Характеристики гемостаза при гемодилюции. Коррекция гемодилюционной гиперкоагуляции ингибиторами тромбина тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.04, доктор биологических наук Синауридзе, Елена Ивановна

• Синауридзе, Елена Ивановна
• доктор биологических наук
• 2013

Оглавление диссертации доктор биологических наук Синауридзе, Елена Ивановна

СОДЕРЖАНИЕ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Часть I. Искусственные плазмозамещающие растворы.

1.1. Гиповолемия.

1.2. Основные патофизиологические процессы, связанные с гиповолемией, и регуляция состава и объема различных водных секторов организма.

1.3. Коррекция гиповолемии.

1.4. Современные плазмозамещающие растворы.

1.4.1. Кристаллоидные растворы.

Изотонические солевые растворы.

Осмотичностъ кристаллоидныхрастворов.

Метаболический ацидоз, возникающий при переливании больших объемов несбалансированных по ионному составу плазмозамещающих растворов.

Дефицит оснований и «носителирезервной щелочности».

Гипертонические кристаллоидные растворы.

Влшние кристаллоидных растворов не систему гемостаза.

1.4.2. Коллоидные плазмозамещающие растворы.

Альбумин.

Применение растворов альбумина.

Побочные эффекты переливания альбумина.

Растворы на основе желатина.

Побочные эффекты желатиновых плазмозамещающих растворов.

Влияние желатиновых растворов на гемостаз.

Декстрановые растворы.

Побочные эффекты переливания декстрановыхрастворов.

Влияние декстрановых плазмозамещающих растворов на гемостаз.

Растворы на основе гидроксиэтилкрахмалов.

Химическая структура гидроксиэтилкрахмалов.

Физико-химические свойства, характеризующие разн ые препарат ы ГЭК.

Концентрация препарата.

Средний молекулярный вес ГЭК.

Степень замещения и степень молярного замещения ГЭК.

С/С^ отношение гидроксиэтилирования.

Источники сырья для производства ГЭК.

Использование сбалансированных солевых растворов для растворения ГЭК и как основы других коллоидных плазмозамещающих растворов.

Фармакокинетические параметры различных препаратов ГЭК.

Побочные эффекты ГЭК.

Влияние ГЭК на гемостаз.

1.5. Влияние гемодилюции на систему свертывания крови.

1.5.1. Влияние гемодилюции на различные времена свертывания.

1.5.2. Исследование влияния гемодилюции на гемостаз с помощью метода тромбоэластографии.

Исследование ТЭГ в опытах in vitro.

Исследование ТЭГ в опытах in vivo.

1.5.3. Исследование влияния гемодилюции на гемостаз путем измерения генерации тромбина.

1.5.4. Механизмы, ответственные за возникновение гиперкоагуляции при гемодилюции.

Часть II. Современные принципы антикоагулянтной терапии.

1.6. Стандартные антикоагулянты.

1.6.1. Антитромбоцитарная терапия.

1.6.2. Нефракционированный гепарин, гепарины низкого молекулярного веса и гепариноиды.

1.6.3. Антагонисты витамина К.

1.7. Селективные ингибиторы тромбина и фактора Ха.

1.7.1. Гирудин и его аналоги.

1.7.2. Низкомолекулярные синтетические ингибиторы тромбина и фактора Ха.

Ингибиторы тромбина.

Аргатробан.

Дабигатран этексилат.

Селективные ингибиторы фактора Ха.

1.8. Новые направления в разработке антикоагулянтов.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Материалы.

2.2. Методы.

2.2.1. Приготовление плазмы для анализа.

2.2.2. Инкубация плазмы с молочной кислотой.

2.2.3. Разбавление плазмы плазмозамещающими растворами.

2.2.4. Измерение стандартных времен свертывания.

Измерение активированного частичного тромбопластинового временм (АЧТВ).

Измерение протромбинового времени свертывания (ПВ).

Измерение тромбинового времени свертывания (ТВ).

Измерение времени рекальцификации (BP).

2.2.5. Измерение генерации тромбина.

Стандартная постановка.

Измерение генерации тромбина без дополнительного разбавления плазмы в ходе анализа.

2.2.6. Тест тромбодинамики (измерение скорости роста сгустка в пространстве).

2.2.7. Приготовление активаторов с тканевым фактором для изучения скорости роста сгустка в пространстве.

2.2.8. Измерение параметров полимеризации фибрина.

Измерение скорости полимеризации фибрина в растворах фибриногена в присутствии различных плазмозаменителей.

Измерение параметров полимеризации в плазме, разбавленной ПЗР.

2.2.9. Тромбоэластография.

2.2.10. Модель умеренной гемодилюции на крысах.

2.2.11. Измерение концентрации гемоглобина.

2.2.12. Счет клеток.

2.2.13. Исследование изменений коагуляции после переливания плазмозамещающих растворов пациентам in vivo.

2.2.14. Компьютерный скрининг для поиска новых ингибиторов тромбина.

2.2.15. Синтез новых соединений - ингибиторов тромбина.

2.2.16. Измерение активности тромбина и фактора Ха.

2.2.17. Измерение острой токсичности вновь синтезированных ингибиторов.

2.2.18. Стабильность лучших новых ингибиторов тромбина в водных растворах.

2.2.19. Статистическая обработка результатов.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Часть I. Влияние на свертывание крови разбавления плазмы искусственными плазмозамещающими растворами.

3.1. Измерение стандартных времен свертывания при разбавлении плазмы плазмозамещающими растворами in vitro.

3.2. Генерация тромбина при разбавлении плазмы in vitro различными плазмозамещающими растворами.

3.3. Скорость пространственного роста сгустка в плазмах, разбавленных различными плазмозамещающими растворами in vitro.

3.4. Влияние различных плазмозамещающих растворов на скорость полимеризации фибрина в растворах фибриногена.

3.4.1. Полимеризация фибрина в присутствии различных ПЗР.

3.4.2. Полимеризация фибрина в присутствии различных ПЗР и фибринстабилизирующего фактора XIII.

3.5. Образование сгустков в плазме, разбавленной различными плазмозамещающими растворами.

3.6. Коррекция гиперкоагуляции, вызванной гемодилюцией, с помощью

ПЗР, содержащих ингибиторы тромбина.

3.6.1. Влияние гемодилюции на эндогенный тромбиновый потенциал в присутствии различных концентраций антитромбина III в системе.

3.6.2. Разбавление плазмы изотоническим солевым раствором, содержащим низкомолекулярный синтетический ингибитор тромбина (HC-025S-IOC).

3.6.3. Коррекция гемодилюционных нарушений скорости роста сгустка в пространстве ингибиторами тромбина.

3.7. Изучение влияния гемодилюции на состояние коагуляции in vivo.

3.7.1. Модель умеренной гемодилюции на животных.

3.7.1.1. Экспериментальное определение степени кровопотери.

3.7.1.2. Выбор концентрации ингибитора тромбина HC-019s-IOC для введения в физиологический раствор.

3.7.1.3. Изменения коагуляции in vivo у крыс после гемодилюции различными плазмозамещающими растворами

Стандартные времена свертывания.

Измененш генерации тромбина при гемодилюции in vivo стандартным физиологическим раствором и раствором, содержащим ингибитор тромбина HC-019s-IOC.

Исследование пространственной динамики свертывания при гемодилюции различными ПЗР у крыс in vivo.

3.7.2. Изменение параметров системы свертывания крови при переливании пациентам in vivo искусственных плазмозамещающих растворов.

3.7.2.1. Влияние гемодилюции in vivo на скорость роста сгустка в пространстве.

3.7.2.2. Изменение генерации тромбина в ходе гемодилюции у пациентов in vivo.

3.7.2.3. Динамика изменения тромбоэластографических показателей у доноров костного мозга, получавших инфузии различных ПЗР.

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Синауридзе, Елена Ивановна

выводы

1. Разбавление плазмы до 50-60% любым плазмозамещающим раствором in vitro вызывает сдвиг в системе свертывания крови в сторону гиперкоагуляции, который может быть зафиксирован такими интегральными методами анализа гемостаза, как тест генерации тромбина и измерение скорости роста сгустка в пространстве. Причиной такого сдвига является преимущественная чувствительность системы при данных степенях разбавления к снижению концентрации ингибиторов свертывания.

2. Кристаллоидные плазмозамещающие растворы не влияют на скорость полимеризации фибрина в растворах фибриногена, а коллоидные растворы ускоряют эту полимеризацию. Гемостатическая некомпетентность сгустков, образующихся в присутствии коллоидов, может быть связана со снижением их качества (например, с увеличением пористости сгустков из-за увеличения отношения масса/длина образующихся фибриновых волокон, с увеличением количества связанной со сгустком воды, ускоренным фибринолитическим разрушением таких сгустков и т.п.).

3. Умеренная гемодилюция различными плазмозамещающими растворами in vivo является риск-фактором возникновения гиперкоагуляционного состояния. Это подтверждается следующими результатами:

При ~ 25% гемодилюции в модели гемодилюции у крыс наблюдается увеличение тромбинового потенциала и ускоренное образование спонтанных сгустков в тесте тромбодинамики;

Переливание плазмозамещающих растворов здоровым добровольцам без кровопотери (по 12 мл/кг), а также объемное восполнение кровопотери различными плазмозамещающими растворами у доноров в ходе эксфузии костного мозга приводят к ускорению роста сгустка в пространстве, увеличению эндогенного тромбинового потенциала и гиперкоагуляционному сдвигу в параметрах тромбоэластографии.

4. Введение ингибиторов тромбина (антитромбина III или низкомолекулярных прямых синтетических ингибиторов) в плазмозамещающий раствор способно полностью или частично компенсировать вызываемые гемодилюцией гиперкоагуляционные изменения свертывания.

5. Метод теоретического докинга низкомолекулярных лигандов в активный центр фермента и разработанная многоступенчатая система экспериментального скрининга антикоагулянтных свойств отобранных соединений позволяют сократить время поиска новых высокоэффективных ингибиторов ферментов системы свертывания. В результате применения такого подхода были разработаны три новых класса низкомолекулярных синтетических прямых ингибиторов тромбина для внутривенного введения, обладающих низкой токсичностью, высокой эффективностью ингибирования и хорошо сохраняющих активность при длительном хранении в водных растворах как при +4°С, так и при комнатной температуре. Лучшие представители этих ингибиторов превосходят по эффективности аргатробан -клинически применяемый низкомолекулярный синтетический ингибитор тромбина для внутривенного введения.

Заключение

Проведенное нами исследование показало, что компьютерный дизайн ингибиторов тромбина на основе правильно настроенной программы докинга, усиленный последующим многоступенчатым экспериментальным скринингом, является мощным инструментом для поиска нового ингибиторного мотива (базовой ингибиторной структуры) с целью создания соединений с повышенной эффективностью ингибирования.

В результате было разработано более 40 новых эффективных, стабильных и безопасных ингибиторов тромбина. Эти соединения не только снижали активность тромбина в буферной системе, но и проявляли антикоагулянтную активность в плазме в различных тестах in vitro. Типичный представитель новых соединений -ингибитор HC-019s-IOC был исследован также в экспериментах in vivo. При добавлении в плазмозамещающий кристаллоидный раствор этот ингибитор предупреждал возникновение гиперкоагуляционного состояния в модели гемодилюционной гиперкоагуляции у крыс. Многие из новых соединений оказались более эффективными ингибиторами тромбина, чем применяемый в настоящее время в клинике для внутривенного введения ингибитор аргатробан. Кроме того, новые ингибиторы прекрасно сохраняют активность при длительном хранении в водных растворах, что делает их пригодными для использования в составе плазмозамещающих растворов. Все новые ингибиторы тромбина являются перспективными с точки зрения разработки новых антитромботических средств, однако для подтверждения возможности их клинического применения необходимы дальнейшие детальные исследования.

Список литературы диссертационного исследования доктор биологических наук Синауридзе, Елена Ивановна, 2013 год

1. Стереофундин изотонический. Доступно на сайте: http://www.bbraun.ru.

2. Горобец ЕС. Современные тенденции в периоперационной инфузионной терапии. Электронная публикация: Consilium medicum, 2002, 4(6). Доступно на сайте:http://www.consilium-medicum.com/medicum/article/12224.

3. Drobin D, Hahn RG. Kinetics of isotonic and hypertonic plasma volume expanders. Anasthesiology, 2002; 96(6):1371-1380.

4. Svensen C, Hahn RG. Volume kinetics of Ringer solution, dextran 70 and hypertonic saline in male volonteers. Anesthesiology, 1997; 87(2):204-212.

5. Boldt J, Suttner S. Plasma substitutes. Minerva Anesthesiol, 2005; 71(12):741-758.

6. Gosling P. Salt of the earth or a drop in the ocean? A pathophysiological approach to fluid resuscitation. Emerg Med J, 2003; 20(4):306-315.

7. Козловский Л. Централизация кровообращения, гипоксия и уремия после легочной эмболии. Хирургия, 1952; 23(11):527-529.

8. Hill GE. Cardiopulmanary bypass-induced inflammation: is it important? J Cardiothorac Vase Anesth, 1998; 12(Suppl):S21-S25.

9. Cusack RJ, Ball JAS, Rhodes A, Grounds RM. Improving postoperative morbidity amd mortality. Intensivmed Notfallmed, 2002; 39(7):571-577.

10. Fleck A, Raines G, Hawker F, Trotter J, Wallace PI, Ledingham IM, Caiman КС. Increased vascular permeability; a major cause of hypoalbuminaemia in disease and injury. Lancet, 1985; l(8432):781-784.

11. Zikria BA, Bascom JU. Mechanisms of multiple organ failure. In: "Reperfusion injuries and clinical capillary leak syndrome" (Zikria BA, Oz MC, Carlson RW, eds.), Armonk, NY, Futura, 1994, pp. 443-492.

12. McDonald DM, Thurston G, Baluk P. Endotelial gaps as sites for plasma leakage in inflammation. Microcirculation, 1999; 6(l):7-22.

13. Boldt J. Volume replacement in the surgical patient does the type of solution make a difference? Br J Anaesthesia, 2000; 84(6):783-793.

14. Boldt J. Volume therapy in cardiac surgery. Annals Card Anaesth, 2005; 8(2): 104116.

15. Vane LA, Prough DS, Kinsky MA, Williams CA, Grady JJ, Kramer GC. Effects of different catecholamines on the dynamics of volume expansion of crystalloid infusion. Anesthesiology, 2004; 101(5):1136-1144.

16. Boldt J. The balanced concept of fluid resuscitation. Br J Anaesth, 2007; 99(3):312-315.

17. Fox JL. Assessing blood substitutes. Biotechnology (N.Y.), 1994; 12(2):231-231.

18. Scott MG, Kucik DF, Goodnough LT, Monk TG. Blood substitutes: evolution and future applications. Clin Chem, 1997; 43(9):1724-1731.

19. Marret E, Bonnin P, Mazoyer E, Riou B, Jacobs T, Coriat P, Samama CM. The effects of a polymerized bovine-derived hemoglobin solution in a rabbit model of arterial thrombosis and bleeding. Anesth Analg, 2004; 98(3):604-610.

20. Turecek PL, Varadi K, Gritsch H, Schwarz HP. FEIBA: mode of action. Haemophilia, 2004; 10 (Suppl 2):3-9.

21. Colomina MJ, Diez Lobo A, Garutti I, Gomez-Luque A, Llau JV, Pita E. Perioperative use of prothrombin complex concentrates. Minerva Anestesiol, 2012; 78(3):358-368.

22. Gringeri A, Mufa-Perja M, Mangiafico L, von Mackensen S. Pharmacotherapy of haemophilia A. Expert Opin Biol Ther, 2011; 11(8):1039-1053.

23. Agrawal N, Murphy JG, Cayten CG, Stahl WM. Blood transfusion increases the risk of infection after trauma. Arch Surg, 1993; 128(2):171-177.

24. Goodnough LT, Brecher ME, Kanter MH, AuBuchon JP. Transfusion medicine: first of two parts blood transfusion. N Engl J Med, 1999; 340(6):438-447.

25. Choi PT-L, Yip G, Quinonez LG, Cook DJ. Crystalloids vs. colloids in fluid resuscitation. A systematic review. Crit Care Med, 1999; 27(1):200-210.

26. Dawidson I. Fluid resuscitation of shock: current controversies. Crit Care Med, 1989; 17(10):1078-1080.

27. Kreimeier U, Peter K. Strategies of volume therapy in sepsis and systemic inflammatory response syndrome. Kidney Int, 1998; 53(Suppl 64):S75-S79.

28. Prough DS, Johnston WE. Fluid restoration in septic shock: no solution yet. Anesth Analg, 1989; 69(6):699-704.

29. Vermeulen LC, Ratko MA, Erstad BL, Brecher ME, Matuszewski KA. A paradigm for consensus the university hospital consortium guidelines for the use of albumin, nonprotein colloids, and crystalloid solutions. Arch Intern Med, 1995; 155(4):373-379.

30. Velanovich V. Crystalloid versus colloid fluid resuscitation: a meta-analysis of mortality. Surgery, 1989; 105(1):65-71.

31. Boldt J, Lenz M, Kumle B, Papsdorf M. Volume replacement strategies on intensive care units: results from a postal survey. Intensive Care Med, 1998; 24(2):147-151.

32. Schierhout G, Roberts I. Fluid resuscitation with colloids or crystalloids in critically ill patients: a systematic review of randomised trials. Br Med J, 1998; 316(7136):961-964.

33. Edwards JD. A new debate: colloid versus crolloid? In:"Yearbook of Intensive Care and Emergency Medicine" (Vincent JL ed.), Berlin, Springer, 1994, pp. 152164.

34. Alexander JW. Mechanism of immunologic suppression in burn injury. J Trauma, 1990; 30(Suppl):S70-S75.

35. Chaudry IH, Ayala A. Immune consequences of hypovolemic shock and resuscitation. Curr Opin Anesth, 1993; 6(2):385-392.

36. Vaupshas HJ, Levy M. Distribution of saline following acute volume loading: postural effects. Clin Invest Med, 1990; 13(4): 165-177.

37. Arieff AI. Fatal postoperative pulmonary oedema: pathogenesis and literature review. Chest, 1999; 115(5):1371-1377.

38. Davies MG, Hagen PO. Systemic inflammatory response syndrome. Br J Surg, 1997; 84(7):920-935.

39. Stein L, Berand J, Morisette M. Pulmonary edema during volume infusion. Circulation, 1975; 52(3):483-489.

40. Rackow EC, Fein A, Leppo J. Colloid osmotic presse as a prognostic indicator of pulmonary edema and mortality in the critical ill. Chest, 1977; 72(6):709-713.

41. Prien T, Backhaus N, Pelster F, Pircher W, Bunte H, Lawin P. Effect of intraoperative fluid administration and colloid osmotic presse on the formation of intestinal edema during gastrointestinal surgery. J Clin Anesth, 1990; 2(5):317-323.

42. Boldt J, Papsdorf M. Fluid management in burn patients: results from a European survey more questions than answers. Burns, 2008; 34(3):328-338.

43. Козинец ГИ. Интерпретация анализов крови и мочи и их клиническое значение. Изд-во «Триада-Х», Москва, 2000, стр. 91-95.

44. Waters JH, Bernstein CA. Dilutional acidosis following hetastarch or albumin in healthy volunteers. Anesthesiology, 2000; 93(5): 1184-1187.

45. Buchalter SE, Crain MR, Kreisberg RA. Regulation of lactate metabolism in vivo. Diabetes Metab Rev, 1989; 5(4):379-391.

46. Davidson WD, Rorke SJ, Guo LSS, Morin RJ. Comparison of acetate-1-14C metabolism in uremic and non-uremic dogs. Am J Clin Nutr, 1978; 31(10): 18971902.

47. Kreisberg RA. Pathogenesis and management of lactic acidosis. Annu Rev Med, 1984;35:181-193.

48. Barry MN. The liver and lactic acidosis. Proc R Soc Med, 1967; 60(12): 12601262.

49. Lang W, Zander R. Prediction of dilutional acidosis based on the revised classical dilution concept for bicarbonate. J Appl Physiol, 2005; 98(1):62-71.

50. McFarlane C, Lee A. A comparison of Plasmalyte 148 and 0.9% saline for intraoperative fluid replacement. Anaesthesia, 1994; 49(9):779-781.

51. Mythen MG, Hamilton MA. Hyperchloremic acidosis: is it clinically relevant? Transfus Altern Transfus Med, 2001; 3(4): 15-19.

52. Kellum JA. Saline-induced hyperchloremic metabolic acidosis. Crit Care Med, 2002; 30(1):259-261.

53. Stephens R, Mythen M. Resuscitation fluids and hyperchloraemic metabolic acidosis. Trauma, 2003; 5(2):141-147.

54. Williams EL, Hilderbrand KL, McCormic SA, Bedel MJ. The effect of intravenous lactated Ringer's solution versus 0.9% sodium chloride solution on serum osmolarity in human volunteers. Anesth Analg, 1999; 88(5):999-1003.

55. Scheingraber S, Rehm M, Finsterer U. Rapid saline infusion produces hyperchloremic acidosis in patient gynecologic surgery. Anesthesiology, 1999; 90(5):1265-1270.