Изучение возможности интраназальной иммунизации против клещевого энцефалита тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.06, кандидат биологических наук Гончарова, Елена Павловна

• Гончарова, Елена Павловна
• кандидат биологических наук
• 2003

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Гончарова, Елена Павловна

Список использованных сокращений

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Вирус клещевого энцефалита

1.1.1. Строение вириона

1.1.2. Структура генома

1.1.3. Патогенетические характеристики вируса КЭ

1.2. Механизм нейроинвазии энцефалитогенных вирусов в ЦНС

1.3. Интраназальная иммунизация

1.4. Рекомбинантные вирусные векторные системы 30 1.4.1. Рекомбинантные вирусы осповакцины

1.5. Химерные вирусные векторные системы

1.6. ДНК-иммунизация

1.7. Не реплицирующиеся векторные системы

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Изучение возможности интраназальной иммунизации против клещевого энцефалита»

Вирус клещевого энцефалита (КЭ) является типичным флавивирусом и широко распространен не только на территории России, но и в Финляндии, Германии, Чехословакии и других странах Европы. Актуальность проблемы клещевого энцефалита для регионов Сибири определяется ростом заболеваемости и тяжестью его клинических форм. В последнее десятилетие эпидемиологическая ситуация в Новосибирской области продолжает неуклонно ухудшаться, несмотря на активную иммунопрофилактику этого заболевания. Показатель заболеваемости КЭ в 90-тых годах составил 17,9 человек на 100 тыс. населения, превышая аналогичный показатель по России в разные годы в 3,5-4,5 раза (Кузнецова и др., 2002). Летальность от КЭ в разные годы в Новосибирской области варьировала от 1,3до 6,2%. Поэтому разработка новых подходов для профилактики и лечения этого заболевания имеет большое социальное значение. Знание механизмов развития патогенетического процесса дает новые возможности в создании антивирусных препаратов и разработке новых способов иммунопрофилактики и лечения КЭ.

Ранние стадии развития клещевого энцефалита остаются во многом неисследованными. Работы, посвященные изучению этого вопроса, полны противоречивых данных. Они не позволяют однозначно описать самый важный этап -.распространение вируса КЭ в центральную нервную систему (ЦНС), что во многом определяет течение и исход болезни.

Основным средством активной иммунопрофилактики клещевого энцефалита является вакцина, содержащая инактивированный вирус КЭ, наработанный на культуре клеток куриных фибробластов. Несмотря на высокую эффективность, коммерческой вакцине против КЭ присущи все недостатки инактивированных вакцин: риски, связанные с производством и очисткой большого количества высокоинфекционного вируса, риск неполной инактивации, парентеральное применение и многоразовая схема иммунизации.

В последние десять лет интраназальный способ иммунизации привлекает значительное внимание как потенциальный способ доставки вакцин (Partidos, 2000). Изучение интраназального способа введения различных вакцин на модельных животных выявило преимущества интраназальной иммунизации: доступность места иммунизации, защиту вакцин от протеолитической деградации и индукцию не только мукозального, но и системного иммунного ответа (Гендон, 1999). Интраназальная иммунизация против КЭ с использованием наиболее эффективных систем доставки позволила бы использовать все преимущества мукозальных вакцин для индукции эффективного иммунитета.

Актуальность, своевременность и практическая значимость исследуемой проблемы - интраназальной иммунизации против вируса КЭ, связана с получением новых знаний о развитии инфекционного процесса КЭ, с возможностью использования этой информации для поиска и оценки новых вакцинных препаратов, способных не только блокировать репликацию вируса в висцеральных органах, но и предотвратить проникновение вируса в головной мозг. Несомненную практическую ценность имеет исследование эффективности различных систем доставки при интраназальной иммунизации против КЭ. Исследование эффективности интраназальной иммунизации для вируса КЭ, типичного представителя семейства флавивирусов, может иметь актуальное значение для других эпидемиологически значимых флавивирусов, таких как вирусы Денге, Японского энцефалита, желтой лихорадки, Западного Нила.

Цель работы и основные моменты ее достижения.

Цель настоящей работы заключалась в исследовании эффективности интраназальной иммунизации против КЭ рекомбинантными вирусами, катионными микрочастицами, а также системой адресного переноса функциональных генов вируса КЭ - вирусоподобными частицами (ВПЧ).

Для исследования эффективности интраназальной иммунизации были выбраны следующие конструкции: 1) два штамма рекомбинантного вируса осповакцины (ОВ) со встройкой генов структурных (С, ргМ, Е) и неструктурных (NSI, NS2a, NS2b, NS3) белков вируса КЭ, 2) вирусоподобные частицы и липосомальные конструкции, содержащие плазмиды со встроенными генами белков ргМ, Е вируса КЭ, 3) катионные микрочастицы, содержащие очищенный инактивированный вирус КЭ.

При этом решали следующие задачи:

-изучение распределения и накопления вируса КЭ в тканях мышей на ранних сроках развития инфекционного процесса при внутрибрюшинном заражении животных вирусом КЭ;

-изучение распределения и накопления вируса ОВ в тканях мышей при интраназальном инфицировании рекомбинантными штаммами WR и ЛИВП со встройкой генов структурных (С, ргМ, Е) и неструктурных (NSI, NS2a, NS2b, NS3) белков вируса КЭ и штаммами WR и ЛИВП;

-определение уровня специфических антител и типа иммунного ответа к вирусам КЭ и ОВ после интраназальной иммунизации мышей вирусными векторными системами на примере рекомбинантных штаммов WR и ЛИВП ВОВ со встройкой генов структурных С, ргМ, Е и неструктурных NSI, NS2a, NS2b, NS3 белков вируса КЭ и штаммов WR и ЛИВП;

-определение уровня специфических антител и типа иммунного ответа к вирусу КЭ после интраназальной иммунизации системами доставки на примере катионных микрочастиц, содержащих инактивированный вирус КЭ, вирусоподобных частиц и липосомальных конструкций, содержащих плазмиды со встроенными генами белков prM, Е вируса КЭ;

-изучение протективности иммунного ответа после интраназальной иммунизации рекомбинантными штаммами WR и ЛИВП ВОВ со встройкой генов структурных С, ргМ, Е и неструктурных NSI, NS2a, NS2b, NS3 белков вируса КЭ при внутрибрюшинном заражении мышей вирусом КЭ;

-изучение протективности иммунного ответа после интраназальной иммунизации мышей катионными микрочастицами, содержащими инактивированный вирус КЭ, и вирусоподобными частицами, содержащими плазмиды со встроенными генами белков ргМ, Е вируса КЭ, при внутрибрюшинном заражении мышей вирусом КЭ.

Большинство из запланированных этапов работы являлись новыми в исследуемой области. Интраназальная иммунизация против нейротропных инфекций, передающихся кровососущими насекомыми, никогда еще не проводилась. Однако, сложившиеся предпосылки, основанные на существовании олфакторного способа распространения в головной мозг других нейротропных вирусов, позволяли надеяться на успех работы.

Научная новизна и практическая значимость.

В результате проделанной работы было проведено исследование накопления и распределения вируса КЭ на начальных стадиях развития инфекционного процесса при внутрибрюшинном заражении мышей. Впервые показано размножение вируса КЭ в верхних отделах дыхательного тракта мышей после внутрибрюшинного заражения животных вирусом.

Проведено исследование накопления четырех штаммов вируса осповакцины в тканях мышей при интраназальном заражении животных. Показано, что штамм WR вируса осповакцины накапливается в головном мозге при интраназальном заражении, тогда как рекомбинантный ТК " штамм WR/CMENS123 со встройкой генов структурных С, ргМ,Е и неструктурных NSI, NS2a, NS2b, NS3 белков вируса КЭ утрачивал нейроинвазивность, выявленную для штамма WR.

Впервые изучена динамика формирования гуморального иммунного ответа и протективность интраназальной иммунизации мышей рекомбинантными штаммами вируса ОВ со встройкой генов структурных С, ргМ,Е и неструктурных NSI, NS2a, NS2b, NS3 белков вируса КЭ при внутрибрюшинном заражении вирусом КЭ.

В результате проведенной работы впервые показана эффективность интраназальной иммунизации против нейроторопного вируса - вируса КЭ.

Впервые показано, что интраназальная иммунизация мышей рекомбинантными вирусами осповакцины штамма WR и штамма ЛИВП со встройкой генов структурных С, ргМ, Е и неструктурных NSI, NS2a, NS2b, NS3 белков вируса КЭ приводит к 100%-й протекции от внутрибрюшинного разрешения вирусом КЭ дозой Ю5БОЕ.

Впервые изучена динамика формирования гуморального иммунного ответа и протективность после интраназальной иммунизации мышей конструкциями катионных микрочастиц, содержащими инактивированный вирус КЭ при внутрибрюшинном заражении вирусом КЭ. Показана высокая эффективность данной вакцинной формы.

Впервые изучена динамика формирования гуморального иммунного ответа и протективность после интраназальной иммунизации мышей конструкциями вирусоподобных частиц, содержащих плазмиды со встроенными генами белков ргМ, Е вируса КЭ при внутрибрюшинном заражении вирусом КЭ. При интраназальной иммунизации вирусоподобными частицами, содержащими плазмиды со встроенными генами ргМ, Е белков вируса КЭ, эффективной защиты мышей от интраперитонеального заражения вирусом КЭ не выявлено.

Апробация работы и публикации.

Материалы диссертации были представлены на следующих конференциях, симпозиумах.

1. International Conference on Bacterial and Viral Virulence Factors, Abstracts, Smolenice, Slovakia, Sept. 24-28, 2000, P.

2. 11th International Congress on Circumpolar Health, Abstracts, Harstad, Norway, June 4-9,2000, N79.

3. 6th International Potsdam symposium on tick-borne diseases, Berlin, Germany, April 26-27,2001

4. 12th International Congress of Virology, Paris, 27 July-1 Aug., 2002, V

1259

5. "DNA vaccines 2002", Edinburgh, UK, October 23-25,2002, p.1-4.

6. 4th ISTC scientific advisory commitee seminar on "Basic science in ISTC activities", Novosibirsk, 23-27 April, 2001

7. Научная конференция "Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера", Новосибирск, 1998

8. Научная конференция "Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера", Новосибирск, 2002

9. 7th International Potsdam symposium on tick-borne diseases, Berlin, Germany, March 15-16,2003

По материалам диссертации опубликовано 4 статьи в отечественной и зарубежной печати.

Получен патент РФ на использование метода интраназальной иммунизации против вируса КЭ рекомбинанатными вирусами осповакцины штамма WR и штамма ЛИВП со встройкой генов структурных С, prM, Е и неструктурных NS1, NS2a, NS2b, NS3 белков вируса КЭ.

Экспериментальные результаты, представленные в диссертации, получены лично диссертантом и в соавторстве с: к.х.н. Порываевым В.Д., к.б.н. Гришаевой О.Н., д.б.н. Рябчиковой Е.И., к.б.н. Малковой Е.М., к.б.н. Лебедевым JI.P.

Положения, выносимые на защиту:

1. Вирус КЭ при интралеритонеальном заражении мышей накапливается и размножается в верхних отделах дыхательных путей, и проникает в головной мозг, как гематогенным путем, так и по обонятельному тракту.

2. Интраназальная иммунизация рекомбинантными штаммами вируса осповакцины со встройкой генов структурных С, prM, Е и неструктурных NSI, NS2a, NS2b, NS3 белков вируса КЭ, индуцируя иммунный ответ преимущественно Thl типа, приводит к эффективной защите мышей от внутрибрюшинного заражения вирусом КЭ.

3. Интраназальная иммунизация препаратом инактивированного вируса КЭ в составе катионных микрочастиц, индуцируя иммунный ответ преимущественно ТЫ типа, обеспечивает эффективную защиту мышей от внутрибрюшинного заражения вирусом КЭ.

4. Интраназальная иммунизация генными конструкциями, содержащими плазмиды со встроенными генами белков prM, Е КЭ, приводит к неполной защите мышей от интраперитонеального заражения вирусом КЭ.

Заключение диссертации по теме «Вирусология», Гончарова, Елена Павловна

ВЫВОДЫ:

1. После внутрибрюшинного инфицирования мышей вирусом КЭ происходит размножение вируса не только в висцеральных органах, но и в верхних отделах дыхательного тракта животных. С использованием метода ОТ-ПЦР впервые получены данные, подтверждающие проникновение РНК вируса КЭ в головной мозг через обонятельный тракт и гематогенным путем.

2. Нейроинвазивный штамм WR вируса осповакцины накапливается в головном мозге при интраназальном заражении мышей, тогда как его рекомбинантный вариант ТК " штамм WR/CMENS123 со встройкой генов структурных С, ргМ, Е и неструктурных NSI, NS2a, NS2b, NS3 белков вируса КЭ утрачивает нейроинвазивность, характерную для штамма WR.

3. Впервые показана принципиальная возможность высокоэффективной интраназальной иммунизации мышей рекомбинантными штаммами вируса ОВ со встройкой генов белков вируса КЭ, индуцирующими протективный иммунный ответ преимущественно Thl типа от внутрибрюшинного заражения вирусом КЭ дозой Ю5БОЕ.

4. Интраназальная ДНК-иммунизация вирусоподобными частицами, содержащими плазмиды со встроенными генами белков ргМ, Е вируса КЭ, приводит к незначимой защите мышей от внутрибрюшинного заражения вирусом КЭ дозой

4*Ю2БОЕ. вяе/> éfte nofi.oja/YO.-iTo ^

5. УИнтраназальная иммунизация мышей катионными микрочастицами, содержащими очищенный инактивированный вирус КЭ, индуцирует протективный иммунный ответ преимущественно Th2 типа против внутрибрюшинного заражения вирусом КЭ дозой 8*Ю3БОЕ.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Клещевой энцефалит по-прежнему остается одной из важнейших проблем инфекционной патологии не только Дальневосточного и Сибирского регионов, но и западных областей России. Поэтому детальное изучение течения инфекционного процесса при заражении вирусом КЭ является важной задачей. Выявление РНК вируса методом ОТ-ПЦР в первые сутки развития инфекции в обонятельной луковице и отсутствие вирусной РНК в этот период в образцах головного мозга при внутрибрюшинном заражении мышей вирусом КЭ свидетельствует о возможном вовлечении структур обонятельного тракта в процесс трансмиграции вирусной РНК в ЦНС. Однако, репродукция вируса в образцах обонятельной луковицы была обнаружена только при заражении дозой 106 БОЕ, что не позволяет считать значимым вклад олфакторного распространения вируса КЭ при инвазии вирусом ЦНС.

Принимая во внимание выявленную активную репродукцию вируса в носовой полости, висцеральных органах, нами выдвинуто предположение, что формирование двойного барьера в виде системного и мукозального иммунитета после интраназальной иммунизации приведет к эффективной защите против клещевого энцефалита.

В результате проведенных исследований было установлено, что интраназальная иммунизация различными системами доставки индуцирует мукозальный и системный иммунный ответ и приводит к эффективной защите против интраперитонеального заражения вирусом КЭ. Были исследованы реплицирующиеся (вирусные) и не реплицирующиеся системы доставки антигенов вируса КЭ для интраназальной иммунизации, а также ВПЧ и липосомы, содержащие плазмиду рсБЫАЗ. 1 -ргМЕ/ТВЕ. Полученные нами данные по изучению эффективности иммунного ответа при интраназальной иммунизации ВГТЧ и липосомами свидетельствуют о низкой эффективности индукции гуморального иммунного ответа и отсутствии эффективной протекции мышей после интраназальной иммунизации ВПЧ, содержащими плазмиду pcDNA3.1-prME/TBE, с экспонированными на поверхности конструкции ЛПС E.coli и белками Е вируса КЭ. Предложена гипотеза о возможной модуляции иммунного ответа с помощью плазмид, со встроенными генами различных цитокинов.

В качестве вирусной системы доставки были изучены рекомбинантные конструкции вируса осповакцины на основе штаммов WR и ЛИВП со встройкой генов структурных С, prM, Е и неструктурных NSI, NS2a, NS2b, NS3 белков вируса КЭ. Анализ соотношения ВКЭ-специфичных IgG2a/IgGl при интраназальной иммунизации в наших экспериментах выявил активацию Thl типа иммунного ответа, и следовательно, преимущественную активацию клеточного звена иммунного ответа.

Кроме вирусных систем доставки были изучены не реплицирующиеся системы доставки антигенов вируса КЭ, в частности катионные микрочастицы, содержащие очищенный инактивированный вирус КЭ. Результаты экспериментов по изучению иммунного ответа при интраназальной иммунизации мышей катионными микрочастицами, содержащими очищенный инактивированный вирус КЭ, свидетельствуют об эффективной индукции протективного иммунного ответа. Полученные данные впервые указывают на возможность применения катионных микрочастиц для обеспечения выраженной защиты интраназально иммунизированных мышей от летальной вирусной инфекции, вызванной вирусом КЭ. Соотношение специфических IgG2a /IgGl после иммунизации мышей катионными микрочастицами, содержащими очищенный инактивированный вирус КЭ, свидетельствует о развитии иммунного ответа ТЫ типа. Высказано предположение, что доминирование гуморальной составляющей иммунного ответа не исключает наличие цитокинов, индуцирующих синтез цитотоксических лимфоцитов. Другим возможным объяснением высокой протективной активности иммунизации мышей катионными микрочастицами, содержащими очищенный инактивированный вирус КЭ, является возможность активации СБ4 + цитотоксических лимфоцитов. Сложность и неоднозначность механизмов индукции эффективного протективного иммунного ответа, выявленная нами при изучении разных систем доставки, указывает на необходимость дальнейшего изучения механизмов индукции протективного иммунного ответа против вируса КЭ.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Гончарова, Елена Павловна, 2003 год

1. Ашмарин И.П., Воробьев A.A., Статистические методы в микробиологических исследованиях (1962) // JL, с. 71-79

2. Богданенко Е.В., Свиридов Ю.В, Московцев A.A., Жданов И Р. (2000) Невирусный перенос генов in vivo в генной терапии // Вопросы медицинской химии, № 3, с. 45-64

3. Вертохин М.А., Савельева JI.B. (1988) Спетрофотометрическая оценка влияния следов гемоглобина на некоторые показатели сыворотки крови // Лабораторное дело, № 4, с. 43-36

4. Гендон Ю.З. (1999) Вирусные мукозальные вакцины // Вопросы вирусологии, № 3, с. 100-105

5. Гендон Ю.З. (2003) Мукозальные вирусные вакцины: успехи проблемы // Вопросы вирусологии, № 4, с. 4-10

6. Гулд Е., Клегг Д. (1988) Культивирование, титрование и очистка тогавирусов // В кн.: Вирусология Методы, ред. Мейхи, с. 97-105

7. Данилов А.И, И.И. Терских, М.Е. Карпова. (1966) Экспериментальная оценка иммунизации аэрозолями жидких вакцин // Вестник АМН, № 5, с. 74-81

8. Злобин В. И., Горин О. 3. (1996) Клещевой энцефалит. Этиология, эпидемиология и профилактика в Сибири. Новосибирск. // Наука, с. 5-141

9. Игнатьев Г.М., Отрашевская Е.В., Воробьева М.С. (2003) Активность цитокинов при иммунизации вакциной против клещевого энцефалита в эксперименте // Вопросы вирусологии, № 2, с. 22-25

10. Иерусалимский А.П. (2001) Клещевой энцефалит // Новосибирск, Государственная медицинская академия, с. 72-74

11. П.Камалов Н.И.,Новожилова А.П., Крейчман Г.С., Соколова Е.Д. (1998) Морфологические особенности клеточной гибели при различных формах острого клещевого энцефалита // Морфология, № 4, с. 54-58

12. Кветкова Э. А., Семенов Б. Ф., Переходова С.К. (1978) Количественная оценка Т-и B-популяций лимфоцитов у больных клещевым энцефалитом // Вопросы иммунитета и диагностики природно-очаговых болезней, JI., с. 36-43

13. Колотвинов C.B., Алексндрова H.H., Субботина JI.C., Ерман Б.А., Броницкая Е.Ю. (1977) Особенности инфекционного процесса, вызываемого клонами вируса клещевого энцефалита различной авидности // Арбовирусы, Свердловск, с. 112-117

14. Конев В.П., Кветкова Э.А., Костерина Л.Д.,Полищук Т.Н. (1989). Морфогенез острых и хронических форм клещевого энцефалита // Актуальные вопросы медицинской вирусологии, Свердловск, с. 173-177

15. Лебедев Л.Р., Гончарова Е.П., Сизов A.A., Булычев Л.Е., Одегов А.М., Игнатьев Г.М., Рыжиков А.Б. (2002) Модель молекулярных конструкций комбинированной вакцины // ДАН, Т.384, № 1, с. 123-125

16. Леонова Г.И., Майстровская О.С. (1996) Вирусемия у больных клещевым энцефалитом и у лиц с присасыванием иксодовых клещей // Вопросы вирусологии, № 5, с. 224-228

17. Львов Д.К., Клименко С.М., Гайдамович С .Я. (1989) Арбовирусы и арбовирусные инфекции // Москва, с. 59-63

18. Морозова О.В. (1991) Состав и функции белков репликативного комплекса вируса клещевого энцефалита // Диссертация кандидата биологических наук, Новосибирск, СОРАН, с. 92

19. Морозова О.В., Максимова Т.Г., Попова Р.В., Марцинкевич О.Н., Бахвалова В.Н. (2001) Экспрессия гена NS1 вируса клещевого энцефалита в грамммотрицательных бактериях — обитателях носоглотки мышей // Прикладная молекулярная биология, Т.35, № 1, с. 157-162

20. Морозова О.В., Попова Р.В., Максимова Т.Г., Митрофанова Е.Э., Бахвалова В.Н. (2001) Сравнение иммунного ответа, индуцированного ДНК или инактивированной вакциной против клещевого энцефалита // ЖМЭИ, № 2, с. 5457

21. Панов А.Г. (1956) Клещевой энцефалит // Медгиз, с.224-234

22. Погодина В.В., Фролова М.П., Ерман Б.А. (1986) Хронический клещевой энцефалит // Новосибирск, Наука, с. 74-76

23. Ройт А., Бростофф Д., Мейл Д. (2000) Иммунология // Москва, Мир, с. 181-183

24. Рыжиков А.Б., Гончарова Е.П., Булычев JI.E., Сергеев А.Н., Дмитриев И.П., Плясунов И.В., Котляров JI.A. (1998) Изучение возможности интраназальной иммунизации против клещевого энцефалита // Вестник РАМН, № 4, с. 17-20

25. Саминский Е.М. Электрофорез // в Кн.: Физико-химические методы изучения, анализа и фракционирования биополимеров, Москва, Наука, с. 40-95

26. Семенов Б.Ф., Резепова А.И. (1964) Изучение природы гемагглютинирующей активности вируса клещевого энцефалита // Вопросы вирусологии, № 1, с. 30-34

27. Сизов A.A., Лебедев Л.Р. Масычева В.И., Кашперова Т.Ф., Одегов A.M. (2001) Разработка вирус-подобной конструкции для рецептор-опосредованного транспорта гена чГ-КСФ в клетки костного мозга in vivo // Биотехнология, №1, с. 3-12

28. Смородинцев A.A., Дубов А. Д. (1986) Клещевой Энцефалит и его вакцинопрофилактика//Л., Медицина, с. 101-104

29. Тимофеев A.B., Кондратьева Я.Ю., Карганова Г.Г., Стефенсон Дж. (2001) Протективная активность бактериальной плазмиды, несущей ген неструктурного белка NS1 вируса клещевого энцефалита // Вопросы вирусологиии, № 1, с. 22-24

30. Шаповал А.Н. (1956) Клещевой энцефаломиелит//Л., Медицина, с. 23-45

31. Шубладзе А.К. (1939) Патогенез весенне-летнего энцефалита // Архив биолог, наук, Т.56, вып.2, с. 83-96

32. Щелкунов С.Н. (1997) Генная инженерия // Новосибирск, с. 330-336

33. Albrecht P. (1962) Pathogenesis of experimental infection with tick-borne encephalitis virus, biology of virus of tick-borne encephalitis complex // Praha, p. 247-257

34. Bernard Moss. (1996) Genetically engineered poxviruses for recombinant gene expression, vaccination, and safety // PNAS, Vol.93, p. 11341-1134

35. Brandtzaeg P., Sollid L.M., Thrane.P.S. (1988) Lymphoepithelia interactions in the mucosal immune system // Gut., 29, p.l 116-1130

36. Bungener L., Serre K., Bijl L., Leserman L., Wilschut J., Daemen T., Machy P. (2002) Virosome-mediated delivery of protein antigens to dendritic cells // Vaccine, 20, p. 2287-2295

37. Chambers T. J., Hanh C. S., Galler R. & Rice C. M. (1990) Flaviviruses genome organization, expression and replication // Annu. Rev. Microbiol., 44, p. 649-688

38. Chambers TM, Kawaoka Y., Webster RG. (1988) Protection of chickens from lethal influenza infection by vaccinia-expressed hemagglutinin // Virology, 167(2), p. 414421

39. Charles P.C., Walster E., Margolis F., Johnston R. E. (1995) Mechanism of neuroinvasion of Venezuelan equine encephalitis virus in the mouse // Virology, Vol.208, p.662-671

40. Etchart N., Wild F., Kaiserlian D. (1996) Mucosal and systemic immune responses to measles virus haemagglutinin in mice immunized with a recombinant vaccinia virus // J. Gen. Virol., 77, p. 2471 -2478

41. Feigner J. H., Kumar R., SridharC. N. Wheeler C. J., Tasi Y. J., Border R., Ramsey P., Martin M., Feigner P. L. (1994) Enhanced gene delivery and mechanism studies with a novel series of cationic lipid formulations // J. Biol. Chem., 269, p.-2550-2561

42. Fleeton M.N., Sheahan B.J., Gould E.A., Atkins G.J., Liljestrom P. (1999) Recombinant Semliki Forest virus particles encoding the prME or NS1 proteins of louping ill virus protect mice from lethal challenge // J. Gen. Virol., 80, p. 1189-1198.

43. Freistadt M.S., Stoltz D.A., EberleK.E. (1995) Role of poliovirus receptors in the spread of the infection // N.Y. Acad. Sei., 753, p. 37-47

44. Gallichan W.S., Rosenthal K.L. (1995) Specific secretory immune responses in the female genital tract following intranasal immunization with a recombinant adenovirus expressing glycoprotein B of herpes simplex virus // Vaccine, 13(16), p. 1589-1595

45. Gu S.Y., Huang T.M., Ruan L., Miao Y.H., Lu H, Chu C.M., Motz M., Wolf H. (1995) First EBV vaccine trial in humans using recombinant vaccinia virus expressing the major membrane antigen // Dev. Biol. Stand, Vol.84, p. 171-177.

46. Guirakhoo F., Heinz F. X., Mandl C. W., Holzmann H., Kunz C. (1991) Fusion activity of flaviviruses: comparison of mature and immature (prM-containing) tickborne encephalitis virions //J. Gen. Virol., Vol.72, p. 1323-1329

47. Haan A., Tomee J.F.,. Huchshorn J.P., Wilschut J. (1995) Liposomes as an immunoadjuvant system for stimulation of mucosal and systemic antibody responses against inactivated measles virus administered intranasally to mice // Vaccine, 13, p. 1320-1324

48. Haberly L.B., Price J.L., (1978) Association and commissurial fiber systems of olfactory cortex of the rat. 1.Systems originating in the piriform cortex and adjucent areas // J. Comp. Neurol., 178, p. 711-740.

49. Hambelton P., Stephenson J., Baskerville A., Wiblin C. (1983) Pahtogenesis and immune respondse of vaccinated and unvaccinated rhesus monkey to tick-borne encephalitis virus // Infection and Immunit., Vol.40, No 3, p. 995-1003

50. Han X., Aho M., Vene S., Peltomaa M., Vapalahti O., (2001) Prevalence of tick-borne encephalitis virus in Ixodes Ricinus in Finland 11 J. Med. Virol., 63, p. 1-8

51. Hathaway L.J, Obeid O.E., Steward M.W. (1998) Protection against measles virus-induced encephalitis by antibodies from mice immunized intranasally with a synthetic peptide immunogen // Vaccine, 16, No 2/3, p.135-141

52. Heinz F. X. & Kunz C. (1980a) Chemical crosslinking of tick-borne encephalitis virus and its subunits // J. Gen. Virol., 46, p. 301-309

53. Heinz F. X., Mandl C. W., Guirakhoo F., Holzmann H., Tuma W.& Kunz C. (1990) The envelope protein of tick-borne encephalitis virus and other flaviviruses: structure, functions and evolutionary relationships // Arch. Virol., (Suppl.l), p. 125-135

54. Heinz F. X., Mandl C. W., Holzmann H., Kunz C., Harris B., Rey F. A., Harrison S. C. (1991) The flavivirus envelope protein E: Isolation of a soluble dimeric form from tick-borne encephalitis virus and its crystallization // J. Virol., 65, p. 5579-5583

55. Holzer G.W., Remp G., Antoine G., Pfleiderer M. (1999) Highly efficient induction of immunity by a vaccinia vitrus vector defective in late gene expression // J. Virol., Vol.73, No 6, p. 4536-4542

56. Hvalbye .B.K. R., Aaberge I.S., Levik M., Haneberg B. (1999) Intranasal Immunization with Heat-Inactivated Streptococcus pneumoniae Protects Mice against Systemic Pneumococcal // Infection Infect. Immun., 67, p. 4320 4325

57. Jacobs S.C., Stephenson J.R., Wilkinson G.W. (1994) Protection elicited by a replication-defective adenovirus vector expressing the tick-borne encephalitis virus non-structural glycoprotein NS1 // J. Gen. Virol., 75, p. 2399-2402

58. Klavinskis L.S., Barnfield C., Gao L., Parke S. (1999) Intranasal immunization with plasmid DNA-lipid complexes elicits mucosal immunity in the female genital and rectal tracts// Immunol., 162, p. 254-262

59. Kochneva G.V., Urmanov I.H., Ryabchikova E.I., Streltsov V.V., Serpinsky O.I. (1994) Fine mechanisms of ectromelia virus thymidine kinase-negative mutants avirulence // Virus Res., 34,1, p.49-61

60. Kreil T. R., Maier E., Fraiss S., Eibl M. (1998) Neutralizing antibodies protect against lethal flavivirus challenge but allow for the development of active humoral immunity to a nonstructural vims protein // J. Virol.,Vol.72, No 4, p. 3076- 3081

61. Kuklin L.Y., Daheshia M., Karem K., Manickan E., Rouse B. (1997) Induction of mucosal immunity against herpes simplex virus by plasmid DNA immunization // J. Virol., Vol.71, No 4, p. 3138-3145

62. Kuper C.F., Koornstra P.J., Hameleers D.M.H., Biewenga J., Spit B.J., Duijvestijn Adrian M, van Breda P.J., Vriesman C., Sminia T. (1992) The role of nasopharyngeal lymphoid tissue // Immunology Today, Vol.13, No 6, p. 219-224

63. Langermann S. (1996) New approaches to mucosal immunization // Sem. Gastrointest. Disease, No 7, p. 12-18

64. Lebedev L.R., Goncharova E.P., Sizov A.A., Odegov H.M. (2003) Experimental molecular design of combined vaccines // Mol. Biol., Vol.37, No 3, p. 464-467

65. Liedtke W., Opalka В., Zimmermann C.W., Lignitz W. (1993) Age distribution of latent herpes simplex virus 1 and varicella-zoster virus genome in human nervous tissue // Neurol. Sci., 116(1), p. 6-11

66. Lobigs M. (1993) Flavivirus premembrane protem cleavage and spike heterodimer secretion require the function of the viral proteinase NS3 // PNAS, Vol.90, p. 62186222

67. Mackett M., Smith G.L., Moss B. (1982) Vaccinia virus: a selectable eukaryotic cloning and expression vector// PNAS, 79(23), p. 7415-7419

68. Mackett M., Yilma Т., Rose J.K., Moss B. (1985) Vaccinia virus recombinants: expression of VSV genes and protective immunization of mice and cattle // Science, 227(4685), p. 433-435

69. De Madrid A.N. and Porterfield J.S. (1969) A simple micro-culture method for study of group В arboviruses // Bull: Wld. Hlth. Org., 40, p. 113-121

70. Malkova D. (1960) Участие лимфатической и кровеносной системы в диссеменадии вируса КЭ в органы экспериментально зараженных мышей // Acta virologica, 4, No 4, с. 290-295

71. Mandl С. W., Guirakhoo F., Holzmann H., Heinz F. X. & Kunz C. (1989a) Antigenic structure of the flavivirus envelope protein E at molecular level using tick-borne encephalitis virus as a model // J. Virol., 63, p. 564-571

72. Martinez X., Li X., Kovarik J., Klein M., Lambert P.H., Siegrist C.A. (1999) Combining DNA and protein vaccines for early life immunization against respiratory syncytial virus in mice // J. Immunol., 29(10), p. 3390-3400

73. Masayuki Yokoyama, Jie Zhang, J. Lindsay Whinton. (1996) DNA immunization:effects of vehicle and route of administration on the induction ofprotective antiviral immunity I I Immunology and Medical Mirobiology, Vol.14, p. 221-230

74. Maurizio T., Hearn T. (1996) ISCOM, lyposomes, and oil-based vaccine delivery systems // in book: Mucosal vaccines, Academic press, UK, p. 175-183

75. McMinn P. C. (1997) 'The molecular basis of virulence of the encephalitogenic flavi viruses// Journal of General Virology, 78, p. 2711-2722

76. McMinn P.C., Weir R.C., Dalgarno L. (1996) A comparison spread of Murray Valley encephalitis viruses of high or low neuroinvasiveness in tissues of Swiss mice after peripheral inoculation // Virology, Vol.220, p. 414-423

77. Monath T.P., Cropp C.B., Harrison A. (1983) Mode of entry of neurotropic arboviruses into the central nerves system: reinvestigation of old controversy // Lab. Invast., 48, p. 399-403

78. Niedrig M., Stolte N„ Fuchs D., Hunsmann G., Stahl-Hennig C., Koch R. (1999) Intra-nasal infection of macaques with Yellow Fever (YF) vaccine strain 17D: a novel and economical approach for YF vaccination in man // Vaccine, 17(9-10), p. 12061210

79. Partidos C D. (2000) Intranasal vaccine:forthcoming challenges // PSTT, Vol.8, p. 273-281

80. Phillpotts R.J., Venugopal K., Brooks T. (1996) Immuinisation with DNA polynucleotides protects mice against lethal challenge with St. Louis encephalilis virus // Aich. Virol., 141, p. 743-749

81. Plaknov I.V., Arlund E.E., Aoki C., Reiss C.S. (1995) The earliest events in vesicular stomatitis virus infection of the murine olfactory neuroepithelium and entry of the central nervous system // Virology, 10,209(1), p. 257-262

82. Pletnev A.G., Karganova G.G., Dzhivanyan T.I., Lashkevich V.A., Bray M. (2000) Chimeric Langat|Denge viruses protect mice from heterologous challenge wiht the virulent strains of Tick-born encephalitis virus // Virology, 274, p. 28-31

83. Pletnev A.G., Yamshchikov V.F. & Blinov V.M. (1990) Nucleotide sequence of the genome and complete amino acid sequence of the polyprotein of tick-borne encephalitis virus // Virology, 174, p. 250-263

84. Ramirez J.C., FinkeD., Esteban M., Kraehenbuhl J.P., Acha-OrbeaH. (2003) Tissue distribution of the Ankara strain of vaccinia virus (MVA) after mucosal or systemic administration // J. Arch. Virol., 148(5), p. 827-839

85. Reubel G.H., Ramos R.A., Hickman M.A., Rimstad E., Hoffinan D.E., Pedersen A.D. (1993) Detection of active and latent feline herpesvirus 1 infection using the polymerase chain reaction // J. Arch. Virol., Vol.132, No 3-4, p.409-420

86. Rey F. A., Heinz F., Mandl X., Kunz C., Harrison S. (1995) The envelope glycoprotein from tick-borne encephalitis virus at 2À resolution // Nature, 375, p. 291298

87. Ryzhikov A.B., Ryabchikova E.I., Sergeev A.N., Tkacheva N.V. (1995) Spread of Venezuelan equine encephalitis virus in mice olfactory tract // Arch Virol, 140(12), p. 2243-2254

88. Ryan E., Daly M., Mills K. (2001) Immunomodulators and delivary systems for vaccination by mucosal routes // Trends in Biotechnology, Vol.19, No 8,p. 293-304

89. Sabin A.B. (1937) Nature and rate of centrepital progression of centain neurotropic viruses along peripheral nerves // Am. J. Pathol., 13, p. 615-617

90. Staats H. F. (1996) Application of basic principles of mucosal immunity to vaccine development // in book Mucosal Vaccine Academic Press, p. 17-33

91. Sutter G. and Moss B. (1992) Nonreplicating vaccinia vector efficiently expresses recombinant genes // PNAS, 89, p. 10847-10851

92. Williamson J.D., Reith R.W., Jeffrey L.J., Arrand J.R., Mackett M. (1991) Biological characterization of recombinant vaccinia viruses in mice infected by the respiratory route // Journal of General Virology, V.71, p. 2761-2767

93. Winkler G., Randolph V.B., Cleaves G.R., Ryan T.E., Stollar V. (1988) Evidence that the mature form of the flavivirus nonstructural protein NS1 is a dimer // Virology, 162(1), p.187-196