Клинико-эпидемиологическая характеристика клещевого риккетсиоза, вызываемого Rickettsia heilongjiangensis на Дальнем Востоке России тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.00.30, кандидат медицинских наук Медянников, Олег Юрьевич

• Медянников, Олег Юрьевич
• кандидат медицинских наук
• 2004

Оглавление диссертации кандидат медицинских наук Медянников, Олег Юрьевич

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ 6 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. РИККЕТСИОЗЫ ГРУППЫ КЛЕЩЕВОЙ

ПЯТНИСТОЙ ЛИХОРАДКИ

1. Характеристика риккетсиозов группы клещевой пятнистой лихорадки

2. Иксодовые клещи как переносчики заболеваний человека

3. Молекулярно-биологический подход к идентификации микроорганизмов, диагностике инфекционных заболеваний и изучению эпидемиологии трансмиссивных инфекций

4. Генетические подходы к филогенетическим исследованиям, эволюции микроорганизмов

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

ГЛАВА I. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

1. Материалы исследования

2. Методы исследования

2.1. Эпидемиологические

2.2.Статистические

2.3. Клинико-лабораторные

2.4.Серологические

2.5. Зоолого-паразито логические

2.6.Молекулярно-биологические (генетические)

2.6.1. Забор материалов для исследований

2.6.2. Выделение ДНК из фибринового сгустка и кожных биоптатов

2.6.3. Выделение ДНК из иксодовых клещей

2.6.4. Разработка модификаций ПЦР

2.6.5. Методика ПЦР

2.6.6. Секвенирование ампликонов

2.6.7. Филогенетические исследования

ГЛАВА II. ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА КЛЕЩЕВОГО РИККЕТСИОЗА

1. Эпидемиологическая характеристика клещевого риккетсиоза в Российской Федерации

2. Географическое положение, природные условия и население Хабаровского края

3. Эпидемиологические особенности клещевого риккетсиоза в Хабаровском крае

4. Сравнение эпидемиологии клещевого риккетсиоза в Хабаровском крае и регионах Сибири и Забайкалья

5. Эпидемиологическая характеристика группы больных клещевым риккетсиозом, диагноз у которых подтвержден обнаружением ДНК Rickettsia heilongjiangensis

ГЛАВА III. ИССЛЕДОВАНИЕ ПЕРЕНОСЧИКОВ КЛЕЩЕВОГО РИККЕТСИОЗА

1. Идентификация иксодовых клещей

2. Результаты обследования потенциальных очагов клещевого риккетсиоза

3. Результаты молекулярно-биологического обследования иксодовых клещей

ГЛАВА IV. СЕРОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ В ИЗУЧЕНИИ ЭТИОЛОГИИ КЛЕЩЕВОГО РИККЕТСИОЗА В ХАБАРОВСКОМ КРАЕ

ГЛАВА V. МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ В

ИЗУЧЕНИИ ЭТИОЛОГИИ КЛЕЩЕВОГО РИККЕТСИОЗА В

ХАБАРОВСКОМ КРАЕ

ГЛАВА VI. КЛИНИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА НОВОГО РИККЕТСИОЗА ИЗ ГРУППЫ КЛЕЩЕВОЙ ПЯТНИСТОЙ

ЛИХОРАДКИ

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

ВЫВОДЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Клинико-эпидемиологическая характеристика клещевого риккетсиоза, вызываемого Rickettsia heilongjiangensis на Дальнем Востоке России»

Последние десятилетия XX века характеризуются активизацией эпидемического проявления природно-очаговых риккетсиозов, объединяемых в группу клещевой пятнистой лихорадки (КПЛ) в различных регионах мира (27, 108, 117). Риккетсиозы являются важной проблемой инфекционной патологии многих стран, в том числе и России (23, 26, 108). За последние годы описано несколько заболеваний, вызываемых ранее неизвестными риккетсиями. Яркими примерами являются астраханская пятнистая лихорадка, японская пятнистая лихорадка, клещевая пятнистая лихорадка островов Флиндерса, а также риккетсиозы, вызываемые Rickettsia slovaca, Rickettsia aeschlimannii, Rickettsia parkeri. Эти заболевания либо ранее не регистрировались, либо принимались за инфекции другой этиологии.

Методы, предлагаемые молекулярной биологией, прежде всего полимеразная цепная реакция и секвенирование нуклеиновых кислот, позволили не только с высокой чувствительностью и точностью характеризовать генетический материал микроорганизмов, но и в ряде случаев выявлять возбудителей новых инфекционных заболеваний (53, 87). Значительно облегчилась задача определения инфекционной причины заболеваний с ранее неизвестной этиологией (51, 111), достигнут значительный прогресс в решении генеральных вопросов эволюции живых организмов, например происхождения эукариотической клетки (58, 72, 138, 140). Молекулярно-биологические методы стали особенно актуальными в отношении риккетсий, поскольку микроорганизмы, относящиеся к порядку Rickettsials, являются облигатными внутриклеточными паразитами, неспособными расти на искусственных питательных средах. Заболевание, носящее аббревиатуру TIBOLA (tick-borne lymphadenopathy), и встречающееся в Венгрии, Испании, Словакии и Франции, вызывается Rickettsia slovaca. Это было неоднократно доказано при амплификации ДНК этого микроорганизма, ранее выделенного в чистой культуре из клещей, из материалов от больных людей (аспираты лимфоузлов, кровь, кожный биоптат) (102, 107). Чистой культуры возбудителя от человека, однако, получено до сих пор не было, а диагноз устанавливается серологически и при обнаружении в ПЦР генов этой риккетсии в материалах от больных людей. Аналогично этому в Южной Африке было описано заболевание, вызываемое Rickettsia aeschlimannii (99, 106). Оно было доказано у нескольких больных в результате амплификации (с последующим секвенированием полученных ампликонов) в ПЦР генов этой риккетсии в материалах от больных людей.

Применение «золотого стандарта» идентификации причины инфекционного заболевания (77, 113), а именно выделение чистой культуры возбудителя, в риккетсиологии является сложным и не всегда достижимым. Другие способы установления этиологического диагноза в риккетсиологии также не всегда достоверны. Серологический метод не является достаточно точным, поскольку для риккетсий характерны множественные и выраженные перекрестные серологические реакции, как между собой, так и с совершенно неродственными микроорганизмами, например Proteus spp. и Legionella spp. (78, 105, 137). Клинико-лабораторная картина заболевания зачастую вариабельна и не имеет выраженных опознавательных критериев для каждого конкретного риккетсиоза (78). Таким образом, амплификация генов риккетсий в материалах из различных тканей и сред организма человека с последующим секвенированием ампликонов для видовой идентификации оказалась ценным методом установления диагноза в риккетсиологии.

Одним из первых описанных в СССР риккетсиозов человека, передаваемых иксодовыми клещами, является клещевой сыпной тиф Северной Азии (клещевой риккетсиоз, клещевой сыпной тиф), активные эндемические очаги которого распространены в азиатской части Российской Федерации. Начиная с 30-х годов прошлого века отмечали периоды роста и снижения заболеваемости, однако за период с 1979 по 1997 гг. в Российской Федерации выявлено 23980 случаев этой инфекции с ростом заболеваемости более чем в 8 раз (34). Показатели заболеваемости также увеличиваются и в 2001 году составили 2,38 на 100 тыс. населения. Это может быть объяснено как ростом активности очагов клещевого сыпного тифа, так и интенсификацией природопользования и контактов человека с природными очагами и улучшением диагностики.

Выделение возбудителя клещевого сыпного тифа Северной Азии, Rickettsia sibirica, произошло в Восточной Сибири в 1937-1939 гг. После этого все острые инфекционные заболевания, клинически, эпидемиологически и серологически (в РСК с растворимым антигеном Rsibirica) соответствующие клещевому сыпному тифу в Сибири и на Дальнем Востоке России, традиционно относили к этому заболеванию. Немногочисленные штаммы риккетсий из дальневосточного региона, также отнесенные к R. sibirica, были утрачены.

Еще с середины прошлого века исследователи отмечали отличия клинико-эпидемиологических показателей заболевания, считавшегося клещевым сыпным тифом Северной Азии на Дальнем Востоке России, от заболевания в классических очагах клещевого риккетсиоза Северной Азии в Центральной Сибири (15, 29). Пик заболеваемости в Хабаровском крае возникал в июне-июле, что на два месяца позднее, чем, например, в Алтайском крае, среди заболевших отмечалось большое количество лиц пожилого возраста, яркость сыпи выражена меньше (29). Были выявлены также и отличия в микробиологических свойствах возбудителя, выделенного на Дальнем Востоке, такие как меньшая вирулентность для лабораторных животных, размножение риккетсий в ядрах 50-60% пораженных клеток, низкие титры антител к антигену ОХ-19 при заражении кроликов, неполная нейтрализация токсического вещества риккетсий в перекрестной реакции между приморскими и эталонными штаммами (22, 32). Тем не менее, выделенные в Приморском крае штаммы также были отнесены к R. sibirica. Нужно отметить, что методы исследования, применявшиеся в то время, не позволяли провести четкую видовую дифференциацию риккетсий.

Соответственно этому, применявшиеся методы диагностики, прежде всего серологической, клещевого сыпного тифа на Дальнем Востоке основывались на принятом мнении об этиологии заболевания. Для диагностики заболевания у человека использовали растворимый (группоспецифический) антиген, приготовленный из штамма «Нецветаев» R. sibirica. Подтверждение клинического диагноза клещевого сыпного тифа Северной Азии на Дальнем Востоке с помощью серологических методов при исследовании с антигенами R. sibirica колебалось в различных исследованиях от 53 до 95% (11).

Указанные особенности и различия клинико-эпидемиологических признаков клещевого риккетсиоза на Дальнем Востоке Российской Федерации по сравнению с регионами Сибири послужили поводом для подробного изучения этиологии клещевого риккетсиоза в этом регионе. В прилежащих районах Китая в последние годы было выделено несколько новых штаммов риккетсий (59, 135, 142). Большинство штаммов оказалось идентичными Rickettsia sibirica, однако некоторые штаммы были идентифицированы как новые виды. Одним из таких штаммов является штамм 054 или Rickettsia heilongjiangensis, выделенный из клещей Dermacentor silvarum в северной провинции Хэйлунцзян КНР, непосредственно граничащей с Хабаровским краем. Наличие антител в сыворотках переболевших людей в Китае предполагает патогенность этого штамма для человека (79).

Цель работы: дать клинико-эпидемиологическую характеристику и изучить этиологию клещевого риккетсиоза на Дальнем Востоке Российской Федерации.

В соответствии с целью поставлены следующие задачи исследования:

1. Провести оценку эпидемиологической ситуации по клещевому риккетсиозу в Хабаровском крае РФ и выявить ее особенности по сравнению с регионами выделения классических штаммов R.sibirica',

2. Обследовать стандартными методами больных острыми инфекционными заболеваниями, связанными с присасыванием иксодовых клещей, и дать им эпидемиологическую и клиническую характеристику;

- 103. Провести исследование сывороток больных на наличие антител к антигенам риккетсий группы пятнистой лихорадки {Rickettsia sibirica; Rickettsia heilongjiangensis; Rickettsia conorii) в РНИФ с корпускулярным антигеном.

4. Разработать тест-систему на основе ПНР для определения ДНК риккетсий в материалах с потенциально низким ее содержанием. Полученные ампликоны при последующем секвенировании должны позволять точно идентифицировать вид риккетсии;

5. Исследовать разработанным методом материалы от больных (ДНК, выделенную из крови и биоптата первичного аффекта), идентифицировать полученные при ПЦР результаты при помощи секвенирования ампликонов для определения этиологии риккетсиальной инфекции в Хабаровском крае.

6. Дать характеристику выявленным бактериальным агентам методом построения филогенетического дерева.

7. Провести эпидемиологическое обследование природных очагов клещевого риккетсиоза, исследовать собранных в очагах и с больных иксодовых клещей молекулярно-биологическими методами для выяснения их инфицированности и определения вида риккетсий.

Научная новизна

Проведенное исследование позволило выявить этиологический агент клещевого риккетсиоза на Дальнем Востоке Российской Федерации. Молекулярно-биологическими методами у больных клинически диагностированным клещевым риккетсиозом выявлены гены Rickettsia heilongjiangensis, что является доказательством того, что именно этот микроорганизм является возбудителем клещевого риккетсиоза. Этот микроорганизм был выделен в 90-х годах 20-го века из клещей Dermacentor silvarum в прилежащей к Хабаровскому краю провинции Китая. Патогенность этого штамма для человека оставалась недостаточно доказанной. Среди широкой выборки с помощью молекулярно-биологических методов выявлено 18 больных клещевым риккетсиозом, а серологическими методами - 52 больных. Описана клиническая картина этого заболевания. Предложено название для этого риккетсиоза группы клещевой пятнистой лихорадки: «дальневосточный клещевой риккетсиоз».

Вследствие клинического сходства с другими риккетсиозами группы КПЛ и серологических перекрестных реакций это заболевание ранее принималось за, клещевой сыпной тиф Северной Азии, распространенный в Сибири и на Алтае.

Установлено, что основным переносчиком дальневосточного клещевого риккетсиоза являются иксодовые клещи Haemaphysalis concinna,. инфицированность которых в изучаемых биотопах составила 28,13%. Клещи вида Haemaphysalis japonica douglasi также могут являться переносчиками дальневосточного клещевого риккетсиоза, инфицированность достигает 4,48%.

Изучены эпидемиологические особенности как в группе официально регистрируемого клещевого риккетсиоза, так и в группе больных с диагнозом риккетсиоза, подтвержденным молекулярно-биологическими методами. Выявленные особенности совпадали в обеих группах и оказались следующими: преобладание среди заболевших лиц старших возрастных групп, пик заболеваемости в конце июня-июле.

Впервые было проведено сравнение взаимодействия сывороток больных дальневосточным клещевым риккетсиозом с антигенами различных риккетсий, в том числе его этиологического агента {Rickettsia heilongjiangensis) и антигена возбудителя клещевого сыпного тифа Северной Азии {Rickettsia sibirica). Поскольку для риккетсий группы КПЛ характерны выраженные перекрестные серологические реакции, исследованные сыворотки реагировали не только с антигеном R. heilongjiangensis, но также и с антигенами других риккетсий, в т.ч. R. sibirica и R. conorii, однако, как правило, в меньшем разведении. Растворимый антиген Rickettsia sibirica в настоящее время применяется в практическом здравоохранении для диагностического исследования сывороток больных клещевым риккетсиозом в Хабаровском крае, что, возможно, объясняет невысокую частоту положительных серологических реакций при исследовании сывороток больных дальневосточным клещевым риккетсиозом.

Разработана модификация ПЦР с использованием «гнездовых» праймеров на основе гена цитрат-синтазы (gltA) риккетсий. Она позволяет обнаруживать генетический материал любых риккетсий в клиническом материале и клещах.

Впервые секвенированы и помещены в базу генетических данных GenBank гены отрВ типовых штаммов Rickettsia heilongjiangensis и Rickettsia hulinensis. Были выявлены и при согласовании с авторами (J.Z. Zhang и др.) исправлены неточности в опубликованных в GenBank нуклеотидных последовательностях генов gltA и отрА Rickettsia heilongjiangensis.

В клещах Haemaphysalis japonica douglasi впервые была обнаружена ДНК Candidatus Rickettsia tarasevichiae.

Впервые выявлена ДНК новой риккетсии, генетически значительно отличающейся от всех известных видов. Она была обнаружена в клещах Haemaphysalis japonica douglasi. Риккетсии дано предварительное название Candidatus Rickettsia principis.

Научно-практическая ценность и реализация результатов работы

Полученные данные свидетельствуют о том, что заболевание, традиционно считавшееся на Дальнем Востоке Российской Федерации клещевым сыпным тифом Северной Азии, вызывается не Rickettsia sibirica, а недавно описанной Rickettsia heilongjiangensis. Поскольку было обнаружено, что возбудитель клещевого риккетсиоза на Дальнем Востоке отличается от микроорганизма, традиционно считавшегося этиологическим агентом этого давно известного заболевания, предлагается ввести новую нозологическую единицу: «дальневосточный клещевой риккетсиоз», относящийся к группе КПЛ и вызываемый Rickettsia heilongjiangensis.

Организациям практического здравоохранения рекомендуется включить обследование на дальневосточный клещевой риккетсиоз в комплекс лабораторных обследований заболевших после присасывания клеща.

Идентификация возбудителя дальневосточного клещевого риккетсиоза предоставляет возможность проводить специфическую диагностику. Антиген

Rickettsia sibirica, который используется в диагностике заболевания до настоящего времени, является группоспецифичным. Корпускулярный антиген этиологического агента болезни {Rickettsia heilongjiangensis) позволяет проводить принципиально более точную диагностику, поэтому именно его следует применять для проведения серологических исследований в эндемичных очагах.

Разработана чувствительная и специфичная модификация ПЦР на ген цитрат-синтазы риккетсий с использованием «гнездовых» праймеров. Она может применяться как в клинической диагностике, так и в научно-исследовательской работе.

Исследование биоптатов первичных аффектов на наличие ДНК риккетсий является значительно более успешным, чем исследование фибриновых сгустков. Это позволяет рекомендовать для клинических реакций использовать материалы биоптатов первичного аффекта.

Апробация работы.

Материалы диссертации представлены на:

• Конференции общества инфекционистов Хабаровского края, г. Хабаровск, 2001 г.

• Краевом конкурсе молодых ученых, секции работ по медицине, г. Хабаровск, 2001 г.

• Конференции отдела эпидемиологии ГУ НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи РАМН, г. Москва, 2002 г.

• Научных конференциях справочного центра ВОЗ, лаборатории риккетсиозов Средиземноморского университета, г. Марсель, 2003, 2004 гг.

• 14-м ECCMID, Прага, 2004 г.

По материалам диссертации опубликовано 7 научных работ, в базу генетических данных GenBank внесено 6 отдельных позиций.

Диссертация апробирована на совместной научной конференции отделов эпидемиологии и природно-очаговых болезней ГУ НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи РАМН 21 апреля 2004 года.

- 15

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКАЯ И КЛИНИКО-ЛАБОРАТОРНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РИККЕТСИОЗОВ ГРУППЫ КЛЕЩЕВОЙ ПЯТНИСТОЙ ЛИХОРАДКИ.

МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ ПОДХОДЫ К ИДЕНТИФИКАЦИИ, КЛАССИФИКАЦИИ И ФИЛОГЕНЕТИКЕ РИККЕТСИЙ

Характеристика риккетсиозов группы клещевой пятнистой лихорадки

Риккетсиозами называются заболевания, вызываемые облигатными внутриклеточными бактериями из семейства Rickettsiaceae порядка Rickettsials группы альфа-протеобактерий (23, 24, 95, 108). За исключением эпидемического сыпного тифа, крысиного сыпного тифа, осповидного риккетсиоза, лихорадки цуцугамуши и заболевания, вызываемого Rickettsia felis, переносчиками и во многих случаях доказанными резервуарами и переносчиками этих инфекционных заболеваний являются иксодовые клещи. Первым риккетсиозом человека, трансмиссивный механизм передачи которого был расшифрован, является пятнистая лихорадка Скалистых гор. В 1909 г. Н. Ricketts, в честь которого позднее будет назван и род, и вид возбудителя этой болезни, опубликовал данные о роли клеща Dermacentor andersonii в передаче пятнистой лихорадки Скалистых гор (112).

До середины 70-х годов XX века было известно только четыре клещевых трансмиссивных заболевания, вызываемых риккетсиями: пятнистая лихорадка Скалистых гор (R.rickettsii), марсельская (средиземноморская) лихорадка {R.conorii), клещевой сыпной тиф Северной Азии (R.sibirica) и квинслендский клещевой тиф {R.australis), (Табл.1). Однако за последнюю четверть века были описаны трансмиссивные заболевания, вызываемые следующими риккетсиями: Rickettsia "mogolotimonae", Rickettsia honei, Rickettsia conorii subsp. israelii и subsp. caspiensis, Rickettsia africae, Rickettsia slovaca, Rickettsia helvetica, Rickettsia japonica, Rickettsia aeschlimannii, Rickettsia parkeri (88, 102, 108).

Доказательство этиологической причины риккетсиозов всегда вызывало значительные трудности, прежде всего из-за сложностей в выделении чистой культуры возбудителя и перекрестных серологических реакций. В последние десятилетия развитие новых методов выделения микроорганизмов, таких как «shell-vial technique», а также молекулярно-биологических методов, привело к. описанию многих новых заболеваний, вызываемых риккетсиями. В таблице .1 сгруппированы данные обо всех известных на настоящий момент риккетсиозах человека.

Одним из наиболее ярких примеров таких заболеваний является Астраханская пятнистая лихорадка. На территории России с начала 80-х годов в Астраханской области стали отмечать ранее неизвестную лихорадку с пятнистой сыпью. И.В. Тарасевич было высказано предположение о риккетсиозной природе этого заболевания, которое позднее было подтверждено в лаборатории экологии риккетсий НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи (25, 131). Выделенные от больных штаммы (80) были идентифицированы как риккетсии группы пятнистой лихорадки. Позднее при комплексном исследовании выделенного микроорганизма, прежде всего на основании эволюционно-филогенетических исследований, было высказано предположение о близости выделенной риккетсии к возбудителю марсельской лихорадки R.conorii (56). Недавно было сделано предложение об объединении на основании генетических критериев возбудителей марсельской лихорадки, Астраханской пятнистой лихорадки и пятнистой лихорадки Израиля в комплекс R.conorii с соответствующим выделением нескольких подвидов, в том числе и Rickettsia conorii subsp. caspiensis, возбудителя Астраханской пятнистой лихорадки (63).

Японская пятнистая лихорадка была впервые описана у двух пациентов в 1984 году (81). Заболевание по клинической картине напоминало клещевые риккетсиозы, а вскоре выделенный от больных штамм был охарактеризован как новая риккетсия - Rickettsia japonica (132).

Новый риккетсиоз был выявлен также на небольшом острове Флиндерса, который находится близ северной оконечности Тасмании. Единственный врач на этом острове, доктор Стюарт, описал 26 случаев острого инфекционного заболевания за 12 лет (127). Заболевание было сезонным и протекало с лихорадкой, сыпью и тромбоцитопенией. Особенности клинико-лабораторной картины свидетельствовали о том, что это заболевание отличалось от известного на тот период в Австралии клещевого тифа Северного Квинсленда. Позднее было доказано, что выделенные от больных штаммы риккетсий принадлежат к новому виду, названному Rickettsia honei (43, 44).

Африканская клещевая лихорадка была открыта дважды. Вначале в 30-х годах прошлого века в Южной Африке A. Pijper описал легко протекающее заболевание, возникающее вследствие присасывания клещей (97). Он же выделил на морских свинках этиологический агент этой болезни и доказал его отличие от возбудителя марсельской лихорадки (98). Его последователь, однако, выделил из клещей рода Rhipicephalus возбудителя марсельской лихорадки, R.conorii, и связал это с описанным заболеванием. В связи с этим до 90 годов прошлого века считалось, что в Африке распространен вариант марсельской лихорадки. Лишь в 1990 году из клещей рода АтЫуотта была выделена новая риккетсия, R.africae. На основании совокупности факторов (большая инфицированность клещей риккетсиями, принципиально более частое нападение этих клещей на человека по сравнению с Rhipicephalus, серологические данные, полученные от больных людей) была доказана роль этой риккетсии как основной причины клещевых риккетсиозов на юге Африки.

Выделенная из кошачьих блох Ctenocephalides felis в Калифорнии новая риккетсия, позднее названая Rickettsia felis (74), вначале не считалась патогенной для человека (100). Однако после того как ДНК данного микроорганизма была амплифицирована из материалов от человека, больного сходным с крысиным сыпным тифом заболеванием (122), этот микроорганизм был признан возбудителем заболевания человека.

Совершенно недавно еще две риккетсии группы КПЛ присоединили к кругу патогенных. Это Rickettsia aeschlimannii, выделенная от африканских клещей более 6 лет назад, и Rickettsia parkeri, клещевой изолят которой известен с 1939 года. Оба этих микроорганизма были идентифицированы в качестве этиологических агентов заболеваний, клинически сходных с риккетсиозами группы КПЛ. В последнем случае был также получен изолят от человека (94, 101). Инфекция, вызванная Rickettsia aeschlimannii, была идентифицирована на основании данных клинико-эпидемиолгических, серологических и молекулярно-биологических исследований (99, 106)

Открытие Rickettsia sp. «mongolotimonae» {Rickettsia sibirica, штамм «mongolotimonae») связано с необычной историей. Возбудитель, описанный сначала как «Rickettsia mongolotimonae», был выделен из двух совершенно разных источников - клещей Hyalomma asiaticum (142), собранных во Внутренней Монголии (КНР) и от больного клинически нетяжелым заболеванием в Марселе (Франция) (104). Было предположено, что больной подвергся нападению клеща, принесенного во Францию из Китая перелетными птицами, в то время, когда он собирал компост в саду, где отдыхали птицы. В Китае заболевание человека, вызванное этим микроорганизмом, до сих пор не было доказано.

Rickettsia slovaca была впервые выделена в Чехословакии в 1968 г. (48) из клещей Dermacentor marginatus, а позднее - во Франции, Армении, Португалии, Швейцарии, России. Документировано уже несколько десятков случаев этой инфекции, вызываемой данным микроорганизмом. Он вызывает острое трансмиссивное лихорадочное заболевание, протекающее, как правило, без сыпи и с выраженной лимфаденопатией (102, 107). Это заболевание было названо «клещевая лимфаденопатия» (tick-borne lymphadenopathy, TIBOLA). Примечательно, что заболевание было доказано без выделения от человека чистой культуры возбудителя. Доказательство было построено на основании серологических и молекулярно-биологических методов. Из организма человека (кровь, пунктат лимфоузла, биоптат первичного аффекта) были амплифицированы фрагменты ДНК возбудителя, что и послужило доказательством этиологической роли Rickettsia slovaca в этом заболевании. Амплификация ДНК была успешной только у 25% в целом, причем, при исследовании кожных биоптатов и пунктатов лимфатических узлов частота получения положительных результатов была выше (102, 107).

Rickettsia helvetica была впервые выделена из клещей Ixodes ricinus в Швейцарии в 1979 году (49). Она считалась непатогенной для человека до 1999 года, когда в Швеции были описаны два клинических случая смертельного перимиокардита у молодых пациентов. В обоих случаях при помощи ПЦР с последующим секвенированием материалов от больных, электронной микроскопии и серологических исследований было доказано, что именно этот микроорганизм вызвал летальные заболевания (88). Позднее описано еще несколько клинических случаев этой инфекции, протекающей в виде лихорадочного заболевания без специфических симптомов (62).

В исследованном нами регионе, Хабаровском крае, традиционно единственным риккетсиозом группы КПЛ считается клещевой сыпной тиф Северной Азии, вызываемый R.sibirica.

В 1936 году Е.И. Милль опубликовал данные о наблюдаемых им с 1932 года в Приморье случаях острого заболевания, эпидемиологически связанного с присасыванием клещей и клинически сходного с другими риккетсиозами группы КПЛ (17). В 1936-1937 гг. Н.И. Антонов и А.Г. Найштат регистрировали подобное заболевание у людей, проживающих в верхнем и среднем течении р. Амур и пойме р. Уссури (1). В 1939 году М.Д.Шматиков и М.А.Велик описали 13 случаев заболевания клещевой лихорадкой в Красноярском крае (33). После этого, несмотря на приоритет описания заболевания, проведение основных исследований сместилось в районы центральной Сибири, видимо, вследствие более высокой плотности населения и заболеваемости, а также географической близости к центральным исследовательским институтам. В 1938-1945 гг. в Сибири клещевые лихорадки детально изучались комплексными экспедициями под руководством Е.Н. Павловского, М.К. Кронтовской, П.А. Петрищевой. Большая работа по изучению эпидемиологии, этиологии риккетсиозов, микробиологических, генетических, иммунологических свойств патогенных и непатогенных риккетсий продолжает вестись в Омском НИИ природно-очаговых инфекций (21,31, 34, 37, 45, 117, 124, 125). Первые штаммы риккетсий от больных и клещей, позднее описанные как Rickettsia sibirica, были получены из Красноярского края (12) и Дальнего Востока (13). В 1943 г. Е.П. Савицкая пришла к выводу об идентичности изучаемых ей штаммов риккетсий, выделенных близ Биробиджана, возбудителю клещевого сыпного тифа Центральной Сибири (20). К сожалению, указанные штаммы не сохранились. В 1949-1956 гг. П.Ф. Здродовский и Е.М. Голиневич детально изучали, возбудителей и пришли к выводу об идентичности возбудителей риккетсиозов группы клещевой пятнистой лихорадки на территории Сибири и Дальнего Востока (8). Тем не менее, в 1947г. М.М. Маевский обратил внимание на отличие друг от друга в различных регионах клещевых пятнистых лихорадок по некоторым особенностям клинической картины и серологических реакций (15).

Интересно, что еще в 1946 г. отмечалось совпадение сезонности клещевого сыпного тифа в Приморье и Сибири, а также других эпидемиологических факторов (19), однако в Хабаровском крае в 1974 г. наблюдали четкий сдвиг максимума заболеваемости на летние месяцы, максимум заболеваемости отмечается в июле, в отличие от апреля-мая в Сибири (11, 29, 46). Четкое отличие в сезонности наблюдалось между Хабаровским и Приморским краями, в последнем максимум заболеваемости также наблюдается в мае (37). Более того, наблюдается значительное преобладание среди заболевших в Хабаровском крае лиц пожилого возраста по сравнению с регионами Сибири, где преобладали дети (29, 46). Так, например, в 1991 г. на долю детей до 14 лет в Красноярском крае приходилось 67% от всех заболевших, тогда как в Хабаровском крае - только 10% (46). Таким образом, эпидемиологические данные свидетельствуют о некоторых особенностях клещевого риккетсиоза в Хабаровском крае от клещевого сыпного тифа Северной Азии в других регионах Сибири и Дальнего Востока. Обычно это объяснялось превалирующим значением в Хабаровском крае и экологическими особенностями такого переносчика, как H.concinnae, в отличие от клещей рода Dermacentor в других регионах (29, 37, 46).

Как известно, морфологически риккетсии практически не отличаются друг от друга, а исследование человеческих сывороток с растворимым антигеном имеют выраженный перекрест (8, 78). Поэтому исследование сывороток больных клещевым риккетсиозом людей с антигеном любой риккетсии группы КПД потенциально способно дать положительный результат. Следовательно, серологические реакции являются группоспецифическими, с их помощью очень сложно провести идентификацию до вида риккетсии, вызвавшей заболевание.

Проводимые в дальнейшем исследования клещевого риккетсиоза в Приморском крае (22) также не выявили выраженных отличий выделенных от людей, клещей и животных штаммов и неотипом R.sibirica, штаммом «Нецветаев», хотя некоторые серологические отличия были отмечены (14). Молекулярно-генетическими методами эти штаммы не исследованы. Три штамма, выделенных от клещей D. silvarum в 1983-1984 гг. в Приморском крае Т.А. Решетниковой, были молекулярно-генетическими методами (полиморфизм длин рестрикционных фрагментов) идентифицированы как типичная R.sibirica (45).

Клинико-лабораторные и эпидемиологические исследования риккетсиоза, проведенные в Хабаровском крае в прошлые годы (11, 29), показали, что заболевание сходно с другими риккетсиозами группы КПЛ, такими как пятнистая лихорадка Скалистых гор, марсельская лихорадка. Это острое природно-очаговое трансмиссивное инфекционное заболевание, протекающее с выраженной интоксикацией, морфологическими изменениями в мелких кровеносных сосудах в виде пролиферативно-деструктивного тромбоваскулита, а также функциональными и метаболическими нарушениями. Тем не менее, отличительными эпидемиологическими особенностями являлось значительно меньшая численность детей до 15 лет среди всех возрастных групп заболевших

11), а также то, что значительную группу больных составляли лица старше 50 лет.

Очаги клещевого риккетсиоза располагаются в южных и центральных районах Хабаровского края, где имеющиеся биогеоценотические факторы способствуют циркуляции возбудителя. В качестве переносчиков предполагались клещи родов Dermacentor и Haemaphysalis; Первые являются классическими.переносчиками клещевого сыпного тифа Северной Азии в регионах Центральной и Восточной Сибири. Из этих клещей были выделены типовые штаммы, неотипы и множество топотипов R.sibirica. Тем не менее, пик активности этих клещей (с марта по май) не совпадает с многолетними пиками заболеваемости клещевым сыпным тифом в Хабаровском крае (июнь-июль).

В 1982 году из клещей D. silvarum, собранных близ г. Суйфеньхэ провинции Хэйлунцзян был выделен изолят риккетсий, названный HLJ-054 (59). Провинция Хэйлунцзян - самая северная провинция КНР, непосредственно прилегающая к Хабаровскому краю РФ. В 1993 году из клещей Н. concinnae, собранных в той же провинции близ г. Хулин была выделена другая риккетсия, штамм HL-93. По основным характеристикам эти штаммы оказались представителями группы клещевой пятнистой лихорадки. Проведенные позднее генетические исследования показали, что эти риккетсии действительно принадлежат к этой группе, однако, образуют наиболее генетически удаленную ветвь на филогенетическом дереве, образуя стабильный (по результатам сравнения нескольких генов) кластер с возбудителем японской пятнистой лихорадки Rickettsia japonica (143). В 2004 году изоляту HLJ-054 был придан статус вида Rickettsia heilongjiangensis (61). Четких данных о патологии этих риккетсий для человека не существовало, однако сыворотки лихорадящих больных из этого региона реагировали с антигеном, приготовленным из штамма HLJ-054 (79). Кроме этого, наличие в этом северном регионе Китая больных с проявлениями сходными с клиникой клещевых пятнистых лихорадок, а также присутствие этой риккетсии в иксодовых клещах. Активно нападающих на человека, привело к предположению и патогенности Rickettsia heilongjiangensis.

В мае 2004 года были опубликованы данные С.Н. Шпынова об обнаружении этой риккетсии в клещах Haemaphysalis concinna, собранных на территории Российской Федерации в Красноярском крае (125).

Немногочисленны исследования непатогенных риккетсий, встречающихся в Сибири и на Дальнем Востоке. В 2003 году были опубликованы данные о наличии в клещах Ixodes persulcatus, собранных в Сибири и на юге Урала, нового вида риккетсии (124). Поскольку штамм риккетсии выделен не был, а риккетсия была обнаружена и характеризована молекулярно-биологическими методами, а также вследствие недостаточной характеристики обнаруженной риккетсии, она получила статус Candidatus (85, 86). Микроорганизм Candidatus Rickettsia tarasevichiae получил свое имя в честь И.В.Тарасевич, вложившей значительный вклад в мировую риккетсиологию. Оказалось, что эта риккетсия имеет очень интересное филогенетическое положение и наиболее близка к непатогенной Rickettsia canadensis. Этот факт, а также то, что процент инфицированности клещей достигал значительных цифр (до 20,5% на юге Урала), позволили предположить, что найденная риккетсия непатогенна для человека и, скорее всего, является эндосимбионтом. В упомянутой выше (125) работе также описывается обнаружение молекулярно-биологическими методами в клещах еще двух риккетсий: риккетсии, генетически близкой к Rickettsia aeschlimannii и Rickettsia sp. RpA4. Последняя, наряду с Rickettsia sp. DnS14 и Rickettsia sp. DnS28 были выделены на лабораторных линиях клещей в Омском НИИ природно-очаговых инфекций и подробно генетически охарактеризованы в 1999 г. (118). Rickettsia sp. RpA4 и Rickettsia sp. DnS14, a также Rickettsia slovaca также молекулярно-биологическими методами были обнаружены клещах рода Dermacentor, собранных в различных регионах юга Сибири и Европейской части России, а также Казахстане (123). Недавно также опубликованы данные о еще одной риккетсии, обнаруженной Dermacentor silvarum в районе озера Байкал (3).

Риккетсиозы группы клещевой пятнистой лихорадки являются классическими примерами так называемых вновь появляющихся (emerging) инфекций, что вызывает пристальное внимание, как свидетельствуют многочисленные публикации (4, 40, 88, 96, 102, 104, 107, 108, 109, 114, 117, 124, 143).

Иксодовые клещи как переносчики заболеваний человека

Клещи семейства Ixodidae служат специфическими переносчиками таких возбудителей болезней человека и животных как риккетсии, анаплазмы, эрлихии, некоторые другие альфа- и гамма-протеобактерии, спирохеты, тейлерии, пироплазмиды, вирусы, микрофилярии. Не исключено участие их в передаче некоторых видов грибов, токсоплазм и жгутиконосцев (4). Они являются кровососущими паразитами наземных позвоночных, в основном млекопитающих. Семейство насчитывает в своем составе около 15 родов и не менее 700 видов, распространенных на всех материках земного шара. Два подсемейства включают в себя роды Ixodes и Ceratixodes (подсемейство Ixodinae)\ Haemaphysalis, Boophilus, Rhipicentor, Dermacentor, Amblyomma, Aponomma, Anomalohimalaya, Cosmiosomma, Nosomma, Margaropus, Rhipicentor, Rhipicephalus и Hyalomma (подсемейство Amblyomminae) (30). На территории бывшего СССР встречается около 70 видов (2, 18, 30).

Тесные и многообразные связи кровососущих клещей с различными микроорганизмами обычно объясняют древностью их паразитизма и разнообразием биоценотических связей с хозяевами - наземными позвоночными (4). Некоторые анатомические, физиологические и биохимические особенности позволяют этим членистоногим быть идеальными переносчиками различных инфекционных агентов. Это смена хозяев в зависимости от стадии развития, способность длительное время обходиться без питания, впадать в анабиоз, длительное время кровососания, значительное разрушение тканей хозяина и выделение туда слюны и цементирующего вещества при прикреплении, способность быть инфицированными несколькими патогенными микроорганизмами (2). Длительность жизни самого клеща при этом может не сокращаться (2, 90, 91). С помощью современных методов было доказано существование в клещах не только патогенных для человека микроорганизмов, но и микроорганизмов с неизвестной патогенностью или вообще считающихся эндосимбионтами (46, 70, 89, 96). Отличить их от патогенных и/или идентифицировать можно зачастую лишь на основании, специфических молекулярных методов исследования (70).

Основное значение клещей для человека - это способность являться источником и переносчиками различных инфекционных заболеваний. В патологии человека наиболее значимыми трансмиссивными заболеваниями, передающимися иксодовыми клещами, являются риккетсиозы группы клещевой пятнистой лихорадки (КПЛ), эрлихиозы и анаплазмозы, болезнь Лайма, вирусные клещевые заболевания (клещевой энцефалит, лихорадка Крым-Конго и другие арбовирусные инфекции), бабезиоз.

Молекулярно-биологический подход к идентификации микроорганизмов, диагностике инфекционных заболеваний и изучению эпидемиологии трансмиссивных инфекций

С 80-х годов XIX века, когда Роберт Кох разработал свои принципы определения роли микроорганизма как возбудителя заболевания, позднее ставшие известными как постулаты Коха, многое изменилось. Фундаментальность постулатов не так очевидна, когда речь идет об облигатных паразитах, в частности вирусах, которые не могут быть выделены и размножены в «чистой» (то есть неживой, бесклеточной) культуре. Это было подчеркнуто еще в 1936 году в выступлении Thomas Rivers перед Американским обществом микробиологов (65, 113). Дальнейшие открытия и внедрение новых методик еще более расширили представление о критериях диагностики инфекционных заболеваний: выяснение роли вируса Эпштейна-Барра в генезе разнообразных заболеваний, персистенция вирусов в организме человека и животных; открытие прионных заболеваний, возбудитель которых не является живым организмом в общепринятом смысле слова; выяснение роли микроорганизмов в канцерогенезе; индукция аутоиммунных заболеваний и др. Все эти открытия встали в разрез с традиционными постулатами и стимулировали постепенный их пересмотр и модификацию.

Термин «полифазная таксономия» употребляется для обозначения таксономии финального уровня, использующей все имеющиеся данные, как фенотипические, так и генетические, для определения позиции определенной группы организмов. Поскольку в микробиологии фенотипические данные зачастую труднодоступны для описания или вообще немногочисленны, генетическая концепция определения вида, основанная на филогенетическом анализе, чрезвычайно важна. Роль полифазной таксономии в описании вида подчеркнута в последней издании определителя Bergey (69). Там же подчеркнуто, что секвенирование некоторых универсальных генов (кодирующих рибосомальную РНК, например) имеет самую высокую разрешающую способность среди всех остальных фенотипических и генотипических методов в идентификации позиций «штамм-вид-род-семейство». Хотя сравнение последовательностей генов рибосомальных ДНК представляет собой филогенетическую основу классификации микроорганизмов на современном этапе развития науки (69), в некоторых случаях, например, у риккетсий, этот ген не содержит достаточное количество информации для определения внутриродовых и внутривидовых отличий. Вследствие этого исследователям приходится дополнительно проводить филогенетические исследования на основании других, менее консервативных генов, например, гена цитрат-синтазы (116).

Развитие методик молекулярной биологии позволило не только с высочайшей чувствительностью и точностью идентифицировать генетический материал микроорганизмов, но и в ряде случаев выявлять возбудителей новых инфекционных заболеваний и определять инфекционную причину заболеваний ранее неизвестной этиологии. Первый случай гранулоцитарного анаплазмоза человека был диагностирован на основании амплификации генов микроорганизма, ныне называемого Anaplasma phagocytophilum в материалах от больных людей (53) и лишь позднее многочисленные штаммы этой анаплазмы были выделены от человека. Примером успешного применения методов молекулярной биологии в идентификации инфекционного генеза давно известных заболеваний с неизвестной этиологией является болезнь Уиппла или кишечная липодистрофия. Благодаря амплификации ДНК специфического микроорганизма из подслизистой оболочки кишечника больных людей была доказана инфекционная причина этого заболевания (40). Лишь спустя почти 10 лет после идентификации инфекционной причины заболевания удалось выделить эту чрезвычайно прихотливую бактерию в чистой культуре (103). Идентификация новых, ранее неизвестных болезней человека также возможна с помощью молекулярно-биологических методов. Причина хантавирусного легочного синдрома, унесшего десятки жизней во время вспышки в США в 1993 году (52) также была идентифицирована этими методами (87). Аналогичным образом доказана инфекционная причина саркомы Капоши (51). Идентификация вируса гепатита С, как причины одного из парентеральных вирусных гепатитов человека также основывалась на молекулярно-биологических принципах (54).

Появление новых технологий, позволяющих получить непосредственный доступ к последовательности нуклеиновых кислот и концептуальные достижения, дающие возможность делать выводы об эволюционном, филогенетическом взаимоотношении на основании сравнения отдельных секвенсов (последовательностей нуклеиновых кислот) принесло практически неограниченные возможности выявления и идентификации ранее неизвестных микроорганизмов. Революционные технологии амплификации ДНК (57, 119, 120), гибридизации нуклеиновых кислот (57) и секвенирования ДНК (82, 121) дополняют традиционные методы микробиологических исследований. С их помощью было выявлено огромное количество ранее неизвестных и некультивируемых микроорганизмов в окружающей среде, а также находящихся в ассоциации с организмом человека (110, 136). Специально разработаны методики, позволяющие получать участки генома как известных, так и новых микроорганизмов из-за того, что разные гены микроорганизмов обладают широчайшим спектром специфичности - от универсальных, встречающихся практически у всех (гены рибосомальных РНК, белков теплового шока, синтетаз нуклеиновых кислот), до родо- и видоспецифичных., Более того, сильно варьирует и специфичность различных участков генов на их протяжении - последовательность может быть специфичной для определенного штамма или для всей группы протеобактерий.

Современные методы позволяют быстро обнаружить ДНК практически в любом материале, а наличие ДНК некультивируемых или ранее неизвестных микроорганизмов в совокупности с классическими микробиологическими подходами может служить способом выявления возбудителей новых инфекционных заболеваний.

В настоящее время разработаны специфические методы идентификации для большого количества микроорганизмов, а описание ни одного нового вида не обходится без молекулярно-биологической характеристики (47, 66).

Обнаружение и идентификация бактерий в клещах: молекулярно-биологические подходы. На современном этапе развития науки методы детекции различных микроорганизмов, предлагаемые молекулярной биологией, играют ведущую роль. Максимально специфичные и чувствительные, значительно менее трудоемкие по сравнению с другими методами, ПЦР и родственные методы заняли ведущую позицию не только в научных исследованиях, но также и в практике, например, диагностике инфекционных заболеваний.

Особое значение данные методы могут иметь при выявлении микроорганизмов из таких сред, определенные характеристики которых затрудняют применение стандартных методов детекции и/или выделение чистой культуры микроорганизма. Исследование микрофлоры, населяющей внутреннюю среду клещей - типичный пример. Наличие огромного количества различных микроорганизмов во внутренней среде этих членистоногих, небольшие размеры каждого клеща и невысокая концентрация микроорганизмов в них, неизученность многих микроорганизмов, ведущая к затруднениям при культивировании: все это ведет к тому, что молекулярно-биологические методы начинают играть ведущую роль в этих исследованиях (126). Кроме того, многие практически неразличимые фенотипически микроорганизмы могут иметь принципиально различную патогенность для млекопитающих. Патогенные и непатогенные виды можно легко дифференцировать с помощью генетического анализа. И, наконец, именно молекулярно-биологические методы наконец-то дали возможность выявить инфицирование одного клеща несколькими патогенными микроорганизмами одновременно, что приводит к возникновению смешанных инфекций, требующих зачастую дифференцированного лечения у людей и у животных (71,84).

Первым этапом молекулярно-биологического исследования является извлечение из внутренних органов клещей комплекса нуклеиновых кислот. Впоследствии растворенные в воде или нейтральном буфере кислоты используются для дальнейших исследований. Методика полимеразной цепной реакции подразумевает многократную амплификацию (умножение) одной или нескольких копий ДНК in vitro специальным ферментом (ДНК-полимеразой) при определенных условиях. Специфичность и чувствительность реакции определяется в первую очередь подбором праймеров («затравок»), необходимых для инициации амплификации. Они должны быть комплементарны искомым участкам ДНК. Соответственно этому, выбрав в качестве праймеров участки ДНК, максимально специфичные искомому организму, можно амплифицировать ДНК строго определенного микроорганизма. Наоборот, праймеры, разработанные на основе участков ДНК, одинаковых у многих микроорганизмов, то есть обладающих широкой специфичностью, можно получить ампликон не только видов, на основании которых были разработаны праймеры, но и других, потенциально новых, неизвестных микроорганизмов.

Возможна разработка различных вариантов ПЦР с потенциально любой специфичностью на основании правильно разработанных праймеров. Этими широчайшими возможностями и пользуются исследователи не только для детекции определенных, известных, но и для поиска новых микроорганизмов. Некоторые гены присутствуют в геноме всех протеобактерий, например, ген, кодирующий 16S рибосомальную РНК. Разработаны праймеры, амплифицирующие практически полный ген потенциально всех протеобактерий (138, 139), то есть обладающие максимально широкой специфичностью. Подобной широкой специфичностью обладает также ген, кодирующий 23 S рибосомальную РНК. Другие гены, например, гены кодирующие РНК-полимеразу (гроВ) или белки теплового шока (оперон groESL) обладают более узкой специфичностью, то есть праймеры, разработанные на их основе могут амплифицировать определенную группу микроорганизмов (115,130).

Каждая методика ПЦР может обладать различной специфичностью. Во многих случаях для разработки реакции используются мало вариабельные гены, которые могут присутствовать у многих микроорганизмов. В таких случаях для полной идентификации полученного ампликона прибегают к определению его нуклеотидной последовательности путем его секвенирования. Как правило, пользуются либо прямым секвенированием полученного ампликона, либо его клонированием в другом микроорганизме с помощью вектора (75). После получения последовательности амплифицированного в ПЦР гена или его участка проводят поиск в базе данных. Как правило, используют доступные в Интернете поисковые системы в основных базах генетических данных, коими являются GenBank, DDBJ (DNA Database of Japan) и EMBL. В основном, данные в этих базах повторяют друг друга. При получении результата сравнения возможно несколько вариантов. Это либо полное совпадение запрашиваемого результата с имеющимся в базе данных, что свидетельствует об идентичности генов амплифицированного микроорганизма и находящегося в базе генетических данных, то есть об идентичности микроорганизмов. При отсутствии полного совпадения можно говорить о гомологии полученного гена с каким-либо (какими-либо) имеющимися в базе данных либо о ее отсутствии. То есть амплифицированный ген либо принадлежит некому микроорганизму, который еще не известен, либо известен, но этот ген у него еще не секвенирован. При существовании гомологии проводится филогенетический анализ. Его результаты определяют систематическое положение и таксономию микроорганизма (73, 86, 126, 138, 139).

Следует отметить, что вследствие сложности выделения чистой культуры возбудителя в риккетсиологии часто используются косвенные методы выявления риккетсий. Например, в клинических диагностических исследованиях преимущественно используются серологические методы диагностики, несмотря на то, что сыворотки больных риккетсиозами группы КПЛ дают выраженные перекрестные серологические реакции с антигенами других микроорганизмов {Proteus spp., Legionella spp.) и антигенами других риккетсий этой же группы (105).

Высокую эффективность показал метод лабораторной диагностики пятнистой лихорадки Скалистых гор путем иммунофлюоресцентного мечения риккетсий в первичном аффекте (133). Было показано также клиническая эффективность и оправданность использования биоптатов первичных аффектов для выявления риккетсиальной этиологии заболевания у человека, поскольку именно здесь наблюдаются большие скопления риккетсий (134).

Вследствие относительной легкости исследования материалов от больных молекулярно-биологические методы нашли широкое применение в риккетсиологии. Амплификация ДНК риккетсий и последующее секвенирование ампликонов для подтверждения специфичности реакции стали основным критерием клинической диагностики риккетсиозов во многих лабораториях мира (88, 94, 106, 107).

Для идентификации ДНК риккетсий в клещах и клинических материалов от больных людей используются различные наборы праймеров, некоторые наиболее часто используемые варианты рассмотрены далее.

В связи с тем, что основная масса генов риккетсий отличается друг от друга в небольшой степени, для видовой идентификации как правило используется комбинация ПЦР с последующим анализом амплифицированного продукта либо при помощи анализа длин рестрикционных фрагментов (RFLP), либо, что в последнее время практически вытеснило все остальные методы, при помощи полного секвенирования полученного продукта.

На настоящий момент чаще всего для идентификации и характеристики риккетсий используются в основном 5 генов. Это ген 16S рибосомальной РНК, ген цитрат-синтазы {gitА), ген 190-кДа поверхностного антигена (отрА), 120-кДа поверхностного антигена (<отрВ) и 17-кДа белка. Огромными преимуществами этих генов являются их изученность, изменчивость, присутствие у всех риккетсий (за исключением отрА, наличие которого является признаком риккетсий группы КПЛ), а также наличие большой базы данных секвенированных генов, что позволяет с легкостью идентифицировать полученные ампликоны или характеризовать ранее неизвестные риккетсии.

На основании гена 16S рибосомальной РНК разработаны праймеры для амплификации ДНК риккетсий, однако специфичность их зачастую бывает низкой (114, 128, 129). Ген gltA кодирует цитрат-синтазу риккетсий, и праймеры, разработанные на его основе способны амплифицировать ДНК риккетсий всех групп (109, 116). Одним из первых известных генов, специфичных для риккетсий группы пятнистой лихорадки, является ген отрА, кодирующий 190-кДа поверхностный антиген (40). На его основе разработан ряд праймеров, амплифицирующих ДНК риккетсий группы пятнистой лихорадки (64, 109). Праймеры на основе 17-кДа антигена также могут обладать родоспецифичностью (41). Ген отрВ, кодирующий 120-кДа поверхностный антиген практически всех риккетсий, был впервые клонирован

-33в 1989 г. (50). На основе его также были разработаны праймеры для амплификации риккетсиальной ДНК (115).

Как правило, при исследовании клинических образцов используют амплификацию нескольких генов риккетсий для снижения вероятности контаминации и облегчения определения видовой принадлежности риккетсии (78).

Генетические подходы к филогенетическим исследованиям, эволюции микроорганизмов В настоящее время описание любого микроорганизма, как выявленного вновь, так и известного давно, не может обойтись без его генетической характеристики. На основании сравнения гомологичных генов различных микроорганизмов разными методами делаются выводы о степени отличия микроорганизмов друг от друга, о близости тех или иных групп, даже о приблизительном времени эволюционного происхождения того или иного микроорганизма (92). Исследования генома археобактерий, проведенные Carl Woese и Gary Olsen в конце 70-х годов прошлого века привели к революционным сдвигам в понимании эволюции жизни на Земле и позволили разработать современные подходы к систематике, филогенетическим и эволюционным исследованиям (93, 140, 141). Классическая схема пяти царств сменилась трехдоменной системой, разработанной на основании сравнения гена, кодирующего рРНК малой субъединицы рибосомы. Этот ген универсален, он присутствует практически во всех клеточных организмах.

ПЦР-диагностика, как правило, всегда сопряжена с таксономической и филогенетической характеристикой, поскольку амплифицированный ген после секвенирования должен быть сравнен с имеющимися в базе данных ортологами и гомологами (83). При полном совпадении делается вывод об идентичности выявленного микроорганизма с занесенным в банк, при выявлении отличий необходимо провести филогенетический анализ. Отличия, как правило, заключаются в точечных заменах (мутациях) нуклеотидов. Считается, что такие замены происходят с определенной скоростью и их количество и качество характеризуют удаленность двух конкретных микроорганизмов друг от друга. Кроме этого, математический анализ качества и количества замен нуклеотидов в ортологичных генах нескольких микроорганизмов способен дать цельную картину филогенетического соотношения исследуемых микроорганизмов. На основании этого также строится современная таксономия.

Анализ такого типа, как правило, проводится с помощью компьютерных филогенетических программ, таких как Genetix-Win, MEGA-2, CLASTAL и др.

Благодаря возможностям, которые открыла молекулярная биология, в риккетсиологии произошла большая перемена: полная реорганизация порядка Rickettsiales (67). Он составляет 2-ой порядок альфапротеобактерий, включает в себя два семейства: Rickettsiaceae и Anaplasmataceae, а также группу риккетсиеподобных микроорганизмов, предварительно сгруппированных в нетаксономическое семейство «Holosporaceae». Бартонеллы, считающиеся ранее близкими к риккетсиям, отнесены к 6-му порядку альфапротеобактерий, а коксиеллы относятся к принципиально другой группе микроорганизмов -гаммапротеобактериям.

Филогенетические исследования применялись для характеристики различных представителей порядка Rickettsiales. Представители рода Rickettsia, например, были подробно охарактеризованы при сравнении и анализе генов 16S рРНК, git А, отрА, отрВ (40, 114, 115, 116). При обнаружении новой риккетсии «золотым стандартом» является не только классическое описание микробиологических характеристик, но также и секвенирование этих генов и филогенетический анализ на их основе (143).

Таким образом, исследования эволюции микроорганизмов, долгое время базировавшиеся либо на сомнительных археологических данных, либо на сравнении фенотипических характеристик (физиология и морфология) микроорганизмов, в настоящее время основываются на точных математических критериях, выведенных из генетических данных. Это является кардинальным изменением в науке об эволюции, уже приведшим к множеству открытий.

Таблица 1.

Список представителей рода Rickettsia, патогенных для человека

Группа Вид Заболевание Переносчик Распространение

Группа клещевой пятнистой лихорадки Rickettsia rickettsii Пятнистая лихорадка Скалистых Гор Dermacentor variabilis, Dermacentor andersoni, Rhipicephalus sanguineus, Amblyomma cajennense Северная и Южная Америка

Rickettsia conorii комплекс, ssp. caspiensis Астраханская пятнистая лихорадка Rhipicephalus pumilio Астраханская область, Россия

Rickettsia conorii комплекс, ssp. israeli Пятнистая лихорадка Израиля Rhipicephalus sanguineus Израиль

Rickettsia sibirica Клещевой сыпной тиф Северной Азии Dermacentor nuttalli, Dermacentor marginatus, Haemaphysal is concinna Россия (Центральная и Восточная Сибирь), Монголия, Северный Китай, Пакистан

Rickettsia sibirica, штамм «mongolotimonae» Клещевая пятнистая лихорадка Hyalomma asiaticum Китай (Внутренняя Монголия), Франция

Rickettsia akari Везикулезный (осповидный) риккетсиоз Allodermanyssus sanguineus США, Украина, Хорватия, Корея

Rickettsia africae Африканская лихорадка укуса клеща (African tick bite fever) Amblyomma hebraeum Юг Африки

Rickettsia australis Клещевой тиф Северного Квинсленда Ixodes holocyclus Австралия (Квинсленд)

Rickettsia japonica Японская пятнистая лихорадка Haemaphysal is longicornis, Dermacentor taiwanensis Япония (юго-западные районы)

Таблица 1 (продолжение). Список представителей рода Rickettsia, патогенных для человека

Группа Вид Заболевание Переносчик Распространение

Группа клещевой пятнистой лихорадки Rickettsia slovaca Клещевая пятнистая лихорадка, TIBOLA Dermacentor marginatus Словакия, Армения, Россия (Урал), Франция, Швейцария, Португалия

Rickettsia honei Клещевая пятнистая лихорадка острова Флиндерса Аропотта hydrosauri Остров Флиндерса (Тасмания, Австралия)

Rickettsia aeschlimannii Риккетсиоз группы КПЛ Rhipicephalus appendiculatus, Hyalomma marginatum Южная и Северная Африка

Rickettsia parkeri Риккетсиоз группы КПЛ Amblyomma maculatum, Amblyomma americanum США

Группа сыпного тифа Rickettsia prowazekii Эпидемический сыпной тиф, болезнь Брилля Pediculus humanus (Pediculus vestimenti) Убиквитарно

Rickettsia typhi Крысиный сыпной тиф Xenopsylla cheopsis Убиквитарно

Rickettsia felis Калифорнийский блошиный риккетсиоз Ctenocephalides felis США (Калифорния, Техас, Оклахома)

Rickettsia helvetica Лихорадочные заболевания без сыпи, перимиокардиты (?) Ixodes ricinus Европа

Заключение диссертации по теме «Эпидемиология», Медянников, Олег Юрьевич

123 Выводы:

1. В результате ревизии этиологии клещевого риккетсиоза молекулярно-биологическими методами выявлено, что клещевой риккетсиоз в Хабаровском крае вызывается Rickettsia heilongjiangensis. Полученные последовательности генов, амплифицированных у 18 больных, помещены в GenBank.

2. Возбудитель клещевого риккетсиоза в Хабаровском крае,

R. heilongjiangensis, является представителем подгруппы Rickettsia japonica группы КПЛ, что подтверждено филогенетическим исследованием на основании анализа впервые секвенированного гена отрВ.

3. Показано, что клещевой риккетсиоз в Хабаровском крае (дальневосточный клещевой риккетсиоз) является эндемичным заболеванием, распространенным только в южных административных районах. Его особенностями являются пик заболеваемости в июле и преимущественная подверженность заболеванию лиц старших возрастных групп, что объясняется особенностями биологии переносчика и хозяйственной деятельности человека.

4. Переносчиками клещевого риккетсиоза, вызываемого Rickettsia heilongjiangensis (дальневосточного клещевого риккетсиоза), являются часто встречающиеся в Хабаровском крае клещи видов Haemaphysalis concinna (основной, инфицированность 28,13%) и Haemaphysalis japonica douglasi (второстепенный, инфицированность 4,48%), в отличие от малораспространенного клеща Dermacentor silvarum, переносчика клещевого риккетсиоза Северной Азии,.

5. Rickettsia sibirica (возбудитель клещевого сыпного тифа Северной Азии) не был выявлен ни в пробах от больных, ни в иксодовых клещах на юге Дальнего Востока;

6. Разработана высокочувствительная и специфичная тест-система на основе ПЦР для индикации наличия патогенных риккетсий в средах и тканях человека. Она позволяет целиком секвенировать ген цитрат-синтазы, что было использовано для идентификации риккетсий и для филогенетического анализа.

7. Выявлены клинические особенности инфекции, вызванной Rickettsia heilongjiangensis, при анализе случаев, этиология которых доказана методами молекулярной биологии: наличие неяркой сыпи только у 87,5% больных, склонность к образованию подкожных лимфангоитов.

8. В клещах вида Haemaphysalis japonica douglasi обнаружена ДНК риккетсий нескольких видов, в том числе R.heilongjiangensis (4,48%), Candidatus Rickettsia tarasevichiae (1,49%) и новой риккетсии, предварительно названной Candidatus Rickettsia principis (2,99%).

9. Растворимый антиген R.sibirica, применяющийся в практике с целью диагностики дальневосточного клещевого риккетсиоза (возбудитель R.heilongjiangensis) группоспецифичен и дает перекрестные реакции. Его применение для лабораторной диагностики дальневосточного клещевого риккетсиоза нецелесообразно, так как он менее специфичен, чем антиген возбудителя, R. heilongjiangensis.

125

Список литературы диссертационного исследования кандидат медицинских наук Медянников, Олег Юрьевич, 2004 год

1. Антонов Н.И., Найштат А.Г. Дальневосточная клещевая лихорадка // Мед. паразитол. и паразитарн. болезни. 1937. - №6. - С.73-81.

2. Балашов Ю.С. Кровососущие клещи (Ixodoidea) — переносчики болезней; человека и животных. Д., 1967. - 320с.

3. Беликов С.И., Дигас С.Э., Хаснатдинов М.А. Обнаружение новой риккетсии в клещах Dermacentor silvarum в районе озера Байкал // Журн. микробиол. —2001. № 5. - С.8-11.

4. Беклемишев В.Н. Круг естественных переносчиков трансмиссивных болезней, поражающих человека // Зоологич. журн. 1955. - № 34(1). - С.З-16.

5. Елкин И.И. Эпидемиология. -М.: Медицина, 1979.-267с.

6. Здоровье населения и среда обитания: Информационный бюллетень / Федеральный центр государственного санитарно-эпидемиологического надзора Министерства Здравоохранения Российской Федерации. 1997. — №1(46). -С.23.

7. Здоровье населения и среда обитания: Информационный бюллетень / Федеральный центр государственного санитарно-эпидемиологического надзора Министерства Здравоохранения Российской Федерации. 1998. -№1(59). -С.31.

8. Здродовский П.Ф., Голиневич Е.М. Учение о риккетсиях и риккетсиозах. -М., 1972.-278с.

9. Ю.Инфекционная заболеваемость в Российской Федерации в 2002-2003 гг.: Информационный сборник статистических и аналитических материалов /

10. Федеральный центр государственного санитарно-эпидемиологического надзора Министерства Здравоохранения Российской Федерации. М., 2004. -20с.

11. Киреева Р.Я. Клещевой риккетсиоз Азии: Вопросы патогенеза, клиники, диагностики и лечения: Дисс. . докт. мед: наук. Москва, 1974. - 433с.

12. Коршунова О.С. Этиология клещевого сыпного тифа в Красноярском крае // Журн. микробиол. 1943. - № 1-2. - С.59-64.

13. З.Коршунова О.С. К этиологии дальневосточной сыпнотифозной лихорадки // Журн. микробиол. 1943. -№ 1-2. - С.51-59.

14. Н.Кулагин С.М., Сомов Г.П., Силич В.А. и др. Дальнейшее наблюдение над клещевым риккетсиозом в Приморском крае // Журн. микробиол. 1960. -№ 9. -С.64-71.

15. Маевский М.М. Новое в учении о риккетсиозах за последние годы // Журн. микробиол. 1947. - № 4. - С.3-14.

16. Мерков A.M., Поляков JI.E. Санитарная статистика. Д., 1974. - 325с.

17. Милль Е.Н. Клещевая лихорадка в Приморье // Дальневосточный, мед. журн. 1936. - №3. - С.34-36.

18. Померанцев Б.И. Иксодовые клещи (Ixodidae) // Фауна СССР : Паукообразные. М.: Изд-во АН СССР, 1950. - T.IV, вып. 2. - 224с.

19. Преображенский А.А. Клещевая сыпнотифозная лихорадка Приморья // Медиц. паразитология, и паразитарн. болезни. 1946. - №4. - С.53-62.

20. Савицкая Е.П. К этиологии клещевого сыпного тифа в Хабаровском крае. // Журн. микробиол. 1943. -№ Ю-11. - С.87.

21. Самойленко И.Е. Эпидемиологические аспекты гетерогенности риккетсий в очагах клещевого риккетсиоза: Дисс. канд. мед. наук. Омск, 1999. -187с.

22. Сомов Г.П. Клещевой риккетсиоз в Приморском крае (материалы по эпидемиологии и этиологии инфекции): Дисс. . докт. мед. наук. Москва, 1966.-673с.

23. Тарасевич И.В. Экология риккетсий: Итоги и перспективы // Экология и популяционная генетика микроорганизмов. Свердловск, 1975. - С.97-103.

24. Тарасевич И.В. Возбудители риккетсиозов в паразитоценозе «риккетсии -членистоногие млекопитающие» // Итоги и перспективы исследований по паразитоценологии в СССР. - М.: «Наука», 1978. - С. 175-186.

25. Тарасевич И.В.Астраханская пятнистая лихорадка. М.: «Медицина», 2002.- 176с.

26. Тарасевич И.В., Панфилова С.С., Фетисова Н.Ф. Экологическая география риккетсиозов группы клещевой пятнистой лихорадки // Итоги науки и техники: ВИНИТИ АН СССР: Серия, мед. география. М., 1980. - 310 с.

27. Тарасевич И.В., Фетисова Н.Ф., Макарова В.А. и др. Риккетсиозы // Природная очаговость болезней: исследования института Гамалеи РАМН. — М., 2003. С.64-98.

28. Тарасов В.В. Эпидемиология трансмиссивных болезней. -М.: Изд-во МГУ, 2002.-336 с.

29. Томилка Г.С. Клиника и иммуно-аллергические аспекты патогенеза клещевого сыпного тифа Северной Азии: Дисс. канд. мед. наук, Новосибирск, 1987. 160 с.

30. Шапиро М.И. Клещевой сыпной тиф на одном из островов Южного Приморья: Дисс. . канд. мед. наук. -М., 1959. 185 с.

31. Шматиков М.Д., Велик М.А. Клещевая сыпная лихорадка // Клинич. Медицина. 1939.-№7. с. 124-128.

32. Яблонская В.А. Возможность практического использования высушенных на бумаге сывороток для серологической диагностики риккетсиозов // Журн. микробиол. 1956. -№ 3. - С.90-94.

33. Ястребов В.К. Трансмиссивные и природноочаговые инфекции в Сибири и на Дальнем Востоке // Проблемы, соц. гигиены, истории мед. 1995. - № 5. -С.16-19.

34. Ястребов В.К., Решетникова Т.А. Материалы по типизации природных очагов клещевого риккетсиоза Сибири и Дальнего Востока // Мед. паразитол. паразитарных, болезней. 1990. - №4. - С. 15-17.

35. Alvarez J. A., Buening G.M., and Figueroa J.V. 1996. Detection of Babesia bovis in ticks by the PCR essay // Abstracts of the 77th Annual Meeting, Conf. Res. Workers Anim. Dis. November 1996, USA, Chicago, IL, - P.69.

36. Anderson B.E., Dawson J.E., Jones D.C., and Wilson K.H. Ehrlichia chaffeensis, a new species associated with human ehrlichiosis // J. Clin. Microbiol. 1991. -Vol. 29. — P.2838-2842.

37. Anderson B.E., McDonald G.A., Jones D.C., and Regnery R.L. A protective protein antigen of Rickettsia rickettsii has tandemly repeated, nearly identical sequences // Infect. Immun. 1990. - Vol. 58, N 9. - P.2760-2769.

38. Anderson B.E., and Tzianabos T. Comparative sequence analysis of a genus-common rickettsial antigen gene // J. Bacteriol. 1989. - Vol. 171, N 9. P.5199-5201.

39. Ausubell F.M., Brent R., Kingston R.E., et al. Short protocols in molecular biology, 4th ed. New York: John Wiley & Sons, 1999. 698p.

40. Baird R.W., Lloyd M., Stenos J., et al. Characterization and comparison of Australian human spotted fever group rickettsiae // J. Clin. Microbiol. 1992. -Vol. 30. - P.2896-2902.

41. Baird R. W., Stenos J., Stewart R., et al. Genetic variation in Australian spotted fever group rickettsiae // J. Clin. Microbiol. 1996. - Vol. 34. - P. 1526-1530.

42. Balayeva N.M., Eremeeva M.E., Ignatovich V.E., et al. Biological and genetic characterization of Rickettsia sibirica strains isolated in the endemic area of the North Asian tick typhus // Am. J. Trop. Med. Hyg. 1996. - Vol. 55, N 6. -P.685-692.

43. Bell E.J., Kohls G.M., Stoenner H.G., and Lackman D.B. Nonpathogenic rickettsias related to the spotted fever group isolated from ticks, Dermacentor variabilis and Dermacentor andersoni from eastern Montana // J. Immunol. -1963. Vol. 90. — P.770-781.

44. Birtles R.J., Rowbotham T.J., Michel R., et al. "Candidates Odyssella thessalonicensis" gen. nov., sp. nov., an obligate intracellular parasite of Acanthamoeba species // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2000. - Vol. 50. - P.63-72.

45. Burgdorfer W., Aeschlimann A., Peter O., et al. Ixodes ricinus: vector of a hitherto undescribed spotted fever group agent in Switzerland // Acta Trop. -1979.-Vol. 36. -P.357-367.

46. Chang Y., Cesarman E., Pessin M.S., et al. Identification of herpesvirus-like DNA sequences in AIDS-associated Kaposi's sarcoma // Science. 1994. - Vol. 266. P.1865-1869.

47. Chapman, L.E., and Khabbaz R.F. Etiology and epidemiology of the Four Corners hantavirus outbreak // Infect. Agents Dis. 1994. - Vol. 3. - P.234-244.

48. Chen S.M., Dumler J.S., Bakken J.S., and Walker D. Identification of a granulocytotrophic Ehrlichia species as the etiologic agent of a human disease // J. Clin. Microbiol. 1994. - Vol. 32. P.589-595.

49. Choo Q.L., Kuo G., Weiner A.J., et al. Isolation of a cDNA clone derived from a blood-borne non-A, non-B viral hepatitis genome // Science. 1989. - Vol. 244. P.359-362.

50. Crampton A., McKay I., and Barker S.C. Phylogeny of ticks (Ixodida) inferred from nuclear ribosomal DNA // Int. J. Parasitol. 1996. - Vol. 26:. - P.511-517.

51. Drancourt M., Beati L., Tarasevich I.V., and Raoult D. Astrakhan fever rickettsia is identical to Israeli tick typhus rickettsia, a genotype of the Rickettsia conorii complex // J. Infect. Dis. 1992. - Vol. 165. - P. 1167-1168.

52. Edberg S.C. Principles of nucleic acid hybridization and comparison with monoclonal antibody technology for the diagnosis of infectious diseases // Yale J. Biol. Med. 1985. - Vol. 58. - P.425-442.

53. Emelyanov V.V. Mitochondrial connection to the origin of the eukaryotic cell // Eur. J. Biochem. 2003. - Vol. 270. - P.1599-1618.

54. Fan M.Y., Zhang J.Z., Chen M., and Yu X.J. Spotted fever group rickettsioses in China // In: D. Raoult and P. Brouqui (ed.), Rickettsiae and rickettsial diseases at the turn of the third millenium. 1999, France: Elsevier Paris. - P.247-257.

55. Fenollar F., and Raoult D. Diagnosis of rickettsial diseases using samples dried on blotting paper // Clin. Diagn. Lab. Immunol. 1999. - Vol. 6. - P.483-488.

56. Fournier P.-E., Dumler J.S., Greub G., et al. Gene sequence-based criteria for identification of new rickettsia isolates and description of Rickettsia heilongjiangensis sp. nov // J. Clin. Microbiol. 2003. - Vol. 41, N 12. - P.5456-5465.

57. Fournier P.-E., Grunenberg F., Jaulhac В., et al. Evidence of Rickettsia helvetica infection in humans, eastern France // Emerg. Infect. Dis. 2000. Vol. 6. -P.398-392.

58. Fournier P.-E., Roux V., and Raoult D. Phylogenetic analysis of spotted fever group rickettsiae by study of the outer surface protein rOmpA // Int. J. Syst. Bacteriol. 1998. - Vol. 48. - P.839-849.

59. Fredricks D.N. and Relman A.D. Sequence-based identification of microbial pathogens: a reconsideration of Koch's postulates // Clin. Microbiol. Rev. -1996. Vol; 9, N 1.-P. 18-33.

60. Friedman C., Andree K.B., Beauchamp K.A., et al. "Candidatus Xenohaliotis californiensis", a newly described pathogen of abalone, Haliotis spp., along the west coast of North America // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2000. - Vol. 50. -P.847-855.

61. Garrity G.M., Winters M., and Searles D. Bergey's manual of systematic bacteriology, 2nd ed. Apr. 2001, New York: Springer-Verlag. - P. 1567.

62. Gear J.H.S. South African typhus // S. Afr. J. Med. Sci. 1938. - Vol. 3. P. 134160.

63. Goddard J. Pathogenic and nonpathogenic Rickettsiae in ticks: a confusing issue // Infect. Med. 2001. - Vol. 18, N 9. - P.411-413.

64. Gubbels J.M., de Vos A.P., van der Weide M., et al. Simultaneous detection of bovine Theileria and Babesia species using reverse line blot hybridization // J. Clin. Microbiol. 1999.-Vol. 37.-P.1782-1789.

65. Gupta R.S., and Golding G.B. The origin of the eukaryotic cell // Trends Biocem. Sci. 1996. - Vol. 21. - P.166-171.

66. Higgins J. A., and Azad A.F. Use of polymerase chain reaction to detect bacteria in arthropods: A review // J. Med. Entomol. 1995. - Vol. 32. - P.213-222.

67. Higgins J.A., Radulovic S., Schriefer M.E., and Azad A.F. Rickettsia felis: a new species of pathogenic rickettsia isolated from cat fleas // J. Clin. Microbiol. -1996. Vol. 34. - P.671-674.

68. Kahn M., Kolter R., and Thomas C. Plasmid cloning vehicles derived from plasmids ColEl, F, R6K, and RK2 // Methods Enzymol. 1979. - Vol. 68. -P.268-280.

69. Kelly, P.J., and Mason P.R. Serological typing of spotted fever group rickettsia isolates from Zimbabwe // J. Clin. Microbiol. 1990. - Vol. 28. - P.2302-2304.

70. Koch R. 1891. Uber bakteriologische Forschung Verhandlung des X Internationalen Medichinischen Congresses, Berlin, 1890, 1,35. August Hirschwald, Berlin.

71. La Scola В., and Raoult D. Laboratory diagnosis of rickettsioses: current approaches to diagnoses of old and new rickettsial diseases // J. Clin. Microbiol. 1997. - Vol. 35. - P.2715-2727.

72. Lou D., Wu Y.M., Wang В., et al. Confirmation of patients with tick-borne spotted fever caused by Rickettsia heilongjiangii II Chin. J. Epidemiol. 1989. -Vol. 10. — P.128-132.

73. Maxam A.M., and Gilbert W. A new method for sequencing DNA // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1977. - Vol. 74. - P.560-564.

74. McDade J., and Anderson B.E. Molecular epidemiology: applications of nucleic acid amplification and sequence analysis // Epidemiol. Rev. 1996. - Vol. 18, N 1. -P.90-97.

75. Murray R.G.E., and Schleifer K.H. Taxonomic notes: a proposal for recording the properties of putative taxa of prokaryotes // Int. J. Syst. Bacteriol. 1994. -Vol. 44.-Pi 174-176.

76. Murray R.G.E., and Stackebrandt E. Taxonomic note: implementation of the provisional status Candidatus for incompletely described prokaryotes // Int. J. Syst. Bacteriol. 1995. - Vol. 45. - P. 186-187.

77. Nichol S.T., Spiropoulou C.F., Morzunov S., et al. Genetic identification of a hantavirus associated with an outbreak of acute respiratory illness // Science. -1993.-Vol. 262. -P.914-917.

78. Nilsson K., Lindquist O., and Pahlson C. Association of Rickettsia helvetica with chronic perimyocarditis in sudden cardiac death // Lancet. 1999. - Vol. 354. -P.l 169-1173.

79. Noda H., Munderloh U.G., and Kurtti T.J. Endosymbionts of ticks and their relationship to Wolbachia spp. and tick-borne pathogens of humans and animals // Appl. Environ. Microbiol. 1997. - Vol. 63, N 10. - P.3926-3932.

80. Paddock C.D., Sumner J.W., Comer J.A., et al. Rickettsiaparkeri: a newly recognized cause of spotted fever rickettsiosis in the United States // Clin. Infect. Dis. 2004. - Vol. 38. - P.805-811.

81. Parola P., and Raoult D. Ticks and tick-borne bacterial diseases in humans: an emerging infectious threat // Clin. Infect. Dis. 2001. - Vol. 32. - P.897-928.

82. Pijper A. Tick-bite fever // S. Afr. Med. J. 1934. - Vol. П.- P.551-556.

83. Pijper A. Etude experimental comparee de la Fievre boutonneuse et de la tick bite fever // Arch. Inst. Pasteur Tunis. 1936. - Vol. 25. - P.388-401.

84. Pretorius A.-M., and Birtles R.J. Rickettsia aeschlimannii: a new pathogenic spotted fever group Rickettsia, South Africa // Emerg. Infect. Dis. 2002. - Vol. 8, N 8. - P.874.

85. Radulovic S., Higgins J.A., Jaworski D.C., et al. Isolation, cultivation, and partial characterization of the ELB agent associated with cat fleas // Infect. Immun. 1995. - Vol. 63. - P.4826-4829.

86. Raoult D. A new rickettsial disease in the United States // Clin. Infect. Dis. 2004. - Vol. 38. - P.812-813.

87. Raoult D., Berbis P., Roux V., et al. A new tick-transmitted disease due to Rickettsia slovaca II Lancet. 1997. - Vol. 350. - P. 112-113.

88. Raoult D., Birg M.L., La Scola B. Cultivation of the bacillus of Whipple's disease // N. Engl. J. Med. 2000. - Vol. 342. - P.620-625.

89. Raoult D., Brouqui P., and Roux V. A new spotted-fever-group rickettsiosis // Lancet. 1996. - Vol. 348. - P.412.

90. Raoult D., and Dasch G. A. Immunoblot cross-reactions among Rickettsia, Proteus spp. and Legionella spp. in patients with Mediterranean spotted fever // FEMS Immunol. Med. Microbiol. 1995.-Vol. 11.-P.13-18.

91. Raoult D., Fournier P.-E., Abboud P., and Caron F. First documented human Rickettsia aeschlimannii infection // Emerg. Infect. Dis. 2002. - Vol. 8, N 7. - P.748-749.

92. Raoult D., Lakos A., Fenollar F., et al. Spotless rickettsiosis caused by Rickettsia slovaca and associated with Dermacentor ticks // Clin. Infect. Dis. -2002. Vol. 34. - P.1331-1336.

93. Raoult D., and Roux V. Rickettsioses as paradigms of new or emerging infectious diseases // Clin. Microbiol. Rev. 1997. - Vol. 10. - P.694-719.

94. Regnery R.L., Spruill C.L., and Plikaytis B.D. Genotypic identification of rickettsiae and estimation of intraspecies sequence divergence for portions of two rickettsial genes // J. Bacteriol. 1991. - Vol. 173. - P.1576-1589:

95. Relman D. A. The identification of uncultured microbial pathogens // J. Infect. Dis. 1993. - Vol. 168. - P. 1-8.

96. Relman D.A., Schmidt T.M., MacDermott R.P., and Falkow S. Identification of the uncultured bacillus of Whipple's disease //N. Engl. J. Med. 1992. - Vol. 327. - P.293-301.

97. Ricketts H.T. Some aspects of Rocky Mountain spotted fever as shown by recent investigations // Med. Rec. 1909. - Vol. 16. - P.843-855.

98. Rivers T.M. Viruses and Koch's postulates // J. Bacteriol. 1937. - Vol. 33.-P.1-12.

99. Roux V., and Raoult D. Phylogenetic analysis of the genus Rickettsia by 16S rDNA sequencing // Res. Microbiol. 1995. - Vol. 146. - P.385-96.

100. Roux V., and Raoult D. Phylogenetic analysis of members of the genus Rickettsia using the gene encoding the outer-membrane protein rOmpB (ompB) // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2000. - Vol. 50. - P. 1449-1455.

101. Roux V., Rydkina E., Eremeeva M., and Raoult D. Citrate synthase gene comparison, a new tool for phylogenetic analysis, and its application for the rickettsiae // Int. J. Syst. Bacteriol. 1997. - Vol. 47. - P.252-261.

102. Rudakov N.V., Shpynov S.N., Samoilenko I.E., and Tankibaev M.A. Ecology and epidemiology of spotted fever group Rickettsiae and new data from their study in Russia and Kazakhstan // Ann. N. Y. Acad. Sci. 2003. - Vol. 990. -P. 12-24.

103. Rydkina, E., V. Roux, N. Fetisova, N. et al. New rickettsiae in ticks collected in territories of the former Soviet Union // Emerg. Infect. Dis. 1999. -Vol.5.-P.811-814.

104. Saiki R.K., Gelfand D.H., Stoffel S., et al. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase // Science. 1988. -Vol. 239. -P.487-491.

105. Saiki R.K., Scharf S., Faloona F., et al. Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia// Science. 1985. - Vol. 230. - P. 1350-1354.

106. Sanger F., Nicklen S., and Coulson A.R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1977. - Vol. 74. -P.5463-5467.

107. Schriefer M.E., Sacci J.B.J., Dumler J.S., et al. Identification of a novel rickettsial infection in a patient diagnosed with murine typhus // J. Clin. Microbiol. 1994. - Vol. 32. - P.949-954.

108. Shpynov, S., P. Parola, N. Rudakov, I. et al. Detection and identification of spotted fever group rickettsiae in Dermatocentor ticks from Russia and central Kazakhstan // Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 2001. - Vol. 20. - P.903-905.

109. Shpynov S., Fournier P.-E., Rudakov N., and Raoult D. "Candidatus Rickettsia tarasevichiae" in Ixodes persulcatus ticks collected in Russia // Ann. N. Y. Acad. Sci. 2003. - Vol. 990. - P. 162-72.

110. Sparagano O.A.E., Allsopp M.T.E.P., Mank R.A., et al. Molecular detection of pathogen DNA in ticks (.Acari:Ixodidae): A review // Exp. Appl. Acarol. 1999. - Vol. 23. - P.929-960.

111. Stewart R.S. Flinders Island spotted fever: a newly recognised endemic focus of tick typhus in Bass Strait. 1. Clinical and epidemiological features // Med. J. Aust. 1991. - Vol. 154. - P.94-99.

112. Stothard D.R:, Clark J.B., and Fuerst P. A. Ancestral divergence of Rickettsia bellii from the spotted fever and typhus groups of Rickettsia and antiquity of the genus Rickettsia II Int. J. Syst. Bacteriol. 1994. - Vol. 44. -P.798-804.

113. Stothard D.R., and Fuerst P. A. Evolutionary analysis of the spotted fever and typhus groups of Rickettsia using 16S rRNA gene sequences // Syst. Appl. Microbiol. 1995. - Vol. 18. - P.52-61.

114. Sumner J.W., Nicholson W.L., and Massung R.F. PCR amplification and comparison of nucleotide sequences from the groESL heat shock operon of Ehrlichia species // J. Clin. Microbiol. 1997. - Vol. 35. - P.2087-2092.

115. Tarasevich I.V., Makarova V.A., Fetisova N.F., et al. Studies of a "new" rickettsiosis, "Astrakhan" spotted fever // Eur. J. Epidemiol. 1991. - Vol. 7. -P.294-298.

116. Uchida Т., Yu X.J., Uchiyama Т., and Walker D.H. Identification of a unique spotted fever group rickettsia from humans in Japan // J. Infect. Dis. -1989.-Vol. 159.-P.l 122-1126.

117. Walker D.H., Cain B.G., and Olmstead P.M. Laboratory diagnosis of Rocky Mountain Spotted Fever by immunofluorescent detection of Rickettsia rickettsii in cutaneous lesions // Am. J. Clin. Pathol. 1978. - Vol. 69, N. 6. -P.619-623.

118. Walker D.H., Gay R.M., and Valdes-Dapena M. The occurrence of eschars in Rocky Mountain spotted fever // Am. Acad. Dermatol. 1981. - Vol. 4. -P.571-576.

119. Wang-J.W., and Walker D.H. Identification of spotted fever group rickettsiae from human and tick sources in the People's Republic of China // J. Infect. Dis. 1987. - Vol. 156, N 4. - P.665-669.

120. Ward D.M., Weller R., and Bateson M.M. 16S rRNA sequences reveal numerous uncultured microorganisms in a natural community // Nature (London). 1990.-Vol. 345. -P.63-65.

121. Weil E., and Felix A. Zur serologischen Diagnose des Fleckfiebers // Wien. Klin. Wochenschr. 1916. - Vol. 29. -P.33-35.

122. Weisburg W.G., Barns S.M., Pelletier D.A., and Lane D.J. 16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study // J. Bacteriol. 1991. - Vol. 173. -P.697-703.

123. Wilson K.H., Blitchington R.B., and Greene R.C. Amplification of bacterial 16S ribosomal DNA with polymerase chain reaction // J. Clin. Microbiol. 1990. - Vol. 28, N 9. - P. 1942-1946.

124. Woese C. Bacterial evolution // Microbiol. Rev. 1987. - Vol. 51, N 2. -P.221-271.

125. Woese C., Kandler O., and Wheelis M.L. Towards a natural system of organisms: proposal for the domains Archaea, Bacteria and Eucarya II Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1990. - Vol. 87. - P. 4576-4579.

126. Yu X., Fan M., Xu G., et al. Genotypic and antigenic identification of two news strains of spotted fever group rickettsiae isolated from China // J. Clin. Microbiol. 1993. - Vol. 31. - P. 83-88.

127. Zhang J.Z., Fan Y., Wu Y.M., et al. Genetic classification of "Rickettsia heilongjiangii" and "Rickettsia hulinii," two Chinese spotted fever group rickettsiae // J. Clin. Microbiol. 2000. - Vol. 38. - P.3498-3501.

128. Искренне благодарен сотрудникам лаборатории риккетсиологии Медицинского факультета Средиземноморского Университета (г. Марсель, Франция) во главе с профессором Didier Raoult за бескорыстную помощь в проведении исследований.

129. Выражаю глубокую признательность ученому секретарю НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи, доктору медицинских наук профессору Екатерине Владимировне Русаковой.12

130. Министерство здравоохранения Хабаровского края

131. УТВЕРЖДАЮ Министр здравоохранения Хабаровского края

132. S^fofr В М.Савкова "10" июня 2004 г.

133. КЛЕЩЕВОЙ РИККЕТСИОЗ, ВЫЗЫВАЕМЫЙ RICKETTSIA HEILONGJIANGENSIS, В ХАБАРОВСКОМ КРАЕметодическое пособие для специалистов здравоохранения)1. Хабаровск 2004

134. Пособие предназначено для врачей-инфекционистов, микробиологов, эпидемиологов.

135. Эпидемиология клещевого риккетсиоза в Хабаровском крае.5

136. Этиология клещевого риккетсиоза в Хабаровском крае.6

137. Клиническая характеристика клещевого риккетсиоза, вшиваемого Rickettsia heilongjiangensis.7

138. Серологическая диагностика.8

139. Молекулярно-биологические методы диагностики риккегтсиозов.9

140. Комплексное обследование.10

141. Список использованной литературы.111. Введение

142. Эпидемиология клещевого риккетсиоза в Хабаровском крае

143. Численность населения этих районов 1203,3 тысяч человек, что составляет 84,4% от обшей оценочной численности населения Хабаровского края на начало 2004 года.

144. Таким образом, судя по данным официальной статистики, клещевой риккетсиоз представляет собой значительную проблему для здравоохранения Хабаровского края.

145. Этнология клещевого риккетсиоза в Хабаровском крае

146. Однако отмечалось, что серологическая подтверждаемость клинически установленного диагноза клещевого сыпного тифа зачастую невысока и колеблется в пределах 20-30%.

147. Было выявлено, что во всех случаях, когда удалось идентифицировать этиологический агент, заболевание вызывалось не Rickettsia sibirica, как ожидалось, а другой риккетсией из группы пятнистой лихорадки, Rickettsia heilongjiangensis (1IX

148. Эти данные подтверждены серологическими исследованиями: в парных сыворотках больных людей обнаруживали антитела классов IgG и IgM в нарастающих титрах против Rickettsia heilongjiangensis.

149. Переносчиками этой риккетсии являются клещи рода Haemaphysalis:• Haemaphysai'u concinna основной, инфицированность 28%• Haemaphysalis japonica douglasl менее значимый, инфицированность 4,5%

150. Клиническая мракгеристика клещевого риккетсиоза! вызываемого Rickettsia heilongjiangensis

151. На амбулаторном этапе больным часто устанавливается диагноз острого респираторного заболевания, поскольку в первые дни болезни наблюдается выраженная интоксикация без каких-либо признаков, патогномоничных для заболевания.

152. Признаки вовлечения сердечно-сосудистой системы типичны для острого инфекционного заболевания: глухость сердечных тонов, тахикардия, гипотония.

153. Серологическая диагностике

154. Последнее обусловливает тот феномен, что сыворотки больных любой клещевой пятнистой лихорадкой реагируют с антигенами большинства риккетсий группы КПЛ, но в разной степени.

155. Молекулярно-биологические методы диагностики риккетсиозов

156. ПЦР проводится в два этапа: на первом этапе используется пара прайме-ров

157. CS2d (5'-ATGACCAATGAAAATAATAAT) и

158. CSendR (5'- CTTATACTCTCTATGTACA).

159. На втором этапе материал, полученный в первой реакции используется как субстрат для второй реакции с гнездовыми (nested) праймерами

160. CS877f(5'-GGGGACCTGCTCACGGCGG) и

161. CS1258r (5'-ATTGCAAAAAGTACAGTGAACA).

162. Материалами для исследования могут стать любые пробы, гипотетически содержащие ДНК риккетсий:• Кровь• Биоптаты первичного аффекта• Пукктаты лимфатических узлов• Присосавшиеся к больным клеши.

163. Для идентификации ДНК риккетсий наиболее успешным является исследование биоптатов первичного аффекта. Выделение ДНК проводят традиционными методами.

164. После проведения реакции готовятся те же реактивы, только вместо исследуемого материала добавляют 5 мкл раствора ДНК га пробирки после первой реакции. Обшее количество циклов в реакции с nested праймерами равняется 35.

165. Продукты амплификации можно визуализировать в 1% агарозовом геле, содержащим бромид этидия, путем электрофореза.

166. При наличии после электрофореза полосы размером в 384 пары нуклеотидов реакцию можно считать положительной.1. Комплексное обследование

167. Данное обстоятельство также диктует необходимость назначения более длительного курса лечения препаратами тетрациклинового ряда. Например, доксициклин по 0,1 г 2 раза в сутки в течение 10-14 дней.

168. Список использованной литературы

169. Маевский М.М. Новое в учении о риккетсиошх за последние годы // Журн. мнкро-биол., элидемнол., нммунобиол. I947.-Xa4.-C.3-I4.

170. Медянникоа О.Ю., Сндельннков Ю.Н. Развитие хронического ЛаЯм-боррелиота после излечения клещевого риккетсиоза при одновременном инфицировании // Клиническая медицина -№б. 2002. -С.64-66.

171. Тарасевич И.О., Фетисова Н.Ф. Макарова В.А., Фаталнева С.Ф., Медянников О.Ю. Риккетсиозы. // Природная очаговость болезней: исследования института Гамалеи РАМН. Москва, 2003. С.64-98

172. Томилка Г.С. Клиника и иммуно-аллергические аспекты патогенеза клетевого сыпною тифа Северной Азии. Дисс. канд. мел. наук, Новосибирск, 1987,- 160 с.

173. Сомов Г П. Клещевой рипсегсиоз в Приморском крае (материалы по эпидемиология и этнологии инфекции). Дисс. докт. мед. наук, Москва, 1966. 673 с.

174. Шапиро М.И. Клещевой сыпной тиф на одном из островов Южного Приморья. Дисс. канд. мед. наук, Москва, 1959. -185 с.

175. Шлынов С.Н. Разработка пммунофермекпюй тест-системы дм выявления антигенов риккетсий группы клешевой пятнистой лихорадки и обоснование се применения в системе эпидемиологического надюра за клещевым риккетсиозом. Дисс. канд мед наук, Омск. 1999.-143 с.

176. Dung У., Cesarman Е., Pessin М. S., Lee F., Culpepper J, Knowles D. M., and Moore P. S , Identification of herpesvirus-like DNA sequences in AlDS-associated Kaposi's sarcoma // Science. 1994. - Vol.266. - P. 1865-1869.

177. Chen S. M., Dumlcr J. S., Bakken J. S., and Walker D. Identification of a granulocytotro phic Ehrlichia species аз the etiologic agent of a human disease // J. Clin. Microbiol. -1994. VoL32. - P.589-595.

178. Medianmk'ov O., Sidelmkov Y., Ivanov L, Mokretsova E., Foumier P.-E, Tarasevic'i I., and Raoult D. Acute tick-bome rickcttsiosis caused by Rickettsia heilongfiangtnsis in Russian Far East // Emerg. Infect. Dis. 2004. - Vol. 10(5). - P.810-817.

179. Raoult D., Rout V. Rkkettsioses as paradigms of new or emerging infectious diseases // Clin. Microbiol. Rev. 1997. Vol. 10. - P.694-719.

180. Relman D. A., Schmidt Т. M., MacDermott R. P. and Falkow S. Identification of the uncultured bacillus of Whipple's disease // N. Engl. J. Med. -1992. Vol.327. - P.293-301.

181. Roux V., Rydkina E., Eremeeva M., and Raoult D. Citrate synthase gene comparison, a new tool for phylogenetic analysis, and its application for the rickettsiae II Int. J. Syst Bacteriol. -1997. Vol.47. - PJ252-261.ike

182. Министерство здравоохранения Ро.Федерации

183. ДГ-. "; ГОСуДЗрСТБЗКНЫЙ v >мсхийуш5|шт

184. Заведующий кафедрой туберкулеза и инфекционных болезней ГОУДПО «Институт повышения квалификации специалистов здравоохранения»доцентт

185. Минисгсг^тт'.; ^-рнгсохранения Ро wi. Федерации

186. S80000, г. Хабаровск ул. Муравьева-Амурского, 35 тел.1. На Nsотот1. АКТоб использовании методического пособия для специалистовздравоохранения

187. Директор клиники инфекционных и паразитарных болезней ДВГМУ профессор ^1. Г.С.Томилка1. УТВЕРЖДАЮ»1. V 5 Vj Iо"кру>:спсп пэгпныйклиш.чз. . i;й госпитальминистерство обороны

188. РОССИПСГОП ОГЛГРЛПИИ (МИНОБОРОЧ1 ! РОССИИ)ого госпиталя Б.Н.КорсяковиА>,±1.2С0Уг. № /ЗЩг. Хабаропск, 3800 2 81. На№21. АКТоб использовании методического пособия для специалистовздравоохранения

189. Главный инфекционист Дальневосточного военного округа

190. МГУЧГ' "CTS'.I S-.^-ViJ^i'iSKKa

191. Заведующий инфекционным отделением /у / ^ В.И.Жолондзь1. В.В.Юхно2 сентября 2004 года

192. ФЕДЕРАЛЬНАЯ ПОГРАНИЧНАЯ СЛУЖБА российской федераци ■ б военный госпиталь ----- 20г.г. Хабаровск1. АКТоб использовании методического пособия для специалистовздравоохранения

193. Министерство здравоохранения Российской Федерации Государственное учреждениере•Ht?

194. ХАБАРОВСКАЯ ПРОТИВОЧУМНАЯ СТАНЦИЯ680031, г.Хабаровск, Санитарный переулок, 7 Телефон: [phone] Факс: [phone] E-mail: [e-mail]