Изучение взаимодействия люциферазы светляков Luciola mingrelica с субстратами и их аналогами методом флуоресцентной спектроскопии тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.15, кандидат химических наук Власова, Татьяна Николаевна

• Власова, Татьяна Николаевна
• кандидат химических наук
• 2007

Оглавление диссертации кандидат химических наук Власова, Татьяна Николаевна

ПРИНЯТЫЕ ОБОЗНАЧЕНИЯ

ВВЕДЕНИЕ 6 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Применение флуоресцентной спектроскопии для изучения физико-химических свойств макромолекул белков

1.1. Собственная флуоресценция белков

1.2. Метод флуоресцентных меток

2. Структура белковой глобулы и активного центра люциферазы светляков

2.1. Структура белковой глобулы

2.2. АТР-связывающие участки

2.3. Люциферин-связывающий участок

2.4. Микроокружение излучателя в активном центре люциферазы

2.5. Изменение конформации люциферазы в процессе биолюминесцентной реакции

3. Использование флуоресцентных методов в изучении биолюминесцентной системы люциферазы светляков

3.1. Спектральные свойства люциферина, оксилюциферина и их аналогов

3.2. Спектральные свойства люциферина, оксилюциферина и их аналогов в комплексе с люциферазой

3.3. Тушение собственной флуоресценции люциферазы в присутствии субстратов и их аналогов

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

1. Исходные вещества и рабочие растворы

2. Используемая аппаратура

3. Методики проведения экспериментов

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Спектральные свойства диметилоксилюциферина и монометилоксилюциферина

1.1. Спектры поглощения и флуоресценции диметилоксилюциферина (DMOL)

1.2. Спектры поглощения и флуоресценции монометилоксилюциферина (MMOL)

1.3. Стабильность DMOL и MMOL.

1.4. Влияние растворителей на спектры флуоресценции DMOL и MMOL

2. Взаимодействие люциферазы светляков с диметилоксилюциферином и монометилоксилюциферином

2.1. Ингибирование люциферазы диметилоксилюциферином

2.2. Спектры кругового дихроизма (КД) рекомбинантной и мутантной (His433Tyr) люциферазы светляков в отсутствие и в присутствии DMOL.

2.3. Флуоресцентное титрование рекомбинантной и мутантной люцифераз люциферином, диметил- и монометилоксилюциферинами при различных значениях рН

2.4. Спектры флуоресценции и возбуждения DMOL в комплексе с рекомбинантной и мутантной люциферазами

2.5. Спектры флуоресценции и возбуждения MMOL в комплексе с рекомбинантной и мутантной люциферазами

2.6. Поляризация флуоресценции DMOL и MMOL в комплексе с люциферазой

2.7. Спектральные свойства DMOL, MMOL, LH2 в комплексе с рекомбинантной и мутантной люциферазами в присутствии ATP (AMP).

3. Влияние субстратов и их аналогов на собственную флуоресценцию люциферазы светляков

3.1. Флуоресценция остатков Тгр и Туг в люциферазе светляков

3.2. Тушение флуоресценции остатков Туг и Тгр люциферазы в присутствии субстратов

ВЫВОДЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Изучение взаимодействия люциферазы светляков Luciola mingrelica с субстратами и их аналогами методом флуоресцентной спектроскопии»

Люцифераза светляков катализирует биолюминесцентную реакцию окисления люциферина (LH2) кислородом воздуха в присутствии аденозин-5'-трифосфорной кислоты (АТР) и ионов Mg2+. Излучателем в биолюминесцентной системе светляков является продукт реакции - оксилюциферин в синглетном электронновозбужденном состоянии [1-3]. Структура излучателя и химическая схема биолюминесцентной реакции идентичны для всех выделенных люцифераз насекомых. Основное различие заключается в цвете возникающей биолюминесценции. Согласно литературным данным, существует взаимосвязь между структурой белковой глобулы люциферазы светляков и спектрами биолюминесценции. Цвет биолюминесценции зависит от свойств микроокружения излучателя, локализованного в активном центре фермента [4]. Таким образом, изучение физико-химических свойств микроокружения излучателя в активном центре люциферазы является одним из важных направлений фундаментального изучения люцифераз.

В настоящее время люциферазы и их гены широко используются как маркеры при изучении различных биохимических процессов в условиях in vitro и in vivo [5]. Для расширения возможностей биолюминесцентного микроанализа возникла потребность в люциферазах, катализирующих эмиссию света в различной области видимого спектра. В связи с этим, изучение взаимосвязи структуры люциферазы и физико-химических свойств микроокружения излучателя имеет большое практическое значение.

Несмотря на то, что известна кристаллическая структура молекулы люциферазы и строение ее активного центра в отсутствие и в присутствии субстратов и продуктов реакции [6-8], нет полной и 6 однозначной информации о физико-химических свойствах микроокружения излучателя в активном центре и роли субстратов в формировании активного центра. Наиболее эффективным методом для изучения свойств микроокружения излучателя является флуоресцентная спектроскопия [9]. Субстрат и продукт биолюминесцентной реакции обладают флуоресцентными свойствами, в связи с этим данный метод успешно применялся ранее для изучения биолюминесцентной системы светляков [10-14]. Поскольку оксилюциферин в водных растворах крайне нестабилен [15], в качестве моделей излучателя использовались аналоги люциферина и оксилюциферина [10, 12, 16-19]. Такое моделирование не могло дать полной информации о свойствах микроокружения излучателя, так как известно [12], что микроокружение участков связывания люциферина и оксилюциферина не идентичны. Кроме того, у большинства используемых аналогов оксилюциферина были заменены функционально значимые для цвета люминесценции группы. В связи с этим, представляется целесообразным в качестве моделей излучателя использовать его аналоги - диметилоксилюциферин (DMOL) и монометилоксилюциферин (MMOL). До настоящего времени подробного изучения спектральных свойств и стабильности этих соединений не проводилось. Поэтому задачей данной работы являлось подробное изучение спектральных свойств и стабильности этих соединений в водных растворах, в различных растворителях и в комплексе с люциферазой. Это позволило получить информацию о физико-химических свойствах микрооокружения излучателя в активном центре люциферазы.

Известно [6], что люцифераза светляков - фермент, состоящий из двух доменов: большого N-домена и малого С-домена, соединенных подвижной неупорядоченной петлей. Окончательное формирование активного центра, а, следовательно, и микроокружения излучателя, происходит только после присоединения субстратов (LH2 и АТР) в результате конформационных изменений с образованием "закрытой" структуры [7]. Однако, какой из субстратов: LH2 или АТР вызывает такое изменение конформации не известно. Флуоресцентные методы широко используются для изучения взаимодействия ферментов с субстратами, продуктами реакции и другими эффекторами, способными тушить собственную флуоресценцию белков, которая в основном обусловлена остатками триптофана и тирозина [9, 20]. Люцифераза светляков Luciola mingrelica содержит один остаток Тгр и 19 остатков Туг [7]. В качестве маркера для исследования взаимодействия люциферазы с люциферином и его аналогами до сих пор успешно использовалась флуоресценция остатка Тгр (^ет= 340 нм) [11, 12, 13, 16, 21, 22]. Было показано, что в присутствии ЬН2 происходит тушение флуоресценции остатка Тгр по статическому типу [21]. Второй субстрат - АТР, тушит флуоресценцию Тгр по динамическому типу только при концентрациях существенно превышающих Кт [14,23].

Флуоресценция остатков Туг люциферазы до настоящего времени не исследована. По литературным данным существенная тирозиновая флуоресценция (Xem = 304-308 нм) наблюдалась для тех белков, у которых содержание остатков Туг больше содержания остатков Тгр [2429]. Поскольку люцифераза светляков Luciola mingrelica содержит 19 остатков Туг и только один остаток Тгр, можно было ожидать существенного вклада тирозиновой составляющей в собственную флуоресценцию люциферазы. Известно, что даже незначительные изменения в трехмерной структуре белка могут привести к тушению флуоресценции остатков Туг [9, 25, 28]. В связи с этим, использование флуоресценции остатков Туг в качестве маркера оказалось перспективным для исследования изменений в структуре люциферазы светляков.

Цель работы - исследовать взаимодействие люциферазы с субстратами и их аналогами, с помощью флуоресцентных маркеров -диметилоксилюциферина и монометилоксилюциферина, а также собственных флуорофоров белка - остатков тирозина и триптофана.

В соответствии с целью, основными задачами исследования являются:

1. Изучить спектральные свойства и стабильность DMOL и MMOL, показать возможность их использования в качестве флуоресцентных маркеров.

2. Сравнить спектральные свойства DMOL и MMOL в буферном растворе, в комплексе с рекомбинантной и мутантной (His433Tyr) люциферазой светляков L. mingrelica.

3. Определить возможность использования флуоресценции Туг остатков люциферазы в качестве маркера фермент-субстратных взаимодействий.

4. Изучить влияние каждого субстрата на сродство люциферазы ко второму субстрату методом флуоресцентного титрования.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение диссертации по теме «Катализ», Власова, Татьяна Николаевна

выводы

1. Показано, что DMOL и MMOL обладают характерными спектральными свойствами, чувствительными к условиям микроокружения. В рН-оптимуме активности люциферазы (7,8) DMOL и MMOL достаточно стабильны, связываются в активном центре люциферазы, в области, близкой к центру связывания субстрата -люциферина и продукта - оксилюциферина, что позволяет использовать DMOL и MMOL в качестве флуоресцентных меток для изучения физико-химических свойств активного центра люциферазы.

2. Показано, что желто-зеленая флуоресценция (А^, = 500 нм), возникающая в щелочных растворах люциферина, DMOL и MMOL, обусловлена образованием стабильных, сходных по строению продуктов разложения субстрата и его аналогов.

3. Методом флуоресцентного титрования определены константы диссоциации комплексов рекомбинантной и мутантной (His433Tyr) люциферазы с DMOL и MMOL в диапазоне рН 6,5-9,0. Показано, что протонированные формы DMOL и MMOL лучше связываются рекомбинантной и мутантной люциферазами, по сравнению с депротонированными. DMOL имеет большее сродство к мутантной люциферазе, чем к рекомбинантной при щелочных рН, а MMOL - во всем изученном диапазоне рН.

4. Показано, что в комплексе DMOL-люцифераза микроокружение DMOL обладает меньшей ориентационной поляризуемостью по сравнению с буферным раствором, а в комплексе MMOL-люцифераза увеличивается кажущееся значение рК фенольной и гидрокситиазольной групп MMOL. Следствием этого является смещение максимума флуоресценции DMOL и MMOL в коротковолновую область на 20 и 100 нм, соответственно.

5. Показано, что для люциферазы светляков Luciola mingrelica характерна флуоресценция не только остатка Тгр (Хет=340нм), но и остатков Туг (А,ет=308 нм). LH2 более эффективно тушит флуоресценцию Тгр по сравнению с флуоресценцией Туг, в то время как АТР более эффективно тушит флуоресценцию Туг за счет образования водородной связи между остатком Туг342 и АТР. Обнаружены два центра тушения АТР (AMP) флуоресценции Туг, по-видимому, соответствующих аллостерическому и активному центрам люциферазы.

6. Методом последовательного флуоресцентного титрования люциферазы субстратами показано, что связывание одного из субстратов с люциферазой затрудняет последующее присоединение другого субстрата, что, по-видимому, связано с конформационными изменениями люциферазы при образовании комплекса с каждым субстратом.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Власова, Татьяна Николаевна, 2007 год

1. Suzuki N., Goto T. Studies on firefly bioluminescence. Identification of oxyluciferin as a product in the bioluminescence of firefly lanterns and in the chemiluminescence of firefly luciferin. // Tetrahedron., 1972, V. 28, N. 16, P. 4075-4082

2. McElroy, W.D., De Luca, M. Kinetics of the firefly luciferase catalyzed reactions. // In Chemiluminescence and Bioluminescence (Cormier, M.J., Hercules, D.M., Lee, J. eds.) Plenum Press, N.Y., 1974, P. 285-311.

3. Угарова H. H. Бровко JI. Ю. Взаимосвязь структуры белковой глобулы и спектров биолюминесценции люциферазы светляков. // Известия Академии наук. Сер. Хим. 2001, N. 10, С. 1670-1679

4. Kricka L.J. Application of bioluminescence and chemiluminescence in biomedical sciences. // In Methods in Enzymology. Bioluminescence and Chemiluminescence. Eds. M.M. Ziegler and Т.О. Baldwin. 2000, P. 333345.

5. Conti E., Francs N. P., Brick P., Crystal structure of firefly luciferase throws light on a superfamily of adenylate-forming emzymes. // Structure, 1996, V. 4, P. 287-289.

6. Сандалова T.P., Угарова H.H. Модель активного центра люциферазы светляков. // Биохимия. 1999, Т. 64, N. 8, С. 1143-1150

7. Nakatsu Т., Ichiyama S., Hiratake J., Saldanha A., Kobashi N., Sakata K. and Kato H. Structural basis for spectral difference in luciferase bioluminescence. // Nature Letters. 2006, V. 440, N. 16, P. 372-375

8. Лакович Дж., Основы флуоресцентной спектроскопии. М.: Мир, 1986

9. Morton R. A., Horkins T. A. Seliger H. H. The Spectroscopic Properties of Firefly Luciferin and Related Compounds. An Approach to Product Emission. //Biochemistry, 1969, V. 8, P. 1598-1607

10. П.Дементьева E. И., Бровко JI. Ю., Дружинина Е. Н., Гандельман О. А., Угарова Н.Н., рН-зависимость спектров биолюминесценции и кинетических констант люциферазы светляков Luciola mingrelica. II Биохимия, 1986, Т. 51, вып. 1, С. 130-139

11. Чудинова E.A., Дементьева Е.И., Бровко Л.Ю., Савицкий А.П., Угарова Н.Н. Флуоресценция остатков триптофана в люциферазах светляков и их комплексах с субстратами. // Биохимия, 1999, Т. 64, С. 1301-1308

12. Suzuki N., Sato М., Okada К., Goto Т. Studies on firefly bioluminescence. Synthesis and spectral properties of firefly oxyluciferin. A possible emitting species in firefly bioluminescence. // Tetrahedron. 1972, V. 28, N. 15, P. 4065-4074

13. Дементьева Е.И. Кинетические свойства растворимой и иммобилизованной люциферазы светляков Luciola mingrelica. II Дисс. канд. хим. наук, 1986, Москва МГУ имени М.В. Ломоносова.

14. DeLuca M, Brand L., Cebula T. A., Seliger H.H., Makula A.F. Nanosecond time-resolved proton transfer studies with degydroluciferin and its complex with luciferase. // J. Biol. Chem. 1971, V. 246, N. 21, P. 6702-6704

15. White E.H., Rapaport E., Seliger H.H., Horkins T.A. The chemi- and bioluminescence of firefly luciferin: an efficient chemical production of electronically excited states. // Bioorg. Chem. 1971, V. 1, P. 92-98

16. White E.H and Roswell J.D.F. Analogs and derivatives of firefly oxyluciferin, the light emitter in firefly bioluminescence. // Photochemistry and Photobiology. 1991, V. 53, N. 1,P. 131-136

17. Фрайфельдер Д. Физическая биохимия // М.: Мир, 1980

18. Cherednikova E.Yu., Chikishev A.Yu., Dementieva E.I., Kossobokova O.V., Ugarova N.N. Quenching of tryptophan fluorescenceof firefly luciferase by substrate. // J. Photochem. Photobiol. B: Biol. 2001, V. 60, P. 7-11

19. Nojima H., Ikai A. and Noda H. Anomalous fluorescence of yeast 3-phosphoglycerate kinase. // Biochimica and Biophysica Acta. 1976, V. 27, P. 20-27.

20. Schlessinger J., Roche. R. S. and Steinberg I. Z. A study of subtilisin tipes Novo and Carlsberg by circular polarization of fluorescence. // Biochem. 1975, V. 14, P. 255-261

21. Sackett D.L., Ruvinov S.B., Thompson J. N5-(L-l-carboxyethyl)-L-ornithine synthase: physical and spectral characterization of the enzyme and its unusial low pK fluorescent tyrosine residues. // Protein Science. 1999, V. 8, N. 10, P. 2121-2129

22. Yang, Y., Shao, Z., Chen, X. and Zhou, P. Optical spectroscopy to investigate the structure of regenerated Bombyx mori silk fibroin in solution. // Biomacromolecules. 2004, V. 5, P. 773-779

23. Finazzi-Agro, A., Rotilio, G., Avigliano, L., Guerrieri P., Boffi, V. and Mondovi, B. Invironment of copper in Pseudomonas fluoresces azurin: fluorometric approach. // Biochem. 1970, V. 9, P. 2009-2014

24. Демченко А.П. Люминесценция и динамика белков. Киев: Наук. Думка, 1988

25. Алфимова Е.Я., Лихтенштейн Г.И. Флуоресцентное исследование переноса энергии, как метод изучения структуры белков. // Итоги науки и техники, серия: Молекулярная биология. 1976, Т. 8, Ч. 2, С. 127-173

26. Экспериментальные методы химической кинетики под ред акад. Эмануэля Н.М. и Кузьмина М. Г. гл. Люминесценция. // М.: Изд-во Московского ун-та. 1985, С. 115-180

27. Владимиров Ю. А. В кн.: Фотохимия и люминесценция белков. // М.: Наука, 1965, С. 232

28. Teale F. W. J. The ultraviolet fluorescence of proteins in neutral solution. // Biochem. J., 1960, V. 76, P. 381-388

29. Lukomska J., Rzeska A., Malicka J., Wiczk W. Influence of a substituent on amide nitrogen atom on fluorescence efficiency quenching of Tyr(Me) by amide group. // J. Photochem. Photobiol. A: Chemistry, 2001, V. 143, P. 135-139

30. Tula Alev-Behmoaras, Jean-Jacques Toulme and Claude Helene. Quenching of tyrosine fluorescence by posphat ions: a model study for protein-nucleic acid complexes. // Photochemistry and Photobiology. 1979, V. 30, P. 533-539

31. Бровко Л.Ю., Чередникова Е.Ю., Чикишев А.Ю., Чудинова Е. А. Влияние микроокружения на спектрально-кинетические свойства люциферина светляков. // Вестник МГУ 1998, Серия 3, Физика. Астрономия, N. 3, С. 26-29

32. Угарова Н.Н., Малошенок Л. Г., Упоров И. В., Кокшаров М. И. Спектры биолюминесценции нативной и мутантной люциферазы светляков как функция рН. // Биохимия. 2005, Т. 70, вып. 11,С. 1534— 1540

33. Conti Е., Lloyd L. F., Akins J., Brick F., Brick P., Crystallization and preliminary diffraction studies of firefly luciferase from Photinus pyralis. // Acta Crtst. 1995, V 52, P. 867-878

34. Sala-Newby G.B., Campbell A.K. Stepwise removal of the C-terminal 12 amino acids of firefly luciferase results in graded loss of activity. // Biochim. Biophys. Acta, 1994, V. 1206, P. 155-160.

35. Sung D., Kang H. The N-terminal amino acids sequences of firefly luciferase are important for stability of the enzyme. // Photochem. Photobiol. 1998, V. 68, P. 749-753

36. Zako Т., Ayabe K., Aburatani Т., Kamiya N., Kitayama A., Ueda H., Nagamune T. Luminescent and substrat binding activities of firefly luciferase N-terminal domain. // Biochimica et Biophysica Asta. 2003, V. 1649, P. 183-189

37. Travis J., McElroy W.D. Isolation and sequence of an essential sulfhydryl peptide of the Active site of firefly luciferase. // Biochemistry. 1966, V. 5, N. 7, P. 2170-2176

38. Denburg J. L., Lee R. Т., McElroy W.D. Substrate binding properties of firefly luciferase. Luciferin-binding site. // Arch. Biochem. Biophys. 1969, V. 134, N. 2, P. 381-394

39. Lee, R.T., Denburg, J.L. and McElroy, W.D. Substrate-binding properties of firefly luciferase. II. ATP-binding site. // Archives of Biochemistry and biophysics. 1970, V. 141, P. 38-52

40. Gates B. J., De Luca M. The production of oxyluciferin during the firefly light reaction. //Arch. Biochem.Biophys. 1975, V. 169, P. 616-621

41. Бровко Л.Ю., Беляева Е.И., Угарова H.H. Субъединичные взаимодействия в люциферазе светляков Luciola mingrelica. Их роль в проявлении активности фермента и процессе термоинактивации. // Биохимия. 1982, Т. 47, N. 5 С. 760-766

42. Лундовских И.А., Дементьева Е.И., Угарова Н.Н. Кинетика и механизм термоинактивации люциферазы светляков Luciola mingrelica. // Вестн. Моск. Ун-та, сер. 2 Химия, 2000, Т. 41, N 6, Р. 362-366

43. Conti E, Stachelhaus T, Marahiel N.A., Brick P., Structural basis for the activation of phenylalanine in the non-ribosomal biosynthesis of gramicidin S. // The EMBO journal. 1997, V. 16, N. 14, P. 4174-4183

44. Branchini B.R., Magyar R.A., Murtiashaw M.H., Anderson S.M., Zimmer M. Site-Directed Mutagenesis of Histidine 245 in Firefly Luciferase: a Proposed Model of the Active Site. // Biochemistry. 1998, V. 37, P. 15311-15319.

45. Branchini B.R., Magyar R.A., Murtiashaw M.H., Anderson S.A., Helgerson L.C., Zimmer M. Site-Directed Mutagenesis of Firefly Luciferase Active Site Amino Acids: a Proposed Model for Bioluminescence Color. // Biochemistry. 1999, V. 38, P. 13223-13230.

46. Branchini B.R., Murtiashaw M.H.,. Magyar R.A, Anderson S. M. The role of lysine 529, a conserved residue of the acril-adenylat-forming enzyme superfamily, in firefly luciferase. // Biochemistry. 2000, V. 39, P. 54335440

47. Морозов B.M., Угарова H.H. Консервативные мотивы в суперсемействе ферментов, катализирующих образование ациладенилатов из АТР и соединений с карбоксильной группой. // Биохимия. 1996, Т. 61, N. 8, С. 1511-1517

48. Thompson J.F., Geoghegan K.F., Lloyd D.B., Lanzetti A.J., Magyar R.A., Anderson S.M., Branchini B.R. Mutation of a Protease-Sensitive Region in Firefly Luciferase Alters Light Emission Properties. // J. Biol. Chem. 1997, V. 272, P. 18766-18771.

49. Дементьева Е.И., Железнова E.E., Кутузова Г.Д., Лундовских И.А., Угарова Н.Н. Физико-химические свойства рекомбинантной люциферазы светляков Luciola mingrelica и ее мутантных форм. // Биохимия. 1996, Т. 61, N. 1, С. 152-158

50. Ayabe К., Zako Т., Ueda H. The role of firefly luciferase C-terminal domain in efficient coupling of adenilation and oxidative steps. // FEBS Letters. 2005, V. 579, P. 4389^39

51. Бровко Л.Ю. Физико-химические и кинетические закономерности функционирования биолюминесцентной системы светляков. // ВИНИТИ. Итоги науки и техники. Биотехнология. 1988, Т. 14, С. 155-195

52. DeLuca М. and McElroy W. D. Two kinetically distinguishable ATP sites in firefly luciferase. Biochemical and biophysical research communications. 1984, V. 123, N 2, P. 764-770

53. Филипова Н.Ю., Духович А.Ф., Букатина В.А., Угарова Н.Н. Аллостерический механизм регуляциии активности люциферазы светляков Luciola mingrelica. II Биохимия, 1984, Т. 49, вып. 12, С. 1965-1971

54. DeLuca M. Hidrophobic nature of the active site of firefly luciferase. // Biochem. 1969, V. 8, N. 1,160-166

55. Branchini B.R., Hayward M.M. Naphthyl and quinolylluciferin: green and red light emitting firefly luciferin analogues. // Photochemistry and Photobiology. 1989, V. 49, N. 5, P. 689-695

56. Wood К. V., Lam Y. A. and Mc Elroy W. D. Bioluminescent click beetles revisited. //J. Biolum. Cemilum., 1989, V. 4, P. 31-39

57. Kajiyama N.K. and Nakano E. Isolation and characterization of mutants of farefly luciferase which produce different colors of light. // Protein Eng., 1991, V. 4, P. 691-693

58. DeLuca M., Marsh M. Conformational changes of luciferase during catalysis. // Arch. Biochem. Biophys. 1967, V. 121, N. 1, P. 233-240

59. DeLuca M. and McElroy W. D. Kinetics of the firefly luciferase catalyzed reactions. // Biochemistry. 1974, V. 13, N 5, P. 921-925

60. Bowie L. J., Horak V., De Luca M. Synthesis of a new substrate analog of firefly luciferin: an active site probe // Biochemistry, 1973, V.12, N. 10, P. 1845-1851

61. Bitler В., McElroy W.D. The preparation and properties of crystalline firefly luciferine // Arch. Biochem. Biophys. 1957, V. 23, N. 2, P. 358368

62. Suzuki N., Goto T. Synthesis of 4-thiazolon derivatives related to firefly oxyluciferin. //Agr. Biol. Chem, 1972, V. 36, N. 12, P. 2213-2221

63. Miska W., Geiger R. Synthesis and characterization of luciferin derivatives for use in bioluminescence enhanced enzyme immunoassays. // J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 1987, V. 25, N. 1, P. 23-30

64. Goto Т., Rubota I., Suzuki N., Kishi Y. Aspects of the mechanism of bioluminescence. // N.Y. Acad Press. 1974, P. 325-335

65. Gandelman O.A., Brovko L.Yu., Ugarova N.N. and Chikishev A.Yu., Shkurimov A.P. Oxyluciferin fluorescence is a model of native bioluminescence in the firefly luciferin-luciferase system. J. Phothchem. Photobiol., B:Biol. 1993, V. 19, P. 187-191

66. Weiss D., Beckert R., Lamm K., Baader W. J., Bechara E.J. H., Stevani C.

67. V. Playing with luciferin new results on the luminescence of a wellknown molecule. // in: J. F. Case, P. J. Herring, В. H. Robinson, S. H. D.th

68. Haddock, L.J. Kricka, P.E. Stanley (Eds.), Proceedings of the 11 Suymposium on Bioluminescence and Chemiluminescence. Bioluminescence & Chemiluminescence 2000, Singapore: World Scientific Publishing Co. Pte. Ltd. 2001, P. 197-200

69. Branchini, B.R., Murtiashaw, M.H., Magyar, R.A., Portier, C.N., Ruggiero, M.C. and Stroh, J.S. Yellow-green and red firefly bioluminescence from 5,5-dimethyloxyluciferin. // J.Am. Chem.Soc. 2002, V. 124, N10, P. 2112-2113

70. Gronowitz S., Matiasson В., Dahibom R., Holmberg В., Jansen K. A. Nuclear Magnetic resonance studies on 2-phenyl-4-thiazolone and somerelated compounds.//Acta chem.Scand. 1965, V. 19, P. 1216-1220

71. White E., Rapaport E., Horkins T.A., Seliger H.H. Chemi- and bioluminescence of Firefly luciferin. //J. Am. Chem. Soc. 1969, V. 91, N. 8, P. 2178-2180

72. Suzuki N., Sato M., Nishikawa K., Goto T. Synthesis and spectral properties of 2-(6'-hydroxybenzothiazol-2'-yl)-4- hydroxythiazole a possible emitting species in firefly bioluminescence. // Tetrahedron letters. 1969, V. 53, P. 4683-4684

73. Denburg J., McElroy W.D. Anion inhibition of firefly luciferase. // Arch. Biochem. Biophys. 1970, V. 141, N. 2, P 668-672

74. Ugarova, N.N. Luciferase of Luciola mingrelica fireflies. Kinetics and Regulation mechanism. // J. of Bioluminescence and Chemiluminescence. 1989, V. 4, P. 406-418

75. Arrio В., Rodier P., Boisson C. and Vernotte C. Fluorescence quenching and conformational changes of proteins. // Biochem. Biophys. research communications. 1970, V. 39, N. 4, P. 589-593

76. Dementieva E.I., Fedorchuk E.A, Brovko L.Yu., Savitskii A.P. and Ugarova N. N. Fluorescent properties of firefly luciferases and their complexes with luciferin. // Bioscience Reports. 2000, V. 20, N. 1, P 2130.

77. Талебаровская И.К., Каткова B.A., Рыжова B.B., Щеголев А.А. Березин И. В. Способ получения D-люциферина. // Авт. св. № 1192324. (Russ.), 1983

78. Chen, Y.H., Yang, J.T., Martinez, H.M. Determination of the secondary structures of proteins by circular dichroism and optical rotatory dispersion. // Biochemistry. 1972, V. 11, P. 4120-4131

79. Manning, M.C., Illangasekare, M., Woody, R.W. Circular dichroism studies of distorted «-helices, twisted 13-sheets, and B-turns. Biophys. Chem., 1988, V.31,P. 77-86

80. Хроматография в тонких слоях. Под ред. Шталя. // М.: Мир, 1965

81. Дорсон P., Элиот Д., Элиот У., Джонс К. Справочник биохимика. // М.: Мир, 1991, С. 446

82. Березин И.В., Мартинек К. Основы физической химии ферментативного катализа. //М.: Высшая школа. 1977

83. Корниш-Боуден Э. Основы ферментативной кинетики. // М.: Мир, 1978

84. Райхардт К. Растворители и эффекты среды в органической химии // М.: Мир, 1991

85. Бровко Л.Ю., Гандельман О.А., Поленова Т.Е., Угарова Н.Н. Кинетика биолюминесценции в люциферин-люциферазной реакции светляков. // Биохимия. 1994, Т. 59, вып. 2, С. 273-281

86. Филипова Н.Ю., Духович А.Ф., Соколова Н.И, Угарова Н.Н. Ингибирование люциферазы из светляков смешанными ангидридами аденозин-5 '-фосфатов и мезитиленкарбоновой кислоты. // Биохимия, 1984, Т. 49, вып. 4 С. 585-588