Кинетика образования комплекса антиген-антитело на микрочипах тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, кандидат физико-математических наук Зубцов, Дмитрий Александрович

• Зубцов, Дмитрий Александрович
• кандидат физико-математических наук
• 2008

Оглавление диссертации кандидат физико-математических наук Зубцов, Дмитрий Александрович

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Общая характеристика микрочипов.

1.2. Применение белковых микрочипов.

1.3. Изготовление микрочипов.

1.3.1. Методы иммобилизации белков на микрочипах.

1.3.1.1. Физическая иммобилизация.

1.3.1.2. Химическая иммобилизация.

1.3.1.3. Иммобилизация за счет комплексообразования.

1.3.1.4. Иммобилизация в пористых средах.

1.3.1.5. Иммобилизация белков на трехмерных гидрофильных носителях.

1.3.2. Методы нанесения молекулярных зондов.

1.3.2.1. Микроконтактный метод.

1.3.2.2. Микроструйный метод.

1.3.2.3. Ближнее электронапыление.

1.3.2.4. Дальнее электронапыление.

1.3.2.5. Микроконтактная печать.;.

1.4. Микрочипы на основе гидрогелей.

1.5. Сравнение двумерных и трехмерных микрочипов.

1.6. Изучение кинетики на гидрогелевых микрочипах.

1.7. Методы ускорения анализа на микрочипах.

2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

2.1. Приборы и реактивы.

2.2. Изготовление микрочипов.

2.3. Введение флуоресцентных меток в молекулу белка.

2.4. Определение эффективности иммобилизации.

2.5. Прямой анализ на микрочипах.

2.6. Сэндвич-анализ ПСА на микрочипах.

2.7. Флуоресцентные измерения на чипах.

2.8. Кинетические измерения на микрочипе.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Сравнение эффективности иммобилизации в двух системах.

3.2. Сравнение поверхностных и гидрогелевых микрочипов по уровням сигналов в сэндвич-иммуноанализе.

3.3. Кинетика реакции антиген-антитело на микрочипах.

3.4. Теоретическое описание кинетики связывания антигена из раствора с антителами, иммобилизованными в ячейках микрочипа.

3.4.1. Кинетика и время насыщения.

3.4.2. Ускорение транспорта антигена при помощи перистальтического насоса и эффект экранирования.

3.5. Эффект принудительного перемешивания раствора.

3.6. Концентрационные зависимости уровней сигналов и характерных времен.

3.7. Влияние интенсивности перемешивания.

3.8. Перспективность применения перемешивания.

ВЫВОДЫ.

БЛАГОДАРНОСТИ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Кинетика образования комплекса антиген-антитело на микрочипах»

Биологические микрочипы становятся все более востребованным эффективным аналитическим инструментом для фундаментальных и прикладных молекулярно-биологических исследований. Микрочипы содержат упорядоченно размещенные биомолекулярные зонды, которые либо химически прикрепляют к поверхности носителя, такого как стекло, пластик, металл, полимерная мембрана (2В-микрочип), либо иммобилизуют в объемных гидрогелевых ячейках, закрепленных на носителе (3D-микрочип). Технология изготовления трехмерных гидрогелевых микрочипов с использованием в качестве зондов ДНК-олигонуклеотидов, белков и Сахаров разработана в Институте молекулярной биологии РАН. Трехмерное размещение молекулярных зондов способно обеспечить ряд преимуществ по сравнению с поверхностной иммобилизацией. Для белковых микрочипов особенно важным является устранение контакта иммобилизованной белковой молекулы с гидрофобной поверхностью подложки. Также важно иметь возможность многократного повышения уровней сигналов за счет увеличения количества зонда, приходящегося на единицу площади ячейки. Вместе с тем опасения могла бы внушать ожидаемая медленность кинетики, типичная в случае олигонуклеотидных гелевых микрочипов и обусловленная механизмом «задержанной диффузии» [1]. Однако наше исследование показывает, что в стандартных условиях использования белковых микрочипов кинетика лимитируется «внешней» диффузией в объеме, окружающем ячейку, и потому одинакова для 3D- и 20-микрочипов. Выявленный кинетический механизм делает осмысленной задачу ускорения реакций на белковых микрочипах посредством принудительного перемешивания раствора. Задача ускорения реакции мотивирована не только удобством практического использования метода, но и возможностью значительного повышения разрешающей способности анализа.

Целью исследования является изучение кинетики образования комплекса антиген-антитело на гидрогелевых микрочипах, получение данных об основных параметрах, влияющих на время достижения насыщения и на уровни сигналов в насыщении для оптимизации иммуноанализа на микрочипах. Для достижения выбранной цели потребовалось сравнить гидрогелевые микрочипы с поверхностными микрочипами, оценивая основные функциональные параметры: эффективность иммобилизации; уровни сигналов в сэндвич-иммуноанализе (тройной комплекс); время выхода и интенсивности сигналов в насыщении (двойной комплекс). Также изучить кинетику реакции антиген-антитело на гидрогелевых микрочипах и возможность ускорения реакции перемешиванием раствора. Оценить практическую значимость опробованных методов ускорения реакции антиген-антитело на микрочипах.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Зубцов, Дмитрий Александрович

выводы

1. Экспериментально установлены преимущества белковых микрочипов, использующих объемную иммобилизацию в гелевых ячейках, по отношению к микрочипам с поверхностной иммобилизацией. Иммобилизация в геле позволяет с сохранением нативности белка получать на порядки более высокие плотности молекул в расчете на единицу площади и иметь соответственно более высокие уровни сигналов.

2. В типичных условиях иммуноанализа на микрочипах кинетика лимитируется «внешней» диффузией антигена к ячейкам микрочипа и потому одинакова на 3D и 2D микрочипах. Наблюдаемые прямая зависимость времени реакции от количества иммобилизуемых антител и обратная зависимость от концентрации антигена соответствуют теоретически ожидаемым.

3. Принудительное перемешивание образца на микрочипе позволяет ускорить реакцию, т.е. сократить время анализа в 4-4.5 раза, что весьма важно для практического применения микрочипов.

БЛАГОДАРНОСТИ

Приношу глубокую благодарность моим научным руководителям Рубиной Алле Юрьевне и Лившицу Михаилу Ароновичу и за доброжелательное руководство, всестороннюю помощь и внимание к работе. Я искренне признателен Зубцовой Жанне за помощь в разрешении некоторых теоретических аспектов, поддержку и участие. Марии Вадимовне Цыбульской, Екатерине Игоревне Дементьевой, Елене Савватеевой, Марине Филлиповой и Сергею Иванову за помощь в работе и дружеское участие. Также выражаю признательность Сергею Панькову, Кириллу Евсееву, Валентине Владимировне Чупеевой и Эдуарду Яковлевичу Крейндлину за подготовку микрочипов для проведения экспериментов; Александру Сергеевичу Заседателеву за помощь и поддержку.

Список литературы диссертационного исследования кандидат физико-математических наук Зубцов, Дмитрий Александрович, 2008 год

1. Livshits, М.А., Mirzabekov A.D. Theoretical analysis of the kinetics of DNA hybridization with gel-immobilized oligonucleotides II Biophys. J. (1996) 71, 2795-2801.

2. Kramer S., Joos Т.О., Templin M.F. Protein microarrays II Curr Protoc Protein Sci. 2005 Mar; 23:23.5.

3. Gamby J., Abid J.P, Tribollet В., Girault H.H. Nanomosaic Network for the Detection of Proteins Without Direct Electrical Contact II Small. 2008 Apr 17.

4. Yang S.T., Zhang X., Wen Y. Microbioreactors for high-throughput cytotoxicity assays И Curr Opin Drug Discov Devel. 2008 Jan; 11(1): 111-27.

5. Mitchell P. A perspective on protein microarrays II Nature Biotechnology Vol.20 march 2002 225-229

6. Templin M.F., Dieter Stoll, Monika Schrenk, Petra C.Traub, Christian F.Vohringer and Thomas O.Joos, Protein microarray technology H TRENDS in Biotechnology Vol.20 No.4 April 2002 160-166

7. MacBeath G. Protein microarrays and proteomics II Nature genetics supplement Vol.32 december 2002 526-532.

8. Lai S.P., Richard I.Cristopherson and Sristobal G.dos Remedios. Antibody arrays: an embryonic but rapidly growing technology 11 Drug Discovery Today Vol.7, No. 18 (Suppl.), 2002 143-149.

9. Abbot A. Betting on tomorrow's chips II Nature Vol 415 lOjanuary 2002 112114.

10. Mirzabekov A. D. and Alexander Kolchinsky. Emerging array-based technologies in proteomics И Current Opinion in Chemical Biology 2001, 6: 70-75.

11. Rubina A.Yu., Dementieva E.I., Stomakhin A.A., Darii E.L., Pan'kov S.V., Barsky V.E., Ivanov S.M., Konovalova E.V., A.D. Mirzabekov.

12. Hydrogel-based protein microchips: manufacturing, properties, and applications //BioTechniques. 34, 2003, 1008-1022.

13. Rubina A. Yu., Dyutova, E. I. Dementieva, A. A. Stomakhin, V. A. Nesmeyanov, E. V. Grishin, A. S. Zasedatelev Quantitative immunoassay of biotoxins on hydrogel-based protein microchips // Anal. Biochem. 340 (2005) 317-329

14. Rubina AY, Kolchinsky A, Makarov AA, Zasedatelev AS. Why 3-D? Gel-based microarrays in proteomics И Proteomics. 2008 Feb; 8 (4): 817-31

15. Angenendt P, Glokler J, Murphy D, Lehrach H, Cahill DJ Toward optimized microarrays: a comparison of current microarray support material II Anal. Biochem. 309, 2002, 253-260.

16. Service R.F. Searching for Recipes for protein chips II Science 294, (2001) 2080-2082

17. Beier M, J.D. Hoheisel. Versatile derivatization of solid support media for covalent bonding on DNA-microchips II Nucleic Acids Res.27 (1999) 19701977

18. Kodadek T. Protein microarrays: prospects and problems И Chemistry & Biology 8 (2001) 105-115.

19. Uetz P, Giot L, Cadney G, Mansfield ТА, Judson RS, Knight JR, Lockshon D, Narayan V, Srinivasan M, Pochart P. A comprehensive analysis of protein-protein interactions in Saccharomyces serevisiae II Nature 2000, 403: 623-627

20. Heng Zhu, Klemic JF, Chang S, Berton P, Casamayor A, Klemic KG, Smith D, Gerstein M, Reed MA, Snyder M. Analysis of yeast protein kinases using protein chips II Nat Genet 2000, 26: 283-289.

21. Moreno-Bondi Maria Cruz, Jean Pierre Alarie and Tuan Vo-Dinh. Multi-analyte analysis system using an antibody-based biochip II Analytical and Bioanalytical Chemistry October 2002

22. Haab B.B., Duhman M.J., Brown P.O. Protein microarrays for highly parallel detection and quantitation of specific protein and antibodies in complex solutions И Genom Biology 2001, 2(2) research 0004.1-0004.13.

23. Heng Zhu, Bilgin M, Bangham R, Hall D, Casamayor A, Bertone P, Lan N, Jansen R, Bidlingmaier S, Houfek T, Mitchell T, Miller P, Dean RA, Gerstein M, Snyder M. Global analysis of protein activities using proteome chips //Science 293 (2001)2101-5.

24. Wiesner A. Detection of tumor markers with ProteinChip technology II Curr Pharm Biotechnol. 2004 Feb;5(l):45-67

25. Belov L, de la Vega O, dos Remedios CG, Mulligan SP, Christopherson

26. RI. Immunophenotyping ofleukemias using a cluster of differentiation antibody microarray //Cancer Res. 2001 Jun 1;61(11):4483-9

27. Seong, S., Choi, C., 2003. Current status of protein chip development in terms of fabrication and application И Proteomics 3, 2176-2189.

28. Chang YJ , Hu CY, Yin LT, Chang CH, Su HJ. Dividable membrane with multi-reaction wells for microarray biochips И J Biosci Bioeng. 2008 Jul;106(l):59-64.

29. Uzawa H, Ito H, Neri P, Mori H, Nishida Y. Glycochips from polyanionic glycopolymers as tools for detecting Shiga toxins //Chembiochem. 2007 Nov 23;8(17):2117-24

30. Delehanty JB, Ligler FS. A microarray immunoassay for simultaneous detection of proteins and bacteria И Anal Chem. 2002 Nov l;74(21):5681-7.

31. Heyries KA, Loughran MG, Hoffmann D, Homsy A, Blum LJ, Marquette CA. Microfluidic biochip for chemiluminescent detection of allergen-specific antibodies //Biosens Bioelectron. 2008 Jul 15;23(12):1812-8. Epub 2008 Mar 7

32. Harwanegg С, Hutter S, Hiller R. Allergen microarrays for the diagnosis of specific IgE against components of cow's milk and hen's egg in a multiplex biochip-based immunoassay II Methods Mol Biol. 2007;385:145-57

33. Avseenko NV, Morozova TY, Ataullakhanov FI, Morozov VN. Immunoassay with multicomponent protein microarrays fabricated by electrospray deposition И Anal Chem. 2002 Mar l;74(5):927-33

34. Chen CS, Zhu H. Protein microarrays II Biotechniques. 2006 Apr;40(4):423, 425, 427

35. Kingsmore SF Multiplexed protein measurement: technologies and applications of protein and antibody arrays И Nat Rev Drug Discov. 2006 Apr;5(4):310-20

36. Elam JH, Nygren H, Stenberg M. Covalent coupling of polysaccharides to silicon and silicon rubber surfaces II J Biomed Mater Res. 1984 Oct;18(8):953-9.

37. Mansur HS, Orefice RL, Vasconcelos WL, Lobato ZP, Machado LJ.

38. Biomaterial with chemically engineered surface for protein immobilization IIJ Mater Sci Mater Med. 2005 Apr;16(4):333-40.

39. Angenendt P. Progress in protein and antibody microarray technology II Drug Discov Today. 2005 Apr 1;10(7):503-11

40. Flemming C, Gobel H, Wand H, Gabert A, Bock W. Synthesis and properties of immobilized enzymes. X. Covalent binding of polygalacturonase to insoluble carriers II Acta Biol Med Ger (1978) 37(2): 179-89.

41. Brockman A.H., Orlando R. New immobilization chemistry for probe affinity mass spectrometry II Rapid. Commun. Mass Spectrum. 1996, 10:1688-1692

42. Liao WH, Lee WC. Immobilization of enzymes on methacrylamide-based copolymers II Prep Biochem Biotechnol. 1997 Feb;27(l):39-46.

43. Nuzzo R.G., Allura D.L. Adsorption of bifunctional organic disulfides on gold surface //J. Amer. Chem. Soc. 1983, 105: 4481-4483.

44. Rusmini F, Zhong Z, Feijen J. Protein immobilization strategies for protein biochips II Biomacromolecules. 2007 Jun;8(6): 1775-89. Epub 2007 Apr 20

45. Frei E, Levy A, Gowland P, Noll M. Efficient transfer of small DNA fragments from polyacrylamide gels to diazo or nitrocellulose paper and hybridization И Methods Enzymol. 1983;100:309-26

46. Hermanson G.T. Bioconjugate Techniques // Acad. Press: San Diego, New York, Boston 1996.

47. Alwine JC, Kemp D J, Stark GR. Method for detection of specific RNAs in agarose gels by transfer to diazobenzyloxymethyl-paper and hybridization with DNA probes И Proc Natl Acad Sci USA. 1977 Dec;74(12):5350-5354.

48. Scott JE, Hughes EW, Shuttleworth A. An 'affinity' method for preparing polypeptides enriched in the collagen-associated Ehrlich chromogen II J Biochem (Tokyo). 1983 Mar;93(3):921-5.

49. Matsuura K, Akasaka T, Hibino M, Kobayashi K. Facile synthesis of stable and lectin-recognizable DNA-carbohydrate conjugates via diazo coupling II Bioconjug Chem. 2000 Mar-Apr; 11(2):202-11.

50. Liu XC, Scouten WH. (1996) Studies on oriented and reversible immobilization of glycoprotein using novel boronate affinity gel II J Mol Recognit., 9(5-6):462-467.

51. Pirrung M.C., Huang, C.Y. A general method for the spatially defined immobilization of biomolecules on glass surfaces using "caged" biotin. II Bioconjug Chem. 1996 May-Jun;7(3):317-21.

52. Clark EA, Golub TR, Lander ES, Hynes RO. Genomic analysis of metastasis reveals an essential role for RhoC II Nature. 2000 Aug 3;406(6795):466-7.

53. Lee S.H., Ruckenstein E. Adsorption of protein onto polymeric surfaces of different hydrophylicities — a case study with BSA II J. Colloid and Interface Sci 1988, 125:365-379.

54. Duncan RJ, Weston PD, Wrigglesworth R. A new reagent which may be used to introduce sulfhydryl groups into proteins, and its use in the preparation of conjugates for immunoassay II Anal Biochem. 1983 Jul l;132(l):68-73.

55. Peeters JM, Hazendonk TG, Beuvery EC, Tesser GI. Comparison of four bifunctional reagents for coupling peptides to proteins and the effect of the three moieties on the immunogenicity of the conjugates II J Immunol Methods. 1989 Jun 2;120(l):133-43.

56. Goff DA, Carroll SF. Substituted 2-iminothiolanes: reagents for the preparation of disulfide cross-linked conjugates with increased stability. II Bioconjug Chem. 1990 Nov-Dec;l(6):381-6.

57. Patel MP, Braden M. Cross-linking and ring opening during polymerization of heterocyclic methacrylates and acrylates И Biomaterials. 1989 May; 10(4):277-80.

58. Balcells M., Klee D., Fagry M., Hocker H. Quantitative assessment of protein adsorption by combination of ELISA with radioisotope-based studies //J. Colloid and Interface Sci 1988, 125:365-379.

59. Falsey JR, Renil M, Park S, Li S, Lam KS. Peptide and small molecule microarray for high throughput cell adhesion and functional assays II Bioconjug Chem. 2001 May-Jun;12(3):346-53.

60. Zhang G, Zhou Y, Wu X, Yuan J, Ren S. Covalent attachment of DNA to glass supports using a new silane coupling agent and chemiluminescent detection // J Tongji Med Univ. 2000;20(2):89-91.

61. Kulaev DV, Zuevsky W, Tsybulskaya MV Use of silica matrix for immunosorbent preparation И Artif. Organs (1987), v. 11, № 6, p. 503-504.

62. Хохлова ТД, Гаркавенко ЛГ, Никитин ЮС Адсорбция белков и ДНК на дегидроксилированных и алюминированных силохромах II Прикл. Биохим. Микробиол. (1991) 27(5):720-4.

63. Hong J, Xu D, Gong P, Ma H, Dong L, Yao S. Conjugation of enzyme on superparamagnetic nanogels covered with carboxyl groups II J Chromatogr В Analyt Technol Biomed Life Sci. 2007 Jan 19; Epub ahead of print

64. Turkova J, Petkov L, Sajdok J, Kas J, Benes MJ. Carbohydrates as a tool for oriented immobilization of antigens and antibodies II J Chromatogr., 500:585-593 (1990).

65. Lueking A., Horn M., Eickhov H., Bussow K., Lehrach H., Walter G.

66. Protein microarrays for gene expression and antibody screening И Anal. Biochem 1999, 270:103-111.

67. Macbeth G., Schreiber S.L. Printing proteins as microarrays for high-throughput function determination II Science 2000, 289: 1760-1763, Scena, 1998

68. Newman J.D., Turner A.P.F. Ink-jet printing for the fabrication of amperometric glucose biosensors II Anal. Chim. Acta. 1992, 262:13-17.

69. Blanchard A.P., Kaiser R.J., Hood L.E. High-density oligonucleotide arrays //Biosensors&Bioelectronics 1996, 11:687-69

70. Moerman R., Frank J., Marijnissen J.C.M., van Dedem G.W.K. Picoliter dispensing in wells of a micro-array by means of electrospraying // Journal of Aerosol Science 1999, 30:551-552

71. Moerman R., Frank J., Marijnissen J.C.M., Schalkhammer Т., van Dedem G.W.K. Miniaturized electrospraying as a technique for the production of reproducible micrometer-sized protein spots // Anal Chem. 2001, 73:2183-2189

72. Morozov V.N., Morozova T.Ya. Electrospray deposition as a method for mass fabrication of mono- and multi-component microarrays of biological and biologically active substance II Anal. Chem. 1999, 71:3110-3117.

73. Morozov V.N., Morozova T.Ya. Electrospray deposition as a method to fabricate functionally active protein films II Anal. Chem., 1999 71:14151420.

74. Kumar A., Whitesides G.M. Patterned Condensation Figures as Optical Diffraction Gratings //Appl. Phia. Lett. 1993, 63:2002.

75. Lahiri J., Ostuni E., Whitesides G.M. Patterning ligands on reactive SAMs microcontactprinting И Langmuir 1999, 15:2055-2060.

76. Arenkov P., Alexander Kukhtin, Anne Gemmel, Sergey Voloshchuk, Valentina Chupeeva and Andrei Mirzabekov. Protein microchips: use for immunoassay and enzymatic reactions II Analytical Biochemistry 278 (2000) 123-131.

77. Rubina A, Pan'kov SV, Ivanov SM, Dement'eva EI, Mirzabekov AD. Protein microchips //Dokl Biochem Biophys. 2001 Nov-Dec;381:419-22

78. Мирзабеков А.Д., Рубина А.Ю., Паньков С.В., Чернов Б.К. Способ иммобилизации олигонуклеотидов, содержащих непредельные группы, в полимерных гелях при формировании микрочипа // Патент N 2175972, 20 ноября 2001 (Б.И. 2001, N 25).

79. Мирзабеков А.Д., Рубина А.Ю., Паньков С.В. Способ полимеризаъ^ионной иммобилизации биологических макромолекул и композиция для его осуществления II Патент РФ N 2216547.

80. V.A. Vasiliskov, E.N. Timofeev, S.A. Surzhikov, A.L. Drobyshev, V.V. Shick, and A.D. Mirzabekov. Fabrication of microarray of gel-ommobilized compounds on a chip by co-polymerization И BioTechniques 1999 27:592606.

81. Drobyshev, A., Mologina, N., Shick, V., Pobedimskaya, D., Yershov, G. & Mirzabekov, A. Sequence analysis by hybridization with oligonucleotide microchip: identification ofbeta-thalassemia mutations II Gene 188, (1997) 45-52.

82. Strizhkov B.N., Drobyshev, A.L., Mikhailovich, V.M., & Mirzabekov, A.D. PCR amplification on a microarray of gel-immobilized oligonucleotides:

83. Detection of bacterial toxin- and drug-resistant genes and their mutations II BioTechniques 29 No4 (2000) 844-857

84. Krylov A.; Zasedateleva, O.; Prokopenko D.; Rouviere-Yaniv, J.; Mirzabekov A. Massive parallel analysis of the binding specificity of HU protein with ss and ds DNA on generic oligonucleotide microchips II Nucl. Acids Res. 29 2001 2654-2660

85. Timofeev, E. & Mirzabekov, A. Binding specificity and stability of duplexes formed by modified oligonucleotides with a 4,096-hexanucleotide microarray //Nucl. Acids Res. 29 (12) (2000) 2626-2634

86. Dubiley S., Kirillov, Eu., & Mirzabekov, A. Polymorphism analysis and gene detection by minisequencing on an array of gel-immobilized primers II Nucl. Acids Res. 27, el9

87. Tillib S., Strizhkov В., & Mirzabekov A. Integration of multiple PCR amplification and DNA mutation analyses by using oligonucleotide microchip //Analyt. Biochem. 292 (2001) 155-160.

88. Gryadunov D., Mikhailovich V., Noskov A., Lapa S., Sobolev A., Pan'kov S., Rubina A., Zasedatelev A., & Mirzabekov A. Detection of Bacillusanthracis using multiplex PCR on the oligonucleotide biochip II Dokl. Biochem. Biophys. 381 (2001) 384-386

89. Nasedkina Т.; Domer, P.; Zharinov, V.; Hoberg, J.; Lysov, Yu.; Mirzabekov, A. Identification of chromosomal translocation in leukemias by hybridization with oligonucleotide microarrays II Haematologica 87 (4) (2002) 363-372

90. Дементьева Е.И., Рубина А.Ю., E.JI. Дарий, С.М., Дюкова В.И., ЗаседателевА.С., Мирзабеков А.Д. 2004. Применение белковых микрочипов для количественного определения опухолеассоциированных маркеров II Докл. Акад. Наук. 395,542-547.

91. Dyukova VI, Dementieva EI, Zubtsov DA, Galanina OE, Bovin NV, Rubina AY. Hydrogel glycan microarrays // Anal Biochem. 2005 Dec 1;347(1):94-105. Epub 2005 Sep 27

92. Kusnezow W, Syagailo YV, Goychuk I, Hoheisel JD, Wild DG. Antibody microarrays: the crucial impact of mass transport on assay kinetics and sensitivity II Expert Rev Mol Diagn. 2006 Jan;6(l): 111-24

93. Williams, J.C., Jr., Mark, L.A., Eichholtz, S. Partition and permeation of dextran in polyacrylamide gel II Biophys. J. 75, (1998) 493-502.

94. Pluen, A., Netti, P.A., Jain, R.K., Berk, D.A. Diffusion of macromolecules in agarose gels: comparison of linear and globular configurations II Biophys. J. (1999) 77, 542-552.

95. Ramanujan, S., Pluen, A., McKee, T.D., Brown, E.B., Boucher, Y., Jain, R.K. Diffusion and convection in collagen gels: implications for transport in the tumor interstitium II Biophys. J. (2002) 83, 1650-1660

96. Sorokin, N.V., Chechetkin, V.R., Livshits, M.A., Vasiliskov, V.A., Turygin, A.Y., Mirzabekov, A.D. Kinetics of hybridization on the oligonucleotide microchips with gel pads II J. Biomol. Struct. Dynamics (2003)21,279-288.

97. Bhanot, G., Louzoun, Y., Zhu, J., DeLisi, C. The importance of thermodynamic equilibrium for high throughput gene expression arrays I I Biophys. J. (2003) 84, 124-135.

98. Gadgil, C., Yeckel, A., Derby, J.J., Hu, W.-S. A diffusion-reaction model for DNA microarray assays II Journal of Biotechnology (2004)114, 31-45.

99. Kusnezow W, Syagailo YV, Ruffer S, Klenin K, Sebald W, Hoheisel JD, Gauer C, Goychuk I. Kinetics of antigen binding to antibody microspots: strong limitation by mass transport to the surface //Proteomics. 2006 Feb;6(3):794-803

100. Yuen P.K., Li G., Bao Y, Muller U.R. Microfluidic devices for fluidic circulation and mixing improve hybridization signal intensity on DNA arrays И Lab Chip. (2003) 3, 46-50

101. Rida A, Gijs MA. Manipulation of self-assembled structures of magnetic beads for microfluidic mixing and assaying II Anal Chem. 2004 Nov l;76(21):6239-46.

102. M. Noerholm, H. Bruus. Polymer microfluidic chip for online monitoring ofmicroarray hybridizations И Biology and Bioeng. (2004) 28-37

103. S.J.Schaupp, et. all Active mixing during hybridization improves the accuracy and reproducibility of microarray results II Biotechniques (2005) 38: 117-11

104. Wiegel, W.F. Fluid Flow Through Porous Macromolecular Systems II Springer-Verlag, Berlin. 1980

105. Heleg-Shabtai V, Gratziany N, Liron Z. On-chip integrated hydrolysis, fluorescent labeling, and electrophoretic separation utilizedfor acetylcholinesterase assay II Anal Chim Acta. 2006 Jul 7;571(2):228-34. Epub 2006 May 9

106. Fu LM, Yang RJ, Lin CH, Chien YS A novel microfluidic mixer utilizing electrokinetic driving forces under low switching frequency //Electrophoresis. 2005 May;26(9): 1814-24

107. Oddy, M.H., Santiago, J.G., Mikkelsen, J.C. Electrokinetic instability micromixing II Anal. Chem. (2001) 73, 5822-5832.

108. Chatrathi MP, Collins GE, Wang J. Microchip-based electrochemical enzyme immunoassays ,// Methods Mol Biol. 2007;385:215-24.

109. Toegl, A., Kirchner, R., Gauer, C., Wixforth, A. Enhancing results of microarray hybridization through microagitation II J. Biomol. Techn. (2003) 14, 197-204.

110. Sahirai, M., Flow and Transport in Porous Media and Fractured Rock II VCH, Weinheim. 1995

111. Fatin-Rouge N, Starchev K, Buffle J. Size effects on diffusion processes within agarose gels II Biophys J. 2004 May;86(5):2710-9.