берендсена и медленная динамика биомакромолекул, Биофизика 47 (2002)611-617.

141. Lemak A.S. and Balabaev N.K., A comparison between collisional dynamics and Brownian dynamics, Mol. Simul. 15 (1995) 223-231.

142. Lemak A.S. and Balabaev N.K., Molecular dynamics simulation of a polymer chain in solution by collisional dynamics method, J. Comput. Chem. 17(1996) 1685-1695.

143. C.Chotia, Principles that determine the structure of proteins. In: 1984, pp. 537-572.