Компонентный состав и гидролитическая способность рекомбинантных целлюлазных препаратов на основе гриба Penicillium verruculosum: новые методы оптимизации состава целлюлазного комплекса тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.06, кандидат наук Проскурина, Ольга Владимировна

• Проскурина, Ольга Владимировна
• кандидат наук
• 2013

Оглавление диссертации кандидат наук Проскурина, Ольга Владимировна

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА 1. ЦЕЛЛЮЛОЗОСОДЕРЖАЩАЯ БИОМАССА

1.1. Лигно целлюлозные материалы

1.2. Состав целлюлозосодержащей биомассы из различных источников

1.3. Структура клеточной стенки растений

1.4. Целлюлоза

1.5. Предобработка лигно целлюлозного сырья

ГЛАВА 2. ФЕРМЕНТАТИВНАЯ ДЕСТРУКЦИЯ ЦЕЛЛЮЛОЗОСОДЕРЖАЩЕЙ

БИОМАССЫ

2.1. Гликозил-гидролазы

2.2. Механизм действия О-гликозил-гидролаз

2.3. Общие представления о ферментативной деградации растительной биомассы

2.4. Особенности строения и свойств целлюлолитических ферментов

2.5. Полисахаридмонооксигеназы, особенности классификации

2.6. Механизм окислительного расщепления целлюлозы под действием полисахаридмонооксигеназ

2.7. Эндоглюканаза IV Trichoderma reesei

2.8. Современные представления о механизме биодеградации целлюлозы

ГЛАВА 3. ПРОДУЦЕНТЫ ЦЕЛЛЮЛАЗ И ЦЕЛЛЮЛАЗНЫЕ ФЕРМЕНТНЫЕ

ПРЕПАРАТЫ

3.1. Промышленные целлюлазные ферментные препараты

3.2. Ферментный комплекс Pénicillium verruculosum

3.3. Реципиентные штаммы Pénicillium verruculosum

3.4. Принципы создания рекомбинантных штаммов Pénicillium verruculosum, несущих гетерологичные гены карбогидраз

3.5. Современные подходы к повышению эффективности процесса биодеградации целлюлозосодержащей биомассы

II. ЭКСПЕРЕМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

ГЛАВА 4. ОБЪЕКТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И МЕТОДЫ ЭКСПЕРИМЕНТОВ

4.1. Ферментные препараты

4.2. Субстраты

4.3. Прочие реактивы

4.4. Хроматографические сорбенты

4.5. Культивирование трансформантов Pénicillium verruculosum

4.6. Хроматографическое фракционирование ферментных препаратов для определения компонентного состава

4.7. Определение концентрации белка

4.8. Определение биохимических характеристик ферментов

4.9. Методы определения активности ферментов

4.10. Масс-спектрометрический анализ трипсиновых гидролизатов белков

4.11. Гидролиз целлюлозосодержащей биомассы

III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

ГЛАВА 5. ФЬЮЖН-КОНСТРУКЦИЯ ДЛЯ ОДНОВРЕМЕННОГО КЛОНИРОВАНИЯ

ГЕНОВ НЕСКОЛЬКИХ ФЕРМЕНТОВ

5.1. Получение фьюжн-конструкции и трансформация штамма-реципиента

P. verruculosum 537 niaD^

5.2. Получение и скрининг ферментных препаратов

5.3. Компонентный состав новых рекомбинантных ферментных препаратов

5.4. Свойства ферментного препарата P.verruculosum РУ-Ф9

5.5. Ферментный препарат P.verruculosum РУ-Ф9 как добавка к препарату

P.verruculosum PV-151

ГЛАВА 6. ЭНДОГЛЮКАНАЗА IV Т.reesei КАК НОВЫЙ КОМПОНЕНТ ЦЕЛЛЮЛАЗНЫХ ПРЕПАРАТОВ НА ОСНОВЕ ГРИБА Р. verruculosum

6.1. Ферментный препарат на основе штамма Р.verruculosum PV-3TIV - продуцента эндоглюканазы IV Т. reesei

6.2. Компонентный состав ферментного препарата Р.verruculosum PV-ЭПУ

6.3. Гидролитическая активность ферментного препарата Р. verruculosum PV-ЭПУ

6.4. Выделение эндоглюканазы IV T.reesei в гомогенном виде и изучение ее влияния на гидролитические свойства целлюлазного препарата Р. verruculosum PV-151

ГЛАВА 7. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ШТАММА-РЕЦИПИЕНТА Р.verruculosum РУ-ГИСТ4-БГЛЗ niaD() ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ФЕРМЕНТНЫХ ПРЕПАРАТОВ С ПОВЫШЕННОЙ ГИДРОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ

7.1. Получение новых ферментных преператов на основе штамма-реципиента Р. verruculosum РУ-Гист4-БГЛЗ niaD( ) при трансформации плазмиды, несущей ген гомологичной ЦБГ1 ббкДа

7.2. Исследование компонентного состава новых ферментных препаратов на основе трансформантов штамма-реципиента Р.verruculosum РУ-Гист4-БГЛЗ гпаЭ^полученных

7 f\

при трансформации плазмиды, несущей ген гомологичной ЦБГ1 ббкДа

7.3. Получение новых ферментных преператов на основе штамма-реципиента Р.verruculosum РУ-Гист4-БГЛЗ niaD("' при трансформации плазмид, несущих гены гомологичных ЦБГ1 ббкДа и ЭГН 39кДа

7.4. Исследование компонентного состава новых ферментных препаратов на основе трансформантов штамма-реципиента Р.verruculosum РУ-Гист4-БГЛЗ niaD("\

83

полученных при трансформации плазмид, несущих гены ЦБГ1 ббкДа и ЭГП 39кДа

7.5. Сравнение гидролитической активности новых рекомбинантых препаратов на основе трансформантов штамма-реципиента Р. verruculosum РУ-Гист4-БГЛЗ

7.6. Получение новых ферментных препаратов на основе штамма-реципиента Р.verruculosum PV-rHCT4-Bni3 niaD(_) при трансформации плазмидами, несущими гены ЦБГ1 ббкДа Р.verruculosum, ЭГП 39кДа Р. verruculosum и ЭГ1У 35кДа T.reesei

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

Ферменты

ЦБГ - целлобиогидролаза;

ЭГ - эндоглюканаза;

БГЛ - (3-глюкозидаза;

ПМО - полисахаридмонооксигеназа;

Прочие сокращения

ЦСБ - целлюлозосодержащая биомасса;

ФП - ферментный препарат;

СП - степень полимеризации

ЦСМ - целлюлозосвязывающий модуль

КЖ - культуральная жидкость

КМЦ - №-соль карбоксиметилцеллюлозы

МКЦ - микрокристаллическая целлюлоза

пНФГ - п-нитрофенил- р -Б-глюкопиранозид

ВС - восстанавливающие сахара

ДДС-ЭФ - электрофорез в денатурирующих условиях

НС - несвязавшаяся фракция

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Компонентный состав и гидролитическая способность рекомбинантных целлюлазных препаратов на основе гриба Penicillium verruculosum: новые методы оптимизации состава целлюлазного комплекса»

ВВЕДЕНИЕ

Целлюлоза - самый распространенный биополимер на Земле. Целлюлозосодержащая биомасса (ЦСБ) - возобновимый, легко доступный источник сырья и энергии. В больших количествах целлюлозосодержащие отходы накаливаются в процессе переработки леса, а также в целлюлозно-бумажной, сельскохозяйственной и пищевой промышленностях [1]. Российская Федерация обладает обширнейшими запасами леса в мире и развитым сельским хозяйством, в России находится 10 % всех пахотных земель мира. Для Российской Федерации актуальна проблема эффективного использования ЦСБ, переработки отходов лесной и пищевой промышленности, а также сельского хозяйства.

Одним из самых перспективных и экологически рациональных методов переработки ЦСБ является биодеградация полисахаридов, входящих в ее состав, с целью получения сбраживаемых Сахаров. Конверсия полисахаридов в простые сахара протекает под действием комплекса ферментов карбогидраз. Получаемые сахара могут быть превращены с помощью микроорганизмов в спирты (моторное топливо), амино- и органические кислоты, которые в дальнейшем могут быть трансформированы в разнообразные полезные продукты, включая полимерные материалы, продукты для фармацевтической промышленности, пищевые и кормовые добавки [2,3,4].

Биоконверсия ЦСБ осуществляется под действием ферментных препаратов. Целлюлазные ферментные препараты (ФП) чаще всего представляют собой ферментный комплекс, секретируемый грибными продуцентами, например, грибами родов Trichoderma или Myceliaphtora. В данной работе в качестве продуцентов использовали различные штаммы гриба Pénicillium verruculosum, препараты на основе данного гриба обладают высокой гидролитической активностью и являются альтернативой современным промышленным препаратам [5].

Эффективность гидролиза ЦСБ зависит от ряда факторов, в том числе от биохимических характеристик ферментов, входящих в состав ферментного комплекса, и от сбалансированности состава ФП. Базовый комплекс ферментов для глубокой деструкции целлюлозы включает в себя ферменты трех типов - эндоглюканазы (ЭГ), целлобиогидролазы (ЦБГ), р-глюкозидазы (БГЛ). Ферментные комплексы, осуществляющие эффективную конверсию ЦСБ, многокомпонентны и содержат целлюлазы, гемицеллюлазы и различные вспомогательные ферменты. К вспомогательным компонентам целлюлазного комплекса относят сволленин, лигнолитические ферменты, полисахаридлиазы, оксидазы и др. [6].

Полисахаридмонооксигеназы (ПМО) - один из типов вспомогательных ферментов. В ходе исследований последних лет было обнаружено, что присутствие в реакционной смеси ферментов данного типа значительно увеличивает эффективность конверсии целлюлозосодержащих субстратов ферментными препаратами [7]. Изучение влияния ПМО на процесс гидролиза целлюлозы в перспективе приведет к повышению гидролитической активности целлюлазных препаратов.

Целью исследования являлось получение и исследование свойств ферментных препаратов на основе новых рекомбинантных штаммов гриба Pénicillium verruculosum с модифицированным компонентным составом, обладающих увеличенной эффективностью гидролиза ЦСБ.

В соответствии с этой целью были сформулированы следующие задачи:

Продемонстрировать целесообразность трансформации штамма-реципиента P. verruculosum В221-151 генно-инженерной фьюжн-конструкцией, несущей гены одновременно нескольких высокоактивных целлюлолитических ферментов;

- Исследовать свойства препарата на основе штамма P.verruculosum, несущего ген гетерологичной полисахаридмонооксигеназы (ПМО) - эндоглюканазы IV T.reesei (ЭГ1У), выделить данный фермент в гомогенном виде и исследовать его свойства;

- Осуществить трансформацию штамма-реципиента Р .verruculosum Гист4-БГЛЗ, характеризующегося конститутивной экспрессией ß-глюкозидазы Aspergillus niger, плазмидами, несущими гены различных целлюлолитических ферментов;

- Изучить свойства ФП на основе новых штаммов и исследовать их гидролитическую активность по отношению к ЦСБ, проанализировать компонентный состав новых ФП.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА 1. ЦЕЛЛЮЛОЗОСОДЕРЖАЩАЯ БИОМАССА

1.1. Лигноиеллюнозные материалы

На Земле ежегодно производится 200*109 тонн растительной биомассы, из них 90% -лигноцеллюлозные материалы. Целлюлозосодержащая биомасса - наиболее крупномасштабный источник возобновляемого сырья для различных нужд, но при этом наименее освоенный [1,8]. Использование ЦСБ, перспективно, ввиду того, что не затрагивает интересов пищевой промышленности [9].

К целлюлозным материалам, которые могут быть пригодны как сырье для получения Сахаров, относятся отходы лесопиления и деревообработки, а также переработки сельскохозяйственных культур. Критериями использования того или иного типа сырья являются их стоимость, размеры запасов, возможности концентрирования их в районе расположения гидролизного производства и другие [10].

Крупнейшим на сегодняшний день источником ЦСБ являются древесные отходы. Для Российской Федерации, страны с обширнейшими запасами леса в мире, древесное сырье является наиболее перспективным источником целлюлозы. В 2012 году на территории России было заготовлено около 200 млн. м3 необработанной древесины, древесные отходы составили 75 млн м3. На лесосеках и производственных площадях скапливается большое количество древесных отходов, что создает экологические проблемы [11].

Багасса сахарного тростника является основным видом ЦСБ доступным в больших количествах в тропических странах. Индия производит около 300 млн. тонн в год сахарного тростника, багассы при этом вырабатывается 75 млн. тонн в пересчете на сухую массу [12]. Бразилия производит около 750 млн. тонн сахарного тростника ежегодно. Для этих и ряда других стран багасса сахарного тростника может стать постоянным сырьем для биотехнологического производства [10].

Другим широко распространенным источником целлюлозы являются стебли риса. Ежегодно по всему миру производится более 700 млн. тонн этого сырья [13]. К важным источникам ЦСБ можно отнести также кукурузные стебли, пшеничную солому, муниципальные отходы, макулатуру [10].

Интересным представляется использование в качестве сырья промышленных отходов, содержащих делигнифицированную, или обработанную иным способом целлюлозу, например, отходы вискозных заводов. В отличие от древесной и хлопковой, эта целлюлоза в значительной степени аморфизована [14], что делает ее более доступной для действия гидролитических ферментов.

1.2. Состав целлюлозосодержащей биомассы из различных источников

ЦСБ, в зависимости от происхождения, значительно отличаются по составу. Так, бытовые и промышленные отходы отличаются высоким содержанием целлюлозы и низким содержанием других компонентов. В травах, коре и зеленых частях многолетних растений обнаруживается большое количество гемицеллюлоз и лигнина, солома также лигнифицирована. Древесина хвойных пород богата целлюлозой, в меньшей степени гемицеллюлозой. Древесина лиственных деревьев отличается от древесины хвойных меньшим содержанием лигнина и отсутствием смол. В табл.1 представлен полисахаридный состав ЦСБ различного происхождения.

Таблица 1. Химический состав ЦСБ из различных источников [10,13].

Вид сырья Целлюлоза, % Гемицеллюлоза, % Лигнин, %

Лиственная древесина 40-55 30-35 18-25

Хвойная древесина 40-45 25-30 25-35

Травянистые растения 25-40 25-50 10-30

Кукурузные стебли 39-47 26-31 3-5

Солома пшеницы 37-41 27-32 13-15

Багасса сах. тростника 32-44 19-24 25-32

Стебли риса 30-35 25-30 15-28

Газетная бумага 40-55 25-40 18-30

Целлюлозная пульпа 60-80 20-30 2-10

При выборе сырья, подлежащего переработке, следует учитывать его состав, поскольку наличие или отсутствие того или иного компонента может значительно влиять на ход процессов ферментативной деструкции.

1.3. Структура клеточной стенки растений

Клеточная стенка составляет значительную часть растительного организма: ее содержание в травянистых растениях составляет до 70% сухой массы, а в древесных растениях достигает 90%. Основные компоненты растительной клетки - самые распространенные органические соединения на Земле [15,16].

Толщина клеточной стенки обычно колеблется от 0,1 до 10 мкм. Ее состав зависит от вида растения и может сильно варьироваться в различных органах и тканях одного растения. Основными компонентами клеточной стенки являются полисахариды, фенольные соединения (лигнин), белки. Упомянутые компоненты структурированы в матриксе, который представляет собой водный гель (75% воды) (рис.1). Матрикс клеточной стенки имеет определенный рН, значения которого обычно колеблются между 4 и 5 [15].

ГЛИКАНОВЫЕ СШИВКИ

. .V -У . >

Компоненты клеточной стенки

Клеточная стенка

*!>•. . -------—...

■ КЛГГОЧНАЯ СТЕНКА

ЦЕЛЛЮЛОЗНАЯ МИКРОФИБРИЛЛА

-Целлюлозный полимер

Рисунок 1. Клеточная стенка растения [16].

До 90% сухой массы клеточной стенки составляют углеводы. Полисахариды клеточной стенки подразделяют на три класса - целлюлоза, гемицеллюлозы (связующие гликаны), пектины [15, 16].

Основным полисахаридом клеточной стенки является целлюлоза. Молекулы целлюлозы за счет сил Ван-дер-Ваальса образуют микрофибриллы толщиной в 5-10 нм и длиной до сотен микрометров. Степень полимеризации целлюлозы колеблется в пределах 300-15000. Степень кристалличности целлюлозы в микрофибриллах достигает 80%, что делает растительную

целлюлозу резистентной к гидролизу. Высокая механическая прочность клеточной стенки обусловлена наличием в ней микрофибрилл целлюлозы [15,16].

Связующие гликаны - полисахариды различного состава, имеющие линейные участки полимерной цепи и боковые ответвления или изгибы. Линейные участки молекул образуют водородные связи между собой с целлюлозными микрофибриллами. Благодаря этим связям и боковым ответвлениям гликаны и микрофибриллы целлюлозы образуют сеть. В роли связующих гликанов у разных организмов выступают различные полисахариды, для двудольных растений это обычно ксилоглюкан. Другие гемицеллюлозы также могут являться связующими гликанами: ксиланы, глюкуроноарабиноксиланы, маннаны, галактоманнаны, глюкоманнаны, Р-(1-3)-глюканы, глюканы со смешанным типом связи (чередование (3-(1 -3)-связей и Р-( 1-4)-связей в цепи).

Пектиновые вещества формируют гелеобразный матрикс, в который погружена сеть микрофибрилл и связующих гликанов [15]. Матрикс клеточной стенки содержит белки (до 10%), как структурные (экстенсины), так и ферменты -оксидазы, гидролазы и другие [15,16].

Вторичная клеточная стенка высших растений помимо белков и углеводов содержит лигнин. В древесных растениях его массовая доля в клеточной стенке может достигать 40%. Лигнин представляет собой гетерополимер сложной трехмерной структуры, мономерами которого являются оксикоричные спирты. Оксикоричные спирты (п-кумаровый, конифериловый, синаповый) могут быть соединены между собой как углерод-углеродными, так и эфирными связями. Лигнин является одним из самых стабильных органических соединений.

1.4. Целлюлоза

Целлюлоза - основной компонент клеточной стенки растений, не менее трети от сухого веса биомассы растений представлены целлюлозой. Некоторые бактерии рода АсеюЪаМег производят бактериальную целлюлозу, свободную от лигнина и гемицеллюлоз. Также целлюлоза распространена в животном мире - встречается в клетках некоторых ракообразных, моллюсков, асцидий [17].

Целлюлоза представляет собой полисахарид, построенный из остатков Э-глюкозы. Глюкопиранозные звенья соединены р-1,4-Э-гликозидной связью и образуют линейный неразветвленный полимер [18,19] (рис. 2). Благодаря особенностям структуры р-1,4-связи, целлюлозные цепи формируют плотную упорядоченную кристаллическую структуру [18-20].

Рисунок 2. Молекулярное строение целлюлозы [17].

Полимерные цепи целлюлозы могут формировать различные кристаллические структуры (целлюлоза 1-1У) [21]. В нативной кристаллической целлюлозе (целлюлоза I) полимерные цепи уложены параллельно. Посредством множественных водородных связей (рис.3) в фибриллах формируются высокоупорядоченные кристаллические участки, которые сменяются аморфными участками. В аморфных участках фибрилл сохраняется общая направленность целлюлозных цепей. При мерсеризации или регенерации целлюлозы полимерные цепи укладываются в антипараллельную термодинамически более выгодную структуру (целлюлоза II) [18].

Рисунок 3. Водородные связи в нативной целллозе [22].

В клеточной стенке растений первичные фибриллы, объединяющие по 40-60 молекул целлюлозы, образуют микрофибриллы. Микрофибриллы являются основными звеньями строения волокон целлюлозы в клеточной стенке растений. Микрофибриллы состоят из нескольких первичных фибрилл, поперечное сечение их составляет примерно 100 х 200 А, длина - около 600 А [19,20].

Кристаллическая структура целлюлозы термодинамически выгодна и очень устойчива к внешним воздействиям. Кристаллические участки целлюлозы малодоступны для ферментов и, соответственно, устойчивы к биодеградации. Снижение индекса кристалличности - одна из проблем биотехнологии целлюлозы.

Расплавить кристаллическую целлюлозу не представляется возможным, температура плавления (от 420 до 450°С) значительно выше температуры термического разложения. Целлюлозу можно растворить в таких специфических растворителях, как оксиды третичных аминов, например, в М-метиморфолин-Ы-оксиде можно получить 55% раствор целлюлозы [22].

Частично перевести кристаллическую целлюлозу в аморфную форму можно при помощи обработки растворами минеральных кислот (например, фосфорной), щелочей, неорганических солей. На явлении набухания целлюлозы под действием растворов щелочей в присутствии оксида цинка основан процесс мерсеризации хлопкового волокна. Механическое измельчение также способствует снижению индекса кристалличности целлюлозы [23].

При проведении научно-технических изысканий следует помнить, что препараты природной целлюлозы неоднородны, степень упорядоченности и ориентации макромолекул или их звеньев различны. Это приводит к тому, что на различных участках волокна скорости диффузии реагентов и, соответственно, скорости реакции могут сильно различаться [24].

1.5. Предобработка лигноцеллюлозного сырья

Особенности структуры клеточной стенки растений обуславливают низкую реакционную способность природного целлюлозосодержещего сырья для ферментативного гидролиза. Природное сырье содержит лигнин, который необратимо сорбирует ферменты [25]. Кристаллическая структура нативной целлюлозы снижает доступность отдельных полимерных цепей для ферментов.

Для повышения эффективности биоконверсии растительной биомассы следует проводить предварительную обработку [26], которая направлена в первую очередь на разрушение кристаллической структуры целлюлозы и удаление лигнина [27,28,29]. Способы предобработки подразделяют на биологические, механические, физические и химические [30].

Основной биологический способ - расщепление лигнина с помощью микроорганизмов, способных избирательно по отношению к целлюлозе утилизировать лигнин, используя его в качестве источника углерода [31]. Практического значения этот способ на данный момент не имеет.

Механические методы предобработки подразумевают различные виды измельчения [30,32,33]. К механическим видам предобработки можно также отнести воздействие ультразвуком на систему субстрат-фермент. Под действием ультразвука происходит разрыхление целлюлозы и увеличение доступной для молекул белка поверхности целлюлозы. Кроме того, ультразвуковая обработка целлюлозы в растворе фермента способствует прониканию фермента в целлюлозную матрицу за счет звукокапиллярного эффекта, то есть влияет на процессы диффузии и сорбции молекул белка [33].

Химические методы более разнообразны и основаны на способности тех или иных химических соединений растворять лигнин или целлюлозу, либо приводить к набуханию и разрушению ее структуры. Обычно обработка теми или иными веществами сопровождается нагреванием и высоким давлением, так что разделять физические методы и химические в этих случаях не совсем корректно. Комбинированное химическое и физическое воздействие приводит к аморфизации целлюлозы, частичному гидролизу гемицеллюлоз, изменению в структуре лигнина и, наконец, к увеличению площади поверхности целлюлозы [25,26].

Делигнификация ЦСБ осуществляется разбавленными растворами щелочи (1-2%), как правило, ШОН или аммиаком (водным или газообразным) при кипячении или автоклавировании в течение 30-60 мин [34-37], а также разбавленными растворами неорганических кислот. Для делигнификации используют также карбонат натрия, гидроксид кальция, раствор фенола, а также обработку перегретым водяным паром [32,34].. К делигнификации приводит также известный и широко применяемый в целлюлозно-бумажной промышленности процесс сульфатной или сульфитной варки [38].

Большое развитие получили методы парового взрыва [39]. Древесину подвергают кратковременному воздействию перегретого пара под давлением (несколько секунд, 240-300°С, 3,5-7,5 МПа) в присутствии или в отсутствие 802 или СОг и далее давление сбрасывают, что вызывает паровой взрыв обрабатываемого материала. При таких условиях лигнин плавится, частично разрушается и выходит из структуры целлюлозы, кроме того, под действием парового взрыва происходит частичная дезинтеграция целлюлозы, а также гидролиз гемицеллюлоз. Одним из интересных модфикаций этого метода является обработка жидким аммиаком при высоком давлении с последующим сбросом давления [40].

Каждый из методов предобработки имеет свои недостатки - материале- и энергоемкость, необходимость нейтрализации реагентов, использование дополнительного оборудования.

14

ГЛАВА 2. ФЕРМЕНТАТИВНАЯ ДЕСТРУКЦИЯ ЦЕЛЛЮЛОЗОСОДЕРЖАЩЕЙ БИОМАССЫ

2.1. Гликозил-гидролазы

Гликозил-гидролазы - группа ферментов, относящихся к классу гидролаз (КФ 3), катализирующих гидролитическое расщепление гликозидной связи (КФ 3.2). В общем случае этот подкласс ферментов объединяют О-, 14- и 8-гликозил-гидролазы [41]. Ы-гликозил-гидролазы (КФ 3.2.2) являются ферментами метаболизма нуклеиновых кислот, в биодеградации полисахаридов роли не играют. Б-гликозил-гидролазы (КФ 3.2.3) - немногочисленная группа ферментов, известен лишь один ее представитель - тиоглюкозидаза. В 2001 году тиоглюкозидаза была реклассифицирована в О-гликозил-гидролазу [6,42].

Остановимся подробно на О-гликозил-гидролазах (КФ 3.2.1). Они относятся к катаболическим ферментам углеводного обмена. О-гликозил-гидролазы катализируют расщепление полисахаридов по гликозидной связи. Некоторые типы гликозидная связь, например связь между глюкозными остатками в молекуле целлюлозы, являются наиболее химически стабильными связями между мономерами в природных полимерах [43]. Гликозил-гидролазы, катализируя расщепление таких связей, могут ускорять реакцию на 17 порядков по сравнению со спонтанным гидролизом. Таким образом, гликозил-гидролазы являются одними из наиболее эффективных катализаторов [42].

Углеводы, главным образом полисахариды, являются самыми распространенными органическими веществами в живых организмах. Гены гликозил-гидролаз обнаружены в геномах почти всех живых организмов, некоторые вирусы также содержат гены гликозидаз. На гены гликозидаз и их гомологов приходится около 1% всех известных генов [41, 44]. В зависимости от таксономического положения организма доля генов гликозил-гидролаз в его геноме может существенно меняться, а для микроорганизмов набор генов гликозил-гидролаз зависит также от занимаемой ими экологической ниши [45]. Гены гликозидаз часто подвержены дупликациям, элиминации и горизонтальному переносу. Это приводит к тому, что даже разные штаммы одного вида могут иметь различное количество копий генов гликозил-гидролаз, и различный набор генов [46]. Зачастую гены гликозил-гидролаз имеют филогенетические деревья отличные от деревьев организмов-хозяев [47].

Для многих гликозил-гидролаз характерна мультидоменная структура, то есть ферменты данной группы зачастую имеют каталитический (один или несколько) и субстрат-связывающий домены [48,49]. Связь между доменами осуществляется посредством подвижного линкера.

Вследствие высокой лабильности генов гликозил-гидролаз разные домены одного белка часто имеют независимую эволюционную историю. Современная классификация карбогидраз предусматривает разделение каталитических и субстрат-связывающих доменов на разные категории. Классификация субстрат-связывающих доменов независима от. классификации каталитических доменов, то есть две части одного белка классифицируются по-разному [6].

Субстратами для гликозил-гидролаз являются различные поли- и олигосахариды. Природные углеводы отличаются большим разнообразием свойств и структур [50]. Для гидролиза тех или иных углеводов требуются ферменты с различными свойствами, этим обусловлено наличие большого числа разнообразных гликозил-гидролаз [6,44]. Гликозил-гидролазы обычно специфичны к конкретному типу субстрата, но часто имеют невысокую активность по отношению к субстратам схожего строения. Кроме того, для одного и того же субстрата может существовать набор специфичных к нему ферментов различного типа действия (например, целлобиогидролазы I и II типа действия).

Разница в субстратной специфичности гликозил-гидролаз может быть обуслолена минимальными изменениями в первичной структуре фермента [51]. Эволюционно близкие ферменты часто имеют разную субстратную специфичность, более того среди гомологов гликозидаз обнаружены ферменты с самыми различными активностями, например, оксигеназы. Вследствие этого факта, классификация гликозил-гидролаз по субстратной специфичности не отражает некоторых особенностей структуры и действия ферментов [7].

В настоящее время гликозил-гидролазы классифицируются по гомологии первичных аминокислотных последовательностей и структурным особенностям с учетом доменной организации молекулы белка. Описаны 132 семьи гликозил-гидролаз, в пределах одной семьи ферменты проявляют сходство аминокислотных последовательностей и характеризуются одинаковым типом укладки (фолдинга), т.е. имеют близкую трехмерную структуру. Кроме того, все ферменты, принадлежащие к одной и той же семье, функционируют по одинаковому механизму с точки зрения стереохимии катализа [6].

2.2. Механизм действия О-гликозил-гидролаз

Ферментативный гидролиз гликозидной связи реализуется посредством общего кислотного катализа [52,53], который требует наличия в активном центре фермента двух ключевых аминокислотных остатков - донора протона и нуклеофила. В большинстве случаев в роли таковых выступают остатки глутаминовой и аспарагиновой аминокислот. Известны также случаи участия в катализе расщепления гликозидной связи тирозина (некоторый вирусные и бактериальные гликозидазы) [52].

Гидролиз гликозидной связи может осуществляться по двум основным механизмам -обращающему и сохраняющему аномерную конфигурацию концевого остатка моносахарида (рис. 4). При реализации сохраняющего механизма кислород, участвующий в гликозидной связи, протонируется кислотным каталитическим остатком (АН). Одновременно с этим С-О-связь атакуется нуклеофилом (В), что приводит к ее разрыву и изменению аномерной конфигурации концевого мономера. Образующийся фермент-субстратный комплекс подвергается гидролизу, в процессе которого аномерная конфигурация концевого мономера восстанавливается.

Принципиальное отличие обращающего механизма заключается в том, что нуклеофильная атака протонированной С-О-связи осуществляется молекулой воды, активированной нуклеофильным каталитическим остатком. Таким образом, обращение аномерной конфигурации, как и в предыдущем случае, имеет место, но восстановления не происходит.

Существование двух различных механизмов гидролиза гликозидной связи обусловлено разницей в структуре активных центров ферментов того или иного типа действия. Кислотный каталитический остаток в карбогидразах сохраняющего и обращающего типа действия одинаково ориентирован около субстрата. Нуклеофильный же каталитический остаток в случае сохраняющего механизма гидролиза находится значительно ближе к субстрату, чем в случае обращающего механизма. В последнем случае между нуклеофильным каталитическим остатком и субстратом находится молекула воды, при том, что в сохраняющий механизм гидролиза предусматривает непосредственное взаимодействие молекулы субстрата с нуклеофильным каталитическим остатком. Расстояние между каталитическими остатками в ферментах сохраняющего типа составляет 5,5А, в ферментах обращающего типа действия -

10А.

Для ферментов сохраняющего типа действия характерны реакции трансгликозилирования, т.е. реакции переноса гликозидного остатка, в результате которых может происходить удлинение цепи олигосахарида. В этом случае фермент-субстратный комплекс подвергается не гидролизу, а реакции замещения нуклеофильного каталитического остатка другим нуклеофилом, например, спиртами или фенолами. Акцепторами глюкозного остатка в этих реакциях могут быть как сахара, так и другие соединения (спирты, фенолы и т.д.) [52-54].

н

в)

н

ион

в

н

А---

I

н

он

0-----

5.5&

I

р н

О-.,

1

1—-,

ион

н

вн--

I

юА

Рисунок 4. Механизмы гидролиза гликозидных связей карбогидразами. о-механизм одностадийного замещения (обращающий), б-механизм двухстадийного замещения

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Проскурина, Ольга Владимировна, 2013 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Buckeridge M.S., Goldman G.H. Routes to Cellulosic Ethanol. New York, Springer, 2011,

261 p.

2. Oh B.-R., Hong W.-K., Heo S.-Y., Luo L.H., Kondo A., Seo J.-W., Kim C.H. The production of 1,3-propanediol from mixtures of glycerol and glucose by a Klebsiella pneumoniae mutant deficient in carbon catabolite repression. Bioresource Technology, 2013, v. 130, p. 719-724.

3. Thakker C., San K.-Y., Bennett G. N. Production of succinic acid by engineered E. coli strains using soybean carbohydrates as feedstock under aerobic fermentation conditions. Bioresource Technology, 2013, v. 130, p. 398-405.

4. Gu C., Zhou Y., Liu L., Tan Т., Deng L. Production of fumaric acid by immobilized Rhisopus arrhizus on net. Bioresource Technology, 2013, v. 131, p. 303-307.

5. Gusakov AV. Alternatives to Trichoderma reesei in bio fuel production. Trends in Biotechnology, 2011, v. 29(9), p. 419-425.

6. Carbohydrate Active Enzymes server (2011), (http://www.cazy.org/).

7. Harris P.V., Welner D., McFarland, K.C., Re E., Poulsen J.C.N., Brown K., Salbo R., Ding H., Vlasenko E., Merino S., Xu F., Cherry J., Larsen S., Leggio L.L. Stimulation of Lignocellulosic Biomass Hydrolysis by Proteins of Glycoside Hydrolase Family 61: Structure and Function of a Large, Enigmatic Family. Biochemistry, 2010, v. 49, p. 3305-3316.

8. Lin Y., Tanaka S. Ethanol fermentation from biomass resources: current state and prospects Applied Microbiology and Biotechnology, 2006, v. 69, p. 627-642.

9. Sánchez O.J., Cardona C.A. Trends in biotechnological production of fuel ethanol from different feedstocks. Bioresource Technology, 2008, v. 99(13), p. 5270-5295.

10. Balat M. Production of bioethanol from lignocellulosic materials via the biochemical pathway: A review. Energy Conversion and Management, 2011, v. 52, p. 858-875.

11. Левин А.Б. Биоэнергетика - важнейшее средство повышения энергоэффективности лесного комплекса России. Лесной вестник, 2012, т. 8, с. 160-165.

12. Adsul. M.G., Singhvi M.S., Gaikaiwari S.A., Gokhale D.V. Development of biocatalysts for production of commodity chemicals from lignoceiiulosic biomass. Bioresource Technology, 2011, v. 102, p. 4304^312.

13. Sakdaronnarong C., Jonglertjunya W. Rice straw and sugarcane bagasse degradation mimicking lignocellulose decay in nature: An alternative approach to biorefinery. ScienceAsia, 2012, v. 38, p. 364-372

14. Научные основы химической технологии углеводов (под ред. Захарова А.Г.). М., Издательство ЛКИ, 2008, 528 с.

15. Горшкова Т.А. Растительная клеточная стенка как динамическая система. М., Наука, 2007, 429 с.

16. Клетки (под ред. Б. Льюина и др.) М., БИНОМ. Лаборатория знаний, 2011, 951с.

17. Dumitriu S. Polysaccharides: structural diversity and functional versatility. New York, Marcel Dekker, 2005, 1205 p.

18. Westphal Y. Analitical profiling of plant cell wall polysaccharides. Thesis, NL, Wageningen University, Wageningen, 2010, 176 p.

19. Синицын А.П., Гусаков A.B., Черноглазое B.M. Биоконверсия лигноцеллюлозных материалов. М., МГУ, 1995, 224 с.

20. Методы исследования целлюлозы (под ред. Карливана В.П). Рига. Зинатне, 1981,

260 с.

21. Алёшина Л.И., Глазкова С.В., Луговская Л.А., Подойникова М.В., Фофанов А.Д., Силина Е.В. Современные представления о строении целлюлоз (обзор). Химия растительного сырья, 2001, т. 1, с. 5-36.

22. Научные основы химической технологии углеводов (под ред. Захарова А.Г.). М., Издательство ЛКИ, 2008, 528 с.

23. Байклз И., Сегал Л. Целлюлоза и ее производные. М., Мир, 1974, в 2-х томах, т.1, 500 с, т. 2,510 с.

24. Роговин З.А., Шорыгина Н.Н. Химия целлюлозы и ее производных. М., Государственное научно-техническое издательство химической литературы, 1953, 678 с.

25. Jonsson L.J., Alriksson В. and Nilvebrant N.-O. Bioconversion of lignocellulose: inhibitors and detoxification. Biotechnology for Biofiiels, 2013, v. 6, 16.

26. Alvira P., Tomás-Pejó E., Ballesteros M., Negro M.J. Pretreatment technologies for an efficient bioethanol production process based on enzymatic hydrolysis: A review. Bioresource Technology, 2010, v. 101, p. 4851^861.

27. Gharpuray M.M., Lee Y.H., Fan L.T. Structural modification of lignocellulosics by pretreatments to enhance enzymatic hydrolysis. Biotechnology and Bioengineering, 1983, v. 25, p. 157-172.

28. Lin K.W., Ladisch M.R., Voloch M., Patterson J.A., Noller C.H. Effect of pretreatments and fermentation on pore size in cellulosic materials. Biotechnology and Bioengineering, 1985, v. 27, p. 1427-1433.

29. Rezende C.A., de Lima M.A., Maziero P., de Azevedo E.R., Garcia W. and Polikarpov I. Chemical and morphological characterization of sugarcane bagasse submitted to a delignification process for enhanced enzymatic digestibility. Biotechnology for Bio&els, 2011, v. 4 p. 54.

30. Синицын А.П., Гусаков A.B., Черноглазов B.M. Биоконверсия лигноцеллюлозных материалов. М., МГУ, 1995, с. 224.

31. Boominathan К., Reddy С.A. cAMP-mediated differential regulation of lignin peroxidase and manganese-dependent peroxidase production in the white-rot basidiomycete Phanerochaete chrysosporium. Proceedings of the National Academy of Sciences, 1992, v. 89, p. 5586-5590.

32. Синицын А.П., Ковалев Г.В., Меса-Манреса C.P., Козловский Д.Ф., Калязин Е.П., Клесов А.А. Сравнительное изучение влияния различных видов предобработки на скорость ферментативного гидролиза природных целлюлозосодержащих материалов. Химия древесины, 1984, т. 5, с. 60-71.

33. Голязимова О. В. Механическая активация ферментативного гидролиза целлюлозы и лигноцеллюлозных материалов. Диссертация на соискание ученой степени канд. хим. наук. Новосибирск, 2010, с. 129

34. Palonen Н. Role of lignin in the enzymatic hydrolysys of lignocellulose. Dissertation for the degree of Doctor of Technology, Espoo, 2004, 84 p.

35. McMillan J.D. Pretreatment of lignocellulosic biomass. Enzymatic conversion of biomass for fuels production, 1994, v. 15, p. 292-324.

36. Jeihanipour A., Taherzadeh M.J. Ethanol production from cotton-based waste textiles. Bioresource Technology, 2009, v. 100, p. 1007-1010.

37. Coletta V.C., Rezende C.A., da Concei9ao F.R., Polikarpov I. and Guimaraes F.E.G. Mapping the lignin distribution in pretreated sugarcane bagasse by confocal and fluorescence lifetime imaging microscopy. Biotechnology for Bio fuels, 2013, v. 6, p. 43.

38. Роговин З.А. Химия целлюлозы. M., Химия, 1972, 519 с.

39. Clark Т.А., Mackie K.L. Steam explosion of the soft-wood Pinus radiata with sulphur dioxide addition. Journal of Wood Chemistry and Technology, 1987, v. 7, p. 373-403.

40. Holtzapple M.T., Jun J.H., Ashok G., Patibandla S.L., Dale B.E. The ammonia freeze explosion (AFEX) process: a practical lignocellulose pretreatment. Applied Biochemistry and Biotechnology, 1991, v. 28, p. 59-74.

41. Cantarel, B.L., Coutinho, P.M., Rancurel, C., Bernard, Т., Lombard, V., and Henrissat, B. The Carbohydrate-Active EnZymes database (CAZy): an expert resource for Glycogenomics. Nucleic Acids Research, 2009, v. 37, p. 233-238.

42. Д.Г. Наумов Иерархическая классификация гликозил-гидролаз. БИОХИМИЯ, 2011, том 76, вып. 6, с. 764 - 780.

43. Wolfenden, R., Lu, X., and Young, G. Spontaneous Hydrolysis of Glycosides. Journal of the American Chemical Society, 1998, v. 120, p. 6814-6815.

44. Coutinho, P.M., Stam, M., Blanc, E., and Henrissat, B. Why are there so many carbohydrate-active enzyme-related genes in plants? Trends in Plant Science, 2003, v. 8, p. 563-565.

45. Hazlewood G.P., Gilbert H.J. Structure and function analysis of Pseudomonas plant cell wall hydrolases. Biochemical Society Transactions, 1998, v. 26(2), p. 185-190.

46. Garcia-Vallve S., Romeu A., Palau J. Horizontal gene transfer of glycosyl hydrolases of the rumen fungi. Molecular Biology and Evolution, 2000, v. 17, p. 352-361.

47. Наумов Д. Г. Филогенетический анализ а-галактозидаз семейства GH27. Молекулярная биология, 2004, т. 38, с. 463-476.

48. Рабинович M.JL, Мельник М.С., Болобова А.В. Структура и механизм действия целлюлолитических ферментов. Биохимия, 2002, т.67 № 8, с. 1026-1050.

49. Karlsson М. Stenlid J. Evolution of Family 18 Glycoside Hydrolases: Diversity, Domain Structures and Phylogenetic Relationships. Journal of Microbiology and Biotechnology, 2009, v. 16, p. 208-223.

50. Laine, R.A. Invited Commentary: A calculation of all possible oligosaccharide isomers both branched and linear yields 1.05 x 1012 structures for a reducing hexasaccharide: the Isomer Barrier to development of single-method saccharide sequencing or synthesis systems. Glycobiology, 1994, v. 4, p. 759-767.

51. Claeyssens, M., Nerinckx, W., Underwood, M., Sinnott, M.L., Warren, R.A., and Gilbert, H.J. Substrate Specificity in Glycoside Hydrolase Family 10. Journal of Biological Chemistry, 2010, v. 275, p. 23027-23033.

52. Davies G., Henrissat B. Structures and mechanisms of glycosyl hydrolases. Current Biology, 1995, v. 3, p. 853-859.

53. McCarter J.D. & Withers S.G. Mechanisms of enzymatic glycoside hydrolysis. Current Opinion in Structural Biology, 1994, v. 4, p, 885-892.

54. Sinnott, M.L. Catalytic mechanisms of enzymatic glycosyl transfer. Chemical Reviews, 1990, v. 90, p. 1171-1202.

55. Billard H., Faraj A., Ferreira N.L., Menir S. and Heiss-Blanquet S. Optimizat 10п о i a synthetic mixture composed of major Trichoderma reesei enzymes for the hydrolysis of steam-exploded wheat straw. Biotechnology for Biofiiels, 2012, v 5, p. 9.

56. Banerjee G., Car S., Scott-Craig J.S., Borrusch M.S., Bongers M., Walton J.D. Synthetic multi-component enzyme mixtures for deconstruction of lignocellulosic biomass. Bioresource Technology, 2010, v. 101, p. 9097-9105.

57. Clarke A.J. Biodégradation of cellulose. Enzymology and biotechnology. Lancaster, Technomic Publishing Company Inc., 1997, 272 p.

58. Moraïs S., Barak Y., Lamed R., Wilson D.B., Xu Q., Himmel M.E. and Bayer E.A. Paradigmatic status of an endo- and exoglucanase and its effect on crystalline cellulose degradation. Biotechnology for Biofiiels, 2012, v. 5, p. 78.

59. Jorgensen H., Kristensen J.B., Felby C. Enzymatic conversion of lignocellulose into fermentable sugars: challenges and opportunities. Bio fuels, Bioproducts and Biorefining, 2007, v. 1, p. 119-134.

60. Gincy M.M., Rajeev K.S., Reeta R.S., Ashok P. Progress in research on fungal cellulases for lignocellulose degradation. Journal of Scientific & Industrial Research, 2008, v. 67, p. 898-907.

61. Wood T.M., McCrae S.I. The cellulase of Trichoderma koningii. Purification and properties of some endoglucanase components with special reference to their action on cellulose when acting alone and in synergism with cellobiohydrolase. Biochemical Journal, 1978, v. 171, p. 61-72.

62. Claeyssens, M., van Tilbeurgh, H., Kamerling, P., Berg, J., Vrsanska, M., Biely, P. Studies of the cellulolytic system of the filamentous fungus Trichoderma reesei QM 9414. Substrate specificity and transfer activity of endoglucanase I. Biochemical Journal, 1990, v. 270, p. 251-256.

63. Bhat K.M., Hay A.J., Claeyssens M., Wood T.M. Study of the mode of action and site-specificity of the endo-l,4-P-D-glucanases of the fungus Pénicillium pinophilum with normal, 1-3 H-labelled, reduced and chromogenic cello-oligosaccharides. Biochemical Journal, 1990, v. 266, p. 371378.

64. Karlsson, J., Siika-aho, M., Tenkanen, M., Tjerneld, F. Enzymatic properties of the low molecular mass endoglucanases Cell2A (EG III) and Cel45A (EG V) of Trichoderma reesei. Journal Biotechnology, 2002, v. 99, p. 63-68.

65. Teeri T.T. Crystalline cellulose degradation: new insight into the function of cellobiohydrolases. Trends in Biotechnology, 1997, v. 15, p. 160-167.

66. Schou C., Rasmussen G., Kaltoft M.B., Henrissat B., Schiilein M. Stereochemistry, specificity and kinetics of the hydrolysis of reduced cellodextrins by nine cellulases. European Journal of Biochemistry, 1993, v. 217, p. 947-953.

67. Divne C., Stahlberg J., Reinikainen T., Ruohonen L., Pettersson G., Knowles J . PC.. Teeri T.T., Jones T.A. The three-dimensional crystal structure of the catalytic core of cellobiohydrolase I from Trichoderma reesei. Science. 1994, v. 265, p. 524-528.

68. Rouvinen J., Bergfors T., Teeri T., Knowles J.K., Jones T.A. Three-dimensional structure of cellobiohydrolase II from Trichoderma reesei. Science. 1990, v. 249, p. 380-386.

69. Vrsanska, M., Biely, P. The cellobiohydrolase I from Trichoderma reesei QM 9414: action on ce ^oligosaccharides. Carbohydrate Research, 1992, v. 227, p. 19-27.

99

70. Tuohy M.G., Walsh D.J., Murray P.G., Claeyssens M., Cuffe M.M., Savage A.V., Coughlan M.P. Kinetic parameters and mode of action of the cellobiohydrolases produced by Talaromyces emersonii. Biochimica et biophysica acta, 2002, v. 1596, p. 366-380.

71. Короткова О.Г., Семенова M.B., Морозова B.B., Зоров И.Н., Соколова Л.М., Бубнова Т.М., Окунев О.Н., Синицын А.П.. Выделение и свойства грибных Р-глюкозидаз. Биохимия, 2009, т. 74, вып.5, с. 699-709.

72. Imai Т., Boisset С., Samejima М., Igarashi К., Sugiyama J. Unidirectional processive action of cellobiohydrolase Cel7A on Valonia cellulose microcrystals. FEBS Letters, 1998, v. 432, p. 113-116.

73. Divne C., Stahlberg J., Teeri T.T., Jones T.A. High-resolution crystal structures reveal how a cellulose chain is bound in the 50 A long tunnel of cellobiohydrolase I from Trichoderma reesei. Journal of Molecular Biology, 1998, v. 275, p. 309-325.

74. Cao W.G., Crawford D.L. Purification and some properties of beta-glucosidase from the ectomycorrhizal fungus Pisolithus tinctorius Strain Smf. Canadian Journal of Microbiology, 1993, v. 39, p. 125-129.

75. Dan S., Marton I., Dekel M., Bravdo B.A., He S., Withers S.G., Shoseyov O. Cloning, expression, characterization, and nucleophile identification of family 3, Aspergillus niger beta-glucosidase. The Journal of Biological Chemistry , 2000, v. 275, p. 4973-4980.

76. Evans C.S. Properties of the beta-D-glucosidase (cellobiase) from the wood-rotting fungus, Coriolus versicolor. Applied Microbiology and Biotechnology, 1985, v. 22, p. 128-131.

77. Зоров И.Н. Исследование целлобиогидролазы и целлобиазы целлюлазного комплекса Penicillium verruculosum. Диссертация на соискание ученой степени канд. хим. наук. М., МГУ, 1998, 156 с.

78. Linder М., Lindeberg G., Reinikainen Т., Teeri Т., Pettersson G. The difference in affinity between two fungal cellulose-binding domains is dominated by a single amino acid substitution. FEBS Letters, 1995, v. 372, p. 96-98.

79. Linder M., Teeri T.T. The roles and function of cellulose-binding domains. Journal of Biotechnology, 1997, v. 57, p. 15-28.

80. Suominen, P., Reinikainen, T. (eds.) Trichoderma reesei cellulases and other hydrolases. Helsinki, Foundation for Biotechnical and Industrial Fermentation Research, 1993, v. 8, 314 p.

81. Saloheimo M., Nakari-Setala Т., Tenkanen M. Penttila M. cDNA cloning of a Trichoderma reesei cellulase and demonstration of endoglucanase activity by expression in yeast. European Journal of Biochemistry, 1997, v. 249, p. 584-591.

82. Westereng B., Ishida T., Vaaje-Kolstad G., Wu M., Eijsink V.G.H., et al. The Putative Endoglucanase PcGH61D from Phanerochaete chrysosporium Is a Metal-Dependent Oxidative Enzyme that Cleaves Cellulose. PLoS ONE, 2011, 6(11): e27807.

83. Koseki T., Mese Y., Fushinobu S., Masaki K., Fujii T., Ito K., Shiono Y„ Murayama T., Iefuji H. Biochemical characterization of a glycoside hydrolase family 61 endoglucanase from Aspergillus kawachii. Applied Microbiology and Biotechnology, 2008, v. 77, p. 1279-1285.

84. Karlsson J., Saloheimo M., Siika-aho M., Tenkanen M., Penttila M. and Tjerneld F. Homologous expression and characterization of Cel61 A (EG IV) of Trichoderma reesei II European Journal of Biochemistry, 2001, v. 268, p. 6498-6507.

85. Zhou J., Wang Y.-H., Chu J., Zhuang Y.-P., Zhang S.-L., Yin P. Identification and purification of the main components of cellulases from a mutant strain of Trichoderma viride T 10014. Bioresource Technology, 2008, v. 99, p. 6826-6833.

86. Cannella D., Hsieh C.C., Felby C., Jorgensen H. Production and effect of aldonic acids during enzymatic hydrolysis of lignocellulose at high dry matter content. Biotechnology for Biofuels, 2012, v. 5, p. 26.

87. Levasseur A., Drula E., Lombard V., Coutinho P.M., Henrissat B. Expansion of the enzymatic repertoire of the CAZy database to integrate auxiliary redox enzymes. Biotechnology for Biofuels, 2013, №6(1), 41.

88. Quinlana R. J., Sweeneya M. D., Leggio L.L., Otten H., Poulsen J.C.N, Johansen K.S., Krogh K.B.R.M., Jorgensen C. I., Tovborg M., Anthonsen A., Tryfona T., Walter C. P., Dupree P., Xu F., Davies G.J., and Walton P.H. Insights into the oxidative degradation of cellulose by a copper metalloenzyme that exploits biomass components. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2011, v.108 №. 37, p.15079-15084.

89. Beeson W.T.,. Phillips C. M, Cate J.H.D., Marietta M.A. Oxidative Cleavage of Cellulose by Fungal Copper-Dependent Polysaccharide Monooxygenases. Journal of American Chemical Society, 2012, v. 134, p. 890-892.

90. Kittl R., Kracher D., Burgstaller D., Haltrich D., Ludwig R. Production of four Neurospora crassa lytic polysaccharide monooxygenases in Pichia pastoris monitored by a fluorimetric assay. Biotechnology for Biofuels, 2012, v. 5, 9.

91. Karkehabadi S., Hansson H., Kim S., Piens K., Mitchinson C., Sandgren M. The First Structure of a Glycoside Hydrolase Family 61 Member, Cel61B from Hypocrea jecorina, at 1.6 A Resolution. Journal of Molecular Biology, 2008, v. 383, p. 144-154.

92. =95 Kumar D. and Murthy G.S. Stochastic molecular model of enzymatic hydrolysis of cellulose for ethanol production. Biotechnology for Biofuels, 2013, v. 6, 63.

93. Horn S. J., Vaaje-Kolstad G., Westereng В., Eijsink V.G.H. Novel enzymes for the degradation of cellulose. Biotechnology for Bio fuels, 2012, № 5, 45.

94. Arantes V., Saddler J.N. Cellulose accessibility limits the effectiveness of minimum cellulase loading on the efficient hydrolysis of pretreated lignocellulosic substrates. Biotechnology for Bio fuels, 2011, v. 4, 3.

95. Chundawat S.P.S., Bellesia G., Uppugundla N., Sousa L.D., Gao D.H., Cheh A.M., Agarwal U.P., Bianchetti C.M., Phillips G.N., Langan P., et al. Restructuring the crystalline cellulose hydrogen bond network enhances its depolymerization rate. Journal of American Chemical Society, 2011, v. 133, p. 11163-11174.

96. Reese E.T., Siu R.G.H., Levinson H.S. The biological degradation of soluble cellulose derivatives and its relationship to the mechanism of cellulose hydrolysis. Journal of Bacteriology, 1950, v. 59, p. 485-497.

97. Saloheimo M., Paloheimo M., Hakola S., Pere J., Swanson В., Nyyssonen E., Bhatia A., Ward M., Penttila M. Swollenin, a Trichoderma reesei protein with sequence similarity to the plant expansins, exhibits disruption activity on cellulosic materials. European Journal of Biochemistry, 2002, v. 269, p. 4202-4211.

98. Gourlay K., Hu J., Arantes V., Andberg M., Saloheimo M., Penttila M., Saddler J. Swollenin aids in the amorphogenesis step during the enzymatic hydrolysis of pretreated biomass Bioresource Technology, 2013, v. 142, p. 498-503.

99. Рабинович М.Л., Клесов A.A., Черноглазов B.M., Вьет В.Н., Березин И.В. Эффективность адсорбции целлюлолитических ферментов - фактор, определяющий реакционную способность нерастворимой (кристаллической) целлюлозы. Докл. АН СССР, 1981, т. 260, с. 1481-1486.

100. Клесов А.А., Черноглазов В.М., Рабинович М.Л., Синицын А.П. Роль адсорбционной способности эндоглюканазы в деградации кристаллической и аморфной целлюлозы. Биоорганическая химия, 1982, т. 8, с. 643-651.

101. Dunnett A.J., Adjiman C.S. and Shah N. A spatially explicit whole-system model of the lignocellulosic bioethanol supply chain: an assessment of decentralised processing potential. Biotechnology for Biofuels, 2008, v. 1, 13.

102. http://www.novozymes.com

103. http://biosciences.dupont.com

104. Gusakov A.V. & Sinitsyn A.P. Cellulases from Penicillium species for producing fuels from biomass. Biofuels, 2012, v. 3(4), p. 463-477.

105. Merino S.T., Cherry J. Progress and challenges in enzyme development for biomass utilization. Advances in Biochemical Engineering / Biotechnology, 2007, v. 108, p. 95-120.

102

106. Марков А.В., Гусаков А.В., Дзедзюля Е.И., Устинов Б.Б., Антонов А.А., Окунев О.Н., Беккеревич А.О., Синицын А.П. Свойства гемицеллюлаз ферментного комплекса Trichoderma longibrachiatum. Прикладная биохимия и микробиология, 2006, т. 42, №66 с. 654664.

107. Скомаровский А.А. Компонентный состав и гидролитическая способность ферментного комплекса Pénicillium verruculosum. Диссертация на соискание ученой степени канд. хим. наук. М., МГУ, 2006, с. 170.

108. Морозова В. В. Свойства целлюлолитических ферментов Pénicillium verruculosum и их применение для осахаривания лигноцеллюлозного сырья. Диссертация на соискание ученой степени канд. хим. наук. М., МГУ, 2009, с. 159.

109. Зоров И.Н. Исследование целлобиогидролазы и целлобиазы целлюлазного комплекса Pénicillium verruculosum. Диссертация на соискание ученой степени канд. хим. наук. М., МГУ, 1998, с. 156.

110. Кастельянос О., Ермолова О.В., Синицын А.П., Попова Н.Н. и др. Схема очистки ферментов целлюлазного комплекса Pénicillium verruculosum, исследование их биохимических свойств и специфичности. Биохимия. 1995, т. 60, с. 925-943.

111. Szakacs G., Reczey К., Hernadi P., Dobozi M. Pénicillium verruculosum WA 30 a new source of cellulose. European Journal of Applied Microbiology and Biotechnology, 1981, v. 11, p. 120-124.

112. Соловьева И.В., Окунев О.H., Вельков B.B., Кошелев А.В., Бубнова Т.В., Кондратьева Е.Г., Скомаровский А.А., Синицын А.П. Получение и свойства мутантов Pénicillium verruculosum -суперпродуцентов целлюлаз и ксиланаз. Микробиология, 2005, т. 74, с.1-7.

113. Короткова О.Г., Рожкова А.М., Матыс Ю.В. и др. Получение комплексных биокатализаторов на основе ферментных препаратов из рекомбинантного гриба Pénicillium verruculosum и применение их в гидролизе отходов деревообрабатывающей промышленности. Катализ в промышленности, 2011, т. 5, с. 61-68.

114. Осипов Д.О., Рожкова А.М., Матыс В.Ю. и др. Получение биокатализаторов на основе рекомбинантных штаммов-продуцентов гетерологичной ксиланазы в грибе Pénicillium verruculosum. Применение их в гидролизе отходов лесной и деревообрабатывающей отраслей промышленности. Катализ в промышленности, 2010, т. 5, с. 64-71.

115. Немашкалов В.А., Беккаревич О.А., Кошелев А.В., Окунев О.Н., Рожкова А.М., Короткова О.Г., Синицын А.П. Создание высокоактивного ферментного препарата для конверсии багассы на основе рекомбинантного штамма Pénicillium verruculosum. Хранение и переработка сельхозсырья, 2011, т. 10, с. 33-35.

103

116. Правильников. А.Г. Состав и осахаривающая способность ферментных препаратов, полученных с помощью новых рекомбинантных штаммов Penicillium verruculosum. Диссертация на соискание ученой степени канд. хим. Наук. М., МГУ, 2012, 104 с.

117. Короткова. О.Г. Получение целлюлазных комплексов с увеличенной осахаривающей способностью на основе рекомбинантных штаммов Penicillium verruculosum. Диссертация на соискание ученой степени канд. хим. Наук. М., МГУ, 2011, с. 171 с.

118. Sorensen H.R, Pedersen S., Jorgensen C.T., Meyer A.S. Enzymatic hydrolysis of wheat arabinoxylan by a recombinant "minimal" enzyme cocktail containing beta-xylosidase and novel endo-1, 4-beta-xylanase and alpha-l-arabinofuranosidase activities. Biotechnology Progress, 2007, v. 23, p. 100-107.

119. Heinzelman P., Snow C.D., Wu I., Nguyen C., Villalobos A., Govindarajan S., Minshull J., Arnold F.H. A family of thermostable fungal cellulases created by structure-guided recombination. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2009, v. 106, p. 5610-5615.

120. Qin Y., Wei X., Song X., Qu Y. Engineering endoglucanase II from Trichoderma reesei to improve the catalytic efficiency at a higher pH optimum. Journal of Biotechnology, 2008, v. 135, p. 190-195.

121. Banerjee G., Car S., Scott-Craig J.S., Borrusch M.S., Aslam N., Walton J.D. Synthetic enzyme mixtures for biomass deconstruction: production and optimization of a core set. Biotechnology and Bioengineering, 2010, v. 106, p. 707-720.

122. Banerjee G., Scott-Craig J.S., Walton J.D. Improving enzymes for biomass conversion: A basic research perspective. ВioEnergy Research, 2010, v.3, p. 82-92.

123. Синицын А.П., Черноглазое B.M., Гусаков A.B. Методы исследования и свойства целлюлолитических ферментов. М.: ВИНИТИ, 1990. Т.25. 154 с.

124. Биссвангер X. Практическая энзимология. М.:БИНОМ. Лаборатория знаний, 2010.

328 с.