Количественное определение возбудителей гемотрансмиссивных инфекций методом полимеразной цепной реакции на олигонуклеотидном микрочипе тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, кандидат биологических наук Ходаков, Дмитрий Андреевич

• Ходаков, Дмитрий Андреевич
• кандидат биологических наук
• 2009

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Ходаков, Дмитрий Андреевич

Принятые сокращения.

Введение.

Литературный обзор.

Гемотрансмиссивные инфекции: возбудители и их идентификация.

Характеристика основных инфекционных агентов, передающихся через кровь.

Вирус иммунодефицита человека (HIV).

Вирус гепатита С (HCV).

Вирус гепатита В (HBV).

Т-лимфотропные вирусы человека I и II типов (HTLV-1,2).

Вирус Эпштейна-Барр.

Вирусы простого герпеса 1 и 2 типов.

Цитомегаловирус.

Вирусы герпеса человека 6, 7 и 8 типов, парвовирус В19.

Проблема безопасности донорской крови.

Методы идентификации возбудителей гемотрансмиссивных инфекций.

Серологические методы идентификации возбудителей гемотрансмиссивных инфекций.

Методы идентификации возбудителей гемотрансмиссивных инфекций, основанные на обнаружении нуклеиновых кислот.

Амплификационные методы в скрининге донорской крови.

Амплификационные методы количественного определения нуклеиновых кислот

Количественное определение нуклеиновых кислот по "конечной точке".

Способы регистрации продуктов амплификации нуклеиновых кислот.

Количественное определение нуклеиновых кислот методом амплификации с регистрацией результатов в режиме реального времени.

Материалы и методы.

Результаты и обсуждение.

Метод мультиплексной qPCR на микрочипе.

Обработка данных кинетики накопления флуоресцентного сигнала.

Выбор оптимальных условий проведения мультиплексной PCR на микрочипе и регистрации продуктов амплификации.

Количественная мультиплексная PCR на микрочипе.

Выбор генетических мишеней для обнаружения вирусных нуклеиновых кислот.

Определение пределов обнаружения вирусных нуклеиновых кислот.

Калибровочные кривые для количественного определения нуклеиновых кислот.

Одновременный количественный анализ нуклеиновых кислот HIV-1, HBV и HCV методом qPCR на микрочипе.

Исследование образцов плазмы крови человека методом мультиплексной qPCR на микрочипе.

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Ходаков, Дмитрий Андреевич

Заключение

Разработанный метод количественного определения возбудителей гемотрансмиссивных инфекций на биологическом микрочипе является чувствительным, специфичным инструментом многопараметрического количественного анализа, позволяющим получать воспроизводимые результаты. Его дальнейшее развитие до стадии диагностической тест-системы и последующее её внедрение в клиническую лабораторную диагностику будет способствовать снижению риска передачи возбудителей гемотрансмиссивных инфекций и позволит в кратчайшие сроки определять вирусную нагрузку с целью оценки тяжести протекания заболевания и эффективности применения противовирусной терапии. Предложенный метод также может быть применён для выполнения широкого спектра исследований, связанных с многосторонней идентификацией и количественным определением других генетических мишеней.

Разработан метод мультиплексной PCR на олигонуклеотидном микрочипе с регистрацией результатов амплификации в режиме реального времени с одним флуоресцентным красителем.

Изучено влияние компонентов реакционной смеси, температурно-временных режимов, концентраций иммобилизованных праймеров и размера гелевых ячеек на эффективность протекания qPCR на микрочипе и кинетику накопления флуоресцентных сигналов.

Создан биологический микрочип для одновременного выявления нуклеиновых кислот вирусов гепатитов В, С и иммунодефицита человека 1-го типа методом мультиплексной qPCR.

Разработанный метод применён для одновременного количественного анализа вирусных нуклеиновых кислот в образцах плазмы крови человека. Чувствительность и специфичность системы составили 100% (на выборке из 132 образцов), пределы количественного определения (с вероятностью обнаружения 95%) составили 14, 10 и 15 геном-эквивалентов для HIV-1, HBV и HCV, соответственно.

Благодарности

Выражаю свою глубокую благодарность моему научному руководителю. Владимиру Михайловичу Михайловичу. Я искренне признателен, Дмитрию Грядунову, Максиму Донникову, Сергею Лапе, Ольге Антоновой и Наталье Захаровой за помощь в работе, поддержку, ценные замечания при обсуждении результатов и рукописи диссертации, Сергею Панькову, Эдуарду Яковлевичу Крейндлину - за подготовку микрочипов для проведения экспериментов, Сергею Суржикову и Ирине Гречишниковой за синтез олигонуклеотидов, Александру Сергеевичу Заседателеву за помощь и поддержку.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Ходаков, Дмитрий Андреевич, 2009 год

1. Cotter S,M,. History of transfusion medicine, Adv. Vet. Sci. Comp. Med., 1991,36:1-8.

2. Bihl F., Castelli., Marineóla F., Dodd R.Y., Brander C., Transfusion-transmittedinfections, Journal of Translational Medicine, 2007, 5:25-36.

3. Offergeld R., Ritter S., Hamouda O., The Risk of Transfusion Transmitted1.fections Current Aspects, Transfus. Med. Hemother., 2006, 33:130134.

4. Goodnough L.T., Brecher M.E., Kanter M.H., and Aubuchon J.P. Transfusion

5. Medicine: blood transfusion, N. Engl. J. Med., 1999, 340:438-447.

6. Guertler L.G., Virus safety of human blood, plasma, and derived products, 2002,

7. Thrombosis research 107: 39-45.

8. Kottilil S., Jackson J.O., Polis M.A., Hepatitis B and hepatitis C in HIVinfection, 2005, Indian J. Med. Res., 121: 424-450.

9. Kim E.Y., Stanton J., Korber B.T., Krebs K., Bogdan D., Kunstman K., Wu S.,

10. Phair J.P., Mirkin C.A., Wolinsky S.M., Detection of HIV-1 p24 Gag in plasma by a nanoparticle-based bio-barcode-amplification method, Nanomed., 2008, 3(3):293-303.

11. Meyers A., Chakauya E., Shephard E., Tanzer F.L., Maclean J., Lynch A.,

12. Williamson A.L., Rybicki E.P., Expression of HIV-1 antigens in plants as potential subunit vaccines, BMC Biotechnol, 2008, 23(8):53-68.

13. Curran J.W., Jaffe H.W., Hardy A.M., Morgan W.M., Selik R.M., Dondero T.J.,

14. Epidemiology of HIV Infection and AIDS in the United States, 1988, Science, 239:610-616.

15. Mills E.J., Kelly S., Bradley M., Mollon P., Cooper C., Nachega J.,

16. Antiretroviral effects on HIV-1 RNA, CD4 cell count and progression to

17. AIDS or death: a meta-regression analysis, HIV Med., 2008 9(10):849-57.

18. Barnett D., Walker B., Landay A., Denny T.N., CD4 immunophenotyping in

19. HIV infection, Nat. Rev. Microbiol., 2008, 6(11):S7-15.

20. Jarlais D.C., Semaan S., HIV prevention for injecting drug users: the first 25years and counting, Psychosom. Med., 2008, 70(5):606-611.

21. Sickinger E., Jonas G., Yem A.W., Goller A., Stieler M., Brennan C.,

22. Liu G.J., Wang J.P., Xiao J.C., Zhao Z.W., Zheng Y.T., Preparation andcharacterization of three monoclonal antibodies against HIV-1 p24 capsid protein, Cel.l Mol. Immunol., 2007, 4(3):203-208.

23. Speth C., Bredl S., Hagleitner M., Wild J., Dierich M., Wolf H., Schroeder J.,

24. Wagner R., Demi L., Human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) Pr55gag virus-like particles are potent activators of human monocytes, Virology, 2008, 382(l):46-58.

25. Anzinger J.J., Mezo I., Ji X., Gabali A.M., Thomas L.L., Spear G.T., HIVinfection of mononuclear cells is calcium-dependent, Virus Res., 2006, 122(1-2):183-188.

26. Monath T.P., Heinz F.X., Fields virology, 1996, 3rd ed. Philadelphia:1.ppincott-Raven Publishers.

27. Boonstra A., Woltman A.M., Janssen H.L., Immunology of hepatitis B andhepatitis C virus infections, Best Pract. Res. Clin. Gastroenterol., 2008, 22(6): 1049-1061.

28. Cui J., Kang X., Dai Z., Prediction of chronic hepatitis B, liver cirrhosis andhepatocellular carcinoma by SELDI-based serum decision tree classification, 2007, J Cancer Res Clin Oncol., 133(11):825-834.

29. Pol S., Mallet V.O., Improving anti-hepatitis C virus therapy, Expert Opin.

30. Biol. Ther., 2006, 6(9):923-933.

31. Ravera G., Bottaro L.C., Franceschini M., Morando A., Polo M., Zare M.,

32. Giacopelli C., Zanardi S., Reliability and diagnostic use of a test for the search of the hepatitis C virus Ag (AgHCV), Hepatogastroenterology, 2006, 53(71):753-756.

33. Kessler H.H., Santner B.I., Umlauft F., Quantitation and genotyping of

34. Hepatitis C virus RNA in sera of hemodialysis and AIDS patients, 1996, Clinical Diagnostic Virology, 5:73-78.

35. Orito E., Mizokami M., Nakano T., Serum hepatitis C virus RNA level as apredictor of subsequent response to interferon-a therapy, 1994, Journal of Medical Virology, 44:410-414.

36. Lee W. Hepatitis B Virus Infection., New England Journal of Medicine, 1997,337:1733-1745.

37. Tajiri H., Tanaka Y., Kagimoto S., Murakami J., Tokuhara D., Mizokami M.,

38. Molecular evidence of father-to-child transmission of hepatitis B virus, J. Med. Virol. 2007. 79(7):922-926.

39. Palumbo E., Hepatitis B genotypes and response to antiviral therapy, Am J.

40. Ther., 2007, 14(3):306-399.

41. Beasley R.P., Hepatitis B virus the major etiology of hepatocellularcarcinoma, Cancer, 1988, 61:1942-1956.

42. Wong D., Cheung A.M., Orourke K., et al., Effect of alpha-interferontreatment in patients with hepatitis B e antigen-positive chronic hepatitis B: a meta-analysis, Annals of Internal Medicine, 1993, 119:312-323.

43. Zuckerman A.J., Lavanchy D., Treatment options for chronic hepatitis:antivirals look promising, British Medical Journal, 1999, 319:799-800.

44. Oua J., Panb J., Nan Lina J.H., Transitional Cell Carcinoma in Dialysis

45. Patients, Eur. Urol., 2000 ,37(l):90-94.

46. Rodriguez-Frias F, Jardi R. Virologic markers of HBV infection, Gastroenterol

47. Hepatol., 2006, 29 (2): 11-19.

48. Brown J.L., Carman W.F. and Thomas H.C., The clinical significance ofmolecular variation within the hepatitis B virus genome, 1992, Hepatology, 15:144-148.

49. Chen L., Liu F, Fan X., Gao J., Chen N., Wong T., Wu J., Wen S.W.,

50. Detection of hepatitis B surface antigen, hepatitis B core antigen, and hepatitis B virus DNA in parotid tissues, Int. J. Infect. Dis., 2009, 13(l):20-23.

51. Jardi R., Rodriguez-Frias F., Schaper M., Giggi E., Tabernero D., Homs M.,

52. Esteban R., Buti M., Analysis of hepatitis B genotype changes in chronic hepatitis B infection: Influence of antiviral therapy, J, Hepatol., 2008, 49(5):695-701.

53. Palumbo E., Lamivudine for chronic hepatitis B: a brief review, Braz. J. Infect.

54. Dis., 2008, 12(5):355-357.

55. Slattery J.P., Franchini G., Gessain A., Genomic evolution, patterns of globaldissemination, and interspecies transmission of human and simian T-cell leukemia/lymphotropic viruses, Genome Res., 1999, 9:525-540.

56. Zunt J.R., Tapia K., Thiede H., Lee R., Hagan H., HTLV-2 infection ininjection drug users in King County, Washington, Scand. J. Infect. Dis., 2006, 38(8):654-663.

57. Yoshida M., Discovery of HTLV-1, the first human retrovirus, its uniqueregulatory mechanisms, and insights into pathogenesis, Oncogene, 2005, 24(39):5931-5937.

58. Burbelo P.D., Meoli E., Leahy H.P., Graham J., Yao K., Oh U., Janik J.E.,

59. Mahieux R., Kashanchi F., Iadarola M.J., Jacobson S., Anti-HTLV antibody profiling reveals an antibody signature for HTLV-I-associated myelopathy/tropical spastic paraparesis (HAM/TSP), Retrovirology, 2008, 5:96-102.

60. McGeoch D.J., Rixon F.J., Davison A .J., Topics in herpesvirus genomics andevolution, Virus Res., 2006, 117(1): 90-104.

61. Cheung A., Kieff E., Long internal direct repeat in Epstein-Barr virus DNAs, J.

62. Virol., 1982, 44: 286-294.

63. Norio P., Schildkraut C.L., Plasticity of DNA Replication Initiation in Epstein

64. Barr Virus Episomes, PLoS Biol., 2004, 2(6):el52.

65. Sample J., Young L., Martin B., Chatman T., Kieff E., Rickinson A., Epstein

66. Barr virus types 1 and 2 differ in the EBNA-3A, EBNA-3B, and EBNA-3C genes, J. Virol., 1990, 64: 4084-4092.

67. Amon W., Binne U.K., Bryant H., Jenkins P.J., Karstegl C.E., Farrell P.J.,1.tic cycle gene regulation of Epstein-Barr virus, J. Virol., 2004, 78(24): 13460-13469.

68. Gulley M.L., Tang W., Laboratory assays for Epstein-Barr virus-relateddisease, J. Mol. Diagn., 2008, 10(4):279-292.

69. Baringer J.R., Herpes simplex infections of the nervous system, Neurol. Clin.,2008, 26(3):657-674.

70. Batterson W., Roizman B., Characterization of the herpes simplex virionassociated factor responsible for the induction of genes, J. Virol., 1983, 46:371-377.

71. Brideau A., Enquist L., Tirabassi. R., The role of virion membrane proteinendocytosis in the herpesvirus life cycle, J. Clin. Virol., 2000, 17:69-82.

72. Mossman K.L., Ashkar A.A., Herpesviruses and the innate immune response.

73. Viral Immunol., 2005, 18(2):267-281.

74. Griffiths P.D., Walter S., Cytomegalovirus, Curr. Opin. Infect. Dis., 2005, 183.: 241-245.

75. McDonough S., Spector D., Transcription in human fibroblasts permissivelyinfected by human cytomegalovirus strain AD 169., Virology, 1983, 125:31-46.

76. Pancholi P., Wu F., Della-Latta P., Rapid detection of cytomegalovirusinfection in transplant patients, Expert Rev. Mol. Diagn., 2004, 4(2):231-242.

77. Gratacap-Cavallier B., Bonadona A., Berthier R., Brambilla E., Seigneurin

78. J.M., Lorimier P., A simplified cytomegalovirus pp65 antigenemia assay procedure, J. Clin. Virol., 2003, 28(3):317-322.

79. Limaye A.P., Kirby K.A., Rubenfeld G.D., Leisenring W.M., Bulger E.M.,

80. Neff M.J., Gibran N.S., Huang M.L., Santo Hayes T.K., Corey L., Boeckh M., Cytomegalovirus reactivation in critically ill immunocompetent patients, JAMA, 2008, 300(4):413-422.

81. Maine G.T., Lazzarotto T., Landini M.P., New developments in the diagnosisof maternal and congenital CMV infection, Expert Rev. Mol. Diagn., 2001, 1(1): 19-29.

82. Oskay T., Karademir A., Ertiirk O.I., Association of anticonvulsanthypersensitivity syndrome with Herpesvirus 6, 7., Epilepsy Res., 2006, 70(l):27-40.

83. Levy J.A., Three new human herpesviruses (HHV6, 7, and 8), Lancet, 1997,349(9051):558-563.

84. Schleuning M., Jager G., Holler E., Hill W., Thomssen C., Denzlinger C.,

85. Human parvovirus В19 associated disease in bone marrow transplantation, Infection, 1999, 27:114-117.

86. Rebecca E., Lukehart S., Biological Basis for Syphilis, Clin Microbiol Rev.2006, 19(1):29—49.

87. Greer L., Wendel G.D., Rapid diagnostic methods in sexually transmittedinfections,. Infect. Dis. Clin. North Am., 2008, 22(4):601-617.

88. Ratnam S., The laboratory diagnosis of syphilis, Can. J. Infect. Dis. Med.

89. Microbiol., 2005, 16(1):45-51.

90. Wagner S.J, Transfusion-transmitted bacterial infection: risks, sources andinterventions, Vox Sang, 2004, 86(3): 157-163.

91. Greenwood В., Fidock D., Kyle D., Kappe S., Alonso P., Collins F., Duffy P.,

92. Malaria: progress, perils, and prospects for eradication, The Journal of Clinical Investigation, 2008, 118(4): 1266-1276.

93. Hellstern P., Solvent/detergent-treated plasma: composition, efficacy, andsafety, Curr. Opin. Hematol. 2004, ll(5):346-350.

94. Pelletier J.P., Transue S., Snyder E.L., Pathogen inactivation techniques, Best.

95. Pract. Res. Clin. Haematol., 2006, 19(l):205-242.

96. Приказ Министерства Здравоохранения Российской Федерации от 4августа 2000 № 311 «О мерах по повышению безопасности гемотрансфузий».

97. Егоров A.M., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б., Гаврилова Е.М., Теория ипрактика иммуноферментного анализа, М.: Высш. Шк., 1991.

98. Lequin R., Enzyme immunoassay (EIA)/enzyme-linked immunosorbent assay

99. ELISA), Clin. Chem., 2005, 51(12):2415-2418.

100. Magi B., Liberatori S., Immunoblotting techniques., Methods Mol. Biol., 2005,295:227-254.

101. Kurien B.T., Scofield R.H., Western blotting, Methods, 2006, 38(4):283-293.

102. Saiki R.K., Gelfand D.H., Stoffel S., Scharf S.J., Higuchi R., Horn,G.T., Mullis

103. K.B., Erlich H.A. Primer-detected enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase, Science, 1988, 239:487-491.

104. Innis MA., PCR protocols: a guide to method and applications, London,1. Academic Press 1990.

105. Berger A., Preiser W., Viral genome quantification as a tool for improvingpatient management: the example of HIV, HBV, HCV and CMV, Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 2002, 49: 713-721.

106. Allain J,P,. Genomic screening for blood-borne viruses in transfusion settings,

107. Clin. Lab. Haematol., 2000, 22(1): 1-10.

108. Larzul D., Guigue F., Sninsky J.J., Mack D.H., Brechot C., Guesdon J.L.,

109. Detection of hepatitis B virus sequences in serum by using in vitro enzymatic amplification, J. Virol. Methods, 1988, 20(3):227-237.

110. Garson J.A., Ring C., Tuke P., Tedder R.S., Enhanced detection by PCR ofhepatitis C virus RNA, Lancet, 1990, 336(8719):878-879.

111. Compton J., Nucleic Acid Sequence-Based Amplification, Nature, 1991, 350:91.92.

112. Fahy E., Kwoh D.Y., Gingeras T.R., Self-sustained Sequence Replication3SR): An isothermal transcription-based amplification system alternative to PCR. PCR Methods and Applications, 1991, 1: 25-33.

113. Chandra M., Keller S., Gloeckner C., Bornemann B., Marx A., New branched

114. DNA constructs, Chemistry, 2007, 13(12):3558-3564.

115. Tehe A., Maurice C., Hanson D., Borget M., Abiola N., Maran M.,

116. Quantification of HIV-1 p24 by a highly improved ELISA: Analternative to HIV-1 RNA based treatment monitoring, J Clin Virol., 2006, 37(3): 199-205.

117. Rotheram-Borus M.J., Leibowitz A.A., Etzel M.A., Routine, rapid HIV testing,

118. AIDS Educ Prev., 2006, 18(3):273-280.

119. Dohner K., Radtke K., Schmidt S., Sodeik B., Eclipse phase of herpes simplexvirus type 1 infection: Efficient dynein-mediated capsid transport without the small capsid protein VP26, J Virol., 2006,80(16):8211-8224.

120. Murphy G., Parry J. V., Assays for the detection of recent infections withhuman immunodeficiency virus type 1, Eurosurveillance, 2008, 13(36):4-10.

121. Vernet G., Molecular diagnostics in virology, J. Clin. Virol., 2004, 31(4):239247.

122. Lelie P.N., van Drimmelen H.A., Cuypers H.T., Best S.J., Stramer S.L.,

123. Sensitivity of HCV RNA and HIV RNA blood screening assays, Transfusion, 2002, 42(5):527-536.

124. Koppelman M.H., Sjerps M.C., Reesink H.W., Cuypers H.T., Evaluation of

125. COBAS AmpliPrep nucleic acid extraction in conjunction with COB AS AmpliScreen HBV DNA, HCV RNA and HIV-1 RNA amplification and detection, Vox Sang, 2005, 89(4): 193-200.

126. Katsoulidou A., Moschidis Z., Sypsa V., Chini M., Papatheodoridis G.V.,

127. Tassopoulos N.C., Mimidis K., Karafoulidou A., Hatzakis A., Analytical and clinical sensitivity of the Procleix Ultrio HIV-1/HCV/HBV assay in samples with a low viral load, Vox Sang. 2007, 92(1):8-14.

128. Ginocchio C.C., Kemper M., Stellrecht K.A., Witt D.J., Multicenter evaluationof the performance characteristics of the NucliSens HIV-1 QT assay used for quantitation of human immunodeficiency virus type 1 RNA, J. Clin. Microbiol., 2003, 41(l):164-73.

129. Elbeik T., Markowitz N., Nassos P., Kumar U., Beringer S., Haller B., Ng V.,

130. Simultaneous runs of the Bayer VERSANT HIV-1 version 3.0 and HCV bDNA version 3.0 quantitative assays on the system 340 platform provide reliable quantitation and improved work flow, J. Clin. Microbiol., 2004, 42(7):3120-3127.

131. Higuchi, R., Dollinger, G., Walsh, P.S., Griffith, R., Simultaneousamplification and detection of specific DNA-sequences, Bio-Technology, 1992,10(4): 413-417.

132. Wittwer C. T., Herrmann M. G., Moss A. A. and Rasmussen R. P., Continuousfluorescence monitoring of rapid cycle DNA amplification, BioTechniques, 1997, 22:134-138.

133. Skeidsvoll J. and Ueland P. M., Analysis of Double-Stranded DNA by

134. Capillary Electrophoresis with Laser-Induced Fluorescence Detection Using the Monomeric Dye SYBR Green I, Anal. Biochem., 1995, 231:359-365.

135. Tseng S. Y., Macool D., Elliott V., Tice G., Jackson R., Barbour M. and

136. Amorese D., An homogeneous fluorescence polymerase chain reaction assay to identify Salmonella, Anal. Biochem., 1997, 245:207-212.

137. Morrison T. B., Weis J. J. and Wittwer C. T., Quantification of low-copytranscripts by continuous SYBR Green I monitoring during amplification, BioTechniques, 1998, 24:954-958.

138. Newton C. R., Graham A., Heptinstall L. E., Powell S. J., Summers C.,

139. Kalsheker N., Smith J. C. and Markham A. F., Analysis of any point mutation in DNA, The amplification refractory mutation system (ARMS), Nucleic Acids Res., 1989, 25: 2503-2516.

140. Gibellini D., Gardini F., Vitone F., Schiavone P., Furlini G., Re M.C.,

141. Simultaneous detection of HCV and HIV-1 by SYBR Green real time multiplex RT-PCR technique in plasma samples, Mol. Cell Probes., 2006, 20: 223-229.

142. Didenko V., DNA Probes Using Fluorescence Resonance Energy Transfer

143. FRET): Designs and Applications, Biotechniques, 2001, 31(5): 11061121.

144. Ranasinghe R.T. and Brown T., Fluorescence based strategies for geneticanalysis, Chem. Commun, 2005, 28(44): 5487 5502.

145. Nazarenko I. A., Bhatnagar S. K. and Hohman R. J., A closed tube format foramplification and detection of DNA based on energy transfer., Nucleic Acids Res., 1997, 25(12): 2516-2521.

146. Nuovo G. J., Hohman R. J., Nardone G. A. and Nazarenko I. A., In Situ

147. Amplification Using Universal Energy Transfer-labeled Primers, J. Histochem. Cytochem., 1999, 47:273-280.

148. Asselbergs F.A., Widmer R., Rapid detection of apoptosis through real-timereverse transcriptase polymerase chain reaction measurement of the small cytoplasmic RNA Yl, Anal Biochem., 2003, 318(2):221-229.

149. Bengra, C., Mifflin, T.E., Khripin, Y., Manunta, P., Williams, S.M., Jose,

150. P.A., and Felder, R.A., Genotyping of essential hypertensionsinglenucleotide polymorphisms by a homogeneous PCR method with universal energy transfer primers, Clin. Chem., 2002, 48:2131-2140.

151. Warden D.R. and Refsum H., Detection of Single-Nucleotide Polymorphismsby PCR with Universal Energy Transfer-Labeled Primers: Application to Folate- and Cobalamin-Related Genes, Clin. Chem., 2005, 51: 17131716.

152. Nazarenko I., Homogeneous detection of nucleic acids using self-quenchedpolymerase chain reaction primers labeled with a single fluorophore (LUX primers), Methods Mol. Biol., 2006, 335:95-114.

153. Kusser W., Use of self-quenched, fluorogenic LUX primers for geneexpression profiling, Methods Mol. Biol., 2006, 335:115-133.

154. Huygens F., Inman-Bamber J., Nimmo G.R., Munckhof W., Schooneveldt J.,

155. Harrison B., McMahon J.A., Giffard P.M., Staphylococcus aureus genotyping using novel real-time PCR formats, J. Clin. Microbiol., 2006, 44(10):3712-3719.

156. KandimallaE.R., Agrawal S., 'Cyclicons' as hybridization-based fluorescentprimer-probes: synthesis, properties and application in real-time PCR, Bioorg. Med. Chem., 2000, 8(8): 1911-1916.

157. Fiandaca M.J., Hyldig-Nielsen J.J., Gildea B.D., Coull J.M., Self-reporting

158. PNA/DNA primers for PCR analysis, Genome Res., 2001, 1(4):609-613.

159. Latorra D., Campbell K., Wolter A., Hurley J.M., Enhanced allele-specific

160. PCR discrimination in SNP genotyping using 3' locked nucleic acid (LNA) primers, Hum. Mutat., 2003, 22(l):79-85.

161. Strerath M., Detmer I., Gaster J., Marx A., Modified oligonucleotides as toolsfor allele-specific amplification, Methods Mol. Biol., 2007, 402:317-328.

162. Holland P.M., Abramson R.D., Watson R., Gelfand D.H., Detection ofspecific polymerase chain reaction product by utilizing the 5'-3'exonuclease activity of Thermus aquaticus DNA polymerase, Proc. Natl. Acad. Sei. U S A., 1991, 88(16):7276-7280.

163. Letertre C., Perelle S., Dilasser F., Arar K., Fach P., Evaluation of theperformance of LNA and MGB probes in 5'-nuclease PCR assays, Mol. Cell Probes., 2003, 7(6):307-311.

164. Piccirilli J.A., Krauch T., Moroney S.E. and Benner S.A., Enzymaticincorporation of a new base pair into DNA and RNA extends the genetic alphabet, Nature, 1990, 343: 33-37.

165. Moser M.J., Marshall D.J., Grenier J.K., Kieffer C.D., Exploiting the

166. Enzymatic Recognition of an Unnatural Base Pair to Develop a Universal Genetic Analysis System, Clin. Chem., 2003, 49:407-414.

167. Moser M.J. and Prudent J.R., Enzymatic repair of an expanded geneticinformation system, Nucleic Acids Research, 2003, 31(17): 5048-5053.

168. Krenke B.E., Nassif N., Sprecher C.J., Knox C., Schwandt M., Storts D.R.,

169. Developmental validation of a real-time PCR assay for the simultaneous quantification of total human and male DNA, Genetics, 2008, 3(1): 14-21.

170. Atallah Z. K., Bae J., Jansky S. H., Rouse D. I., and Stevenson W. R.,

171. Multiplex Real-Time Quantitative PCR to Detect and Quantify Verticillium dahliae Colonization in Potato Lines that Differ in Response to Verticillium Wilt, Phytopathology, 2007, 97(7): 865-872.

172. Moser M.J., Christensen D.R., Norwood D. and Prudent J.R., Multiplexed

173. Detection of Anthrax-Related Toxin Genes, J. Mol. Diagn., 2006, 8(1): 89-96.

174. Marras S.A., Tyagi S., Kramer F.R., Real-time assays with molecular beaconsand other fluorescent nucleic acid hybridization probes, Clin. Chim. Acta., 2006, 363(l-2):48-60.

175. Escaja N., Gómez-Pinto I., Rico M., Pedroso E., González C., Structures andstabilities of small DNA dumbbells with Watson-Crick and Hoogsteen base pairs, Chembiochem., 2003, 4(7):623-632.

176. Crey-Desbiolles C., Ahn D.R., Leumann C.J., Molecular beacons with ahomo-DNA stem: improving target selectivity, Nucleic Acids Res., 2005, 33(8):e77.

177. Thelwell N., Millington S., Solinas A., Booth J., Brown T., Mode of actionand application of Scorpion primers to mutation detection, Nucleic Acids Res., 2000, 28(19):3752-3761.

178. Solinas A., Brown L.J., McICeen C., Mellor J.M., Nicol J., Thelwell N.,

179. Brown T., Duplex Scorpion primers in SNP analysis and FRET applications, Nucleic Acids Res., 2001, 29(20):E96.

180. Li Q., Luán G., Guo Q., Liang J., A new class of homogeneous nucleic acidprobes based on specific displacement hybridization, Nucleic Acids Res., 2002, 30(2):E5.

181. Wolff D., Gerritzen A., Comparison of the Roche COBAS Amplicor Monitor,

182. Roche COBAS Ampliprep/COBAS Taqman and Abbott RealTime Testassays for quantification of hepatitis C virus and HIV RNA, Clin. Chem. Lab. Med., 2007, 45(7):917-922

183. Gueudin M., Plantier J.C., Lemee V., Schmitt M.P., Chartier L., Bourlet T.,

184. Ruffault A., Damond F., Vray M., Simon F., Evaluation of the Roche Cobas TaqMan and Abbott RealTime extraction-quantification systems for HIV-1 subtypes, J. Acquir. Immune. Defic. Syndr., 2007, 44(5):500-505.

185. Sarrazin C., Dragan A., Gärtner B.C., Forman M.S., Traver S., Zeuzem S.,

186. Valsamakis A., Evaluation of an automated, highly sensitive, real-time PCR-based assay (COBAS Ampliprep/COBAS TaqMan) for quantification of HCV RNA, J. Clin. Virol., 2008, 43(2): 162-168.

187. Romano J.W., van Gemen B., Kievits T., NASBA: a novel, isothermaldetection technology for qualitative and quantitative HIV-1 RNA measurements, Clin. Lab. Med., 1996, 6(1):89-103.

188. Deiman B., Jay C., Zintilini C., Vermeer S., van Strijp D., Venema F., Van de

189. Wiel P., Efficient amplification with NASBA of hepatitis B virus, herpes simplex virus and methicillin resistant Staphylococcus aureus DNA, J. Virol. Methods., 2008, 51(2):283-293.

190. Yates S., Penning M., Goudsmit J., Frantzen I., van de Weijer B., van Strijp

191. D., van Gemen B., Quantitative detection of hepatitis B virus DNA by real-time nucleic acid sequence-based amplification with molecular beacon detection, J. Clin. Microbiol., 2001, 39(10):3656-3665.

192. Rubina A.Yu., Pankov S.V., Dementieva E.I., Penkov D.N., Butygin A.V.,

193. Vasiliskov V.A., Chudinov A.V., Mikheikin A.L., Mikhailovich V.M., and Mirzabekov A.D., Hydrogel drop microchips with immobilized DNA: properties and methods for large-scale production, Analytical Biochemistry, 2004, 325:92-106.

194. Finney, D.J., Probit Analysis, 1971, Cambridge University Press, ISBN052108041X, p. 333.

195. Larionov A., Krause A., Miller W., A standard curve based method forrelative real time PCR data Processing, BMC Bio informatics, 2005, 6:6278.

196. Strizhkov B.N., Drobyshev A.L., Mikhailovich V.M., Mirzabekov A.D., PCRamplification on a microarray of gel-immobilized oligonucleotides: detection of bacterial toxin- and drug-resistant genes and their mutations. Biotechniques, 2000, 29(4):844-854.