Клонирование и исследование нового гена Camello в раннем развитии Xenopus laevis тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, кандидат биологических наук Попсуева, Анна Эдуардовна

• Попсуева, Анна Эдуардовна
• кандидат биологических наук
• 2001

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Попсуева, Анна Эдуардовна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Раннее развитие Xenopus laevis

Гены, участвующие в эмбриональной индукции

Регуляция клеточных движений на стадии гаструлы

Семейство ацетилтрансфераз

1. Функции ацетилтрансфераз в цитоплазме

2. Ядерные ацетилтрансферазы

3. Ацетилирование сиаловых кислот в комплексе Гольджи

Комплекс Гольджи. Распределение мембранных белков между эндоплазматическим ретикулумом и комплексом Гольджи

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

1. Биологический материал

2. Поиск дифференциально экспрессирующихся генов Xenopus laevis

3. Клонирование гена Xcml

4. Секвенирование, анализ последовательности кДНК

5. Создание генных конструктов в экспрессионных плазмидных векторах

6. Анализ экспрессии гена Xcml в ходе развития Xenopus laevis

7. Анализ пространственной картины экспрессии генаХст^

8. Микроинъекции мРНК Xcml, синтезированной in vitro, в эмбрионы Xenopus

9. Культивирование клеток COS-1, экспрессия рекомбинантного белка и прижизненное окрашивание ядер

10. Фракционирование COS-1 клеток

11. Экспрессия белка в ооцитах Xenopus, фракционирование клеточного содержимого

12. Исследование внутриклеточной локализации Xcml с помощью конфокальной микроскопии

13. Гистологическая обработка и световая микроскопия

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Клонирование нового гена Camello Xenopus laevis

Новое генное семейство Camello

Исследование области и времени экспрессии гена Xcml

Исследование функций Xcml во время раннего развития Xenopus

Исследование внутриклеточной локализации белка Xcml

ВЫВОДЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Клонирование и исследование нового гена Camello в раннем развитии Xenopus laevis»

Основным вопросом биологии раннего развития является процесс образования сложной системы из относительно простой под действием внутренних и внешних сигналов. В ходе развития позвоночных различают три этапа формирования взрослого организма. На первом этапе, оплодотворенная яйцеклетка многократно делится, образуя бластулу, затем, во время гаструляционных движений, в ходе взаимодействия зародышевых листков -эктодермы, мезодермы и эндодермы, формируется план строения всего зародыша. На втором этапе, который называется органогенезом, появляются закладки всех органов. И, наконец, заключительная фаза, во время которой все структуры завершают свой рост, и формируется взрослый организм.

Гаструляция является важнейшей стадией развития позвоночных, в это время происходят значительные изменения клеточной морфологии, клеточной подвижности и адгезии. Процесс гаструляции начинается на дорсальной стороне, где клетки мезодермы инволюируют через губу бластопора и движутся по крыше бластоцеля к аномальному полюсу. При этом эндодерма постепенно втягивается внутрь, а эктодермальные клетки стекают с анимального полюса вниз и к концу гаструляции покрывают весь зародыш [Keller, 1986].

Последние несколько лет большое внимание уделяется изучению молекулярных механизмов, лежаших в основе этих процессов, хотя по-прежнему довольно мало известно о тонкой регуляции морфогенетических движений. Известно, что дорсальная губа бластопора и возможно вся зона инволюирующей мезодермы являются источниками сигналов, координирующих гаструляционные движения и определяющих прямо или опосредованно специализацию тканей [Blumberg et al., 1991; von Dassow et al., 1993;

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Раннее развитие Xenopus laevis

Ооциты Xenopus laevis имеют все типичные черты женских гамет: они гаплоидны, имеют значительные, по сравнению с соматическими клетками и спермиями, размеры (около 1 мм в диаметре), содержат разнообразные запасные вещества и окружены сложной оболочкой. В цитоплазме оодита содержатся питательные вещества, рибосомы и тРНК, значительные запасы которых обеспечат бурный синтез белка сразу после оплодотворения, а также материнские мРНК в неактивном состоянии. Кроме того, в цитоплазме ооцита неравномерно распределены морфогенетические факторы - белки, направляющие дифференцировку тканей и органов; при дроблении они распределяются между различными клетками [Melton, 1987].

Непосредственно над цитоплазматической мембраной лежит тонкая желточная оболочка, образованная гликопротеинами. Она играет важную роль в обеспечении видоспецифичности оплодотворения. Над ней - толстая студенистая виттелиновая оболочка, образованная также гликопротеинами, и участвующая в привлечении спермиев. Под плазматической мембраной находится слой кортикальной цитоплазмы. Кортикальная цитоплазма более вязкая, чем глубокие слои, и содержит кортикальные гранулы и глобулярный актин в высокой концентрации. По распределению желтка, яйца Xenopus мезолецитальные, желток скапливается в вегетативном полюсе, у них хорошо видны светлый вегетативный и пигментированный анимальный полюса [Gilbert, 1988].

К моменту проникновения спермия, яйцеклетки Xenopus находятся в метафазе второго деления мейоза. Спермий может проникнуть в любую точку анимального полушария, но здесь возникает проблема - клеточная мембрана ооцита должна быть способна слиться с мембраной спермия, и при этом допустить проникновение только одного сперматозоида [Just, 1919]. Существует механизм, предотвращающий полиспермию и состоящий из двух фаз - быстрой и медленной.

Мембранный потенциал у ооцита в нормальном состоянии состовляет около -70 мВ. Он определяется разностью концентраций ионов калия и натрия. Цитоплазматическая концентрация ионов калия больше, чем во внеклеточном пространстве, а натрия, наоборот, меньше. После слияния клеточных мембран ооцита и первого спермия, в цитоплазму яйца поступают ионы натрия, в результате мембранный потенциал становиться положительным и достигает +20 мВ, что делает невозможным связывание других сперматозоидов. С момента проникновения сперматозоида до изменения мембранного потенциала в положительную сторону проходит всего 0.1 секунды [Jaffe, 1980], поэтому этот процесс называют быстрым блокированием полиспермии. Он был изучен на морском еже, а позднее и на лягушке [Cross and Elinson, 1980]. Но мембранный потенциал сохраняется положительным не больше минуты и этого времени недостаточно для предотвращения множественного оплодотворения яйцеклетки. Существует второй, механический блок полиспермии, который связан с кортикальной гранулярной реакцией и развивается через 1 минуту после связывания сперматозоида с яйцом. Реакция заключается в Са2+-зависимом слиянии кортикальных гранул с плазматической мембраной, при этом их содержимое высвобождается в пространство между плазмалеммой и желточной оболочкой. Протеолитические ферменты, содержащиеся в гранулах, растворяют белки, прикрепляющие желточную оболочку к плазматической мембране, а осмотически активные вещества (мукополисахариды) привлекают в это пространство воду. В результате желточная оболочка отходит от плазмалеммы. В ходе реакции от плазмалеммы отделяются или модифицируются рецепторы спермиев вместе с прикрепившимися спермиями и новое оплодотворение становится невозможным [Glabe and Vacquier, 1978]. Кортикальная реакция распространяется по всей поверхности яйцеклетки волнообразно, начиная с места проникновения спермия, в течение 5-6 минут.

Повышение внутриклеточной концентрации Са2+ приводит к изменениям в структуре цитоплазмы яйца. Во время первого клеточного цикла поверхностный слой цитоплазмы смещается примерно на 30° относительно внутренней массы, происходит кортикальный поворот, в результате чего в области экватора напротив места проникновения спермия образуется серый серп, хорошо видимый у некоторых видов животных [Vincent and Gerhart, 1987; Vincent et al., 1986]. У Xenopus серый серп визуально неразличим, однако наличие кортикального поворота у шпорцевой лягушки было продемонстрировано следующим образом: на субкортикальной цитоплазме яйца отпечатывали гексагональную решетку красителя нильского голубого, а на поверхности оболочки - пятна флуоресцеина. Яйцо иммобилизовали и после оплодотворения наблюдали смещение пятен красителей друг относительно друга [Vincent et al., 1986].

Серый серп всегда возникает на противоположной стороне зародыша от места проникновения сперматозоида и обозначает дорсальную сторону. В этой области бесцветный кортекс вегетативного полушария покрывает пигментированную анимальную цитоплазму, в результате цитоплазма двух полюсов перемешивается на дорсальной стороне зародыша. Кортикальный поворот приводит к образованию зоны, где активируются факторы, необходимые для последующего развития дорсальных структур. Это было продемонстрировано в ходе нескольких экспериментов.

При пересадке области серого серпа на вентральную сторону другого зародыша, у эмбриона развивается вторая ось [Yuge et al., 1990].

Если оплодотворенные эмбрионы облучить с вегетативной стороны ультрафиолетовым светом, то под его воздействием разрушается сеть микрофиламентов, которая руководит кортикальным поворотом. В результате у зародышей полностью или частично будут отсутствовать дорсо-антериальные структуры, такие как голова, хорда, нервная трубка и сомиты [Manes and Elinson, 1980].,

Таким образом кортикальный поворот приводит к двум важным событиям в ходе развития - образование второй дорсо-вентральной оси и активации факторов индукции дорсальных структур эмбриона.

Следующий процесс развития - дробление, приводящее к образованию бластулы. Деление дроблением отличается от нормальных митозов: клетки не растут (период G1 сильно сокращен, а период G2 отсутствует) и быстро колеблются между М и S-фазой. Все необходимое для протекания и синхронизации процессов уже имеется в оплодотворенном яйце, и вплоть до двенадцатого деления геном зародыша "молчит". В начале образования бластулы в вегетативной области обособляется свободная от желтка область - зародышевая плазма, которая даст начало половым клеткам. Борозда первого деления появляется на анимальном полушарии и распространяется по направлению к вегетативному полюсу, разделяя серый серп, вторая борозда ложится также меридианально, перпендикулярно первой, а третья - параллельно плоскости экватора, но несколько ближе к анимальному полюсу, так как желток затрудняет прохождение борозды. С этого момента дробление идет асимметрично и приводит к образованию мелких часто делящихся анимальных бластомеров и крупных вегетативных. Борозды дробления формируются таким образом, что уже после первого деления появляется небольшая полость - зачаток бластоцеля. Бластула представляет собой полый шар, верхняя часть которого - крыша бластоцеля составлена из нескольких слоев мелких клеток, а нижняя - из более крупных вегетативных бластомеров (Рис.1 А).

Бластоцель, по-видимому, выполняет две основные функции: во-первых, является полостью, в которую смогут мигрировать клетки при гаструляции и, во-вторых, не дает клеткам крыши, презумптивной эктодерме, соприкасаться с вегетативными бластомерами, секретирующими мезодермальные индукторы. Таким образом предотвращается/ неправильная дифференцировка анимальных клеток.

Вплоть до 12-го деления дробления в яйце еще достаточно мРНК, накопленной во время оогенеза, но их запас постепенно истощается. Через 6-7 часов после оплодотворения начинается транскрипция генома зародыша, удлиняется клеточный цикл, и теряется синхронизация дробления, клетки начинают выпускать лобоподии и филоподии [Hausen and Riebesell, 1991]. Все эти изменения происходят за очень короткое время. Эту стадию называют "переходом средней бластулы" (Midblastula Transition, МВТ). Время наступления МВТ связано с отношением объема цитоплазмы к количеству РНК, что было показано в ряде экспериментов [Newport and Kirshner, 1982 I; II].

Следующая стадия развития позвоночного животного - гаструляция. Это в высшей степени сложный и согласованный процесс, во время которого происходят клеточные перестройки и формируется план строения животного. Xenopus laevis является классическим объектом для изучения этого процесса.

Гаструляции предшествует эпиболия анимальных клеток - поверхностное движение эпителиального клеточного пласта, при которой анимальное полушарие растягивается и закрывает часть вегетативного. При этом клетки движутся как одно целое, все вместе. Гаструляция начинается в экваториальной зоне, на дорсальной стороне (Рис.1 В). Клетки мезодермы, лежащие чуть ниже экватора, начинают инволюировать внутрь зародыша, перекатываясь через дорсальную губу бластопора. Они движутся по крыше бластоцеля к передней, анимальной части зародыша, при этом бластоцель смещается и формируется архентерон (Рис. 1С). Эндодермальные клетки впячиваются внутрь зародыша, сохраняя контакт с поверхностью. Затем начинается инвошщия клеток краевой зоны, при этом эпиболия анимальных клеток по направлению к бластопору продолжается (Рис.Ш). Материал губы бластопора постоянно меняется. Первые подвернувшиеся клетки являются будущей мезодермой головы, за ними следуют клетки презумптивной хордомезодермы. Во время инволюции бластоцель оттесняется на вентральную сторону зародыша. Бластопор постепенно расширяется в виде изогнутой складки, концы которой ползут к вентральной стороне зародыша и наконец смыкаются, образуется вентральная губа бластопора. Бластопор кольцом окружает крупные эндодермальные клетки - желточную пробку, которые постепенно погружаются внутрь, с ходом гаструляции края бластопора сужаются и в конце концов замыкаются в точку. В результате образуется трехслойный зародыш - эктодерма покрывает зародыш снаружи, эндодерма втянута внутрь, мезодерма находится между ними (Рис. 1F).

Кроме эпиболии эпителия анимального полюса и миграции мезодермы по внутренней стороне крыши бластоцеля в ходе гаструляции происходят клеточные перестройки дорсальной части маргинальной зоны, соседствующей с дорсальной губой. Они включают конвергенцию клеток в латеро-медиальном направлении и растяжение по серединной линии дорсальной стороны эмбриона [Keller, 1986]. В основном именно за счет этих движений достигается удлиннение зародыша в антеро-постериальном направлении. образуя нервные валики, которые движутся навстречу друг другу и сливаются, образуя открытую с обоих концов нервную трубку. Клетки нервного гребня, соединившиеся при этом, в дальнейшем мигрируют и дают начало периферической нервной системе; нервная трубка отшнуровывается от вышележащей эктодермы [Hausen and Riebeseil, 1991].

Установление спинно-брюшной и передне-задней осей тела, формирование трех основных типов ткани и ее последующая дифференцировка - явления мало изученные. Для их изучения применяются различные подходы, от микрохирургии до математического моделирования. Одно из активно развивающихся направлений - молекулярно-биологическое, где основной метод исследований - поиск генов, необходимых для развития зародыша и изучение их взаимодействия с продуктами других генов-маркеров.

Гены, участвующие в эмбриональной индукции

Ключевое явление в развитии позвоночных - формирование эмбриональных осей. Неоплодотворенные яйца лягушки имеют только одну анимально-вегетативную ось. Полярность яйца создается в ходе оогенеза, когда многочисленные внутриклеточные компоненты распределяются между вегетативным и анимальным полушарием. Важнейшие события после оплодотворения - установление дорсо-вентральной оси и индукция мезодермы. Дорсо-вентральная ось устанавливается во время первого клеточного цикла, после поворота кортикальной цитоплазмы (см. предыдущую главу).

Следующее формообразующее событие - индукция мезодермы, связанное с образованием центра начала гаструляции - организатором Шпеманна (область дорсальной губы). Классические эксперименты Ньюкупа по конъюгации эксплантантов анимального и вегетативного полюсов продемонстрировали, что вегетативные клетки эндодермы способны вызвать в анимальных шапочках образование мезодермальных тканей

Nieuwkoop, 1969]. Более того, тип ткани, развивающийся в подобных "сэндвичах", зависит от дорсо-вентральной полярности эндодермальных фрагментов. В результате конъюгации эктодермы анимальных шапочек с дорсальной вегетативной эндодермой, известной как центр Ньюкуповской индукции, в анимальных шапочках возникает дорсальная мезодерма (будущий организатор Шпеманна). В аналогичных экспериментах с вентральными эксплантантами в анимальных шапочках индуцируется вентральная мезодерма [Nieuwkoop, 1973; Dale and Slack, 1987]. Эти эксперименты привели к созданию трех-сигнальной модели (Рис.2). Согласно этой модели, эндодерма содержит два типа полярно локализованных факторов: одни локализованы в дорсо-вегетативных бластомерах и индуцируют образование организатора и мезодермы осевого комплекса (хорду и сомиты), другие - в вентральных и индуцируют развитие вентральной мезодермы - мезенхимы и кровяных островков. ^Первичная индукция происходит до включения генома зародыша во время МВТ за счет материнских факторов, накопленых в оогенезе. После МВТ третий индукционный сигнал распространяется от организатора по маргинальной зоне и анимальному полушарию зародыша.

Рисунок 2. Трех-сигнальная модель [Smith, 1989]. На стадии ранней бластулы вегетативный полюс посылает два сигнала: вентральный индуцирует вентральную мезодерму, а дорсальный - организатор Шпеманна. Во время гаструляции организатор посылает третий, дорсализующий сигнал в маргинальную зону. Из области МЗ формируется мышечная ткань, и только из самой вентральной Ml - кровяные островки. А - анимальное полушарие, VV - вентральная вегетативная область, DV - дорсальная вегетативная область, VM - вентральная мезодерма, О - организатор Шпеманна (дорсальная мезодерма), Ml, М2, МЗ - в разной степени дорсализованная мезодерма.

Область организатора получила свое название после опытов Шпеманна по пересадке дорсальной губы на вентральную сторону зародыша, в результате чего развивалась эктопическая вторая ось [Spemann and Mangold, 1924].

В последние несколько лет усилия многих исследований были направлены на идентификацию молекул, вовлеченных в индукцию осей и дифференцировку мезодермы. В настоящее время известны некоторые компоненты дорсального и вентрального путей.

1. Wnt: путь передачи дорсального сигнала

Формирование дорсальной оси у Xenopus зависит от цитоплазматических компонентов, гомологичных элементам сигнального пути Wingless у Drosophila [Sokol, 1996]. В результате взаимодействия одного из членов белкового семейства Wnt с соответствующим Frizzled-подобным рецептором, активируется цитоплазматический белок Dishevelled (Рис.3), ингибирующий серин/треониновую протеинкиназу GSK-3(3 (glycogen synthase kinase) [Sokol, 1996]. GSK-3P ингибирует дорсальный путь передачи сигнала, влияя на стабильность р-катенина [Wylie, 1996]. Доминантно-негативная форма GSK-Зр вызывает эктопическое формирование осевых структур в зародыше Xenopus [Dominguez, 1995]. При активации Dishevelled ингибирующее действие GSK-3J3 подавлено, уровень цитоплазматического (3-катенина возрастает, и р-катенин переходит в ядро в комплексе с транскрипционным фактором Tcf-3. Комплекс Р-катенин/Тс^З действует как транскрипционный фактор, стимулируя wnt-активируемые гены, такие, как goosecoid (gsc) - транскрипционный фактор, участвующий в организации головных структур [Cho, 1991] и Siamois - материнский ген, способный формировать эктопическую дорсальную ось [Lemaire, 1995].

0 Presence of Freb .T~(b) Absence ofFrzb

Рисунок 3. Сигнальный путь Wnt. (a) Frzb связывает Wnt, предотвращая его взаимодействие с рецептором Frizzeled, GSK-3ß вызывает деградацию ß-катенина; (b) Wnt связывается с рецептором, Dishevelled (Dsh) инактивирует GSK-3ß, цитоплазматический пул ß-катенина растет и в комплексе с транскрипционнам фактором Tcf запускает транскрипцию Wnt-зависимых генов [Рисунок взят из Zorn, 1997].

В течении долгого времени для объяснения причин индукции различных тканей в ходе развития привлекались модели морфогенетических градиентов [Huxley, 1934], согласно которым клетки направлялись по тому или иному пути дифференцировки в зависимости от концентрации сигнальной молекулы [Dalcq and Pasteeis, 1937]. За последущие годы было собрано множество эксперементальных данных. Например, обнаруженные секреторные антагонисты таких индукторов, как BMP (bone morphogenic protein) [Thomsen, 1997] и Wnt (см. ниже), позволили сформулировать новые модели раннего развития.

Антагонистом Wnt является Frzb - секретируемый белок, необыкновенно похожий на внеклеточный амино-концевой домен рецептора Wnt - Frizzled [Wang, 1997]. Frzb представляет белковое семейство, в настоящее время клонировано 5 членов этого семейства [Hoang, 1998; Hu, 1998]. Frzb связывает Wnt и тем самым предотвращает его взаимодействие с рецептором. В отсутствие Wnt GSK-3ß фосфорилирует цитоплазматический ß-катенин и вызывает его деградацию. Передачи сигнала внутрь клетки не происходит [Zorn, 1997] . Но Frzb не единственный антагонист сигнального пути Wnt.

Cerberus - секреторный фактор, экспрессирующийся на стадии гаструлы в районе организатора, предполагается, что он участвует в индукции головных структур [Bouwmeester, 1996]. В тоже время, эктопически экспрессированный в дорсальной мезодерме Wnt-8 ингибирует процесс развития головы [Christian, 1993]. Совсем недавно было установлено, что Cerberus является ингибитором сигнального пути Wnt во время раннего развития эмбрионов Xenopus, хотя механизм его действия еще не выяснен [Glinka, 1997].

Исходя из того, что области экспрессии обоих антагонистов сигнального пути Wnt перекрываются в районе дорсальной губы, можно предположить, что организатор -источник множества ингибиторов Wnt, которые выполняют роль тонких регуляторов индукционных взаимодействий.

2. ВМР4: вентральный путь передачи сигнала

Классические эксперименты Шпеманна и его коллег, поставленные 75 лет назад [обзор Smith, 1989] привели к созданию дорсо-вентральной модели развития. В этих экспериментах дорсальный эксплантат пересаживали на вентральную сторону нормального зародыша, в результате у него развивалось два осевых комплекса, причем значительная часть тканей второй дорсальной оси образовывалась из вентральной ткани зародыша. Процесс дорсализации затрагивал и эктодерму. На вентральной стороне при нормальном развитии из эктодермы образуются клетки кожид а при пересадке донора с дорсальной стороны - нервная трубка, происходит нейральная индукция. Таким образом пересаженный кусочек дорсальной мезодермы изменял судьбу клеток вентральной мезодермы. Модель получила дополнительную поддержку после экспериментов по культивированию дорсальных и вентральных эксплантатов [Smith, 1989]. Изолированные кусочки вентральных областей зародышей Xenopus при культивировании образуют шарики из клеток, в которых можно обнаружить закладки мезенхимы и кровяных островков, то есть только вентральные ткани. Дорсальные эксплантаты вытягиваются из-за происходящих в них клеточных движений, а гистологический анализ показывает наличие закладок хорды и сомитов - тканей дорсальной мезодермы. При совместном культивировании дорсальных и вентральных эксплантантов в виде "сэндвичей", в последних возникали хорда и сомиты.

Результаты этих экспериментов были интерпретированы следующим образом: 1). вентральные ткани способны лишь пассивно воспринимать специфические сигналы центра Ньюкупа и организатора Шпеманна, вызывающие дорсализацию мезодермы и эктодермы, 2). вентральные ткани, в отличии от дорсальных, не являются источником индукционных влияний. Однако, эта теория была опровергнута результатами последующих экспериментов. Исследования показали, что вентральная ткань является источником активного вентр ализующего сигнала, который является антагонистом дорсальных индукторов. И, вероятно, главная роль в этом принадлежит ВМР4 - члену суперсемейства TGF-(3 (transforming growth factor).

Суперсемейство TGF-p играет ключевую роль в выборе пути развития и дифференцировке клеток [обзор Hogan, 1996]. Члены этого семейства имеют общие черты в структуре, однако разные молекулы вызывают различные ответы клеток-мишеней в ходе развития. Например, два материнских фактора, вовлеченных в формирование мезодермы, являются членами семейства TGF-(3: активин [Cornell and Kimelman, 1994] и ВМР4 [обзор Harland, 1994]. Первый является дорсализующим фактором, а второй - вентрализующим. Сигналы TGF-P опосредуются семейством серин/треониновых рецепторных протеинкиназ. Эти рецепторы подразделяются на две группы: класс I и класс П. Рецепторы класса П действуют как первичные лиганд-связывающие факторы, тогда как рецепторы класса I непосредственно передают сигнал [обзор Baker and Harland]. Взаимодействие ВМР4 с рецепторами ведет к фосфорилированию рецепторов класса I и последующему фосфорилированию цитоплазматических белков. Это Smad 1 в сигнальном пути ВМР4 и Smad 2 - в активиновом пути [Candía, 1997]. Smad 2 затем переходит в ядро и связывается с FASTI (forkhead activin-sensitive transcription factor). FASTI активирует транскрипцию М1х2-транскрипционного фактора, содержащего гомеодомен [Chen, 1988]. ДНК-связывающие факторы, входящие в состав транскрипционного комплекса, опосредующие действие ВМР4, до сих пор не выявлены. Известно, что ВМР4 индуцирует транскрипцию гомеобокс содержащего гена PV.l [Ault, 1996].

Для выяснения роли ВМР4 в раннем развитии применялось два разных подхода: (1) эктопическое увеличение количества белка в зародышах, (2) блокирование действия сигнальной молекулы in vivo. При добавлении к эмбрионам экзогенного ВМР4 [обзор Harland, 1994], наблюдалась индукция вентральной мезодермы даже в том случае, когда ВМР4 добавляли вместе с дорсализующими молекулами. Микроинъекции мРНК ВМР4 вызывают вентрализацию зародышей, у которых в результате отсутствуют хорда и мышцы. Из этих наблюдений был сделан вывод, что ВМР4 является индуктором вентральной мезодермы, способным оказывать вентрализующее действие даже в присутствии эндогенных дорсализующих сигналов. Однако эти опыты были проведены с использованием экзогенного белка, поэтому оставались сомнения по поводу функций ВМР4 in vivo. Чтобы их развеять, был применен подход по блокированию сигнального пути ВМР4. Это осуществлялось несколькими способами: с использованием доминант-негативного рецептора ВМР4 [Graff, 1994; Suzuki, 1994], антисмысловой РНК ВМР4 и доминант-негативной формы лиганда ВМР4 [Hawley, 1995; Sasai, 1995; Schmidt, 1995]. Результаты этих экспериментов подтвердили сделанные ранее выводы, что сигнальный путь ВМР4 необходим для индукции вентральной мезодермы. Но плюс к этому оказалось, что при отсутствии передачи сигнала ВМР4, вентральная мезодерма дорсализуется и связано это с тем, что при элиминировании эндогенного сигнала ВМР4, на вентральной стороне появляются дорсальные факторы. Аналогичные эффекты ВМР4 были продемонстрированы и на эктодерме, где отсутствие белка на вентральной стороне приводило к нейральной индукции [Wilson and Hammati-Brivanlou, 1995].

Таким образом, два совершенно разных воздействия могут вызвать дорсализацию мезодермы - воздействие дорсальных индукторов организатора Шпеманна и отсутствие сигнального пути ВМР4. Этот феномен был объяснен группами De Robertis и Harland, которые показали, что индукторы дорсальной мезодермы - chordin и noggin связывают ВМР4 с высокой степенью аффинности [Sasai, 1995; Zimmerman, 1996], блокируя действие вентрализующих агентов. На рисунке 4 приведена модель установления паттернов в мезодерме и эктодерме в раннем развитии Xenopus.

Рисунок 4. Модель мезодермальной индукции.

Организатор Шпеманна секретирует дорсализирующие факторы chordin и noggin, которые противодействуют вентрализующему сигналу ВМР4 в вентрально-латеральной мезодерме. Эти взаимодействия влияют на формирование мезодермальных производных (сомитов и почек), а также на дифференцировку нервной и эктодермальной ткани [Рисунок взят из Zorn, 1997].

Настоящая работа посвещена исследованию гена, экспрессирующегося в перибластопорной области и влияющего на гаструляционные движения. Белок Xcml обладает чертами семейства N-ацетилтрансфераз (N-АТз) и локализуется внутри клетки в комплексе Гольджи. В следующих главах обсуждаются особенности морфогенетических движений у Xenopus, описаны известные классы ацетилтрансфераз, строение и функции комплекса Гольджи и ассоциированных с ним белков.

Регуляция клеточных движений на стадии гаструлы

Во время гаструляции у позвоночных происходят значительные изменения в клеточной морфологии, клеточной адгезии и клеточных движениях. Они приводят к образованию трех зародышевых листков - внешней эктодермы, внутренней эндодермы и мезодермы между ними. У амфибий, в начале гаструляции дорсальная мезодерма инволюирует через дорсальную губу и движется к анимальному полюсу по внутренней стороне крыши бластоцеля. Эндодерма втягивается внутрь, а эктодерма к концу гаструляции покрывает весь зародыш снаружи (подробнее см. главу "Ранее развитие X.laevis"). Процесс гаструляции направляют регионально-специфичные клеточные движения: (1) эпиболия клеток анимального полюса; (2) конвергентные растяжения и латеро-медиальная интеркаляция клеток маргинальной зоны и (3) миграция клеток мезодермы по крыше бластоцеля [Keller and Tibbets, 1989; Winklbauer, 1990; Wilson and Keller, 1991]. В способности клеток совершать морфогенетические движения большую роль играют двигательная активность самих клеток, адгезия к внеклеточному матриксу и межклеточная адгезия [обзор Winklbauer, 1996].

Двигательную активность клеток трудно изучать на целом зародыше, наиболее удобной моделью являются клетки презумптивной головной мезодермы, высаженные на покрытый фибронектином (ФН) субстрат, который является основным компонентом внеклеточного матрикса крыши бластоцеля. Через несколько минут после контакта с ФН, клетка распластывается и выпячивает ламеллы на противоположных концах тела вдоль поверхности субстрата, но не в среду [Winklbauer and Selchow, 1992]. На дистальном конце ламеллы концентрируются фибриллы актина. Ламеллоподии связаны с кортексом клетки сетью актиновых филаментов и являются короткоживущими, динамичными структурами. Они постоянно появляются, исчезают или смещаются латерально [Winklbauer and Selchow, 1992]. Само клеточное тело почти не прикреплено к субстрату, это облегчает функции ламелл, которые тянут клетку вдоль подложки.

Внеклеточный матрикс состоит из многих компонентов, в том числе в его состав входят гликопротеины, выполняющие разные функции в организме. Фибронектин (ФН) -крупный белок, состоящий из двух субъединиц, выполняет in vivo две функции -способствует прикреплению клеток к субстрату и является необходимым для образования цитоплазматических выпячиваний - ламелл [Winklbauer and Keller, 1996]. Адгезия мезодермальных клеток к поверхности крыши бластоцеля не зависит целиком только от ФН. В результате обработки клеток антителами к ФН, или RGD-содержащим пептидом или антителами к рецептору ФН - интегрину, клетки перестают взаимодействовать с ФН, но останутся прикрепленными к крыше бластоцеля. Они, однако, приобретают сферическую форму и не образуют ламеллоподии [Winklbauer, 1990; Winklbauer, 1996]. Поведение клеток при ФН-независимой адгезии указывает на то, что одно только прикрепление мезодермальных клеток к крыше бластоцеля не приводит к движению и образованию ламелл. Напротив, двигательная активность клеток целиком зависит от их взаимодействия с ФН.

Движение клеток представляет собой непрерывный процесс связывания-отсоединения от субстрата, поэтому должны существовать факторы как способствующие адгезии, так и препятствующие ей. Не так давно были обнаружены гликопротеины - ингибиторы клеточной адгезии. SPARC - секреторный кислый белок, состоящий из 4 доменов, два из которых являются Са2+-связывающими [Engel, 1987]. Возможно SPARC играет роль внеклеточного буффера Са2+, регулируя кальций-зависимые процессы. Было показано, что SPARC взаимодействует с другими белками матрикса - коллагенами I и V типов в Са2+-зависимой манере. В клеточной культуре SPARC вызывает отсоединение клеток от субстрата и препятствует клеточным движениям [Sage, 1989]. Тенасцин - еще один белок, проявляющий анти-адгезивные свойства [Chiquet-Ehrismann, 1991]. Он состоит из 6 субъединиц и обнаруживается в тех местах зародыша, где происходят клеточные движения. Тенасцин ингибирует клеточную адгезию к ФН и эта активность может быть подавлена с помощью антител к тенасцину [Chiquet-Ehrismann, 1988]. Причем действие его по отношению к ФН специфично - тенасцин не подавляет адгезию к ламинину или коллагенам I и IV типов [Probstmeier, 1990]. Также было продемонстрировано, что тенасцин ингибирует морфогенетические движения мезодермальных клеток у Xenopus [Riou, 1990]. Взаимодействие белков внеклеточного матрикса с рецепторами является необходимым условием клеточной адгезии, поэтому было бы логично предположить, что анти-адгезивные белки действуют на трансмембранные протеогликаны и интегрины, препятствуя их взаимодействию с ФН [Chiquet-Ehrismann, 1991].

Совершая гаструляционные движения, мезодермальные клетки двигаются как единая масса. Их агрегация друг с другом влияет и на поведение - группа клеток движется в одном направлении, почти непрерывно, тогда как отдельные клетки способны лишь хаотично ползать, часто меняя направление. В среде с низкой концентрацией Са2+ эксплантаты анимального полюса распадаются на отдельные клетки, при увеличении кальция клетки вновь агрегируют, причем через непродолжительное время они сортируются по гистотипам [Townes and Holtfreter, 1955]. То же происходит и in vivo, когда на гаструле клетки лидерного края, ползущие в направлении анимального полюса не смешиваются с клетками крыши бластоцеля. Это обусловлено тем, что на своей поверхности клетки экспрессируют молекулы клеточной адгезии. Известны два класса этих белков - Са2+-зависимые, к ним относятся кадгерины и Са2+-независимые, среди которых самым известным является N-CAM (neural cell adhesion molecule).

Кадгерины - трансмембранные молекулы, внеклеточный домен которых содержит несколько Са2+-связывающих доменов [Pouliot, 1992]. Внеклеточные домены в присутствии кальция связываются друг с другом, осуществляя гомофильное взаимодействие клеток [Takeichi, 1990; Geiger and Ayaion, 1992]. Цитоплазматический домен через а- и ß-катенины и плакоглобин взаимодействует с цитоскелетом, то есть катенины являются посредниками между кадгеринами и внутриклеточной системой микрофиламентов [Ozawa, 1989; Ozawa and Kemler, 1992]. Считается, что благодаря цитоскелету, кадгерины образуют кластеры на поверхности клетки, осуществляя взаимодействие между соседними клетками по типу застежки «Молния», увеличивая силу адгезии [Takeichi, 1995].

Различные представители семейства кадгеринов были найдены у Xenopus. По времени экспрессии их разделяют на два подкласса - материнские, начинающие экспрессию до включения зародышевого генома, то есть до МВТ, и зиготические - после МВТ. Зиготическими являются Е-кадгерин, экспрессирующийся в эктодерме [Choi and Gumbiner, 1989] и N-кадгерин, появляющийся во время нейральной индукции [Detrick, 1990]. Недавно открытый РАРС (Paraxial Protocadherin) помимо осуществления межклеточной адгезии, участвует в морфогенетических клеточных движениях [Kim, 1998]. До МВТ начинают свою экспрессию XB/U- и ЕР/С-кадгерины [Choi, 1990; Ginsberg, 1991; Herzberg, 1991]. Оба материнских кадгерина экспрессируются во всех трех зародышевых листках" вплоть до конца гаструлы. Для изучения влияния кадгеринов на раннее развитие Xenopus использовались разные экспериментальные подходы. При "выключении" трансляции с мРНК гена ЕР/С-кадгерина с помощью анти-смысловых олигонуклеотидов, наблюдалась диссоциация внутренних бластомеров на стадии дробления и, в некоторых случаях - ингибирование эмбрионального развития на стадии гаструлы [Heasman, 1994]. Эктопическая экспрессия N- и Е-кадгеринов продемонстрировала, что N-кадгерин участвует в закрытии нервной трубки [Detrick, 1990], а Е-кадгерин участвует в процессе эпиболии анимальной шапочки во время гаструляции [Levine, 1994]. Экспрессия мутанта XB/U-кадгерина с делецией цитоплазматического домена вызвала ингибирование инволюционных движений, из-за чего мезодерма мигрировала вдоль бластопора и образовывала 2 осевых комплекса [Kühl, 1996].

Таким образом, кадгерины влияют на клеточную подвижность в ходе развития, обуславливают адгезивные свойства клеток и участвуют в развитии нервной системы.

2+

Белки, осуществляющие Ca -независимую межклеточную адгезию относятся к суперсемейству иммуноглобулинов (Ig) из-за Ig-подобных доменов, входящих в их состав. Наиболее хорошо изученным является N-CAM (neural cell adhesion molecule). Известно около 20 форм N-CAM, которые получаются из одного гена путем альтернативного сплайсинга пре-мРНК [Daniloff,1994; Walsh, 1989]. У всех белков экстраклеточная часть состоит из 5 Ig-подобных доменов и двух фибронектин-тип III гомологичных повторов, которые участвуют в адгезии и передаче сигналов внутрь клетки [Frei, 1992]. Большинство являются трансмембранными белками, их цитоплазматический домен варьирующий по размеру, участвует, как и у кадгеринов, во взаимодействии с цитоскелетом. Известен N-CAM, который связан с клеточной мембраной через гликозилфосфотидилинозитол [Walsh and Doherty, 1991. Дополнительное разнообразие достигается путем гликозилирования белков - некоторые подвергаются модификации путем присоединения длинных цепей полисиаловой кислоты, причем у разных форм N-САМ - разное количество остатков [Theodosis, 1991; Breen and Regan, 1988]. Поскольку остаток сиаловой кислоты несет отрицательный заряд, увеличение или уменьшение их количества может влиять на степень адгезивности клетки.

Было показано, что молекулы N-CAM играют важную роль в процессе развития позвоночных. Подобно N-кадгерину, N-CAM экспрессируется в клетках нервной системы, хотя он обнаруживается и в других развивающихся тканях [Kintner, 1988; Kay, 1988]. Введение в зародыш антител на N-CAM приводит к изменениям в развитии нервной системы.

Помимо молекул клеточной адгезии - кадгеринов, известны несколько генов, влияющих на морфогенетические движения клеток. Xwnt-5A - представитель семейства Wnt, чья роль в развитии описана (см. выше), ингибирует элонгацию эксплантированных анимальных шапочек Xenopus в ответ на действие активина - известного индуктора элонгации [Moon, 1993]. Интересно, что Xwnt-5A не влияет на образование в шапочках | I мезодермальных тканей, индуцированных активином. В отличие от других членов семейства, Xwnt-5A не является индуктором мезодермы, но оказывает влияние на клеточные движения.

Гомеобоксный ген milk, экспрессирующийся на стадии гаструлы в вегетативных клетках, при оверэкспрессии в маргинальной зоне ингибирует инволюцию мезодермальных клеток [Ecochard, 1998]. Он подавляет экспрессию нескольких мезодермальных генов - Xbra, gsc, Xvent-1, учавствующих в том числе и в процессе гаструляции. Таким образом тйк является негативным регулятором развития мезодермы и, очевидно, что его влияние на морфогенетические процессы лишь следствие этого. То же можно сказать и о последствиях оверэкспрессии в эмбрионах Xenopus гена Smad8 -члена семейства Smad [Nakayama, 1998]. Он подавляет экспрессию Xbra - маркера мезодермы [Hemmati-Brivanlou and Melton, 1992] и активина - индуктора мезодермы и активатора клеточных движений [Cornell, 1994] и, видимо, как следствие, ингибирует инволюцию клеток в ходе гаструляции.

Семейство ацетилтрансфераз

Одна из чрезвычайно распространенных посттрансляционных модификаций белка - N-концевое ацетилирование. Примерно половина, по некоторым оценкам больше, до 90% растворимых внутриклеточных белков эукариот ацетилировано по N-концу [Driessen,

1985]. Этот факт говорит о том, что N-концевое ацетилирование выполняет важные функции в клетке. Состояние аминного конца белка определяет его устойчивость к внутриклеточному протеолизу [Siddig, 1980; Johnson, 1988], то есть влияет на стабильность белка. Например, рибосомный белок S5 Escherichia coli и NADP-специфичная глутамат-дегидрогеназа Neurospora crassa в ацетилированной форме являются термостабильными, тогда как в неацетилированном виде - нет [Siddig, 1980; Cumberlidge, 1979]. Однако известны примеры, когда эта модификация не влияет на стабильность белков [Jornavall, 1980]. Также N-AT могут влиять на сворачивание белка [Dreissen, 1985]. Чаще всего ацетилированию подвергается концевой метионин, либо, после его отщепления, серии, аланин или валин. Реакция ацетилирования осуществляется N-ацетилтрансферазой, в роли донора выступает ацетилкоэнзим А.

Ацетилтрансферазы играют существенную роль в различных клеточных процессах и обнаруживаются в различных частях клетки. Помимо N-ацетилирования растущих полипептидных цепей, цитоплазматические ацетилтрансферазы участвуют в катаболизме мелатонина [Deguchi, 1972; Ohtomi, 1989; Hintermann, 1985] и других биоактивных аминов - катехоламинов и индоламинов [Ebisawa, 1995], необходимых для нервной и гуморальной регуляции позвоночных. Кроме того, обнаружены ядерные ацетилтрансферазы, мишенью которых являются многочисленные остатки лизина в N-концевой области гистонов [обзор Wade, 1997]. В комплексе Гольджи проходят реакции ацетилирования олигосахаридов в составе гликопротеинов, а именно остатков сиаловой кислоты. Причем описано ацетилирование как N-, так и О-типа [Mitsuoka, 1999; Shi, 1996; Shi, 1998].

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Попсуева, Анна Эдуардовна

выводы

1. Идентифицирован новый ген, названный Camello, который экспрессируется в перибластопорной области эмбриона шпорцевой лягушки.

2. Проклонирована полноразмерная кДНКая копия гена, определена ее первичная последовательность, предсказана структура кодируемого белка.

3. На основе анализа белковых последовательностей показано, что Xcamello является родоначальником ранее нейзвестного семейства N-ацетилтрансфераз, члены которого найдены нами у нескольких млекопитающих, включая человека.

4. Продемонстрировано, что оверэкспрессия Xcamello приводит к ингибированию морфогенетических движений клеток в ходе раннего эмбрионального развития шпорцевой лягушки.

5. На субклеточном уровне белок Xcamello обнаружен в комплексе Гольджи и частично в эндоплазматическом ретикулуме.

6. На основании полученных данных сформулирована гипотеза о негативном влиянии Xcamello на способность клеток к адгезии.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Попсуева, Анна Эдуардовна, 2001 год

1. Издательство "Мир", Москва. Almouzni, G., Khochbin, S., Dimitrov, S. and Wolffe, A.P. (1994) Histone acetylation influences both gene expression and development of Xenopus laevis. Dev. Biol. 165, 654669.

2. Ault, K.T., Dirksen, M.L. and Jamrich, M. (1996) A novel homeobox gene PV.l mediates induction of ventral mesoderm in Xenopus embryos. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93,64156420.

3. Ausubel, F.M., Brent, R., Kingston, R.E., Moore, D.D., Seidman, J.G., Smith, J.A., Struhl, K.1998) Current Protocols In Molecular Biology. John Wiley & Sons, Inc. Baker, J.C. and Harland, R.M. (1997) From receptors to nucleus: the Smad pathway. Curr.

4. Blitz, I.L. and Cho, K.W. (1995) Anterior neuroectoderm is progressively induced during gastralation: the role of the Xenopus homeobox gene orthodenticle. Development 121, 993-1004.

5. Blumberg, B„ Wright, C.V.E., de Robertis, E.M. and Cho, K.W.Y. (1991) Organizer-specific homeobox genes in Xenopus laevis embryos. Science 253, 194-196.

6. Bouwmeester, T., Kim, S.-H., Sasai, Y., Lu, B. and De Robertis, E.M. (1996) Cerberus is a head-inducing secreted factor is expressed in the anterior endoderm of Spemann's organizer. Nature 382, 595-601.

7. Bradford, M.M. (1976) A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein dye binding. Anal Biochem. 72, 248254.

8. Breen, K.C. and Regan, C.M. (1988) Differentiation-dependent sialylation of individual neural cell adhesion molecule polypeptides during postnatal development. J. Neurochem. 50,712-716.

9. Bretscher, M.S. and Munro, S. (1993) Cholesterol and Golgi apparatus. Sciense 261, 12801288.

10. Brieher, W.M. and Gumbiner, B.M. (1994) Regulation of C-cadherin function during activin induced morphogenesis of Xenopus animal caps. J. Cell Biol. 126, 519-527.

11. Brivanlou, A.H. and Harland, R.M. (1989) Expression of an engrailed-related protein is induced in the anterior neural ectoderm of early Xenopus embryos. Development 106, 611617.

12. Brownell, J. E., Zhou, J., Ranalli, T., Kobayashi, R. and Edmondson, D. J. (1996) Tetrahymena histone acetyltransferase A: a homolog to yeast Gcn5p linking histone acetylation to gene activation. Cell 84, 843-851.

13. Cadigan, K. M. and Nusse, R.(1997) Wnt signalling: a common theme in animal development. Genes and development 11, 3286-3305.

14. Chen, Y.G., Hata, A., Lo, R.S., Wotton, D., Shi, Y., Pavletich, N. and Massague, J. (1988) Determinants of specificity in TGF-beta signal transduction. Genes Dev. 12(14), 21442152.

15. Chiquet-Ehrismann, R. (1991) Anti-adhesive molecules of the extracellular matrix. Curr. Opin. Cell Biol. 3, 800-804.

16. Chiquet-Ehrismann, R., Kalla, P., Pearson, C.A., Beck, K. and Chiquet, M. (1988) Tenascin interferes with fibronectin action. Cell 53, 383-390.

17. Cho, K. W. Y„ Blumberg, D„ Steinbeisser, H. and De Robertis, E. M. (1991) Molecular nature of Spemann's Organizer: the role of the Xenopus homeobox gene goosecoid. Cell 67,1111-1120.

18. Choi, Y.-S. and Gumbiner, B. (1989) Expression of cell adhesion molecule E-cadherin in Xenopus embryos begins at gastrulation and predominates in the ectoderm. J. Cell Biol. 108, 2449-2458.

19. Choi, Y.-S., Sehgal, R., McCrea, P. and Gumbiner, B. (1990) A cadherin-like protein in eggs and cleaving embryos of Xenopus laevis is expressed in oocytes in response to progesterone. J. Cell Biol. 110, 1575-1582.

20. Christian, J. and Moon, R.T. (1993) Interactions between Xwnt-8 and Spemann organizer signaling pathways generate dorso-ventral pattern in the embryonic mesoderm of Xenopus. Genes Dev. 7, 13-28.

21. Coon, S. L., Roseboom, P. H., Baler, R., Weller, J. L., Namboodiri, M. A. A., Koonin, E. V. and Klein, D. C. (1995) Pineal serotonine N-acetyltransferase: expression cloning and molecular analysis. Science 270, 1681-1683.

22. Cornell, R.A. and Kimelman, D. (1994) Activin-mediated mesoderm induction requires FGF. Development 120, 453-462.

23. Cosson, P. and Letourner, F. (1994) Coatomer interaction with di-lysine endoplasmic reticulum retention motif. Science 263, 1629-1631.

24. Cross, N.L. and Elinson, R.P.C. (1980). A fast block of polyspermy in frogs mediated by changes in the membrane potential. Dev. Biol. 75, 187-198.

25. Cumberlidge, A.G. and Isono, K. (1979) Ribosomal protein modification in Escherichiacoli. I. A mutant lacking the N-terminal acetylation of protein S5 exhibits thermosensitivity. J.1. Mol. Biol. 131, 169-189.

26. Dalcq, A and Pasteels, J. (1937) Une conception nouvelle des bases physiologiques de la morphogenese. Arch. Biol. 48, 669-710.

27. Dale, L. and Slack, J.M. (1987) Regional specification within the mesoderm of early embryosof Xenopus laevis. Development 100, 279-295. Daniloff, J.K., Moore, V. and Oliver, E.H. (1994) Activity of neural cell adhesion molecule

28. Farguhar, M.G. (1985) Progress in unravelling pathways of Golgi traffic. Annu. Rev. Cell Biol. 1,447-488.

29. Frei, T., von Bohlen und Halbach, F., Wille, W., Schachner, M. (1992) Different extracellular domains of the neural cell adhesion molecule (N-CAM) are involved in different functions. J. Cell Biol. 118, 177-194.

30. Fujita, N., Sato, S., Kurihara, T., Kuwano, R., Sakimura, K., Inusuka, T., Takahashi, Y. and Miyatake, T. (1989) cDNA cloning of mouse myelin associated glycoprotein: A novel alternative splicing pattern. Biochem. Biophys. Res. Commun. 165, 1162-1169.

31. Geiger, B. and Ayalon, O. (1992) Cadherins. Annu. Rev. Cell Biol. 8, 307-332.

32. Gilbert, S.F. (1988) Developmental biology. Chap. 2. Sinauer Associates Inc.

33. Ginsberg, D., DeSimone, D. and Geiger, B. (1991) Expression of a novel cadherin (EP-cadherin) in unfertilized eggs and early Xenopus embryos. Development 111,315-325.

34. Glabe, C.G. and Vacquier, V.D. (1978). Egg surface glycoprotein receptor for sea urchin sperm bindin. Proc. Natl Acad. Sci. USA 75, 881-885.

35. Glinka, A.W.W., Onichtchouk, D., Blumenstock, C. and Niehr, C. (1997) Head induction by simultaneous repression of BMP and Wnt signalling in Xenopus. Nature 389, 517-519.

36. Gont, L.K., Steinbeisser, H., Blumberg, B. and De Robertis, E.M. (1993) Tail formation as a continuation of gastrulation: the multiple cell population of the Xenopus tailbud derive from the late blastopore lip. Development 119, 991-1004.

37. Graff, J.M., Thies, R.S., Song, J.J., Celeste, A.J. and Melton, D.A. (1994) Studies with a Xenopus BMP receptor suggest that ventral mesoderm inducing signals override dorsal signals in vivo. Cell 79, 169-179.

38. Graham, T.R. and Emr, S.D. (1991) Compartmental organization of Golgi-specific protein modification and vacuolar protein sorting events defined in yeast sec 18 (NSF) mutant. J.Cell Biol. 114, 207-218.

39. Graham, V.L. and Van Der Eb, A.J. (1973) A new technique for the assay of infectivity of human adenovirus 5 DNA. Virology 52, 456-467.

40. Greenfield, L., Simpson, L. and Kaplan, D. (1975) Conversion of closed circular DNA molecules to single-nicked molecules by digestion with DNAase I in the presence of ethidium bromide. Biochim Biophys Acta 407(3), 365-75.

41. Griffiths, G. and Simons, K. (1986) The trans Golgi network: sorting at the exit site of the Golgi complex. Science 234, 438-443.

42. Harland, R.M. (1991) In situ hybridization: an improved whole mount method for Xenopus embryos. Meth. Enzymol. 36, 675-685.

43. Harland, R.M. (1994) The transforming growth factor (3 family and induction of the vertebrate mesoderm: Bone morphogenic proteins are ventral inducers. Pro. Natl. Acad. Sci. USA 91, 10243-10246.

44. Hausen, P. and Riebesell, M. (1991) The early development of Xenopus laevis. The atlas of histology. Springer-Verlag, New-York.

45. Hawley, S., Wunnenberg-Stapleton, K., Hasimoto, C., Laurent, M., Watabe, T., Blumberg, B. and Cho, K. W.Y. (1995) Disruption of BMP signals in embryonic Xenopus ectoderm leads to direct neural induction. Genes Dev. 9, 2923-2935.

46. Hemmati-Brivanlou, A. and Melton, D.A. (1992) A truncated activin receptor inhibits mesoderm induction and formation of axial structers in Xenopus embryos. Nature, 359, 609-614.

47. Herzberg, F., Wildermuth, V. and Weldich, D. (1991) Expression of XBcad, a novel cadherin, during oogenesis and early development of Xenopus. Mech. Dev. 35, 32-42.

48. Hintermann, E., Jeno, P. and Meyer, U. A. (1995) Isolation and characterization of an arylalkylamine N-acetyltransferase from Drosophila melanogaster. FEBS Lett. 395, MS-ISO.

49. Hirsch, N. and Harris, W.A. (1997) Xenopus Pax-6 and retinal development. J. Neurobiol. 32, 45-61.

50. Hogan, B. L. M. (1996) Bone morphogenetic proteins: multifunctional regulators of vertebrate development. Genes and Development 10, 1580-1594.

51. Hu, E., Zhu, Y., Fredrickson, T„ Barnes, M., Kelsell, D., Beeley, L. and Brooks, D. (1998) Tissue restricted expression of two human Frzbs in preadipocytes and pancreas. Biochem Biophys Res Commun 247, 287-293.

52. Jackson, M.R., Nilsson, T. and Peterson, P.A. (1990) Identification of a consensus motif for retention of transmembrane protein in the endoplasmic reticulum. EMBO J. 9, 3153-3162.

53. Jacobson, A. (1987) Purification and fractionation of poly(A)+ RNA. Methods Enzymol. 152, 254-261.

54. Jaffe, L.A. (1980). Electrical polyspermy block in sea urchins: Nicotine and low sodium experiments. Dev. Growth Differ. 22, 503-507.

55. Jentoft, N. (1990) Why are proteins O-glycosilated? Trends Biochem. Sci. 15, 291-294.

56. Jornvall, H., Fairwell, T., Kratofil, P. and Wills, C. (1980) Differences in alpha-amino acetylation of isozymes of yeast alcohol dehydrogenase. FEBS Lett. Ill, 214-218.

57. Just, E.E. (1919) The fertilization reaction in Echinarachinus parma. Biol.Bull. 36, 1-10.

58. Kay, B.K., Schwartz, L.M., Rutishauser, U„ Qiu, T.H. and Peng, H.B. (1988) Patterns of N-CAM expression during myogenesis in Xenopus laevis. Development 103, 463-471.

59. Kelleher, D.J., Kreibich, G. and Gilmore, R. (1992) Oligosaccharyltransferase activity is assotiated with a protein complex composed of ribophorins I and II and 48 kDa protein. Cell 69, 55-65.

60. Keller, R. and Tibbets, P. (1989) Mediolateral cell intercalation in the dorsal, axial mesoderm of Xenopus laevis. Dev. Biol. 131, 539-549.

61. Keller, R.E. (1986) The cellular basis of epiboly: An SEM study of deep cell rearrangement during gastrulation of Xenopus laevis. J. Embryol. Exp. Morphol. 60, 201-243.

62. Kelm, S., Pelz,A., Schauer, R„ Filbin, M.T., Tang, S„ de Bellard, M.E., Schnaar, R.L.,

63. Mahoney, J.A., Hartnell, A., Bradfield, P. and Crocker, P.R. (1994) Sialadhesin, myelin-associated glycoprotein and CD22 define a new family of sialic acid-dependent adhesion molecules of immunoglobulin superfamily. Curr. Biol. 4,465-472.

64. Kim, S.-H., Yamamoto, A., Bouwmeester, T., Agius, E. and De Robertis, E.M. (1998) The role of Paraxial Protocadherin in selective adhesion and cell movements of the mesoderm during Xenopus gastrulation. Development 125, 4681-4691.

65. Kintner, C. (1988) Effects of altered expression of the neural cell adhesion molecule, N-CAM, on early neural development in Xenopus embryos. Neuron 1, 545-555.

66. Kjer-Nielsen, L„ Teasdale, R.D., van Vliet, C. And Gleeson, P.A. (1999) A novel Golgi-localization domain shared by a class of coiled-coil peripheral membrane proteins. Curr. Biol. 9, 385-388.

67. Kornfeld, R. and Kornfeld, S. (1985) Assembly of asparagine-linked oligosaccharides. Annu. Rev. Biochem. 54, 631-634.

68. Kozak, M. (1987) An analysis of 5'-noncoding sequences from 699 vertebrate messenger RNAs. Nucl. Acids Res. 15, 8125-8148.

69. Machamer, C.E. (1991) Golgi retention signals: do membranes hold key? Trends Cell Biol. 1, 144-151.

70. Manes, M.E. and Elinson, R.P. (1980) Ultraviolet light inhibits grey crescent formation on the frog egg. Roux's Arch. Dev. Biol. 189, 73-76.

71. Manzi, A.E., Sjoberg, E.R., Diaz, S. and Varki, A. (1990) /. Biol. Chem. 265, 13091-13103.

72. Masibay, A.S., Balaji, P.V., Boeggeman, E.E. and Qasba, P.K. (1993) Mutational analysis of Golgi retention signal of bovine 3-1,4-galactosyltransferase. J. Biol. Chem. 268, 99089917.

73. Mechamer, C.E. (1993) Targeting and retention of Golgi membrane proteins. Curr. Opin. Cell Biol. 5, 606-612.

74. Mechamer, C.E. and Rose, J.K. (1987) A specific transmembrane domain of acoronavirus El glycoprotein is required for its retention in the Golgi region. J. Cell Biol. 105, 1205- 1213.

75. Meegee, P. C., Morgan, B. A. and Smith, M. M. (1995) Histone H4 and the maintenance of genome integrity. Genes Dev. 9, 1716-1727.

76. Melton, D. (1987) Translocation of localized maternal mRNA to the vegetal pole of Xenopus oocytes. Nature 328, 80-82.

77. Moon, R.T., Campbell, R.M., Christian, J.L., McGrew, L.L., Shih, J. and Fraser, S. (1993) Xwnt-5A: a maternal Writ that affects morphogenetic movements after overexpression in embryos of Xenopus laevis. Development 119, 97-111.

78. Munro, S. (1991) Sequences within and adjacent to the transmembrane segment of a-2,6-sialyltransferase specify Golgi retention. EMBO J. 10, 3577-3587.

79. Munro, S. and Pelham, H.S. (1987) A C-terminal signal prevents secretion of luminal ER proteins. Cell 48, 899-907.

80. Nakayama, T., Snyder, M.A., Grewal, S.S., Tsuneizumi, K., Tabata, T. and Christian J.L. (1998) Xenopus Smad8 acts downstream of BMP-4 to modulate its activity during vertebrate embryonic patterning. Development 125, 857-867.

81. Neiuwkoop, P. D., Faber, J. (1956) Normal table of Xenopus laevis (Daudin). Amsterdam, North-Holland Publ., Co., 243.

82. Neuwald, A. F. And Landsman, D. (1997) GCN5-related histone N-acetyltransferases belong to the diverse superfamily that includes the yeast SPT10 protein. TIBS 22, 154-155.

83. Newport, J. W. and Kirshner, M. V. (1982) A major developmental transition in early Xenopus embryos: I. Characterization and timing of cellular changes at midblastula stage. Cell 30, 675-686.

84. Newport, J. W. and Kirshner, M. V.(1982). A major developmental transition in early Xenopus embryos: II. Control of the onset of transcription. Cell 30, 687-696.

85. Niehrs, C., Keller, R„ Cho, K.W. and De Robertis, E.M. (1993) The homeobox gene goosecoid controls cell migration in Xenopus embryos. Cellll, 491-503.

86. Nieuwkoop, P.D. (1969) The formation of the mesoderm in urodelan amphibians. I. Induction by the endoderm. Wilhelm Roux's Arch. Entwicklungsmech. 162, 341-373.

87. Nieuwkoop, P.D. (1973) The organization center of the amphibian embryo: Its origin, spatial organization, and morphogenetic action. Adv. Morphol. 10, 1-39.

88. Nilsson, T., Hoe, M.H., Slusarewicz, P., Raboullile, C., Watson, R., Hunte, F., Watzele, G., Berger, E.G. and Warren, G. (1994) Kin recognition between medial Golgi enzymes in HeLa cells. EMBO J. 13, 562-573.

89. Ohtomi, M., Sasaki, M. and Deguchi, T. (1989) Two arylamine N-acetyltransferases from chicken pineal gland as identified by cDNA cloning. Eur. J. Biochem. 185, 253-261.

90. Orci, L., Montesano, R., Meda, P., Malaisse-Lagae, F., Brown, D., Perrelet, A. and Yassali, P. (1981) Heterogeneous distribution of filipin-cholesterol complexes across the cisternae of the Golgi apparatus. Proc. Natl Acad. Sci. USA 78, 293-300.

91. Oschwald, R., Richter, K. and Grunz, H. (1991) Localization of a nervous system-specific class II beta-tubulin gene in Xenopus laevis embryos by whole-mount in situ hybridization. Int J Dev Biol 35, 399-405.

92. Ozawa, M. and Kemler, R. (1992) Molecular organization of the uvomorulin-catenin complex. J. Cell Biol. 116, 989-996.

93. Ozawa, M., Baribault, H. and Kemler, R. (1989) The cytoplasmic domain of the cell adhesion molecule uvomorulin associates with three independent proteins structurally related in different species. EMBO J. 8, 1711-1717.

94. Paulson, J.C. and Colley, K.J. (1989) Glycosyltransferases. Structure, localization, and control of cell type-specific glycosylation. J.Biol. Chem. 264, 17615-17618.

95. Pelham, H.R. (1990) The retention signal for soluble proteins of the endoplasmic reticulum. Trends Biol. Sci. 15, 483-486.

96. Pouliot, Y. (1992) Phylogenetic analysis of the cadherin superfamily. Bioessays 14, 743-748.

97. Probstmeier, R., Martini, R., Schachner, M. (1990) Expression of I/Tenascin in the Crypt-Villus unit of adult mouse small intestine: Implications for its role in epithelilal cell shedding. Development 109, 313-321.

98. Rambourg, A. and Clermont, Y. (1990) Three-dimensional electron microscopy: structure of the Golgi apparatus. Eur. J. Cell Biol. 51, 189-200.

99. Ruoslahti, G. (1988) Structure and biology of proteoglycans. Annu. Rev. Cell Biol. 4, 229-255.

100. Rutishauser, U. and Landmesser, L. (1996) Polysialic acid in the vertabrate nervous system: A promoter of plasticity in cell-cell interactions. Trends Neurosci. 19, 422-427.

101. Sage, H., Vernon, R.B., Funk, S.E., Everitt, E.A. and Angello, J. (1989) SPARC, a secreted protein associated with cellular proliferation, inhibits cell spreading in vitro and exibits

102. Ca -dependent binding to the extracellular matrix. J. Cell Biol. 109, 341-356.

103. Salic, A.N., Kroll, K.L., Evans, L.M. and Kirschner, M.W. (1997) Sizzled: a secreted Xwnt8 antagonist expressed in the ventral marginal zone of Xenopus embryos. Development 124, 4739-4748.

104. Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York.

105. Sasai, Y., Lu, B., Steibeisser, H., Geissert, D., Gont, L.K. and De Robertis, M. (1994) Xenopus chordin: a novel dorsalizing factor activated by organizer-specific homeobox genes. Cell 79, 779-790.

106. Sasai, Y., Lu, B., Steinbeisser, H. and De Robertis, E.M. (1995) Regulation of neural induction by the Chd and BMP4 antagonistic pattering signals in Xenopus. Nature 376, 333-336.

107. Schachter, H. and Roseman,S. (1980) Mammalian glycosyltransferases: their role in the synthesis and function of complex carbohydrates and glycolipids. Biochemistry of Glycoproteins and Proteoglycans, Chap.3. New York: Plenum Press.

108. Schmidt, J., Suzuki, A., Ueno, N. and Kimelman, D. (1995) Localized BMP-4 mediates dorsal/ventral patterning in the early Xenopus embryo. Dev. Biol. 169, 37-50.

109. Shaper, J.H. and Shaper, N.L. (1992) Enzymes associated with glycosylation. Curr. Opin. Struc. Biol. 2, 701-709.

110. Shi, W.-X., Chammas, R. and Varki, A (1996) Linkage-specific action of endogenous sialic acid O-acetyltransferase in Chinese hamster ovary cells. J. Biol. Chem. 271, 15130-15138.

111. Shi, W.-X., Chammas, R. and Varki, A. (1998) Induction of sialic acid 9-O-acetylation by diverse gene products: implications for the expression cloning of sialic acid O-acetyltransfareses. Glycobiology 8, 199-205.

112. Shin, J., Dunbrack, R.L., Jr. Lee, S., Strominger, J.L. (1991) Signals for retention of transmembrane proteins in the endoplasmic reticulum studied with CD4 truncated mutants. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 1918-1922.

113. Siddig, M.A.M., Kinsey, J.A., Fincham, J.R.S. and Keighren, M. (1980) Frameshift mutations affecting the N-terminal sequence of Neurospora NADP-specific glutamate dehydrogenase. J. Mol. Biol. 137,125-135.

114. Smith, J.C. (1989) Mesoderm induction and mesoderm-inducing factors in early amphibian development. Development 105, 665-667.

115. Smith, J.C., Price, B.M., Green, J.B., Weigel, D. and Herrmann, B.G. (1991) Expression of a Xenopus homolog of Brachyury (T) is an immediate-early response to mesoderm induction. Cell 67, 79-87.

116. Sokol, S. Y.(1996). Analysis of Dishevelled signalling pathways during Xenopus development. Current Biology 11, 1456-1467.

117. Song, J. and Slack, J.M. (1996) XFGF-9: a new fibroblast growth factor from Xenopus embryos. Dev. Dyn. 206, 427-436.

118. Spemann, H. and Mangold, H. (1924) Uber Induktion von Embryonenanlagen durch Implantation artfrember Orgaisatoren. Wilhelm Roux's Arch. Entwicklungsmech. 100, 699638.

119. Stamenkovic, I., Sgroi, D. and Aruffo, A. (1992) CD22 binds to a-2,6-sialyltransferase-dependent epitopes on COS cells. Cell 68, 1003-1004.

120. Stutz, F. and Spohr, G. (1986) Isolation and characterization of sarcomeric actin genes expressed in Xenopus laevis embryos. /. Mol. Biol. 187, 349-361.

121. Sugita, K., Koizumi, K. and Yoshida, M. (1992) Morphological reversion of sis-transformed NIH3T3 cells by trichostatin A. Cancer Res. 52, 168-172.

122. Suzuki, A., Thies, R.S., Yamaji, N., Song, J.J., Wozney, J.M., Murakami, K. and Ueno, N. (1994) A truncated bone morphogenic protein receptor affects the dorsal-ventral pattering in the early Xenopus embryo. Pro. Natl. Acad. Sci. USA 91, 10255-10259.

123. Sweet, D.J. nad Pelham, H.R.B. (1992) The Saccharomyces serevesiae Sec20 gene encodes a membrane glucoprotein which is stored by the HDAL retrieval system. EMBO J. 11, 423432.

124. Takeichi, M. (1990) Cadherins: a molecular family important in selective cell-cell adhesion. Annu. Rev. Biochem. 59, 237-252.

125. Takeichi, M. (1995) Morphogenetic role of classic cadherin. Curr. Opin. Cell Biol. 7, 619627.

126. Tanaka, S., Matsushita, Y., Yoshikawa, A. and Isono, K. (1989) Cloning and molecularcharacterization of the gene rimL which encodes an enzyme acetylating ribosomal protein L12 of Escherichia coli K12. Mol. Gen. Genet. 217, 289-293.

127. Teasdale, R.D. and Jackson, M.R. (1996) Signal-mediated sorting of membrane proteins between the endoplasmic reticulum and the Golgi apparatus. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 12, 27-54.

128. Thomsen, G.H. (1997) Antagonism within and around the organizer: BMP inhibitors in vertebrate body pattering. Trends Genet. 13, 209-211.

129. Yarki, A. (1992) Diversity in the sialic acids. Glycobiology 2, 25-40.

130. Varki, A. (1997) Sialic acids as ligands in recognition phenomena. FASEB J. 248-255.

131. Yarki, A., Hooshmand, F., Diaz, S., Varki, N.M. and Hedrick, S.M. (1991) Developmental abnormalities in transgenic mice expressing a sialic acid-specific 9-O-acetylesterase. Cell 65, 65-74.

132. Vincent, J.-P. and Gerhart, J.C. (1987). Subcortical rotation in Xenopus eggs: An early step in embryonic axis specification. Develop. Biol. 123, 526-539.

133. Vincent, J.-P., Oster, G.F. and Gerhart, J.C. (1986) Kinematics of grey crescent formation in Xenopus eggs: The displacement of subcortical cytoplasm relative to the egg surface. Develop. Biol. 113,484-500.

134. Von Dassow, G., Schmidt, J.E. and Kimelman, D. (1993) Induction of Xenopus organizer: expression and regulation of Xnot, a novel FGF and activin-regulated homeobox gene. Genes Dev. 7, 355-366.

135. Von Heijne, G. (1985) Signal sequences: the limits of variation. J. Mol. Biol. 184, 99-105.

136. Wade, P.A., Pruss, D. and Wolffe, A.P. (1997) Histone acetylation: chromatin in action. TIBS 22, 128-132.

137. Walsh, F.S. and Dickson, G. (1989) Generation of multiple N-CAM polypeptides from a single gene. Bioessays 11, 83-88.

138. Walsh, F.S. and Doherty, P. (1991) Glycosylphosphatidylinositol anchored recognition molecules that function in axonal fasciculation, growth and guidance in the nervous system. Cell Biol. Int. Rep. 15, 1151-1166.

139. Wang, S., Krinks, M., Lin, K., Luyten, F.P. and Moos, M. Jr. (1997) Frzb, a secreted protein expressed in the Spemann organizer, binds and inhibits Wnt-8. Cell 88, 757-766.

140. Weisz, O.A., Swift, A.M. and Mechamer, C.E. (1993) Oligomerization of a membrane protein correlates with its retention in the Golgi complex. J. Cell Biol. 122, 1185-1196.

141. Welsh, J., Petersen, C. and McClelland, M. (1991) Polymorphisms generated by arbitrarily primed PCR in the mouse: application to strain identification and genetic mapping. Nucleic. Acids Res. 14, 5777-5792.

142. Wilson, P. and Hemmati-Brivanlou, A. (1995) Induction of epidermis and inhibition of neural fate by Bmp-4. Nature 376, 331-333.

143. Wilson, P. and Keller, R. (1991) Cell rearrangement during gastralation of Xenopus: direct observation of cultured explants. Development 112, 289-300.

144. Winklbauer, R. (1990) Mesodermal cell migration during Xenopus gastrulation. Dev. Biol. 142, 155-168.

145. Winklbauer, R. and Keller, R.E. (1996) Fibronectin, mesoderm migration and gastrulation in Xenopus. Dev. Biol. 177, 413-426.

146. Winklbauer, R. and Selchow, A. (1992) Motile behavior and protrusive activity of migratory mesoderm cells from the Xenopus gastrula. Dev. Biol. 150, 335-351.

147. Winklbauer, R., Nagel, M., Selchow, A. and Wacker, S. (1996) Mesoderm migration in the Xenopus gastrula. Int. J. Dev. Biol. 40, 305-311.

148. Wylie, C., Kofron, M., Payne, C., Anderson, R., Hosobuchi, H., Joseph, E. and Heasman, J. (1996). Maternal beta-catenin establishes a "dorsal signal" in early Xenopus embryos. Development 122, 2987-2996.

149. Yoshida, M., Nomura, S. and Beppy, T. (1987) Effects of trichostatins on differentiation of murine erythroleukemia cells. Cancer Res. 47, 3688-3691.

150. Yuge, M., Kobayakawa, Y., Fujisue, M. and Yamana, K. (1990) Development 110, 10511056.

151. Zevahi-Willner, T. and Lane, C. (1977) Subcellular compartmentation of albumin and globin made in oocytes under the direction of injection messenger RNA. Cell 11, 683-693.

152. Zimmerman, L.B., De Jesus-Escobar, J.M. and Harland R.M. (1996) The Spemann organizer signal noggin binds and inactivates Bone Morphogenic Protein 4. Cell 86,599-606.

153. Zorn, A.M. (1997) Cell-cell signalling: frog frizbees. Curr. Biol. 7, R501-504.1. БЛАГОДАРНОСТИ