Комплекс молекулярно-генетических методов для мониторинга ВИЧ-инфекции тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.03.10, доктор медицинских наук Богословская, Елена Владимировна

  • Богословская, Елена Владимировна
  • доктор медицинских наукдоктор медицинских наук
  • 2012, Санкт-ПетербургСанкт-Петербург
  • Специальность ВАК РФ14.03.10
  • Количество страниц 230
Богословская, Елена Владимировна. Комплекс молекулярно-генетических методов для мониторинга ВИЧ-инфекции: дис. доктор медицинских наук: 14.03.10 - Клиническая лабораторная диагностика. Санкт-Петербург. 2012. 230 с.

Оглавление диссертации доктор медицинских наук Богословская, Елена Владимировна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Методы диагностики и лечения ВИЧ-инфицированных пациентов.

1.2. Молекулярно-генетические методы диагностики ВИЧ.

1.3. Эпидемиологические особенности ВИЧ.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Глава 3. НОВЫЕ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ПОДХОДЫ, ПОЗВОЛЯЮЩИЕ ПРОВОДИТЬ РАННЮЮ ДИАГНОСТИКУ ВИЧ-ИНФЕКЦИИ У ДЕТЕЙ, РОЖДЕННЫХ ОТ ВИЧ-ИНФИЦИРОВАННЫХ

МАТЕРЕЙ.

Глава 4. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ НОВОГО ПОДХОДА, ОСНОВАННОГО НА ОДНОВРЕМЕННОМ ВЫЯВЛЕНИИ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ ВИЧ И ВИРУСОВ ГЕПАТИТА ВИС, ДЛЯ ПОВЫШЕНИЯ ИНФЕКЦИОННОЙ

БЕЗОПАСНОСТИ ДОНОРСКОЙ КРОВИ.

Глава 5. ОБОСНОВАНИЕ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ ПОДХОДОВ ПРИ КОНСТРУИРОВАНИИ ТЕСТ-СИСТЕМ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВИРУСНОЙ НАГРУЗКИ ВИЧ И ОЦЕНКА ИХ ЭФФЕКТИВНОСТИ ПРИ

АРВ ТЕРАПИИ У ВИЧ-ИНФИЦИРОВАННЫХ ПАЦИЕНТОВ.

Глава 6. СТАНДАРТИЗАЦИЯ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ

ИССЛЕДОВАНИЙ ПРИ ДИАГНОСТИКЕ ВИЧ-ИНФЕКЦИИ.

Глава 7. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ГЕНОТИПИЧЕСКИХ МЕТОДОВ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЛЕКАРСТВЕННОЙ УСТОЙЧИВОСТИ ВИЧ ДЛЯ СОВЕРШЕНСТВОВАНИЯ АРВ ТЕРАПИИ И ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКОГО НАДЗОРА ЗА ПЕРВИЧНОЙ РЕЗИСТЕНТНОСТЬЮ ВИЧ.

Глава 8. ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКИЙ НАДЗОР ЗА РАСПРОСТРАНЕНИЕМ ГЕНЕТИЧЕСКИХ ВАРИАНТОВ ВИЧ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ МЕТОДОВ.

ОБСУЖДЕНИЕ.

ВЫВОДЫ.

Рекомендованный список диссертаций по специальности «Клиническая лабораторная диагностика», 14.03.10 шифр ВАК

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Комплекс молекулярно-генетических методов для мониторинга ВИЧ-инфекции»

ВИЧ-инфекция по масштабам своего распространения наносит человечеству ущерб, сравнимый только с ущербом, который наносил туберкулез до появления антибиотиков. По данным ЮНЭИДС (Global report: UNAIDS report on the global AIDS epidemic, 2010) к концу 2009 года в мире насчитывалось 33,3 млн. человек, живущих с ВИЧ, из них 2,5 млн. детей моложе 15 лет. Только за 2009 год от ВИЧ-инфекции погибло 1,8 млн. человек.

В России в последние годы складывается крайне неблагоприятная эпидемиологическая ситуация в отношении ВИЧ-инфекции. В 2000 году заболеваемость ВИЧ-инфекцией стала приобретать характер эпидемии. К середине 2002 года было зарегистрировано более 220 тысяч ВИЧ-инфицированных. На конец 2010 года было зарегистрировано уже более 580 тысяч ВИЧ-инфицированных российских граждан (Информационный бюллетень № 34 «ВИЧ-инфекция», 2010). Причем, восемьдесят процентов людей, живущих с ВИЧ, составляет молодежь в возрасте от 15 до 30 лет, то есть люди, находящиеся в репродуктивном и наиболее трудоспособном возрасте.

Среди зарегистрированных случаев ВИЧ-инфекции более 5000 случаев приходится на детей, из них 3651 ребенок инфицирован при перинатальном контакте с матерью (данные на конец 2010 года) (Информационный бюллетень № 34 «ВИЧ-инфекция», 2010). Еще более 25000 детей в возрасте до полутора лет, рожденных в 2009-2010 г. от зараженных ВИЧ матерей, находятся под наблюдением до окончательного установления диагноза (Информационный бюллетень № 34 «ВИЧ-инфекция», 2010).

Ряд вопросов диагностики и лечения ВИЧ-инфекции представляет собой серьезную проблему для практического здравоохранения, в частности существуют сложности диагностики недавно инфицированных лиц, а также детей, рожденных от ВИЧ-инфицированных матерей, а проведение антиретровирусной терапии ВИЧ-инфицированных пациентов требует постоянного мониторинга вирусологических маркеров.

Диагностика ВИЧ-инфекции у детей, рожденных от ВИЧ-инфицированных матерей, затруднена в связи с тем, что в крови таких детей в течение длительного времени сохраняются материнские антитела к ВИЧ. По существовавшим до 2011 года в России рекомендациям постановка или снятие диагноза ВИЧ-инфекции детям, рожденным от ВИЧ-инфицированных матерей, проводится на основании результатов серологического обследования не ранее 18 месяцев (Инструкция по профилактике передачи ВИЧ-инфекции от матери ребенку и образца информированного согласия на проведение химиопрофилактики ВИЧ, 2004). Проблема более ранней диагностики ВИЧ-инфекции у новорожденных детей за рубежом была решена несколько лет назад с появлением молекулярно-генетические методов, которые позволяют выявлять фрагменты генома ВИЧ в периферической крови на ранних сроках инфицирования. Было показано, что у большинства инфицированных детей ДНК провируса ВИЧ определяется к 1 месяцу жизни и практически у всех к 6 месяцу (Bremer, 1996; Pugatch, 2002; Charbonneau, 1997).

Другая проблема, связанная с неблагоприятной эпидемиологической ситуацией в отношении ВИЧ-инфекции, касается вирусной безопасности донорской крови. В 2009 году в нашей стране было обследовано почти 4 млн. доноров, среди них выявлено 1240 ВИЧ-инфицированных (Информационный бюллетень № 34 «ВИЧ-инфекция», 2010). Обязательное тестирование донорской крови с помощью серологических методов на наличие антител к ВИЧ и вирусу гепатита С, а также на HBs-антиген вируса гепатита В значительно сократило риск переливания инфекционно опасной крови от донора к реципиенту. Однако, серологические методы в ряде случаев бывают неэффективны для обнаружения инфицированной крови, в первую очередь из-за наличия серологического окна - периода времени от момента заражения до появления в крови специфических антител. Сокращение инфекционного риска, связанного с серологическим окном возможно с помощью прямых методов выявления инфекционного агента. Максимальной чувствительностью из прямых методов обладают тесты, направленные на выявление нуклеиновых кислот вирусов, а точнее молекулярно-генетические (Schreiber, 1996).

За рубежом первые попытки внедрения молекулярных методов в службу крови были предприняты еще в 1995 году. За период с 1998 по 2000 годы в США, Канаде, Австралии, Японии и во многих Европейских странах молекулярный скрининг был внедрен для тестирования всех компонентов крови. В России использование молекулярных методов директивными документами не регламентировано, поэтому они используются только в некоторых регионах страны, поскольку требует серьезных денежных вложений, специальных лабораторий и грамотного и хорошо обученного медицинского персонала.

Внедрение противоретровирусных препаратов в практику терапии ВИЧ-инфицированных пациентов позволило значительно увеличить продолжительность и улучшить качество жизни таких пациентов. Под действием лекарственных препаратов удается подавить вирусную репликацию до минимального уровня. Слежение за изменением концентрации ВИЧ в процессе противовирусной терапии позволяет во время оценить ее эффективность и в случае неудачи подобрать новую комбинацию препаратов. Таким образом, в настоящее время мониторинг вирусной нагрузки (концентрации РНК ВИЧ) является обязательной процедурой, как на этапе назначения терапии, так и в процессе терапии (Churchill, 1999; Brown, 2001; Graham, 1996; Guidelines for the Use of Antiretroviral Agents in HIV-l-Infected Adults and Adolescents. 2011; Harrigan, 1995; MacDougall, 1998; Saag, 1997; Back, 2000). Проведение такого рода исследований стало возможным после разработки и внедрения целого ряда количественных тест-систем для определения концентрации РНК ВИЧ.

Большую проблему представляет генетическое разнообразие ВИЧ, а также данные, свидетельствующие о значительных генетических отличиях российских вариантов ВИЧ от вариантов, представленных в США и Европе, где разрабатываются и производятся основные коммерческие тест-системы. Также высокая стоимость зарубежных тест-систем ограничивает их широкое применение в России. Все это может приводить к тому, что не у всех пациентов, получающих антиретровирусную терапию, адекватно оценивают, насколько терапия эффективна, что в конечном итоге приводит к развитию лекарственной устойчивости. Внедрение в практику дешевых отечественных тестов с доказанной эффективностью в отношении наиболее представленных вариантов ВИЧ в России, а также апробированных на образцах от российских пациентах, позволит широко использовать критерий вирусной нагрузки в клинике ВИЧ-инфекции.

Несмотря на использование высокоэффективных схем лечения, у достаточно большой части пациентов терапия становится неэффективной. Хотя причина неэффективности терапии может быть многофакторной, практически во всех случаях развивается устойчивость к используемым препаратам. Тестирование лекарственной устойчивости ВИЧ к противоретровирусным препаратам является важным дополнением в общей схеме мониторинга пациентов, получающих специфическую терапию, так как в большинстве случаев такие методы позволяют объяснить причину неэффективности терапии и назначить оптимальную комбинацию препаратов. Одним из наиболее распространенных методов определения лекарственной устойчивости ВИЧ является метод, основанный на секвенировании ДНК выбранных фрагментов генома ВИЧ. Две тест-системы, принцип которых основан на секвенировании ДНК, одобрены и разрешены к применению в США и Европе и недавно стали использоваться в России: Trugene HTV1 genotyping kit and open gene sequencing system (фирмы Visible Genetics) и Viroseg HIV-1 Genotyping System (фирмы Applied Biosystems).

Суммируя вышесказанное, можно подчеркнуть значительную роль молекулярно-генетических методов в диагностике и лечении ВИЧ-инфекции. Кроме того, молекулярные методы могут быть использованы при проведении эпидемиологического надзора за ВИЧ-инфекцией, в частности, при изучении распространенности различных субтипов ВИЧ, а также при изучении циркуляции резистентных вариантов ВИЧ среди недавно инфицированных пациентов. Разработка дешевых, доступных и хорошо апробированных отечественных тестов позволит заменить импортные аналоги, что в свою очередь приведет к активному внедрению таких тестов в клиническую практику.

Цель работы

Совершенствование лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции путем разработки и использования комплекса молекулярно-генетических подходов с учетом генетических особенностей вариантов ВИЧ, циркулирующих на территории России.

Задачи исследования

1. Разработать молекулярно-генетические подходы и оценить возможность их использования для проведения ранней диагностики ВИЧ-инфекции у детей, рожденных от ВИЧ-инфицированных матерей.

2. Обосновать необходимость проведения скрининга донорской крови с помощью молекулярно-генетических методов и предложить современные подходы повышения инфекционной безопасности при переливании крови.

3. Обосновать и сконструировать оптимальный формат отечественных тест-систем для определения вирусной нагрузки ВИЧ, подтвердить их эффективность в клинической практике для прогнозирования течения ВИЧ-инфекции и оценки эффективности АРВ терапии в сравнении с зарубежными тест-системами.

4. Разработать методические подходы, позволяющие стандартизовать молекулярно-генетические исследования при ВИЧ-инфекции.

5. Разработать генотипический подход для определения лекарственной устойчивости ВИЧ и охарактеризовать возможность применения разработанного подхода для совершенствования АРВ терапии и проведения эпидемиологического надзора за первичной резистентностью.

6. Предложить новую технологию генотипирования ВИЧ на основе метода секвенирования, позволяющую определять большинство генотипов

ВИЧ, включая рекомбинантные формы. С помощью разработанной технологии оценить разнообразие вариантов ВИЧ на территории России.

Научная новизна

1. Впервые в РФ разработана методология создания ПЦР-тест-систем для диагностики и мониторинга ВИЧ-инфекции с учетом генетических особенностей вариантов ВИЧ, циркулирующих на территории РФ.

2. Впервые проведена оценка аналитических и диагностических показателей тестов, основанных на молекулярно-генетических методах и предназначенных для диагностики ВИЧ.

3. На основе разработанных молекулярно-генетических подходов для диагностики и генотипирования ВИЧ создан алгоритм оценки лабораторных показателей эффективности АРВ терапии у пациентов, инфицированных ВИЧ.

4. Определены частота и характер развившейся лекарственной устойчивости у ВИЧ-инфицированных пациентов, получавших различные схемы АРВ терапии в течение нескольких лет.

5. Сформулированы теоретические положения, обосновывающие проведение скрининга донорской крови на наличие вирусных маркеров с помощью молекулярно-генетических методов.

6. Получены новые данные о распространенности различных субтипов ВИЧ в России в 2003 и 2007 гг. и проведена оценка полученных результатов по сравнению с данными, полученными в более ранние годы.

7. Показана высокая эффективность метода секвенирования для определения генотипа ВИЧ по сравнению с другими методами генотипирования.

8. Разработаны методические подходы стандартизации лабораторных исследований для ВИЧ-инфекции, основанных на молекулярно-генетических методах.

Практическая значимость

1. Разработан комплекс отечественных диагностических препаратов на основе молекулярно-генетических методов, которые позволили усовершенствовать диагностику, мониторинг и лечение ВИЧ-инфицированных пациентов. На основе разработанных методологических подходов созданы наборы реагентов: «АмплиСенс ДНК-ВИЧ-96 М», «АмплиСенс ДИК-ВИЧ-РЯТ», «АмплиСенс ВИЧ Монитор» «АмплиСенс ВИЧ Монитор-РЯТ», «АмплиСенс ВИЧ-генотип-ЕрЬ», которые зарегистрированы Федеральной службой по надзору в сфере здравоохранения и социального развития РФ и внесены в государственный реестр изделий медицинского назначения и медицинской техники.

2. Разработаны методические рекомендации по использованию тест-систем на основе молекулярно-генетических методов, позволяющие оптимально использовать молекулярно-генетические тесты в клинической и лабораторной практике.

3. Впервые в РФ разработаны и внедрены в клиническую практику молекулярно-генетический подход и алгоритм его использования для ранней диагностики ВИЧ-инфекции у детей, рожденных от ВИЧ-инфицированных матерей.

4. Разработана стандартная панель контрольных образцов, содержащих РНК ВИЧ, для проведения внешнего и внутрилабораторного контроля качества молекулярно-генетических исследований в области ВИЧ-инфекции.

5. Создана система эпидемиологического надзора за циркуляцией различных вариантов ВИЧ с помощью молекулярно-генетических методов для оценки генетического разнообразия вируса и эпидемиологических расследований новых случаев инфицирования ВИЧ.

Структура и объем

Диссертация представлена на 230 страницах, включая 25 рисунков, 25 таблиц, список литературы и приложения. Работа состоит из введения, обзора литературы, 7 глав собственных наблюдений, обсуждения полученных результатов с выводами. Список использованной литературы включает 16 отечественных и 176 зарубежных источников.

Похожие диссертационные работы по специальности «Клиническая лабораторная диагностика», 14.03.10 шифр ВАК

Заключение диссертации по теме «Клиническая лабораторная диагностика», Богословская, Елена Владимировна

Выводы.

С целью проведения постоянного надзора за распространением различных субтипов ВИЧ на территории РФ была разработана методика типирования ВИЧ, основанная на секвенировании ДНК.

Разработанная методика генотипирования ВИЧ основана на секвенировании четырех фрагментов генома, позволяя идентифицировать с высокой точностью большинство известных подтипов ВИЧ, включая рекомбинантные формы. Данная методика была использована для изучения распространенности различных вариантов ВИЧ в России в 2003 и 2007 годах. В результате было показано, что ВИЧ подтипа А сохраняет доминирующее положение. Однако наблюдается появление новых вариантов ВИЧ, которое требует дальнейшего детального изучения с целью выяснения их роли в общем эпидемическом процессе.

Разработанная методика генотипирования ВИЧ может быть использована не только с целью слежения за распространенностью различных субтипов ВИЧ, но также для проведения эпидемиологических расследований.

Широкое использование молекулярно-генетических методов в различных сферах здравоохранения, особенно в области инфекционной патологии, обусловлено большим количеством преимуществ таких методов по сравнению с традиционными подходами типа микроскопия, бактериология и вирусология. В России наибольшее распространение получили молекулярные методы, основанные на полимеразной цепной реакции (ПНР), которая отличается высокой чувствительностью и специфичностью. К недостаткам ПЦР-диагностики можно лишь отнести высокий риск контаминации образцов продуктами амплификации, получаемыми в огромном количестве в ходе реакции (Клуок, 1989). Однако за последние годы были разработаны различные подходы по снижению риска контаминации, а также методы по контролю за ложноположительными результатами (Методические рекомендации по проведению работ в диагностических лабораториях, использующих метод полимеразной цепной реакции, 1995; Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы 1-1У групп патогенности: Методические указания, 2009; Клуок, 1989).

До недавнего времени использование молекулярно-генетических методов для диагностики ВИЧ-инфекции было ограничено из-за небольшого количества тест-систем и их недостаточно высокого качества. Кроме того, большинство зарубежных диагностикумов не проходит апробации на клиническом материале от российских пациентов и не адаптированы к российским вариантам ВИЧ. Из-за высокой изменчивости вируса возникает опасность, что импортные тесты окажутся малоэффективными для диагностики ВИЧ у российских пациентов. Тем более, известно, что в России широко распространен вирус субтипа А, который, в основном не представлен в США и Западной Европе, где разрабатываются и производятся ПЦР-тесты.

Важной особенностью российских вирусов также является его уникальность и непохожесть на другие варианты ВИЧ субтипа А, представленные в базах данных Los Alamos и NCBI.

В 2003 году было официально признано, что тест-система для выявления ДНК провируса ВИЧ производства Хоффманн-Ла Рош непригодна для использования на территории РФ. Причинами тому были низкая эффективность выявления ВИЧ субтипа А, отсутствие внутреннего контрольного образца (ВКО), что часто приводило к появлению ложноотрицательных результатов (Бобкова, 2003). Такой негативный опыт привел к тому, что создалось общественное мнение о малой эффективности ПЦР-тестов в отношении ВИЧ-инфекции. Этим фактом, по-видимому, также объясняется то, что в России до 2011 года диагноз ВИЧ-инфекции детям, рожденным от ВИЧ-инфицированных матерей, снимали на основании серологических методов не раньше 18 месяцев жизни ребенка (Инструкция по профилактике передачи ВИЧ-инфекции от матери ребенку и образца информированного согласия на проведение химиопрофилактики ВИЧ, 2004). В то время как в развитых странах постановка диагноза таким детям осуществляется в первые 6 месяцев жизни на основании ПЦР-исследований (Guidelines for the Use of Antiretroviral Agents in Pediatric HIV Infection, 2011).

Целью настоящей работы была разработка не отдельных тест-систем, а целого комплекса молекулярно-генетических диагностических препаратов, которые позволят в полном объеме осуществлять диагностику и мониторинг ВИЧ-инфицированных пациентов, а также позволят проводить эпидемиологический мониторинг за циркулирующими в России вариантами ВИЧ и эпидемиологические расследования.

Разработка тест-систем включала не только создание самого диагностического препарата, но и проведение расширенных клинических испытаний в сравнении с известными коммерческими тест-системами, а также создание рекомендаций по использованию разработанных тестов. Причем, необходимо было определить не только место каждого теста в структуре лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции (т.е. понимание того, в каких случаях необходимо использовать тот или иной тест, как правильно интерпретировать результат), но и сформулировать основные правила проведения исследований с помощью молекулярных методов с целью уменьшения лабораторных ошибок и получения корректных результатов. Только в этом случае можно будет говорить о внедрении молекулярно-генетических методов в структуру лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции.

В ходе разработок отечественных тест-систем были сформулированы следующие требования:

1. отечественные тесты должны быть в несколько раз более дешевыми по сравнению с коммерческими импортными тест-системами;

2. аналитические характеристики разработанных тестов должны быть не хуже, чем у импортных аналогов;

3. тест-системы должны быть зарегистрированы в России и апробированы на большом объеме клинического материала, полученного от российских пациентов.

В ходе настоящей работы было разработано и апробировано шесть ПЦР-тест-систем, предназначенных для диагностики и мониторинга ВИЧ-инфекции, пять из которых прошли Государственную регистрацию и поставляются в региональные Центры СПИД за счет федерального бюджета.

Место молекулярных исследований в области ВИЧ-инфекции не раз обсуждалось в литературе. Поскольку серологические методы в более чем 99% случаев позволяют выявить ВИЧ-инфекцию у пациента, молекулярные методы нашли свое место только для диагностики определенных групп населения. Так, абсолютно незаменимым исследованием является выявление ДНК провируса ВИЧ методом ПЦР у детей, рожденных от ВИЧ-инфицированных матерей, поскольку позволяет сократить срок постановки или снятия диагноза с 18 месяцев до 6. ПЦР-диагностика на наличие ДНК провируса может быть полезна для разрешения сомнительных результатов иммуноблотта, а также для выявления ВИЧ у лиц в период серологического окна.

Некоторые исследователи не видят необходимости в создании тест-систем для выявления ДНК провируса ВИЧ, полагая, что их можно заменить на тесты, выявляющие РНК ВИЧ, тем более, что таких тестов разработано в мире достаточное количество и они отличаются высокой эффективностью в отношении большинства субтипов ВИЧ. Правда, в основном, речь идет о тестах, предназначенных для количественного определения РНК ВИЧ, а такие исследования достаточно дорогие. Даже в рекомендациях (Guidelines for the Use of Antiretroviral Agents in Pediatric HIV Infection, 2011), касающихся диагностики ВИЧ-инфекции у детей, рожденных от ВИЧ-инфицированных матерей, предлагается в странах, где распространены варианты ВИЧ, отличные от субтипа В, пользоваться тестами для определения вирусной нагрузки ВИЧ (т.е. тестами, позволяющими выявлять РНК ВИЧ в плазме крови). Помимо крайне высокой стоимости таких исследований, есть и другие существенные ограничения для такой замены. В частности, если новорожденному ребенку назначают профилактический курс АРВ терапии сразу после рождения, выявление РНК ВИЧ для постановки диагноза у него будет неэффективным, поскольку лекарственные препараты приводят к быстрому подавлению репликации вируса и, тем самым, к уменьшению содержания РНК ВИЧ.

Для подтверждения сомнительных результатов ИБ также целесообразнее пользоваться тестами по выявлению ДНК провируса, поскольку ВИЧ-инфицированные пациенты на протяжении длительного промежутка времени находятся на стадии субклинической, когда концентрация РНК ВИЧ может быть невысокой. Согласно зарубежным данным, а также собственным результатам, полученным при тестировании ВИЧ-инфицированных пациентов, не получавших терапии, приблизительно в 5% случаев могут встречаться пациенты с недетектируемым количеством

РНК ВИЧ. При этом ДНК провируса у таких пациентов определяется в 100% случаев.

Таким образом, разработка отечественных тест-систем для выявления ДНК провируса ВИЧ позволила решить одну из важнейших проблем -ранняя диагностика ВИЧ-инфекции у детей, рожденных от ВИЧ-инфицированных матерей. На сегодняшний день для этих целей в рамках Национального проекта «Здоровье» во все Центры СПИД России поставляются 2 тест-системы «АмплиСенс ДНК-ВИЧ-96 М» и «АмплиСенс ДИК-ВИЧ-РЯТ», речь о которых шла в главе 1.

Отдельное место в генодиагностике ВИЧ-инфекции занимает скрининг донорской крови на наличие инфекционных маркеров. В данном случае молекулярные методы являются дополнительным исследованием в комплексе с серологическими методами. Основная роль молекулярных методов заключается в уменьшении инфекционного риска, связанного с наличием серологического окна за счет того, что вирус или его компоненты могут быть обнаружены в крови донора задолго до появления антител. Поскольку после внедрения вируса в организм человека вирус начинает быстро размножаться, то наиболее ранним маркером является РНК ВИЧ. Именно РНК ВИЧ отражает скорость репликации вируса, которая максимальна в период острой инфекции.

В последние годы в России проблема инфекционной безопасности донорской крови стала приобретать особую актуальность в связи с резким увеличением числа ВИЧ-инфицированных пациентов и лиц с хроническими вирусными гепатитами В и С. Увеличение числа инфицированных лиц среди донорского контингента повышает риск переливания крови от донора, находящегося в серологическом окне, когда вирус в крови присутствует в высокой концентрации. Необходимо еще раз подчеркнуть, что молекулярные методы ни в коем случае не заменяют серологический скрининг донорской крови, а только дополняют с целью уменьшения остаточного инфекционного риска, связанного с серологическим окном. В ряде случаев такой дополнительный скрининг позволит сократить остаточный инфекционный риск за счет уменьшения лабораторных ошибок. Тем более, что до сих пор все известные случаи переливания инфицированной ВИЧ донорской крови в России были связаны с лабораторными ошибками, а вовсе не с тем, что донор находился в фазе серологического окна.

При разработке тест-систем, предназначенных для молекулярного скрининга донорской крови, необходимо было учесть особенности работы станций переливания крови. В большинстве случаев результаты тестирования крови должны быть получены в течение 1-2 дней. Крупные СПК за 1 день обрабатывают более 200-300 образцов крови. Таким образом, важной характеристикой, которой должны обладать ПЦР-тесты, является высокая пропускная способность. Для решения этой проблемы были предложены 3 ключевых момента:

1. автоматизация основных этапов ПЦР-анализа;

2. одновременное тестирование 3 маркеров основных вирусных агентов (РНК ВИЧ и вируса гепатита С и ДНК вируса гепатита В);

3. использование метода Real-Time ПЦР.

Реализация этих трех подходов позволила разработать тест-систему, с помощью которой можно в течение 5-6 часов провести молекулярный скрининг более 200 образцов донорской крови, что практически сопоставимо с серологическими исследованиями.

Одной из ключевых особенностей разработанной тест-системы был формат тестирования мини-пулов. В отличие от общепринятого понятия о мини-пул-тестировании (когда анализируется небольшая аликвота из общего пула, состоящего из нескольких индивидуальных образцов, чаще от 8 до 24), был предложен подход, позволяющий тестировать мини-пул целиком, что способствовало сохранению высокой эффективности при увеличении пропускной способности теста.

Важной составной частью данной разработки было создание методических рекомендаций по проведению молекулярно-генетического скринига в службе крови.

Если говорить о роли молекулярно-генетических методов диагностики в мониторинге ВИЧ-инфицированных пациентов, то незаменимым показателем для оценки прогноза течения заболевания и эффективности АРВ терапии является вирусная нагрузка ВИЧ или концентрация РНК ВИЧ в плазме крови. Роль данного маркера была неоднократно продемонстрирована в когортных исследованиях за рубежом (Ledergerber, 1999; Mellors, 1997; Saag, 1997; Murray, 1999). Для его определения разработаны коммерческие тест-системы. Однако зарубежные фирмы-производители таких тест-систем предлагают их по сильно завышенным ценам в силу востребованности таких исследований (каждому ВИЧ-инфицированному пациенту необходимо проводить таких исследований в среднем 4 раза в год). Помимо высокой стоимости самих тестов большинство производителей предлагают «закрытую» систему анализа, т.е. для подобного рода исследований необходимо закупить соответствующее дорогостоящее оборудование, которое предназначено для работы с реактивами того же производителя. В тоже время в клинике ВИЧ-инфекции большое значение приобретает диагностика оппортунистических инфекций. Однако зарубежные производители ПЦР-тестов в большинстве случаев не предлагают тест-систем для диагностики таких актуальных инфекций у ВИЧ-инфицированных пациентов, как ЦМВИ, пневмоцистная пневмония, токсоплазменные поражения, герпетические инфекции и другие. В результате лаборатории, имеющие «закрытое» оборудование, либо вынуждены закупать дополнительные оборудование и реагенты, либо предоставляют клиническому отделению ограниченный спектр исследований.

Проведенные в настоящей работе исследования позволили создать тест-системы, которые с одной стороны не уступают по своим аналитическим характеристикам зарубежным тестам, а с другой стороны отличаются низкой себестоимостью и являются «открытыми» системами. Разработанные тест-системы рассчитаны на лаборатории с разным уровнем оснащения и степенью загруженности. Кроме того, тест-системы предполагают разные способы пробоподготовки: «ручной» и автоматический. Для «ручной» пробоподготовки предлагается несколько методик, выбор которых зависит только от предпочтений сотрудников лаборатории. Надо отметить, что обе тест-системы закупаются за счет федерального бюджета в рамках Национального проекта «Здоровье» наравне с импортными тестами.

Одним из важнейших этапов настоящей работы было проведение широкомасштабных испытаний разработанных тест-систем в сравнении с импортными тестами, широко представленными в России. Одной из задач такого исследования было оценить качество разработанных тест-систем, выявить дискордантные результаты, найти причины и при необходимости провести оптимизацию (модернизацию) тест-систем. Другая задача исследования заключалась в оценке качества работы импортных тест-систем на образцах, полученных от российских пациентов.

Одной из широко используемых в России импортных тест-систем является «Amplicor HIV-1 Monitor» фирмы Хоффманн-Ла Рош. За рубежом данная тест-система используется более 15 лет, и результаты многочисленных ее апробаций представлены в литературе очень широко (Berger, 2005; Coste, 1996; Rouet, 2010; Highbarger, 1999; Swanson, 2000, 2005, 2007; Lin, 1998; Murphy D.G., 2000; Elbeik, 2000). Причем, до сих пор регулярно выходят публикации, в которых описываются результаты сравнения различных тест-систем для определения вирусной нагрузки ВИЧ, в числе которых почти всегда присутствует тест-система «Amplicor HIV-l Monitor».

Другая тест-система, которая в последние годы стала активно использоваться в России, представлена фирмой Эбботт (Abbott Real-Time HÍY-1). В отличие от предыдущей тест-системы опыт использования «Abbott Real-Time HIV-1» даже за рубежом не велик. Минимальное количество публикаций по сравнению данной тест-системы с известными коммерческими аналогами (Swanson, 2006, 2007; Crump, 2009), а также отсутствие клинических испытаний в России требовали проведения исследований, которые продемонстрируют возможность использования данной тест-системы на территории РФ.

Проведенные исследования продемонстрировали высокую сходимость результатов, полученных с помощью разработанных и импортных тест-систем, в особенности в сравнении с тест-системой «Cobas Amplicor HIV-1 Monitor v. 1.5» фирмы Хоффманн-Ла Pom. Также была выявлена недостаточная эффективность работы тест-системы «Abbott Real-Time HIV-1». И хотя количество образцов, для которых были получены заниженные результаты вирусной нагрузки ВИЧ в данной тест-системе, было не велико (8,4%), полученные данные заставляют задуматься о правомерности повсеместного использования такой тест-системы на территории РФ.

Точность количественных измерений РНК ВИЧ имеет огромное значение при проведении мониторинга эффективности АРВ-терапии. Поскольку таких исследований стало проводиться в нашей стране значительное количество, необходимо было разработать стандартную панель образцов, которую можно было использовать для проведения контроля качества лабораторных исследований, связанных с определением вирусной нагрузки ВИЧ.

Актуальность данной проблемы стала особенно очевидна, когда на российском рынке появилось сразу несколько отечественных ПЦР-тест-систем, предназначенных для определения концентрации РНК ВИЧ, но для которых не было в литературе никакой информации о результатах клинических испытаний, тем более в сравнении с ранее зарегистрированными тест-системами, в том числе импортными.

За рубежом разработаны и продаются различные стандартные образцы, которые можно было использовать для контроля качества лабораторных исследований, связанных с определением концентрации РНК ВИЧ. Наиболее известный из них - Международный стандарт. Однако все импортные стандарты отличаются высокой стоимостью и сложностью транспортировки. Кроме того, для России одним из существенных недостатков импортных панелей стандартных образцов является тот факт, что они крайне редко включают образцы, содержащие ВИЧ субтипа А (наиболее распространенного в нашей стране). Поэтому было необходимо создать отечественную стандартную панель, которая бы включала образцы, содержащие ВИЧ наиболее распространенных по России субтипов (в частности А), а также образцы с разными концентрациями РНК ВИЧ.

В последние годы стала повышаться актуальность определения лекарственной устойчивости ВИЧ к АРВ препаратам. Связано это с все более активным использованием АРВ препаратов для лечения большого количества пациентов. Причем, все больше регионов вовлекается в этот процесс. Этому способствуют увеличивающиеся бюджетные ассигнования.

Актуальность определения лекарственной устойчивости связана в большой степени и с необходимостью как можно более раннего назначения такого рода исследований при выявлении вирусологической неэффективности терапии. Это определяется тем фактом, что в условиях неэффективного приема лекарственных препаратов вирус реплицируется с формированием вариантов, у которых имеются мутации, приводящие к лекарственной устойчивости. И чем дольше вирус размножается в таких условиях, тем больше мутаций может сформироваться, что в конечном итоге приводит к появлению вирусов, обладающих перекрестной резистентностью к нескольким или даже всем препаратам из одного класса. Кроме того, накапливающиеся вторичные мутации способствуют повышению жизнеспособности резистентного вируса, и такой вирус начинает обладать репликативной способностью, не меньшей чем «дикий» вриант.

Несмотря на то, что разработаны схемы высоко эффективной АРВ терапии, далеко не у всех пациентов удается достичь полного подавления репликации вируса и сохранения такого состояния долгие годы. Причинами неэффективности терапии могут быть как неправильный прием препаратов, так и индивидуальные особенности фармакокинетики, а также масса других причин. Причину неэффективности терапии у таких пациентов желательно найти как можно раньше, когда еще не успела сформироваться резистентность. С другой стороны, большую проблему составляют пациенты, у которых терапия становится неэффективной через несколько лет успешной терапии. В таких случаях чаще всего причиной неэффективности терапии является появление лекарственно устойчивых вирусов. По-видимому, в ряде случаев полностью подавить репликацию вируса не удается, и продолжающаяся репликация ВИЧ, хоть и на очень низком уровне, в присутствии АРВ препаратов приводит в конечном итоге к появлению резистентных вариантов. Большую опасность представляют эпизоды транзиторного повышения вирусной нагрузки в процессе терапии, спровоцированные, например ОРВИ. Несмотря на то, что вирусная нагрузка впоследствии снижается до неопределяемого уровня, одного такого эпизода может быть достаточно, чтобы сформировался резистентный вариант вируса, который со временем проявит себя.

Определение лекарственной устойчивости ВИЧ - это дорогостоящее и сложное исследование, требующее закупки дорогого оборудования -секвенатора. Однако понимание того, что бесконтрольное распространение резистентных вариантов ВИЧ приведет к тому, что мультирезистентных пациентов просто нечем будет лечить, способствовало в последние годы оснащению многих лабораторий Центров СПИД необходимым оборудованием и поставкам соответствующих тестов в рамках национальных проектов и государственных контрактов. Высокие цены на импортные тестсистемы (порядка 500 долл. США за одно исследование) приводят к необходимости проведения разработки отечественных тест-систем, что и было выполнено в ходе настоящей работы.

Разработка отечественной тест-системы для определения лекарственной устойчивости ВИЧ позволила решить сразу несколько задач. В первую очередь, такой тест позволяет в большинстве случаев выявлять причину неэффективности терапии и правильно подбирать новую комбинацию АРВ препаратов. Проведенные исследования, в которые были вовлечены ВИЧ-инфицированные пациенты, получавшие в течение нескольких лет высокоактивную антиретровирусную терапию, продемонстрировали необходимость как можно более раннего назначения тестов, предназначенных для выявления лекарственной устойчивости ВИЧ в случае вирусологической неэффективности терапии. Результаты, полученные в ходе данной работы, позволили не только описать спектр мутаций, появившихся в ответ на прием различных препаратов, но и проследить динамику появления и исчезновения разных мутаций при изменении схем лечения.

Вторая важная задача, которая может быть решена с помощью разработанной тест-системы, связана с эпидемиологическим надзором за первичной резистентностью ВИЧ. В ходе работы была показана не только возможность использования отечественного теста для решения эпидемиологических задач, но и подтверждена ее более высокая эффективность по сравнению с импортной тест-системой.

Если рассматривать проблему с экономической точки зрения, то разработанная тест-система оказалась более чем на порядок дешевле импортного аналога. Замена импортных тестов на отечественные позволит значительно сэкономить государственный бюджет с одной стороны, а также позволит проводить регулярный мониторинг первичной резистентности ВИЧ по России с другой стороны.

Данные исследования приобретают особую актуальность в последние годы в связи с активным внедрением АРВ терапии среди пациентов большинства регионов России. Кроме того, последние данные по первичной резистентности ВИЧ в США и странах Западной Европы не утешительны: частота превышает 10%, что создает огромные трудности в выборе оптимальных препаратов для лечения. На такие исследования в нашей стране редко выделяются большие бюджетные средства, поэтому их себестоимость имеет огромное значение. В противном случае это приведет к тому, что эпидемиологический надзор будет проводиться не в полном объеме и не будет отражать реальной ситуации по распространенности резистентных вариантов ВИЧ в различных регионах России.

Другой важной задачей эпидемиологического мониторинга, которую невозможно решить без использования молекулярных методов, является изучение распространенности различных вариантов ВИЧ на территории РФ. Полученные данные могут быть использованы и для оценки эволюции ВИЧ на конкретной территории, и для выявления новых вариантов ВИЧ, и для разработки вакцинных, терапевтических и диагностических препаратов.

В последние годы такие исследования практически не проводились в нашей стране либо объем этих исследований ограничивался 1-2 областями. Последние масштабные работы по изучению распространенности вариантов ВИЧ по России были сделаны в 1999-2003 годах (ВоЬкоу, 2004). Основная часть этой работы была сделана с использованием гетеродуплексного анализа, основанного на разнице электрофоретической подвижности гомо- и гетеродуплексов ДНК. Однако данный подход имеет ряд ограничений: длительность и трудоемкость процедуры, низкая информативность результатов. А в ряде случаев образцы могут не образовывать «гомодуплекс» ни с одним из контрольных образцов, что может быть связано с неполноценностью контрольной панели и необходимостью ее расширения.

В связи с активным внедрением молекулярных методов диагностики в различные отрасли медицины в нашей стране, многие лаборатории стали оснащаться автоматическими секвенаторами, поэтому на сегодняшний день метод секвенирования можно назвать методом выбора для генотипирования ВИЧ. Помимо собственно определения субтипа ВИЧ метод секвенирования позволяет получить полную информацию о нуклеотидной последовательности изучаемых штаммов. Эта информация в дальнейшем может быть использована для филогенетического анализа. Поэтому секвенирование ДНК является незаменимым методом при проведении эпидемиологических расследований случаев инфицирования ВИЧ.

В результате настоящей работы был разработан комплекс молекулярно-генетических тестов (включающий 6 тест-систем), предназначенных для выявления, количественного определения и генотипирования ВИЧ. Весь разработанный комплекс тестов позволяет решить большинство вопросов, связанных с молекулярной диагностикой ВИЧ-инфекции. Все разработанные тесты апробированы на клиническом материале от российских пациентов в сравнении с импортными тест-системами, причем объем клинического материала для большинства тест-систем превышал 200 образцов. Пять тест-систем зарегистрированы и разрешены к применению на территории РФ, четыре из них поставляются ежегодно в лаборатории Центров СПИД в рамках Национального проекта «Здоровье».

Комплекс разработанных молекулярных тестов позволил решить основные проблемы диагностики и мониторинга пациентов с ВИЧ-инфекцией: ранняя диагностика ВИЧ у новорожденных детей, сокращение остаточного риска инфицирования при переливании крови, прогноз течения заболевания, оценка эффективности АРВ терапии и определение лекарственной устойчивости ВИЧ. Большое значение имеет тот факт, что разработанный спектр тестов рассчитан как на слабо оснащенные лаборатории, так и на лаборатории, имеющие полный набор высоко технологичного оборудования для проведения молекулярных исследований. Это позволило сделать современные методы диагностики ВИЧ максимально доступными для большинства ВИЧ-инфицированных пациентов.

Помимо разработки тест-систем были сформулированы основные рекомендации по проведению молекулярных исследований в клинической лаборатории, начиная от организации ПЦР-лаборатории и заканчивая тонкостями интерпретации полученных результатов, без которых было бы невозможно повсеместное внедрение молекулярных методов диагностики в клиническую и лабораторную практику. Краткое содержание некоторых из них изложено в Сборнике нормативно-правовых актов и методических документов по вопросам диагностики, лечения, эпидемиологического и поведенческого надзора ВИЧ/СПИД и сопутствующих заболеваний, Москва, 2007, 4 том.

Также в ходе работы была разработана методика генотипирования ВИЧ, которая совместно с тест-системой для определения лекарственной устойчивости ВИЧ может быть использована для решения различных эпидемиологических задач, таких как надзор за первичной резистентностью, распространенность различных вариантов ВИЧ, проведение эпидемиологических расследований и др.

1. Разработанные молекулярно-генетические подходы, предназначенные для выявления ДНК провируса ВИЧ в лейкоцитах крови, позволяют: сократить время постановки диагноза детям, рожденным от ВИЧ-инфицированных матерей, до 4-6 месяцев вместо 12-18 месяцев и подтвердить сомнительные результаты ИБ, а также проводить раннюю диагностику ВИЧ-инфекции у контактных лиц при подозрении на недавнее инфицирование.

2. Доказана эффективность нового комплексного подхода для решения проблемы инфекционной безопасности донорской крови, включающего разработку методики и алгоритма проведения молекулярно-генетического скрининга донорской крови параллельно с уже используемым серологическим скринингом. Предложенный подход и методы его реализации позволяют повысить производительность исследования до 200300 образцов в день при сохранении высокой эффективности выявления инфекционных агентов.

3. Разработанные тест-системы для количественного определения РНК ВИЧ обладают высокими аналитическими и диагностическими характеристиками при более низкой по сравнению с зарубежными тест-системами себестоимости. Показана возможность их использования для оценки прогноза течения заболевания и эффективности АРВ терапии.

4. Разработанные алгоритмы приготовления и аттестации стандартных образцов позволили создать панель стандартных образцов ВИЧ, которая может быть использована для проведения внешнего и внутрилабораторного контроля качества исследований, связанных с молекулярной диагностикой ВИЧ-инфекции.

5. Разработанная тест-система для выявления мутаций устойчивости ВИЧ к АРВ препаратам обладает более высокими аналитическими и диагностическими показателями, а также более низкой стоимостью по сравнению с зарубежными тест-системами. Показана возможность ее использования как для раннего выявления причин неэффективности АРВ терапии и дальнейшей коррекции схемы лечения, так и для проведения эпидемиологического надзора за распространением первичной резистентности ВИЧ.

6. Разработанная методика генотипирования ВИЧ позволяет определять большинство известных субтипов ВИЧ-1, включая рекомбинантные формы, что в свою очередь позволяет усовершенствовать эпидемиологический надзор за распространением различных вариантов ВИЧ на территории РФ, процедуру эпидемиологических расследований новых случаев инфицирования, а также диагностику ВИЧ-инфекции.

7. С помощью разработанной методики генотипирования ВИЧ показана распространенность различных субтипов ВИЧ по России в разные годы. ВИЧ субтипа А сохраняет доминирующее положение, начиная с 1997 года, и составляет более 90% всех случаев ВИЧ-инфекции. С 2007 года показано распространение нового для России варианта ВИЧ рекомбинантной формы А/О (7%). На остальные варианты ВИЧ приходится менее 3% всех случаев ВИЧ-инфекции.

Список литературы диссертационного исследования доктор медицинских наук Богословская, Елена Владимировна, 2012 год

1. Бартлетт, Д. Клинические аспекты ВИЧ-инфекции 2009-2010 / Д. Бартлетт, Д. Галлант, П. Фам. М.: Р.Валент, 2010. - 490 с.

2. Беляева, В.В. Консультирование при ВИЧ-инфекции. Пособие для врачей разных специальностей / В.В.Беляева, В.В.Покровский, А.В.Кравченко. М.: ТУП «Медицина для Вас», 2003. - 77 с.

3. Бобков, А.Ф. Субтипы ВИЧ-1 в России в 1987-98 гг. / А.Ф. Бобков и др.. Журнал микробиологии эпидемиологии и иммунобиологии.- 1999.-№1.-С. 43-45.

4. Бобков, А.Ф. Молекулярно-генетическая характеристика ВИЧ-1 на территории России. / А.Ф. Бобков и др.. Вестник Российской Академии медицинских наук. 2002. - № 8. - с. 40-42.

5. Бобкова, М.Р. Молекулярно-эпидемиологическая характеристика основных очагов эпидемии ВИЧ-инфекции среди наркоманов в России / М.Р. Бобкова и др.. Вопросы вирусологии. 1999. - Т. 44.- С. 220-224.

6. Бобкова, М.Р. Применение тест-системы Amplicor HIV-l для диагностики ВИЧ-инфекции у новорожденных детей в России: первые результаты (2001-2002 г.г.). / М.Р. Бобкова и др. -Клиническая лабораторная диагностика. 2003. - №6. - С. 49-53.

7. Дзысюк, Н.В. Циркуляция различных генотипов ВИЧ среди населения Казахстана. / Н.В. Дзысюк и др. Сборник тезисов

8. Вторая конференция по вопросам ВИЧ/СПИД в Восточной Европе и Центральной Азии. М.: 2008. с.26.

9. Ю.Информационный бюллетень № 34 «ВИЧ-инфекция», 2010. 52 с. -URL - http://www.hivrussia.ru.

10. Лукашов, B.B. Молекулярная эволюция и филогенетический анализ. / В.В.Лукашов. М.: Бином. Лаборатория знаний, 2009. - 256 с.

11. Покровский, В.В. ВИЧ-инфекция: клиника, диагностика и лечение./ В.В. Покровский, Т.Н. Ермак, В.В. Беляева, О.Г. Юрин / Под общ. ред. В.В. Покровского. М.: ГЭОТАР МЕДИЦИНА, 2000. - 496 с.

12. Покровский, В.В. Эпидемиология и профилактика ВИЧ-инфекции и СПИД / В.В.Покровский. М.: Медицина, 1996. - 248 с.

Обратите внимание, представленные выше научные тексты размещены для ознакомления и получены посредством распознавания оригинальных текстов диссертаций (OCR). В связи с чем, в них могут содержаться ошибки, связанные с несовершенством алгоритмов распознавания. В PDF файлах диссертаций и авторефератов, которые мы доставляем, подобных ошибок нет.