Контроль экспрессии генов в процессе подвижности грамотрицательных бактерий тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, кандидат биологических наук Сутурина, Ольга Александровна

• Сутурина, Ольга Александровна
• кандидат биологических наук
• 2001

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Сутурина, Ольга Александровна

Контроль экспрессии генов в процессе подвижности грамотрицательных бактерий

I. Введение.

II. Обзор литературы.

Структура и функция жгутиков.

Функционирование моторной системы.

Хромосомная организация жгутиковых генов.

Контроль экспрессии генов синтеза жгутиков.

Каскад регуляции системы перитрического жгутикования

Е. coli и S. typhimurium.

Каскад регуляции системы полярных жгутиков.

Регуляторы первого класса.

FlhDC.

Регуляторы первого класса системы полярных жгутиков.

Опероны второго и третьего классов в иерархической системе.

Промоторы.

Фазовая вариация эксрессии генов жгутикового филамента.

Другие функции жгутиков: роль в формировании биофильмов, в адгезии к субстратам и вирулентности.

Штаммы рода Vibrio.

Proteus mirabilis.

Bordetella bronchiseptica и Bordetella pertussis.

Salmonella typhimurium.

Yersinia.

Serratia marcescens.

Serratia liquefaciens.

Xenorhabdus nematophilus.

Pseudomonas.

Координация бактериальной подвижности в ответ на изменение условий окружающей среды.

Эффект неорганических ионов.

Эффект углеводородов.

Эффект низкомолекулярных спиртов.

Эффект ингибиторов гиразы.

Эффект детергента дезоксихолата натрия.

Механизм ингибирования подвижности.

Регуляция подвижности pH среды.

Президиум ВАК России решение от "М?> г., № решил выдать диплом КАНДИДАТА,

У, наук

Начальник управления ВАК России

Исследование механизма регуляции подвижности на примере температурных эффектов у Yersinia enterocolitica.

Влияние уровня суперскрученности ДНК на бактериальную подвижность

Неорганический фосфат необходим для подвижности патогенных бактерий

Регуляторные белки, участвующие в контроле подвижности.

H-NS.

Роль глобального регулятора.

Регуляция экспрессии гена hns.

Авторегуляция.

Холодный шок.

Структурные данные.

Гомологи H-NS в других бактериях.

Механизм действия H-NS.

Связывание с ДНК.

Модуляция экспрессии генов H-NS.

Модуляция экспрессии RpoS.

H-NS - антагонист активаторов.

H-NS и осморегуляцня.

H-NS и температурная регуляция. цАМФ-САР.

Классы САР-зависимых промоторов.

Активация транскрипции промоторов первого класса.

Активация транскрипции с промоторов второго класса.

Активация транскрипции с промоторов третьего класса.

Репрессорная функция САР.

Другие регуляторы, участвующие в контроле подвижности.

Белки теплового шока.

Фактор инициаци репликации DnaA.

Мутации, затрагивающие синтез компонентов бактериальной мембраны

Гистоноподобный белок HU.

Белок FIS.

Особенности регуляции подвижности Proteus и Serratia.

III. Постановка задачи

IV. Результаты.

Исследование роли комплекса цАМФ-САР и белка H-NS в регуляции подвижности Escherichia coli.

Оперон первого класса flltDC является главной мишенью регуляции.

Определение сайта начала транскрипции flhDC.

Связывание белков H-NS и САР с промоторной областью flhDC.

Необходимость района после сайта начала транскрипции для активации белком H-NS, но не САР.

Прямое взаимодействие цАМФ-САР комплекса с РНК полимеразой приводит к активации оперона flhDC.

Сравнительный анализ последовательностей регуляторных областей flhDC.

Использование метода прямого секвенирования на хромосомной ДНК. 89 Последовательные этапы секвенирования для определения последовательности оперона flhDC байкальской энтеробактерии

Enterobacter 22.

Эксперименты по поиску возможного дополнительного регулятора, опосредующего механизм регуляции H-NS.

Глобальный сравнительный анализ физиологических изменений в мутантном штамме hns Е. coli.

Сравнительный анализ профиля аккумуляции белков в мутантном по гену hns штамме и штамме дикого типа Е. coli.

Результаты по сравнению экспрессии генов на уровне транскрипции. 99 Компоненты клеточной оболочки, находящиеся под контролем H-NS. 99 Эффект H-NS на регуляцию генов, кодирующих ДНК-связывающие белки

Увеличение устойчивости мутантного штамма hns к условиям высокой осмолярности и кислого pH.

Использование метода гибридизации на мембранах высокой плотности для анализа ревертантных подвижных штаммов hns Е. coli

Регуляция бактериальной подвижности в условиях низкого pH опосредована белком Н-^ и эффектами на уровне суперскрученности ДНК.

Регуляция подвижности в условиях кислого рН среды.

Регуляция экспрессии/IНОС в условиях кислого рН.

Изоляция и характеризация супрессорных мутаций.

Регуляция подвижности другими факторами окружающей среды.

Роль топологии ДНК в механизме регуляции подвижности.

Сравнение ответов природных бактериальных штаммов на изменение условий окружающей среды на примере байкальских бактерий: энтеробактерии с перитрическим жгутикованием и штамма Pseudomonas с полярным типом жгутикования и соотвествующими каскадами регуляции подвижности.

Эффекты условий окружающей среды на инициацию транскрипции регуляторных генов.

Роль уровня суперскрученности ДНК в контроле подвижности.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Контроль экспрессии генов в процессе подвижности грамотрицательных бактерий»

Мы не перестаем удивляться необычайному разнообразию живых организмов и их способности адаптироваться даже к экстремальным условиям окружающей среды и населять самые неожиданные экологические ниши. В частности, одной из интересных особенностей микроорганизмов является их способность развиваться в самых различных условиях окружающей среды, включая соленость, температуру и содержание питательных компонентов. Для выживания в изменяющихся условиях бактерии обладают способностью к быстрой адаптации своей структуры и физиологии. Механизмы этого процесса основаны на существовании многочисленных регуляторных сетей, дающих возможность координированной регуляции экспрессии генов в ответ на сигналы окружающей среды.

Примером такой сложной регуляторной системы является координация процессов бактериальной подвижности и хемотаксиса. Эта система обладает чувствительностью ко многим внешним факторам и представляет собой таким образом чрезвычайно богатый объект для исследования, позволяющий проанализировать множественные взаимодействия в регуляции бактериальной физиологии. Многие бактериальные штаммы обладают подвижностью посредством жгутиков. Структура и положение жгутиков связаны со специфическими условиями жизнедеятельности бактерий. В некоторых случаях (Kim and McCarter, 2000) бактерии даже способны адаптировать тип жгутикования в ответ на изменение условий окружающей среды. Так, например, Vibrio parahaemolyticus обладает двойной системой жгутиков. Одиночный полярный жгутик используется при передвижении в жидкой среде.

Многочисленные латеральные жгутики используются при передвижении по поверхности субстратов. Полярная система жгутикования функционирует постоянно, тогда как синтез латеральных жгутиков индуцируется в вязкой среде или на поверхности субстрата. Еще один пример такого явления - это клеточная дифференциация в гиперподвижную фазу у таких грамотрицательных бактерий, как Serratia marcescens (Alberti et al., 1990) и Proteus mirabilis (Allison et al., 1995).

Кроме ключевой роли подвижности в адаптации к условиям окружающей среды, в патогенных бактериальных штаммах недавно была показана роль подвижности в вирулентности и в индукции воспалительного процесса такими бактериями, как Bordetella bronchiseptica (Akerley et al, 1995), Vibrio cholerae (Gardel and Mekalanos, 1996) и Salmonella typhimurium (Ciacci-Woolwine et al, 1998). Кроме того, была показана важная роль подвижности в колонизации, прикреплении к субстратам и образовании биофильмов, например, Vibrioßscheri (Graf et al, 1994) и Escherichia coli (Pratt and Kolter, 1998). Во многих случаях, в условиях конкуренции между несколькими бактериальными штаммами, было показано, что подвижность дает специфические преимущества для выживания (Moens and Vanderleyden, 1996).

В бактериях сложные системы включают участие многих регуляторных белков, организованных в иерархическую структуру. Такая структуризация позволяет эффективную и быструю адаптацию к изменению условий, а также постоянный и адекватный контроль взаимоотношения микроорганизмов с внешней средой. В системе подвижности существует несколько уровней контроля ингибирования или индукции синтеза жгутиков или изменения их функционирования, что дает возможность тонкой регуляции, позволяющей подходящий к каждой ситуации ответ.

В последние годы развитие новых методов глобального анализа экспрессии генов и исследования взаимодействий между макромолекулами, часто сопряженные с секвенированием бактериальных геномов, предоставило новые возможности для анализа регуляторных процессов на молекулярном уровне. Усовершенствование этих методов должно позволить улучшить наше понимание молекулярных механизмов сложных систем регуляции, в частности в бактериальном мире.II. Обзор литературыМногие бактерии движутся посредством жгутиков (Macnab, 1996, Silverman and Simon, 1974). Эти пропеллевидные структуры прикреплены через НАР белки (ассоциированные с крючком белки) к универсальному соединению (структура крючка), который связан с мотором (или телом основания), расположенным в цитоплазматической мембране (Jones and Aizawa, 1991). В природе существует большое разнообразие жгутиков (Joys et al, 1988; Wilson and Beveridge, 1993): от одиночного полярного до 2-6 полярных и многочисленных латеральных. Некоторые жгутики, например, у спирохет, расположены в цитоплазматическом пространстве (Canale-Parola, 1978). Состав жгутикового филамента может также варьировать: существуют простые жгутики, как в Е. coli и S. typhimurium, гомополимеры, состоящие из одинаковых флагеллиновых субъединиц; сложные жгутики, полимеризованные из многих различных субъединиц у таких организмов, как Campylobacter (Guerry et al, 1991; Logan et al, 1989), Caulobacter (Driks et al, 1989; Gill and Agabian, 1983; Minnich et al, 1988) и Rhizobium (Bergman et al, 1991; Pleier and Schmitt, 1991; Trachtenberg et al, 1987). Кроме того, структурные белки жгутиков могут быть модифицированы, например, фосфорилированы (Pseudomonas aeruginosa (Kelly-Wintenberg et al, 1993)) или гликозилированы (Halobacterium halobium (Gerl and Sumper, 1988)), филамент также может быть окружен специфической оболочкой (Bdellovibrio bacteriovorus, Helicobacter pylori и многие штаммы Vibrio (Sjoblad et al, 1983; Tomashow and Rittenberg, 1985)).

Структура и функция жгутиков Escherichia coli и Salmonella typhimurium достаточно хорошо изучены (Macnab, 1996). Для этих бактерий характерен перитрический тип расположения жгутиков, число которых варьирует от 5 до 10 на клетку, расположение жгутиков случайно по всей поверхности клетки (Рис. 1). Бактериальный жгутик состоит из трех компонентов: длинный спиральный филамент, короткая изогнутая структура, называемая « крючком » и основание, состоящее из нескольких колец и центральной части (DePamphilis and Adler, 1971).

Штамм дикого типа!Мутант hnsшНшНEscherichia coliVibrio choleraeРис.1 Электронно-микроскопические фотографии бактерий Е, coli с латеральными жгутиками (подвижный штамм дикого типа и неподвижный мутант hns) и К cholerae с полярным жгутикомДлина жгутикового филамента варьирует от 5 до 10 мкм, диаметр постоянен: 20 нм (Namba et al, 1989). Это главный по массе и биосинтетической стоимости компонент жгутика с особыми структурными свойствами, который является потенциальным антигеном. Эта спиралевидная структура состоит из 20000 субъединиц одного белка флагеллина FliC, молекулярная масса которого около 50-60 кДа, но может варьировать в зависимости от фазы для S. typhimurium (Kondoh and Hotani, 1974). Флагеллин состоит из трех доменов, причем N-концевой и С-концевой домены отвечают за взаимодействия между субъединицами жгутика. Удивительной особенностью этого белка является его прочность, которая в 2 раза превышает эту характеристику у актина. Деполимеризация филамента на субъединицы происходит при высокой температуре, кислом pH и др.

Филамент прикреплен к клетке « крючком », который построен из белка FlgE (130 субъединиц). Длина этой структуры 55+6 нм. На месте соединения расположены белки FlgK и FlgL (Homma and Macnab, 1990).

Основание жгутика или мотор - сложная структура, расположенная в клеточной стенке, состоит из нескольких колец: L (FlgH белок), Р (Flgl белок), MS (FliF белок), С (FÜG белок), дистальное основание (FlgG белок), проксимальное основание (FlgB, FlgC, FlgF белки), FliE белок (Jones et al, 1990; Muller et al, 1992). Белки MotA и MotB интегрированы в клеточную мембрану и необходимы для функционирования мотора жгутика.

Примером грамотрицательных бактерий с полярным жгутиком являются штаммы рода Vibrio и рода Pseudomonas.

Полярные жгутики V. parahaemolyticus (McCarter et al, 1995, Kim and McCarter, 2000), V. anguillarum (McGee, 1996) и V. cholerae (Klose and Mekalanos, 1998) состоят из нескольких различных субъединиц (6, 5 и 5, соответственно). Мутации в некоторых генах флагеллинов V. anguillarum не имеют значительного эффекта на подвижность, но приводят к дефектам в вирулентности штамма (McGee, 1996). Это показывает, что некоторые структурные белки филамента имеют дополнительную роль в патогенности, не связанную с подвижностью.

Только один FlaA белок V. cholerae необходим для подвижности, 4 других белка: FlaB, FlaC, FlaD и FlaE имеют высокую степень гомологии между собой (61-82 процента идентичности).

Полярный жгутик Pseudomonas aeruginosa построен из одного структурного белка FliC (Törten, 1990).

Функционирование моторной системыМотор жгутика Е. coli и S. typhimurium способен вызывать вращения в двух направлениях: против часовой стрелки (направленное движение) и по часовой стрелке (колебания клетки на месте) (Macnab, 1996) или функционировать с кратковременными паузами.

Некоторые характеристики мотора: скорость вращения жгутика 100 Гц, скорость направленного движения 25 мкм/с (10-кратная длина клетки в секунду) (Berg and Brown, 1972; Macnab and Koshland, 1972).

Источником энергии вращения жгутикового мотора является трансмембранный протонный потенциал (Glagolev and Skulachev, 1978; Khan et al, 1978; Larsen et al, 1974; Manson et al, 1977; Manson et al, 1980). Источник поддержания трансмембранного протонного потенциала варьирует в зависимости от условий, например, при дыхании - это цепь переноса электронов, в условиях анаэробного гликолиза - гидролиз АТФ АТФазой. Мотор жгутика функционирует очень эффективно (Рис. 2).

В некоторых бактериях трансмембранный электрохимический потенциал ионов Na+, а не Н+, преобразуется в механическую работу для вращения жгутика. Примером такой системы мотора является V. cholerae (Hase and Mekalanos, 1999), V. alginolyticus, V. parahaemolyticus (Dibrov et al, 1986; Atsumi et al, 1992). Интересным примером является штамм V. parahaemolyticus с двойной системой жгутиков, в которой полярный жгутик вращается за счет натриевого трансмембранного потенциала, тогда как система латеральных жгутиков функционирует за счет протонного трансмембранного потенциала (Atsumi et al, 1992). Недавно были опубликованы интересные результаты о возможности создания гибридных моторов V. cholerae в которых моторные белки РошА, РошВ, MotX и MotY замещены белками MotA и MotB Е. coli ( Gosink and Hase, 2000).

Рис. 2 Структура и функционирование бактериальногожгутикаМесто сборк органеллыЖгутиковый филаментСС\Л/:г:С\Л/Мо(Структура крючка Тело Внешняяоснования среда Мембрана Пептидогликаны Комплексы А в^штв МембранаКольцо С | Экспортныйаппарат Экспортируемый субстратТакие гибридные системы способны функционировать за счет протонного потенциала в V. cholerae. Анализ такого штамма с гибридной моторной системой может помочь в понимании механизма значительного увеличения скорости движения жгутиков с Na+ -мотором, по сравнению с Н+- мотором. Жгутик Е. coli вращается со скоростью около 15000 оборотов в минуту (Lowe et al, 1987), тогда как жгутик V. cholerae - 100000 оборотов в минуту (Magariyama et al, 1994). Возможно, что роль белков MotX и MotY заключается в стабилизации мотора в мембране, что позволяет увеличить скорость вращения. С другой стороны, эти два белка формируют независимый от РошАВ ионный канал, что увеличивает эффективность конверсии энергии.

Хромосомная организация жгутиковых геновДля синтеза жгутиков Е. coli и S. typhimurium необходима экспрессия около 50 генов, организованных в несколько кластеров на хромосоме (Macnab, 1996). Кластер I (24 минута на хромосоме Е. coli, 23 минута S. typhimurium ) включает многие структурные гены. Кластер II (41 минута на хромосоме Е. coli, 40 минута S. typhimurium ) включает гены, продукты которых участвуют в регуляции и сборке, а также гены мотора motA, motB и гены che, кодирующие компоненты сенсорного аппарата жгутиков. Кластер III состоит из трех хромосомных областей (43 минута на хромосоме Е. coli, 40 минута S. typhimurium ). Большая часть генов системы организована в 15 ( Е. coli) и 17 (S. typhimurium ) оперонов (Komeda et al 1980; Kutsukake et al, 1988). Существуют также отдельные опероны для разных хеморецепторов, таких как сериновый рецептор, Tsr. Кодирующие области соседних генов в опероне лежат близко друг к другу, часто даже перекрываются.

Геномная организация системы синтеза полярного жгутика менее изучена. Совсем недавно были опубликованы данные по полному анализу системы генов синтеза полярного жгутика из V. parahaemolyticus (Kim and McCarter, 2000). Авторами этой работы определено 57 потенциальных генов, продукты которых гомологичны белкам системы подвижности и хемотаксиса других бактерий. Большая часть генов расположена в двух геномных областях и организована в большие опероны. Самые близкие гомологи найдены у V. cholerae, P. aeruginosaи Р. putida, причем геномная организация высоко консервативна в этих организмах.

Контроль экспрессии генов синтеза жгутиковПоддержание системы подвижности и хемотаксиса является дорогостоящей частью клеточной экономики с точки зрения числа необходимых генов и затраченной энергии для экспрессии генов, синтеза белков и движения жгутиков. Поэтому система подвижности находится под строгим контролем в бактериальной клетке.

Каскад регуляции системы перитрического жгутиковапия Е. coli и S.typhimuríumИерархия этой регуляторной системы хорошо изучена у бактерий с перитрическим типом жгутикования, какими являются Е. coli и S. typhimuríum (Komeda et al, 1982; Komeda et al, 1986; Kutsukake et al, 1990). Опероны жгутиковой системы организованы в иерархическом порядке в так называемый регулон, в котором экспрессия оперонов на данном уровне зависит от экспрессии оперонов вышестоящего уровня. Такая схема контроля позволяет координировать экспрессию генов со сборкой органеллы (Рис. 3).

Регуляторный каскад включает три класса генов, причем гены каждого класса должны быть функциональными для экспрессии генов нижестоящего класса. Гены первого класса, flhD и flhC, формирующие главный регуляторный оперон на вершине системы, кодируют транскрипционные активаторы FlhD и FlhC экспрессии генов второго класса. Большая часть генов второго класса кодирует компоненты системы экспорта жгутиков и структуры основания. Ген fliA, расположенный на этом втором уровне каскада, кодирует альтернативный сигма фактор 28, специфичный для данной системы (Ohnishi et al, 1990).

Класс IсС| сАМР- ]1 (а™) J [ САР Jч ^рС1 flhDCРис. 3 Каскад регуляции системы латеральных жгутиков в S. typhimurium и Е. coliрС2 fliFG etcpC2flgBC etcДругие опероны с класса II(anti-FlgM)Рсза ßgMPciJgKLРсзаfliDSTРезь etcОпероны третьего класса положительно регулируются сигма фактором 28 и отрицательно регулируются анти-сигма фактором FlgM (Ohnishi et al, 1992; Kutsukake and lino, 1994). Анти-сигма фактор задерживается внутри клетки до окончания сборки структуры основания и соединительной структуры крючка жгутиков (Hughes et al, 1993). В этот момент FlgM экспортируется за пределы клетки, что позволяет сигма фактору 28 активировать экспрессию генов третьего класса, кодирующих структурные компоненты жгутикового филамента (флагеллин FliC), белки, ассоциированные с соединительной структурой, моторные и хемотактические белки передачи сигнала.

Кроме этого общего каскада существуют дополнительные регуляторные пути, например, транскрипционные классы внутри классов и трансляционная модуляция, координированная со сборкой структуры основания, а также связь между клеточным делением и образованием жгутиков (Karlinskey et al, 1998; Liu and Matsumura, 1996; Pruss and Matsumura, 1996; Pruss and Matsumura, 1997).

Каскад регуляции системы полярных жгутиковИерархия регуляции системы полярных жгутиков менее изучена. Однако, недавно были охарактеризованы регуляторы первых уровней каскада из V. cholerae, и была предложена схема регуляторного каскада этого организма (Klose and Mekalanos, 1998). Авторы работы идентифицировали регуляторный локус flrABC, кодирующий два активатора сигма фактора 54, FlrA и FlrC.

Белок FlrA расположен на вершине каскада и необходим вместе с сигма фактором 54 (RpoN) для транскрипции оперона flrBC.

Белки FlrB и FlrC были отнесены к членам двухкомпонентной системы переносчиков сигнала. По аналогии с другими представителями таких двухкомпонентных систем, было предложено, что в условиях индукции киназа FlrB переносит фосфат на консервативный остаток аспартата в позиции 54 аминоконцевой части регуляторного белка FlrC, таким образом активируя способность последнего катализировать сигма 54-зависимую инициацию транскрипции.

Полярный жгутик V. cholerae, подобно другим родственным штаммам, V. anguillarum и V. parahaemolyticus (McCarter et al, 1995; McGee, 1996), состоит из различных структурных единиц, которые регулируются различным образом (Klose and Mekalanos, 1998). В других бактериях гены флагеллинов находятся на нижнем уровне транскрипционного каскада, так как необходимо, чтобы эти белки были синтезированы в последнюю очередь из-за их структурной роли в формировании жгутикового филамента. В случае V. cholerae было показано (Klose and Mekalanos, 1998), что только один из белков флагеллинов FlaA необходим для подвижности, и только ген, кодирующий этот структурный компонент, транскрибируется РНК полимеразой с сигма 54. Для транскрипции этого гена необходима активная фосфорилированная форма белка FlrC. Промоторы генов других флагеллинов, которые не являются необходимыми для подвижности, flaE, flaD и flaB, транскрибируются полимеразой с альтернативным сигма фактором 28 FliA, подобно Е. coli и S. typhimurium. Было предложено, чтоFlrA и полимераза с сигма фактором 54 действуют на активность сигма фактора 28 и, возможно, FlrC посредством участия в транскрипции генов, необходимых для экспорта анти-сигма 28 фактора.

Таким образом, характеристикой регуляторного каскада полярных жгутиков является участие сигма фактора 54. Известно, что РНК полимераза с сигма фактором 54 способна инициировать транскрипцию только вместе с активаторным белком, который часто регулируется в ответ на изменение факторов окружающей среды, и активирует транскрипцию только в индуцирующих условиях (Kustu, 1989). В противоположность этому РНК полимераза с сигма фактором 28 может действовать в отсутствие активаторных белков, но для ее активности требуется экспорт анти-сигма фактора FlgM после окончания сборки комплекса структуры основания и соединения. Для остановки сигма 54-зависимой транскрипции необходимо только восприятие изменений факторов окружающей среды, тогда как для остановки сигма 28-зависимой транскрипции необходим синтез анти-сигма фактора в клетке, что является более длительным процессом ответа.

Недавно были определены элементы регуляторного каскада полярной системы в другом штамме V. parahaemolyticus (Kim and McCarter, 2000). Подобно V. cholerae было показано существование сигма 54-зависимого класса генов, который включает гены, участвующие в сборке структуры основания-соединения; моторный ген motY, белки, ассоциированные с соединительной структурой крючка, гены хемотаксиса, fliA ген альтернативного сигма фактора 28. Этот специфический сигма фактор 28 необходим для транскрипции другого класса генов, который включает гены моторных белков MotA, MotB и MotX, белков хемотаксиса, белка наконечника филамента, анти-сигма фактора FlgM, возможных шаперонов и пяти генов флагеллинов. Были идентифицированы также возможные активаторы сигма 54, FlaK, FlaM - регуляторные белки двухкомпонентных сенсорных систем, и FlaL - сенсорная киназа, однако их непосредственная роль остается неизвестной.

Отличие регуляторных систем V. cholerae, V. anguillarum и V.parahaemolyticus в том, что в двух первых организмах только один специфический флагеллин необходим для подвижности и находится под контролем сигма фактора 54, тогда как другие флагеллины не являются необходимыми и находятся под контролем сигма фактора 28. Гомолог специфического флагеллина в V. parahaemolyticus - FlaC также находится под дифференцированным контролем факторами окружающей среды, в отличие от других флагеллинов, однако этот ген не является необходимым для подвижности, и не находится под контролем сигма фактора 54. Этот организм интересен присутствием одновременно двух систем жгутикования - полярной и латеральной, и, соответственно, двух регуляторных каскадов, причем структурные компоненты - свои для каждой системы.

Еще один пример регуляторного каскада системы полярного типа -система P. aeruginosa (Arora and Ramphai, 1997; Ritchings and Ramphai, 1995) с геном fleQ на вершине, кодирующим транскрипционный регулятор группы NtrC, действующий с RpoN сигма фактором. FleQ регулирует транскрипцию оперона fleSR, кодирующего FleS сенсор и FleR регулятор (сигма 54 активатор) двухкомпонентной системы, необходимой для контроля синтеза жгутиков. Точная иерархическая структура остается неизвестной, однако были идентифицированы гены fliC, структурный ген флагеллина (Totten and Lory, 1990), и fliA, кодирующий специфический сигма фактор, необходимый для контроля синтеза жгутиков (Stambach and Lory, 1992). Предложена роль каскада для быстрой положительной и отрицательной регуляции структурных генов в ответ на сигналы окружающей среды. Кроме того, недавно были опубликованы данные об идентифицикации дополнительного регулятора FleN, контролирующего число жгутиков в Р. aeruginosa (Dasgupta and Ramphai, 2000), посредством прямого или непрямого влияния на активность FleQ регулятора.

Участие сигма фактора 54 в регуляции подвижности - довольно широко распространенное явление. Недавно опубликованы данные по вовлеченности сигма фактора 54 в контроль экспрессии генов, кодирующих структурные элементы « крючка » и структуры основания мотора у Rhodobacter sphaeroides (Poggio et al, 2000). Иерархическая система регуляции полностью не определена, однако предполагается существование регулятора первого класса - активаторасигма 54; гены второго класса с промоторами, зависимыми от сигма 54, подобно Caulobacter crescentus и гены третьего класса, как показано для fliC, могут транскрибироваться с сигма 28. Предполагается, что регуляторная система R. sphaeroides является комбинацией элементов двух систем: энтеробактерий и С. crescentus.

Авторы работы (Souijik et al, 2000) сообщили об идентифицикации регуляторной системы подвижности другой грамотрицательной бактерии Sinorhizobium (Rhizobium) melioti. Жгутиковый регулон этой бактерии включает 41 ген, организованный в 7 оперонов и 6 транскрипционных единиц. На вершине регуляторного каскада находятся гены visN и visR в составе одного оперона. Продукты этих генов формируют гетеродимер VisNR, являющийся глобальным регулятором всех других генов системы подвижности и хемотаксиса. Белки VisN и VisR (27 кДа) принадлежат к семейству LuxR с типичными доменами связывания лиганда и ДНК. Оперон vis транскрибируется конститутивно, однако для активации транскрипции необходимо связывание еще неизвестного эффекторного лиганда. Иерархия экспрессии генов включает три класса, подобно другим системам: первый класс - оперон vis, второй класс включает гены сборки жгутика и мотора, третий класс - гены флагеллина и хемотактические гены, для которых необходимо функционирование первого и второго классов. Таким образом, иерархия сходна с энтеробактериальной, с некоторыми различиями: активаторы принадлежат к другому типу, mot гены находятся во втором, а не в третьем классе.

Интересно отметить, что у другой грамотрицательной бактерии с перитрическим типом жгутикования Yersinia enterocolitis были идентифицированы три гена для структурных компонентов жгутикового филамента, флагеллина fleA, flеВ и flеС в противоположность единичному гену fl iC других энтеробактерий Е. coli и S. typhimurium (Kapatral and Minnich, 1995). Аминокислотные последовательности белков FleA( 36,7 кДа), FleB( 37,4 кДа) и FleC (39,6 кДа) близки друг другу (83-89% идентичности). Показано, что эти белки структурно и функционально родственны другим флагеллинам энтеробактерий. Транскрипция трех генов флагеллинов зависит от fl ¿А сигма фактора и координированно регулируется температурой.

Регуляторы первого классаFlhDCВ хорошо изученной системе Е. coli и S. typhimurium на вершине регуляторного каскада лежит оперон flhDC (Macnab, 1996), продукты которого необходимы для экспрессии всех других генов регулона, то есть оперонов второго и третьего классов.

Белки FlhD(13 кДа) и FlhC(22 кДа) формируют гетеротетрамерный комплекс, необходимый для активации транскрипции генов системы синтеза жгутиков (Liu and Matsumura, 1994; Yanagihara, 1999). Было показано, что две молекулы FlhD и две молекулы FlhC необходимы для формирования активного комплекса (Liu and Matsumura, 1994), который способен связываться с промоторами генов второго класса, однако специфический механизм узнавания остается неизвестным (Рис. 4). Последовательность TT(T/A)GCCGATAACG может быть сайтом фиксации комплекса FlhDC (Bartlett et al, 1988), однако, не было определено консенсусной последовательности с помощью анализа футпринтинга с ДНКазой I (Liu and Matsumura, 1994). FlhD/FlhC были отнесены к транскрипционным факторам первого класса, было продемонстрировано, что С-концевой домен альфа-субъединицы РНК полимеразы необходим для активации транскрипции комплексом FlhD/FlhC (Liu and Matsumura, 1995). Было показано, что белок FlhD без FlhC не способен связываться с промоторными областями генов второго класса и не способен активировать транскрипцию (Liu and Matsumura, 1994).

Для белка FlhD была предложена более обширная роль в регуляции бактериального метаболизма. FlhD, но не FlhC, отрицательно регулирует транскрипцию генов, не связанных с подвижностью, при входе в стационарную фазу роста (Pruss and Matsumura, 1996). Кроме того, было показано, что FlhD отрицательно регулирует деление клеток посредством индукции оперона cadBA (Pruss, 1997). Остается неизвестным, каким образом FlhD регулирует экспрессию cadBA, напрямую посредством непосредственного связывания с регуляторнойРис. 4 Структура димера белкаМономер А: альфа-спираль обозначена оранжевым цветом, бета-листок обозначен синим цветом; мономер В: альфа-спираль - зеленым цветом, бета-листок - красным цветомA. Димер белка Р1ЬВ;B. Взаимодействие комплекса ПЬОФШС с ДНКобластью или через формирование комплекса с другими неидентифицированными факторами. FlhD также участвует в регуляции некоторых других клеточных процессов на транскрипционном уровне (Pruss et al, 2001). Таким образом, было предложено, что белок FlhD способен изменять специфичность своего действия.

Пик транскрипции оперона flhDC приходится на середину логарифмической фазы роста (Pruss and Matsumura, 1997), тогда как транскрипция генов второго уровня, в которой участвует комплекс FlhDC, происходит на конечной фазе клеточного цикла. Таким образом, белок FlhD может присутствовать в клетке в середине логарифмической фазы, взаимодействовать с другими факторами для регуляции экспрессии не связанных с подвижностью генов. FlhD является первым примером прокариотического глобального регуляторного белка, способного изменять свою специфичность для участия в контроле несвязанных процессов.

Последовательности гомологичных оперонов flhDC были определены во многих бактериях, эти последовательности имеют высокую степень гомологии: S. typhimurium, Erwinia carotovora, Bordetella bronchiseptica, Proteus mirabilis (Furness, 1997), Serratia liquefaciens (Givskov, 1995), Yersinia enterocolitica (Young, 1999), Xenorhabdus nematophilus (Givaudan, 2000). Во многих патогенных бактериях была продемонстрирована роль гомологов flhDC в координации регуляции подвижности и вирулентности, примером могут служить работы по роли flhDC X. nematophilus в регуляции подвижности, липолиза, внеклеточного гемолиза и полной вирулентности в насекомых (Givaudan, 2000), P. mirabilis (Allison, 1992), Y. enterocolitica (Badger, 1998; Kapatral, 1996). Кроме того, оперон flhDC играет ключевую роль в процессе клеточной дифференциации в гиперподвижную фазу в S. liquefaciens и P. mirabilis (Eberl, 1996; Furness, 1997). Было также показано, что индукция экспрессии и секреции фосфолипазы находится под контролем оперона flhDC в S. liquefaciens (Givskov, 1992; Givskov, 1995), а также в Y. enterocolitica (Young, 1999; Schmiel, 2000). Некоторые гены вирулентности находятся под контролем других белков системы, которые в свою очередь регулируются flhDC, например, FliZ (оперон второго класса fliAZY) в Salmonella enterica необходим для активации экспрессии гена инвазина hilA (Lucas, 2000).

Регуляторы первого класса системы полярных жгутиковРегуляторы на вершине каскада системы полярных жгутиков относятся к семейству NtrC активаторов сигма фактора 54. Альтернативный сигма фактор 54 участвует в транскрипции генов с различными физиологическими функциями: гены ассимиляции азота Е. coli и S. typhimurium (Hirschman, 1985; Reitzer and Magasamk, 1986), гены системы жгутиков P. aeruginosa, V. cholerae и Caulobacter crescentus (Totten, 1990; Klose and Mekalanos, 1998; Brun, 1992), и гены пилинов, необходимые для вирулентности Р. aeruginosa и Neisseria gonorrhea (Ishimoto and Lory, 1989). РНК полимераза в комплексе с сигма фактором 54 нуждается в активаторном белке для инициации транскрипции (Porter, 1995). Такие активаторы сигма фактора 54 обычно связываются с энхансерным элементом промоторной области и активируют транскрипцию посредством контакта с РНК полимеразой в комплексе с сигма фактором 54, связанной с промотором (Reitzer and Magazanik, 1986). Гидролиз АТФ сигма 54 активатором приводит к изомеризации неактивного комплекса сигма 54 -РНК полимеразы с промотором в открытый транскрипционно компетентный комплекс (Popham, 1989, Weiss, 1991). Транскрипционная активность сигма 54 активаторов часто модулируется в ответ на изменения условий окружающей среды.

В системе V. cholerae присутствуют два активатора сигма фактора 54: Fir А (55,2кДа ) и FlrC (52,1 кДа), причем последний вместе с белком FlrB (38,5 кДа) формируют двухкомпонентную систему передачи сигнала (Klose and Mekalanos, 1998). Белок FlrA имеет значительную гомологию с FlaK V. parahaemolyticus (77% идентичности) (Stewart and McCarter, 1996) со сходным положением на хромосоме.

Двухкомпонентная система FlrB/FlrC имеет гомологов в P. aeruginosa FleS/FleR белки (46% и 56% гомологии, соответственно) (Ritchings, 1995). Предполагается, что сенсорная киназа FleS P. aeruginosa является трансмембранным белком, тогда как белок FlrB является цитоплазматическим. Промотор flrB имеет сайт связывания с сигма фактором 54, близкий к консенсусуTGGCACn4TTTGCA (Morett and Buch, 1989; Ashraf, 1997). Было показано, что FlrA и РНК полимераза с сигма фактором 54 транскрибируют оперон flrBC.

Роль этих регуляторов в бактериальном метаболизме более обширна. Авторы работы (Klose and Mekalanos, 1998) продемонстрировали роль белка FlrC в стимуляции клеточного деления. Полярный жгутик собирается на одном полюсе клетки, возможно, что координированная регуляция синтеза жгутиков и клеточного деления необходима для предотвращения образования многочисленных жгутиков.

В другой бактерии Caulobacter crescentus сигма 54-зависимая экспрессия генов подобным образом тесно связана с контролем клеточного деления (Brun and Shapiro, 1992). Результаты Klose и Mekalanos предполагают, что активная фосфорилированная форма FlrC стимулирует клеточное деление, а также что активность FlrC уменьшается в стационарной фазе роста или в условиях колонизации, что приводит к элонгации клеток.

Гомологами белков FlrA, FlrB и FlrC в Р. aeruginosa являются активаторы сигма фактора 54 FleQ и FleR (Arora and Ramphai, 1997) и сенсорная киназа FleS. FleQ вместе с комплексом сигма 54 с РНК-полимеразой необходим для транскрипции fleSR оперона. Было показано, что эти компоненты регуляторного каскада участвуют в контроле не только подвижности, но и синтеза адгезинов, необходимых для прикрепления к эпителиальным клеткам в процессе колонизации дыхательных путей.

Опероны второго и третьего классов в иерархической системеПромоторыВ системе Е. coli и S. typhimurium опероны второго и третьего классов несут специфическую консенсусную последовательность минус 10 бокса GCCGATAA, которая отличается от общей (Macnab, 1996). Опероны третьего класса также имеют специфическую последовательность в позиции минус 35 ТААА, тогда как в промоторных областях второго класса не наблюдается консенсуснойпоследовательности в этой позиции. Недавно была сообщена более длинная консенсусная последовательность для промоторов третьего класса TAAAGTTTnl 1GCCGATAA (Ide et al, 1999).FliA (специфический сигма фактор) необходим для экспрессии почти всех генов третьего класса, с некоторыми исключениями:1) flgM, JlgN могут транскрибироваться независимо от FliA с промотора гена второго класса JlgA (Gillen and Hughes, 1993; Kutsukake et al, 1994).

2) Транскрипция оперона flgK возможна с промотора вышестоящего оперона второго класса JlgB.

3) Оперон fliD имеет два промотора : класса 2 и класса 3.

Транскрипция оперонов второго класса непосредственно зависит от FlhDC. Ген flgM кодирует антагонист специфического сигма фактора FliA, который, связываясь с сигма F, предотвращает его взаимодействие с промоторами третьего класса (Kutsukake et al, 1994; Ohnishi et al, 1992), являясь таким образом антисигма фактором. Компоненты жгутикового аппарата по мере синтеза экспортируются вне клетки для последовательной сборки органеллы. Эта же транспортная система используется для удаления FlgM анти-сигма фактора из клетки в то время, когда появляется необходимость в экспрессии генов третьего класса.

Фазовая вариация экспрессии генов жгутикового филаментаВ противоположность Е. coli, S. typhimurium имеет два гена, кодирующих структурный белок жгутикового филамента - флагеллин. Эти гены удалены друг от друга на хромосоме, близки, но не идентичны по нуклеотидной последовательности, особенно в центральной антигенной части (Macnab, 1996). В одно и тоже время экспрессируется только один из генов жгутикового филамента.

Авторы работы по анализу полярной системы жгутиков (Kim and McCarter, 2000) в V. parahaemolyticus сообщили о существовании двух типов промоторов для генов второго и третьего классов:1) сигма-54-зависимые промоторы с консенсусной последовательностьюTGGCn7TTGCnl 1 +1(сайт начала транскрипции). В этот класс входят гены структуры основания и крючка, моторный ген motY, НАР1,3, гены хемотаксиса, fliA.

2) сигма-28-зависимые промоторы с консенсусной последовательностью CTAAAGn 14G(C/T)CG(A/T)TAAn7 +1(сайт начала транскрипции), близкой последовательности Е. coli и S. typhimurium (Ide et al, 1999). В эту группу входят моторные гены motA, motB, motX, гены белков хемотаксиса, НАР2, FlgM, 5 генов флагеллинов.

Другие функции жгутиков: роль в формировании биофильмов, в адгезии к субстратам и вирулентностиСпособность к направленному движению может дать микроорганизмам определенные преимущества в адаптации к условиям внутри хозяина. Потенциальные преимущества за счет подвижности включают увеличение эффективности захвата питательных веществ, избежание токсичных веществ, способность передвижения к предпотительным организмам-хозяинам и достижения оптимальных для колонизации сайтов внутри организма и распространение на большие пространства во время трансмиссионной стадии.

С другой стороны, подвижность требует значительных энергетических и других затрат на синтез компонентов жгутиковой системы (что составляет около 2% полной клеточной энергии), а также энергетических затрат на функционирование моторов жгутиков. Кроме того, полимерные жгутиковые филаменты обладают высоко антигенными свойствами при взаимодействии с иммунной системой организма хозяина. Таким образом, неудивительно, что синтез жгутикового аппарата подвержен строгому контролю. Многочисленные исследования взаимодействий бактерий с организмом хозяина продемонстрировали роль подвижности в процессе патогенеза, а также координированную регуляцию системы подвижности и вирулентности факторами окружающей среды на разных стадиях цикла бактериальной инфекции (Ottemann and Miller, 1997).

Во многих случаях подвижность является важным фактором вирулентности, давая возможность бактериям достигнуть организм-мишень на первых стадиях инфекции, затем колонизировать поверхности ткани организма, проникнуть внутрь клеток ткани-мишени и пролиферировать в них (Рис. 5).

Важность подвижности была продемонстрирована в ходе сравнения вирулентности подвижных, содержащих жгутики штаммов и неподвижных штаммов. В некоторых случаях жгутики имеют и другие важные для патогенности функции, например, участие в прикреплении бактерий к субстратам (Moens and Vanderleyden, 1996).

Рис, 5 Связь между подвижностью и вирулентностьюпатогенных бактерийВнешняя средаКолонизацияорганизма хозяина или органа-мишениЛВнутренняя средаИзменение условий; температуры, рН, осмолярности, содержания кислорода.VРаспространение в средеКоординированная регуляцияподвижности и вирулентностиИспользование жгутикого экспортного аппарата для факторов вирулентностиАдаптация к иммунным ответам• Ингибирование подвижности внутри организма хозяина• Антигенные модификацииКак уже отмечалось, жгутиковые органеллы во многих случаях вызывают сильный иммунный ответ в клетках позвоночных организмов. Существует несколько возможных механизмов для избежания иммунного ответа в организме хозяина. Так, многие микроорганизмы способны к вариации фазы от содержащей жгутики к лишенной этих органелл фазе. Другие штаммы способны к антигенной вариации засчет вариации между разными типами флагеллинов с разными антигенными свойствами. Например, Campylobacter jejuni способен к вариации фазы, а С. coli - к антигенной вариации (Moens and Vanderleyden, 1996).

Синтез систем факторов вирулентности координированно регулируется в ответ на изменение условий окружающей среды. Причем во многих случаях одни и те же факторы, такие как температура, pH, осмолярность, участвуют в контроле как подвижности, так и систем вирулентности. Часто такой координированный контроль осуществляется глобальными двухкомпонентными регуляторными системами, примерами могут служить системы OmpR/EnvZ Е. coli, Vi г A/Vi rG Agrobacterium, AlgRJ/A\gR2 Pseudomonas, BvgA/BvgS Bordetella, PhoP/PhoQ Salmonella, а также ассоциированный с мембраной регулятор ToxR Vibrio, несущий два домена, гомологичных двум компонентам других систем: внешний сенсорный киназный домен и внутренний ДНК-связывающий регуляторный домен (Mahan et al, 1996, Miller et al, 1989).

Штаммы рода Vibrio Для штаммов рода Vibrio показана во многих случаях прямая роль подвижности в колонизации и вирулентности.

Клетки люминесцентной морской водной бактерии Vibrio fischeri обладают высокой подвижностью при входе в симбиотический организм, спустя 24 часа после колонизации более 95% симбионтов лишены жгутиков, причем репрессия синтеза жгутиков является обратимым процессом, и бактериальные клетки вновь синтезируют жгутики при возврате в морскую воду. Graf с сотр. (1994) показали абсолютную необходимость подвижности для колонизации симбионта, неподвижные мутантные штаммы были неспособны проникать и колонизировать световой орган симбионта.

Другой штамм, V. anguillarum, патогенный для морских рыб, также использует подвижность для проникновения в водный организм хозяина. Анализнеподвижных мутантных штаммов (O'Tolle et al, 1996) показал, что подвижность необходима для полной вирулентности при естественном пути инфекции. Ormonde с сотр. (2000) показали необходимость активной подвижности для проникновения V. anguillarum в организм хозяина.

В случае морской патогенной бактерии V. parahaemolyticus предполагается роль жгутиков в прикреплении патогена к клеткам хозяина (Moens and Venderleyden, 1996).

Патогенным для человека является штамм V. cholerae. Связь между патогенностью этого микроорганизма и подвижностью изучалась в течение многих лет (Fretter et al, 1981), однако остается неясной определенная роль подвижности в этом контексте (Richardson, 1991; Gardel and Mekalanos, 1996). Недавно были найдены некоторые связи между экспрессией детерминант вирулентности и подвижности. Например, локус tcpl кодирует гомолог метил-связывающего хемотактического белка, продукт этого гена участвует в отрицательном контроле экспрессии генов пилина и поверхностной подвижности (Harkey et al, 1994). Экспрессия tcpl активируется системой контроля вирулентности ToxR-ToxT, что предполагает возможность механизма координированной регуляции подвижности и вирулентности. Gardel и Mekalanos (1996) сообщили об аберрантной экспрессии факторов вирулентности в неподвижных и гиперподвижных мутантных штаммах. Из этих исследований ясно, что подвижность V. cholerae и колонизация кишечника связаны между собой сложным и тесным образом.ToxR-зависимая глобальная система регуляции необходима для контроля патогенности V. cholerae. ToxR - 32-кДа-трансмембранный белок, регулирующий транскрипцию многих генов, и синтезируемый в ответ на изменение факторов окружающей среды. Известно, что синтез продуктов ToxR-регулируемых генов также находится под контролем сигналов окружающий среды, таких как осмолярность, температура (Ottemann and Mekalanos, 1995). Кроме того, была предложена отрицательная роль ToxR в регуляции подвижности, так как мутантный по ToxR штамм имеет гиперподвижный фенотип (Strauss, 1995). Nye с сотр. (2000) сообщили интересные данные о вовлеченности гомолога H-NS в регуляцию экспрессии генов вирулентности на многих ступенях регуляторного каскада ToxR.

Многие патогенные бактерии адаптировали свои свойства к экологической нише, связанной со слизистой поверхности желудочно-кишечного тракта. Примерами могут быть Campylobacter jejuni и Helicobacter pylori. Опосредованная жгутиками подвижность по-видимому является необходимым компонентом для патогенности этих микроорганизмов. С. jejuni и Н. pylori способны двигаться в среде с повышенной вязкостью. Для этих организмов с помощью анализа мутантных по генам флагеллинов штаммов была показана важность подвижности для колонизации слизистой желудочно-кишечного тракта (Ottemann and Miller, 1997).Proteus mirabilis - патогенная бактерия, вызывающая инфекции мочевых путей. Для этой бактерии характерна способность дифференциации в продолговатые, мультинуклеоидные, гиперподвижные клетки, специализрованные в передвижении по поверхности. Такая дифференциация сопровождается увеличением экспрессии генов некоторых факторов вирулентности (Allison et al, 1992). Из этих результатов следует, что дифференцированная клеточная гиперподвижная стадия является вирулентной формой P. mirabilis.

Многие подвижные патогенные микроорганизмы, включая Yersinia, Legionella, Serratia, Listeria и Bordetella bronchiseptica неподвижны при температуре организма хозяина. Другие патогенные бактерии, такие как Bordetella pertussis (Akerley et al, 1992; Akerley and Miller, 1993), Shigella.sp.(Tominaga et al, 1994) и Yersinia pestis (Kapatral et al, 1996), лишены способности к подвижности, хотя и несут критические жгутиковые гены. Как отмечалось ранее, регуляция подвижности может быть важным аспектом вирулентности многих микроорганизмов, однако подвижность требует больших затрат энергии, а также жгутиковые структуры имеют сильные антигенные свойства, поэтому репрессия подвижности может быть необходимой внутри организма хозяина.Bordetella bronchiseptica - патоген животных, близкий к Bordetella pertussis, которая является патогеном человека. Гены вирулентности Bordetellaкоординирование» регулируются двухкомпонентной системой BvgAS в ответ на сигналы окружающей среды (Weiss et al, 1983; Arico et al, 1989). BvgS является трансмембранным сенсорным компонентом, a BvgA - регулятором транскрипции. Во время Bvg+ фазы система BvgAS активна, адгезины, токсины и другие факторы вирулентности экспрессируются. In vitro при понижении температуры с 37 до 25 градусов С и при других условиях, происходит переход в Bvg- фазу, которая характеризуется ингибированием экспрессии факторов вирулентности и индукцией экспрессии генов синтеза жгутиков (Akerley et al, 1992; Akerley and Miller, 1993). Показано, что фаза Bvg+ соответствует вирулентной форме бактерии. Akerley и Miller (1993), а также Akerley с сотр. (1995) определили, каким образом осуществляется координация регуляции генов вирулентности и подвижности. В активной стадии BvgAS репрессирует транскрипцию оперона frlA, являющегося функциональным аналогом регуляторного оперона fihDC энтеробактерий Е. coli и S. typhimurium. Оперон frlAB находится на вершине регуляторного каскада и активирует транскрипцию жгутиковых генов В. bronchiseptica. Эксперименты по искуственной экспрессии жгутиков и подвижности во время фазы Bvg+ за счет экспрессии оперона frlAB с Bvg-активируемого промотора показали, что подвижность не является необходимой для колонизации респираторных путей В. bronchiseptica и более того, одной из функций системы контроля вирулентности BvgAS является выключение подвижности для эффективного развития инфекции. Функция подвижной фазы Bvg- может заключатся в адаптации к условиям вне организма хозяина (Akerley and Miller, 1996). Han с сотр. (1999) продемонстрировали, что экспрессия BvgAS в Е. coli приводит к ингибированию подвижности на уровне транскрипции оперона flhDC. Авторы предполагают наличие BvgAS-подобного регулятора или регуляторов в Е. coli, вовлеченных в координированную регуляцию подвижности в ответ на изменение условий окружающей среды. Однако, к настоящему времени такого регулятора не было обнаружено в Е. coli.Salmonella typhimuriumПодобно В. bronchiseptica неадекватная экспрессия генов подвижности приводит к снижению вирулентности S. typhimurium. Schmitt с сотр. (1996) показали, что инактивация гена fliA специфического сигма-фактора не приводит куменьшению вирулентности. С другой стороны, штамм, мутантный по гену flgM анти-сигма фактора имеет сильно сниженную вирулентность (Schmitt et al,1996). Анти-сигма фактор ингибирует FliA и является отрицательным регулятором для координации морфогенеза жгутиков и экспрессии жгутиковых генов. Таким образом, адекватная регуляция экспрессии генов флагеллина необходима для патогенеза, в то время как подвижность сама по себе не является необходимой. Ciacci-Woolwine с сотр. (1998) показали непосредственную вовлеченность флагеллина в индукцию воспалительного процесса в зараженных клетках человека. Wyant с сотр. (1999) продемонстрировали иммуннорегуляторные эффекты жгутиков S. typhimurium в антигенной стимуляции клеток периферической крови человека.Yersinia spp. вызывают кишечные инфекционные заболевания животных и человека. Для Y. enterocolitica и Y. pseudotuberculosis характерна зависимость синтеза жгутиков от температуры. Клетки Y. enterocolitica имеют жгутики и подвижны только при температурах, меньших или равных 30 градусам С. Клетки, растущие при температуре выше 37 градусов неподвижны, что предполагает отсутствие экспрессии жгутиков в температурных условиях внутри организма хозяина. Kapatral и Minnich (1995) наблюдали координацию репрессии подвижности и индукции генов вирулентности. Badger и Miller (1998) представили результаты, предполагающие что экспрессия гена inv инвазина и флагеллиновых генов координированно регулируется на уровне транскрипции. Кроме того, вирулентные гены и жгутиковые гены находятся под контролем общей терморегуляции.

Как уже отмечалось ранее, сборка жгутика включает синтез специфического аппарата для экспорта белков, через который транспортируются по мере синтеза белки компонентов жгутика по механизму секреции 1П типа без модификации. Young с сотр. (1999) показали, что жгутиковый экспортный аппарат способен функционировать также для транспорта других, не связанных с подвижностью белков, в частности, YplA, ассоциированной с вирулентностью фосфолипазы Y. enterocolitica. Гомология между жгутиковым аппаратом транспорта белков и секреторным аппаратом типа III, осуществляющего транспорт без модификации, предполагает общее эволюционное происхождениеэтих двух функционально связанных систем. Таким образом, жгутиковый регулон способен влиять на взаимодействия бактерии с организмом хозяина независимо от подвижности самой по себе. Для полной патогенности достаточно наличие интактного жгутикового экспортного аппарата. Schmiel с сотр. (2000) представили результаты, показывающие, что ген необходимой для патогенности фософлипазы yplA является часью жгутикового регулона, находящегося в зависимости от регуляторного оперона flhDC и гена fliA специфического сигма-фактора.Serratia marcescens - пигментированная энтеробактерия, встречающаяся в разных экологических нишах. Оптимальная температура для поверхностной подвижности - около 30 градусов С, подвижность ингибируется выше 37 градусов С. Способность S. marcescens к распространению на большие расстояния или к дифференцировке в гиперподвижную фазу может быть важной для патогенности в слизистых оболочках кишечного, респираторного и мочевого тракта. Вариация поверхностных антигенов (пигмента в ассоциации со жгутиком) может представлять механизм избежания от иммунной системы организма хозяина (Moens and Vanderleyden, 1996).

Для Serratia liquefaciens было показано, что поверхностная подвижность и фосфолипаза корегулируются опероном flhDC, находящимся на вершине иерархической системы экспрессии генов (Eberl et al, 1996; Givskov et al, 1995). Фосфолипаза является одним из потенциальных детерминант вирулентности. Eberl с сотр. предлагают, что оперон flhDC связывает дифференцировку в гиперподвижную фазу с экспрессией факторов вирулентности.Xenorhabdus nematophilusДля этой энтеробактерии была показана роль оперона flhDC в регуляции генов подвижности, липолиза, клеточного гемолиза, а также необходимость для полной вирулентности этой бактерии (Givaudan et al, 2000).PseudomonasДля P. aeruginosa было показано, что подвижность является важным фактором, влияющим на взаимодействие с организмом хозяина и на синтез фактороввирулентности (Arora et al, 1997; Feldman et al, 1998). Arora с сотр. (1997) показали, что транскрипционный активатор FleQ, находясь на вершине каскада, регулирует адгезию к слизистым оболочкам и экспрессию жгутиковых генов в Р. aeruginosa. Адгезия является важной стадией в процессе колонизации этой патогенной бактерией дыхательных путей.

Вообще, было показано, что подвижность или жгутики необходимы на трех стадиях инфекции: проникновение в организм, иммуностимуляция и адаптация (Feldman et al, 1998).

Координация бактериальной подвижности в ответ на изменение условий окружающей средыКак следует из предыдущей части, система бактериальной подвижности и хемотаксиса играет важную роль в адаптации микроорганизмов к внешним факторам. Эта система находится под строгим контролем многокомпонентной регуляторной сети в ответ на изменение условий окружающей среды. В данном параграфе будут более детально рассмотрены факторы окружающей среды, влияющие на бактериальную подвижность (Рис. 6).

Процесс формирования бактериального жгутика чувствителен к внешним условиям. В Е. coli синтез компонентов жгутика ингибируется в условиях катаболической репрессии при росте с D-глюкозой в качестве источника углерода (Adler and Templeton, 1967), а также при повышенной температуре в 42 градуса С (Adler and Templeton, 1967; Morrison and McCapra, 1961; Li et al, 1993). Кроме того Li с сотр. протестировали целый ряд экстремальных условий, ингибирующих подвижность Е. coli: высокие концентрации солей, углеводородов, низкомолекулярных спиртов и присутствие ингибиторов ДНК гиразы. Эффект неорганических ионовИнгибирование подвижности увеличивается с возрастанием концентрации солей. Для NaCl полная потеря подвижности наблюдалась при концентрации 586 мМ. Для хлоридов эффективность ингибирования уменьшается в следующем катионном ряду: Ca2+>Mg2+>Ba2+>Sr2+>Cs2+>Li+>Rb+>K+=Na+=NH4. Для натриевых и калиевых солей эффективность уменьшается в следующем анионном ряду F->I->Br->N03-=(S04)2->CkЭффект углеводородовПодвижность Е. coli полностью ингибировалась в присутствии как неметаболизируемых углеводородов: сахарозы (бООмМ) и рибитола (бООмМ), так и метаболизируемых углеводородов, таких как D-сотбитол (700мМ).

Эффект низкомолекулярных спиртовПодвижность Е. coli полностью ингибировалась при добавлении 4% этанола (700мМ), 7% метанола (1,8М), 3% изопропанола (бООмМ) и 1,5% н-пропанола (200мМ).

Рис. 6 Факторы окружающей среды, влияющие набактериальную подвижностьВысокая осмолярность содержание солейТемператураКатаболическая репрессияУглеводороды, низкомолекулярные спиртыДетергентырНИнгибиторы ДНК гиразыЭффект ингибиторов гиразыПотеря подвижности наблюдалась при добавлении налидиксата до 20 мкМ или новобиоцина до 200 мкМ.

Не наблюдалось ингибирования подвижности в среде с повышенной вязкостью.D'Mello и Yotis (1987) сообщили о влиянии детергента дезоксихолата натрия на жгутикование и подвижность P. mirabilis и Е. coli. Уменьшение количества жгутиков наблюдалось при содержании 0,05% дезоксихолата, полное ингибирование формирования жгутиков наблюдалось при концентрации детергента в 0,1%. Авторы высказывают предположение о действии дезоксихолата не на уровне синтеза жгутиков, а на уровне сборки органеллы.

Синтез жгутиков требует больших затрат энергии. Количество структурного белка жгутикового филамента флагеллина достигает в оптимальных условиях до 8% общего количества белка в клетке. Способность бактерии останавливать этот дорогостоящий процесс в неблагоприятных условиях может дать ей преимущества для выживания. Интересно заметить, что для Е. coli многие из этих условий являются также реппелентными (при содержании соединений в миллимолярных концентрациях). Этот микроорганизм избегает высоких концентраций неорганических солей и условий высокой осмолярности (Li et al, 1988). Спирты и налидиксат также известны, как реппеленты (Tso and Adler, 1974). Таким образом, бактерии в первую очередь отвечают отрицательным тактизмом для удаления от места с неблагоприятными условиями, если это не удается, они выключают синтез белков системы подвижности и хемотаксиса.

Интересным примером контроля подвижности условиями окружающей среды является способность V. cholerae дифференциированно регулировать синтез разных флагеллинов в составе жгутика (Klose and Mekalanos, 1998), что может позволить бактерии синтезировать жгутики с характеристиками, адаптированными для подвижности в данных условиях окружающей среды (слизистые оболочки с высокой вязкостью, условия с высокой или низкой осмолярностью или pH и так далее), изменяя физические параметры жгутикового филамента. Кроме того существование многочисленных флагеллинов приводит к возможности антигенной вариации.

Каким образом неблагоприятные условия воздействуют на подвижность, остается неизвестным. Li с сотр. (1993) были получены мутантные штаммы, способные двигаться в определенных неблагоприятных условиях. Многие мутации были локализованы в районе кластеров генов жгутиков (42 минута хромосомы Е. coli). Мутации другого типа были локализованы вне жгутиковых кластеров на хромосоме. Интересно отметить, что мутации, приводящие к устойчивости к катаболической репрессии, были локализованы в локусе flhDC, а мутации, приводящие к устойчивой к температуре подвижности - в локусах fliA и flhDC (Silverman and Simon, 1977).Shi и Adler (1993) представили данные по возможному механизму ингибирования подвижности в неблагоприятных условиях. Было показано, что рассматриваемые условия затрагивают синтез жгутиковых компонентов, более того, продемонстрирован эффект на уровне транскрипции генов трех классов flhDC, fliA и fliC. Таким образом, предполагается, что все рассматриваемые условия ингибируют подвижность, действуя на уровне экспрессии регуляторного оперона flhDC. Остается неизвестным сигнал, ведущий к выключению синтеза жгутиков, однако этот процесс не зависит ни от катаболической репрессии, ни от сигналов хемотактической системы. Возможно, что в этот процесс вовлечена новая, еще неизвестная сенсорная система.

Что касается возможного механизма ингибирования подвижности неблагоприятными условиями, авторы предполагают возможность того, что рассматриваемые условия изменяют уровень суперскрученности ДНК, что в свою очередь приводит к изменению уровня транскрипции жгутиковых генов. Это предположение подтверждается данными по потере подвижности в присутствии ингибиторов гиразы В и гиразы А, новобиоцина и налидиксата, влияющих на топологию ДНК. Другие условия, такие как повышенная температура и высокая осмолярность приводят к изменению топологии ДНК (Anderson and Bauer, 1978; Goldstein and Drlica, 1984; Higgins et al, 1987). Однако ингибиторы гиразы уменьшают уровень суперскрученности, в то время как высокая осмолярность увеличивает его. Системы ответа на стрессы, такие как система теплового шока, осморегуляции и SOS ответа также могут воспринимать факторы внешней среды и передавать репрессорный сигнал для выключения синтеза жгутиков. Действительно, белки теплового шока необходимы для синтеза жгутиков (Shi etal, 1992), мутант lexA с конститутивной экспрессией генов SOS системы лишен жгутиков (Shi et al, 1993). Таким образом, предполагается вовлеченность множества стрессовых систем в регуляцию подвижности и хемотаксиса.

Регуляция подвижности рН средыВ природе встречаются условия с очень разнообразными значениями рН, от pHl в кислых серных источниках до pHl 1 в щелочных озерах (Ingraham and Marr, 1996). Бактерии способны развиваться во всех этих условиях, однако за исключением некоторых групп ацидофильных бактерий, живущих в экстремальных условиях с кислым рН, и некоторых групп алкалофильных бактерий, живущих в экстремальных щелочных условиях, большинство бактерий принадлежат к нейтрофильной группе, живущей в диапазоне рН от 5,0 до 9,0. Е. coli и S. typhimurium являются представителями последнего класса. Эти бактерии растут к максимальной скоростью при рН от 6 до 8, однако способны развиваться с меньшей скоростью при более кислых и щелочных значениях рН от 4 до 10,5.рН является важным параметром скорости многих типов реакций в клетке, таких как ионизация кислот и оснований, а также растворимость и реакции окисления-восстановления. Ферменты и другие макромолекулы оптимально функционируют только в определенных узких значениях рН, близких к нейтральным. Е. coli и другие нейтрофилы выработали эффективные механизмы поддержания внутриклеточного рН. Патогенные штаммы Е. coli, S. typhimurium, Shigella flexneri и V. cholerae встречают условия кислого рН как внутри человеческого организма, так и вне его. Во время патогенеза клетки находятся в кислой среде в желудке или внутри фагосом и фаголизосом в кишечных эпителиальных клетках или макрофагах (Slonczewski and Foster, 1996). Условия кислого рН индуцируют факторы вирулентности, такие как регулятор вирулентности ToxR Vibrio spp. и белки кислотного шока. Значение внутриклеточного рН зависит от многих факторов, таких как буферная эффективность клетки, выделение протонов, ассоциированное с дыханием и гидролизом АТФ, обмен протонов на ионы натрия и калия (Ingraham and Marr, 1996).

Дельта рН - разница между внешним и внутриклеточным рН являетсякомпонентом трансмебранного протонного потенциала, который вовлечен в процессы транспорта, подвижности и дыхания, анаэробный метаболизм также регулируется pH (Slonczewski and Foster, 1996). Бактерии выработали разные стратегии для поддержания постоянного внутриклеточного pH и противодействия неблагоприятным значениям внешнего pH (Dil worth and Glenn, 1999). Макромолекулы, находящиеся за пределами цитоплазматической мембраны (жгутики, пили, хеморецепторы, периплазматические белки, клеточные стенки и другие), в первую очередь подвержены неблагоприятным воздействиям внешнего pH среды. Клетки имеют ограниченные возможности для защиты этих структур и должны либо образовывать модифицированные структуры, устойчивые к неблагоприятным pH, либо элиминировать данные клеточные функции. Примером последнего решения проблемы является потеря бактериальной подвижности и хемотактического ответа в условиях кислого pH. Даже если сохраняется способность к подвижности, может быть нарушено функционирование необходимых хеморецепторов. Так, Bowra и Dilworth (1981) сообщили о зависимости подвижности Rhïzobium leguminosarum от pH среды. Оптимальная подвижность этой грамотрицательной бактерии с субполярным жгутиком при медленном росте и перитрическими - при быстром росте, наблюдалась в пределах pH от 5,5 до 8,0; резко снижалась при pH ниже 5,5 и полностью отсутствовала при pH 4,5. Чувствительность подвижности к pH для R. leguminosarum согласуется с данными по другим бактериям, для которых оптимум pH для подвижности близок к оптимуму pH для роста. Adler и Templeton (1967) определили оптимальные величины pH для подвижности Е. coli между pH 6 и 7,5. Авторы полагают, что форма кривой зависимости подвижности от pH среды, возможно, определяется эффектом pH на энергетическую систему клетки и другие процессы. Отмечается, что жгутики дезинтегрируются на субъединицы при кислых значениях pH 3-4 (Weibull, 1948; Stocker and Campbell, 1959).Adler (1973) определил оптимум pH также для хемотаксиса Е. coli: pH 69,5. Уменьшение таксиса при pH ниже 6 отражает соответствующее снижение подвижности, при pH 4 бактерии полностью неподвижны, но способны к росту.

Исследования по отрицательному хемотаксису Е. coli (Tso and Adler, 1974) показали, что условия кислого и щелочного pH вызывают репеллентный ответ у бактерий, пределы жизнеспособности находятся между pH 4,5 и 9,6; пределывоздействия на скорость клеточного роста рН 4,5 и 8,5; эффект на подвижность отмечался при рН 4 и 8,5; предельные значения рН, вызывающие реппелентный ответ: рН 6,5 и 7,5.

Первой возможностью для противостояния неблагоприятным условиям рН является минимизация проницаемости клеточной мембраны, предотвращение ввода или потери протонов, в зависимости от рН. Известно, что жгутиковые моторы Е. соП и 5. 1урЫтигтт функционируют за счет энергии трансмембранного протонного потенциала, таким образом, кажется очевидной необходимость остановки их функционирования для предотвращения дополнительного ввода протонов в клетку, вызванное функционированием жгутика.

Другим решением проблемы является улучшение буферных свойств цитоплазмы. Бактерии также способны модифицировать рН за счет метаболической активности. Так, катаболизм Сахаров или спиртов приводит обычно к уменьшению внешнего рН, тогда как катаболизм органических кислот или аминокислот приводит к повышению рН. Однако эти процессы зависят от наличия в среде соответствующих субстратов и являются неконтролируемыми результатами метаболизма.

В противоположность этому, системы декарбоксилирования аминокислот индуцируются в ответ на кислые значения рН, и их функционирование приводит к увеличению рН. В Е. соП эти системы включают системы лизиндекарбоксилазы (в диамин кадаверин), глутаматдекарбоксилазы и аргининдекарбоксилазы (Беагеоп <Я а1,1997).

Отмечается также важность систем активного транспорта ионов для поддержания рН, например, антипортерные системы протона и иона калия при кислых рН для удаления протонов из клетки.

Сенсорная система для восприятия концентрации протонов остается неизвестной. Предполагается существование нескольких систем для восприятия изменений во внешнем и внутреннем рН. Обсуждается возможность прямой детекции внешнего рН белками,.имеющими периплазматический домен, такими как регулятор ТохЯ V. с!ю1егае или регулятор лизиндекарбоксилазы СаёС Е. соП. Ы-концевой домен этого связанного с мембраной белка близок поаминокислотной последовательности соответствующему домену ToxR, предполагается, что периплазматический домен CadC способен детектировать внешний рН. Интересно отметить, что регулятор ToxR играет двойную роль, являясь активатором вирулентных генов при кислых рН и, как предполагается, ингибитором подвижности.

С другой стороны, должны существовать цитоплазматические белки, способные измерять внутриклеточный рН. Значения внешнего рН могут измеряться также не напрямую, через изменения во внуриклеточных значениях рН. Изменения во внуриклеточных значениях рН в пределах от 6,5 до 7,5 должны напрямую вызывать конформационные изменения ДНК в регуляторных районах. Например, Htun и Dahlberg (1988) показали образование стабильных триплексов Н-ДНК при кислых значениях рН, причем при понижении рН до 4 теряется необходимость высоких уровней суперскрученности для поддержания данных структур ДНК. В других работах (Stim and Bennett, 1993; Karem and Foster, 1993) сообщается о важности изменений топологии ДНК, вызванных понижением рН, в регуляции экспрессии генов, индуцируемых условиями кислого рН. Так, важным компонентом зависимой от рН регуляции гена adi аргининдекарбоксилазы Е. coli (Stim and Bennett, 1993) является уровень суперскрученности ДНК. В случае регулируемого рН гена aniG S. typhimurium (Karem and Foster, 1993) показано, что изменения рН среды приводят к конформационным изменениям операторной структуры ДНК, таким образом связывая контроль экспрессии данного гена внешним рН с эффективностью связывания репрессора данного гена ЕагА с регуляторной областью гена aniG. Интересно отметить, что ген aniG находится под контролем многокомпонентной системы регуляторов, включая H-NS, цАМФ-САР, ДНК гиразу, специфический репресор ЕагА, подобно многокомпонентной сети контроля экспрессии генов жгутиковой системы.

Необходимо отметить роль H-NS в бактериальных ответах на кислый рН. Мутации в гене hns приводят к дерепрессии системы cad и adi, лизин- и аргининдекарбоксилазы, соответственно при нейтральных рН (Slonczewski and Foster, 1996).

Следует различать эффекты на экспрессию генов от физиологических ответов, таких как хемотактические, в которых изменения в рН или концентраций слабых кислот и оснований детектируются хеморецепторами, не затрагиваяэкспрессии генов.

Несмотря на имеющиеся данные по эффектам кислого рН среды на подвижность в основном на уровне физического разрушения компонентов жгутикового аппарата, было бы очевидным предположить необходимость ответа на уровне синтеза жгутиковых компонентов, для предотвращения необоснованных затрат энергии для такого дорогостоящего процесса, каким является синтез этих органелл. Наши данные подтверждают это предположение.

Исследование механизма регуляции подвижности на примере температурных эффектов в Yersinia enterocoliticaКак отмечалось ранее, Adler и Templeton (1967) определили температурный оптимум для подвижности Е. coli около 25-37 градусов С, с потерей подвижности при 42 градусах С. Мутации, приводящие к сохранению подвижности при повышенных температурах были локализованы в локусах flhDC и fliA (Silverman and Simon, 1977).

В другой грамотрицательной бактерии У. enterocolitica также наблюдается ингибирование подвижности при повышенной температуре, кроме того имеются некоторые данные об исследовании механизма терморегуляции в этой бактерии (Rohde et al, 1994; Kapatral and Minnich, 1995; Kapatral et al, 1995; Rhode et al, 1999). Y. enterocolitica способна расти в широком температурном диапазоне от 4 до 42 градусов С с оптимумом при 28 градусах С. Температура оказывает сильное влияние на морфологию и физиологию этой бактерии. При температуре ниже или равной 30 градусов С клетки растут как единичные подвижные коккобациллы с перитрическим жгутикованием; при повышении температуры до 37 градусов и выше клетки теряют жгутики и формируют короткие неподвижные формы, требующие Ca для роста. Многие штаммы патогенных бактерий подвижны только при пониженных температурах и неподвижны при повышенных: Listeria monocytogenes (Peel et al, 1983), Bordetella bronchiseptica (Akerley et al, 1992; Akerley and Miller, 1993), Legionella pneumophila (Ott et al, 1991), Y. enterocolitica и Yersinia pseudotuberculosis.го: У '¿"у,'j,j; Механизм терморегуляции остается неясным. Предполагается, что терморегуляция в Y. enterocolitica осуществляется посредством изменения уровня суперскрученности ДНК (Rhode et al, 1994). Kapatral и Minnich (1995) показали, что транскрипция трех генов флагеллинов fleABC координированно репрессируется сразу после помещения клеток в условия с повышенной температурой в 37 градусов С, при обратном переносе неподвижных клеток из условий с 37 до 30 градусов С транскрипция генов флагеллинов восстанавливается только после двух клеточных поколений. В другой работе Kapatral с сотр. (1996) показали, что транскрипция генов JliA и flgM также репрессируется немедленно при повышении температуры до 37 градусов С. В другой публикации Rhode с сотр. (1999) предполагают вовлеченность третьего компонента - наличия локальных изогнутых структур в ДНК, вместе с участием гистоноподобного белка YmoA (Cornelis et al, 1991) и уровня суперскрученности ДНК в зависимый от топологии ДНК механизм терморегуляции экспрессии генов в Y. enterocolitica.

Влияние уровня суперскрученности ДНК на бактериальнуюподвижностьИз вышесказанного следует, что многие факторы окружающий среды, воздействующие на подвижность, также влияют на топологию ДНК, например, высокие концентрации солей, осмолярность, рН среды, температура. Во многих случаях предложен механизм воздействия этих условий на экспрессию генов посредством изменения топологии ДНК. Кроме того, непосредственная вовлеченность топологии ДНК в регуляцию бактериальной подвижности подтверждается данными по воздействию на синтез жгутиков ингибиторов ДНК гиразы налидиксата и новобиоцина (Shi et al, 1993).

Хромосомная ДНК бактериальных клеток находится в отрицательно суперскрученном состоянии. Существует несколько ферментов, способных изменять уровень суперскрученности хромосомной ДНК, такие как ДНК гираза и топоизомераза I (Drlica, 1984). ДНК гираза, состоящая из двух субъединиц, кодируемых генами gyrA и gyrB, вводит отрицательные супервитки в ходе требующего затрат энергии процесса, свойственного только прокариотам. Впротивоположность этому ферменту топоизомераза I является релаксирующим ДНК ферментом, она удаляет отрицательные супервитки по энергетически-независимому механизму. Топоизомераза I кодируется геном topA. Таким образом, противоположное действие этих двух ферментов играет центральную роль в определении уровня суперскрученности бактериальной ДНК. Уровень суперскрученности ДНК in vivo регулируется гомеостатической модуляцией экспрессии генов topA и gyr в ответ на изменение топологии ДНК (Menzel and Geliert, 1983; Tse-Dinh, 1985). Так, промоторы генов gyr ингибируются при повышении уровня суперскрученности и индуцируются при релаксации ДНК (Menzel and Geliert, 1983, 1987). То есть экспрессия генов gyr может отвечать на изменения в суперскрученности на уровне транскрипции и активность гиразы может модулироваться флуктуациями в отношении концентрации АТФ к АДФ. Другие менее охарактеризованные ферменты, такие как топоизомераза III (Dean et al, 1983; Srivenugopal et al, 1984) могут также влиять на уровень суперскрученности ДНК.

Другими факторами, определяющими топологическое состояние бактериальной ДНК, являются такие белки, как IHF (integration host factor), специфичный к последовательности ДНК-связывающий белок, вводящий изгибы в 180 градусов в ДНК и модулирующий функцию многих бактериальных промоторов, а также влияющий на процессы транспозиции, сайт-специфической рекомбинации, репликации ДНК и другие.

Белок H-NS также способен изменять уровень суперскрученности ДНК. Как уже отмечалось ранее, этот ассоциированный с нуклеоидом белок неспецифически связывается с ДНК и модулирует транскрипцию многих генов, а также другие клеточные процессы, такие как сайт-специфическая рекомбинация.

Наряду с H-NS другие ДНК-связывающие белки участвуют в регуляции экспрессии генов системы синтеза жгутиков, такие как гистоноподобный белок HU (Nishida et al, 1997) и фактор инициации репликации DnaA (Mizushima et al, 1997). В случае двух этих белков предложен механизм регуляции подвижности посредством воздействия на топологию ДНК.

Неорганический фосфат необходим для подвижности патогенныхбактерийRashid с сотр. (2000) показали, что мутации в гене ррк, кодирующем полифосфат киназу, бактериальный фермент, необходимый для синтеза polyP из АТР, у 6 различных патогенных бактерий (P. aeruginosa, V. cholerae, S. enterica serovar Typhimurium, S. enterica serovar Dublin, E. coli, К. pneumoniae) приводит к сильному ингибированию подвижности. В Е. coli была предложена роль polyP в регуляции сетей, необходимых для ответов на нехватку питательных веществ и различные стрессы, а также в выживании в стационарной фазе роста. Была также предложена роль polyP в вирулентности некоторых патогенных штаммов. Предполагается возможный эффект polyP на подвижность посредством изменения функционирования жгутика.

Регуляторные белки, участвующие в контроле подвижностиПроцесс координации бактериальной подвижности и хемотаксиса очень сложен и включает многие регуляторные компоненты (Рис. 7). В Е. coli многочисленные мутации приводят к изменению подвижности, в частности, мутации, затрагивающие синтез компонентов бактериальной мембраны, таких как порины (Ingham et al, 1990) и липополисахариды (Parker et al, 1992). Кроме того, было показано, что мутации, затрагивающие уровень белков теплового шока DnaK, DnaJ и GrpE (Shi et al, 1992) или фактора инициации репликации ДНК, DnaA (Mizushima et al, 1997), а также приводящие к модификации фосфолипидного состава мембраны (Shi et al, 1993), приводят к потере подвижности.

Кроме того, было показано, что некоторые регуляторные белки участвуют в контроле подвижности в Е. coli и S1. typhimurium в частности, комплекс САР-цАМФ (катаболический активаторный белок в комплексе с цАМФ) (Silverman and Simon, 1974; Yokota and Gots, 1970) и гистоноподобный белок, структурирующий ДНК, H-NS (Bertin et al, 1994; Hinton et al, 1992). САР-цАМФ положительно и отрицательно регулирует большое число генов различных функций в Е. coli (Busby and Kolb, 1996). Белок H-NS участвует в регуляции экспрессии многих генов, находящихся также под контролем условий окружающей среды, таких как pH, температура и осмолярность (Atlung and Ingmer, 1997). Мутации в гене сгр или hns приводят к полной потере подвижности Е. coli (Bertin et al, 1994; Silverman and Simon, 1974). Однако молекулярный механизм действия этих регуляторов в координации экспрессии генов подвижности остается малоизученным.

Рис. 7 Белки, участвующие в регуляции бактериальной подвижностиКомплекс цАМФ-САРн-шБелки теплового шокаСбгАОшрИ,штЬгрв Р. т1гаЬШ$ТохК, ВуйА8в V. с/ю/егае и В. ЬгопсЫзерИсаОпаАниП8в 5". ПрНушипитH-NSРоль глобального регулятораH-NS (histone-like nucleoid structuring protein) является одним из ДНК-связывающих белков энтеробактерий, присутсвующих в больших количествах в клетке (около 20000 копий на клетку (Spassky, 1984)). Этот нейтральный белок был первоначально выделен около 30 лет назад, как фактор транскрипции (Jacquet, 1971). Позднее было показано, что этот белок также участвует в организации бактериальной хромосомы, влияя на уровень конденсации ДНК (Spassky, 1984). H-NS находится преимущественно в гомодимерной форме (Falconi, 1988) и связывается преимущественно с участками ДНК с изогнутой структурой in vitro (Bracco, 1989; Yamada, 1991; Owen-Hughes, 1992; Jordi, 1997)Структурный ген hns белка H-NS E.coli был идентифицирован в 1988 году (Pon et al, 1988). Несколько лет спустя, несколькими группами был клонирован этот ген, способный комплементировать фенотипически несвязанные мутации (May et al, 1990; Ussery, 1994). Ген hns расположен на 27 минуте на хромосоме Е. coli и кодирует белок из 137 аминокислот с молекулярной массой 15,4 кДа (Falconi, 1988). Мутации в гене hns приводят к модификации уровня экспрессии многих напрямую не связанных между собой генов (Bertin et al, 1990; Higgins et al, 1990; Yamada et al, 1991), которые также часто регулируются параметрами окружающей среды, такими как рН, осмолярность и температура (Atlung and Ingmer, 1997). Кроме того, была предложена важная роль H-NS во многих других биологических процессах, таких как репликация, рекомбинация и транспозиция (Ussery, 1994).

Регуляция экспрессии гена hns АвторегуляцияБыло показано, что экспрессия гена hns подвержена отрицательной саморегуляции на уровне транскрипции (Falconi, 1993; Ueguchi, 1993),позволяющей поддерживать на постоянном уровне отношение количества H-NS к ДНК при нормальных условиях роста. Существуют данные также о регуляции синтеза H-NS в зависимости от фазы роста.

Холодный шокСинтез H-NS индуцируется в условиях ответа на шок при низких температурах (LaTeana, 1991), например, при резкой смене температуры с 37 до 10 градусов С. Индукция синтеза H-NS зависит от белка холодного шока CspA (Brandi, 1994).

Одной из главных ролей H-NS является модуляция экспрессии большого числа генов, продукты которых вовлечены в самые разнообразные биологические процессы. В большинстве случаев H-NS ингибирует транскрипцию генов, и мутации в гене hns приводят к увеличению уровня синтеза продуктов регулируемых генов (Atlung and Ingmer, 1997).

Сравнительный анализ результатов двумерного электрофореза белков показал существование не только репрессии, но и активации экспрессии генов белком Н-NS (Bertin et al, 1990; Bertin et al, 1994; Yamada et al, 1991). Была показана положительная роль H-NS в регуляции мальтозного оперона Е. coli (Johansson et al, 1998). К такой группе относятся также гены синтеза жгутиков. Было показано, что мутации в гене hns затрагивают подвижность S. typhimurium (Hinton et al, 1992). Bertin с сотр. (1994) продемонстрировали, что белок H-NS необходим для синтеза жгутиков Е. coli. Многие гены, которые отрицательно регулируются Н-NS, также регулируются в ответ на изменение факторов окружающей среды, таких как осмолярность, температура, анаэробиоз, pH или фаза роста. Кроме того многие гены также находятся под положительным контролем таких транскрипционных факторов, как Lrp, CfaD, VirB и FIS (Atlung and Ingmer, 1997).

Структурные данныеДанные по характеризации мутантов и по мутагенезному анализу предполагают, что белок H-NS состоит из двух доменов: С-концевой домен (аминокислотныеостатки 91-137) отвечает за связывание с ДНК и N-концевой домен - за димеризацию белка (Ueguchi et al, 1996; Williams et al, 1996).

Было показано, что С-концевой фрагмент из 47 аминокислот способен связывать ДНК, однако с меньшим сродством, чем полный белок (Shindo et al, 1995). Трехмерная структура С-концевого домена, определенная0 с помощью метода ЯМР (Shindo et al, 1995), уникальна и не имеет гомологов в структурах других ДНК-связывающих белков.

Фрагмент, содержащий 60 N-концевых аминокислот, способен к димеризации с интактным H-NS in vitro (Williams, 1996). К настоящему времени нет структурных данных по этой части бежа, но по предсказанию возможных структур предполагается, что этот домен имеет высокое содержание альфа-спиральных структур (Ussery, 1994), что согласуется с его ролью в белок-белковых взаимодействиях.

Изоэлектрическая точка H-NS, рассчитанная по аминокислотной последовательности равна 5,1. В клетках дикого типа были идентифицированы три изоформы белка с разными значениями pi (Spassky, 1984), две доминирующие формы имеют pi 7,5 и 6,5. Все изоформы способны связываться с ДНК (Spassky, 1984), и являются продуктами гена hns (Ussery, 1994), что предполагает возможность посттрансляционных модификаций белка H-NS.

Гомологи H-NS в других бактерияхАминокислотные последовательности H-NS высоко консервативны среди энтеробактерий (Atlung and Ingmer, 1997), а также в близкородственных бактериях Erwinia chrysanthemi (GenBank accession number X89444) и Haemophilus influenzae (Fleischmann, 1995). Кроме того, белок StpA с на 57% идентичной последовательностью к H-NS был охарактеризован в Е. coli (Zhang, 1996). Вне этих групп к недавнему времени был охарактеризован только один H-NS-подобный белок ВрНЗ в бактерии Bordetella pertussis, которая принадлежит к более удаленной группе (Goyard and Bertin, 1997). Авторы работы по H-NS-подобным белкам (Bertin et al, 1999), основываясь на теоретических и экспериментальных данных, показали существование обширного семейства функционально и структурно родственных H-NS-подобных белков (Рис. 8).

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Сутурина, Ольга Александровна

V. Заключение и выводы

Подвижность играет важную роль в процессах бактериальной адаптации к условиям окружающей среды, в процессах колонизации, образования биофильмов, а также вирулентности патогенных бактериальный штаммов. Процессы бактериальной подвижности и хемотаксиса находятся под строгим контролем сложной многокомпонентной регуляторной сети. Несмотря на многолетние исследования молекулярный механизм регуляции синтеза жгутиков остается неизвестным, даже у таких хорошо изученных микроорганизмов, какими являются Е. coli и S. typhimurium. Так, около 30 лет назад была предложена роль комплекса цАМФ-САР в регуляции подвижности Е. coli и S. typhimurium (Silverman and Simon, 1974; Yokota and Gots, 1970). Однако не было приведено экспериментальных доказательств этой гипотезы, ни молекулярного механизма действия этого регулятора. Подобным образом, положительная роль гистоноподобного белка H-NS в подвижности остается загадкой. Кроме того, остаются нерешенными вопросы, каким образом факторы окружающей среды способны влиять на подвижность и синтез жгутиков.

Полученные результаты позволяют частично ответить на поставленные вопросы о механизме регуляции системы подвижности в Е. coli. Более того получены интересные данные по сравнению регуляции подвижности факторами окружающей среды и по компонентам регуляторных каскадов различного типа жгутикования на примере отличных от лабораторных, природных грамотрицательных бактериальных штаммов, выделенных из уникальной экосистемы озера Байкал.

Как уже подчеркивалось ранее, следует отметить множественность уровней регуляции подвижности и в частности регуляции энтеробактериального жгутикового оперона flhDC на вершине каскада, примерами которых является исследованный в данной работе транскрипционный контроль или обнаруженный недавно посттранскрипционный контроль с участием белка CsrA (Рис. 34) (Romeo, 1998 ; Wei et al, 2001). Этот строгий контроль выражается например в очень короткой продолжительности жизни транскрипта flhDC в Е. coli (Wei et al, 2001), а также белков FlhD и FlhC в P. mirabilis (Claret and Hughes, 2000). Контроль бактериальной подвижности таким образом чрезвычайно чувствителен к флуктуациям количества регуляторов FlhD и FlhC. Так, уменьшение уровня экспрессии оперона flhDC в 2-3

Рис. 34 Регуляция жгутикового оперона flhDC

Факторы окружающей среды Q (рН, осмолярность, новобиоцин)

Оперон flhDC

Суперскрученность Стабильность регуляторной области

Факторы окружающей среды (температура)

Деградация в P. mirabilis

Белки FlhD/FlhC

Контроль синтеза жгутиков

раза, наблюдаемое в большинстве случаев регуляции подвижности факторами окружающей среды (Shi et al, 1993) или белками DnaK (Shi et al, 1992), DnaA (Mizushima et al, 1997) и HNS (Soutourina et al, 1999), достаточно, чтобы заблокировать синтез жгутиков. Другие уровни контроля жгутиковых регуляторных генов должны быть исследованы в будущем. Например, поиск белковых партнеров по сродству к специфическим мотивам РНК позволит возможно прояснить участие различных факторов в регуляции оперона flhDC на посттранскрипционном уровне.

Что касается понимания молекулярного механизма действия белка H-NS в различных процессах бактериальной физиологии, множество вопросов остаются к настоящему времени нерешенными. Можно ли рассматривать этот белок как регулятор транскрипции генов или только как архитектурный компонент комплексов с ДНК? Почему экспрессия только части генов чувствительна к присутствию H-NS, тогда как других нет? Что определяет специфичность действия этого белка: топология ДНК в районах генов под контролем H-NS или белковые факторы, взаимодействующие с H-NS? В большинстве описанных к настоящему времени случаев модуляции экспрессии генов, H-NS действует вместе с другими регуляторами, возможно в форме многокомпонентных нуклеопротеиновых комплексов. В некоторых случаях H-NS противодействует специфическим активаторам, иногда другие белковые компоненты способны стабилизировать комплекс H-NS с ДНК или влиять на связывание с регуляторными областями. С другой стороны встает вопрос о возможности действия белка H-NS посредством взаимодействия с РНК. Следует отметить, что в случае регуляции жгутикового оперона flhDC не было обнаружено посттранскрипционных эффектов мутации в гене hns ни на уровне стабильности соответствующих мРНК, ни на уровне экспрессии репортерного гена под контролем соответствующей регуляторной области. С другой стороны, нельзя исключить возможную роль белка H-NS в контроле бактериальной подвижности на других регуляторных уровнях, за пределами контроля экспрессии flhDC. Например, H-NS возможно действует также на уровне функционирования жгутикового мотора посредством взаимодействия с белком FliG (Donato and Kawula, 1998). H-NS возможно играет роль также на других уровнях жгутикового регуляторного каскада, взаимодействуя с некоторыми специфическими РНК. Для идентификации таких нуклеопротеиновых или многокомпонентных белковых комплексов с участием H-NS может быть полезным использование методов выделения взаимодействующих белков в комплексе с помощью тандемной аффинной хроматографии или методов «двойных» или «тройных гибридов».

Вовлеченность белков родственных H-NS в системах регуляции бактериальной подвижности достаточно обширна. Нами были идентифицированы белки типа H-NS в трех штаммах грамотрицатеоьных бактерий, выделенных из естественной среды обитания: два регулятора гомологичные H-NS и StpA в Enterobacter 22, новый регулятор с отдаленной первичной структурой в Pseudomonas Y1000 и гомологичный H-NS белок в Acinetobacter sp. Положительный эффект H-NS в контроле подвижности Е. coli (Bertin et al, 1994), а также других энтеробактерий 5. typhimurium (Hinton et al, 1992) и E. chryzanthemi (Nasser et al, 2001), и вовлеченность белка семейства H-NS в положительном контроле синтеза полярных жгутиков V. cholerae (Tendeng et al, 2000) предполагает участие этих белков в контроле подвижности разных бактерий с системами латеральных и полярных жгутиков (Рис. 35). С другой стороны, выявление белка типа H-NS в неподвижном штамме Acinetobacter sp., способного комплементировать отсутствие подвижности в мутантном штамме hns Е. coli, показывает функциональный консерватизм в активации подвижности. Исследование структуры и функции этих регуляторов позволит получить важную информацию о механизмах адаптации к условиям окружающей среды и должно расширить наши знания о роли белков семейства H-NS в различных микроорганизмах.

Сравнительный анализ последовательностей регуляторных областей гомологичных flhDC оперонов выявил присутствие в разных энтеробактериях продолжительных нетранслируемых областей между сайтом начала транскрипции и инициирующим кодоном трансляции, однако без консервации ни нуклеотидной последовательности, ни вторичной структуры (Рис. 16). Таким образом можно предположить вовлеченность этой области в процесс контроля подвижности в разных микроорганизмах, даже если детали этого регуляторного механизма могут варьировать в разных бактериях. Сравнение эффектов уровня суперскрученности ДНК в других грамотрицательных бактериях, в частности в бактериях с латеральными и полярными жгутиками, показало, что механизмы с вовлечением локального уровня суперскрученности ДНК и нетранслируемой области могут быть общими в организмах с различной организацией регуляторных каскадов синтеза жгутиков (Soutourina et al, 2001).

Общий сравнительный анализ бактериальных жгутиковых систем подчеркивает присутствие одновременно сходных черт и значительных различий (Рис. 35). Например, системы полярных и латеральных жгутиков отличаются по вовлеченности специфических ст факторов и транскрипционных активаторов, по функционированию и эффективности жгутиковых моторов. Так следует отметить вовлеченность а 54 и соответствующих

Рис. 35 Регуляториые каскады синтеза жгутиков

Латеральные

Enterobacteriaceae

Enterobacter 22

Регуляториые белки: H-NS, cAJViF-CAP, CsrA

Факторы окружающей среды

Фаза роста

Полярные

Pseudomonas aeruginosa/ Vibrio cholerae

Pseudomonas Y1000

Регуляториые белки типа H-NS

Класс I Оперон ßhDC

Активаторы FlhD7FlhC2

Клеточное деление, транскрипционный контроль других процессов

Экспорт факторов вирулентности

Класс I ßeQ/ßrA

Активаторы а54

FleQ Контроль адгезии

Класс II ßiA

фактор

Экспортный аппарат

Класс II ОперонßeSR/ßrBC Двухкомпонентная система ßiA, ст2* фактор Fl г С -> Клеточное деление

1 ст28 t Класс III ßiC/ßaA Жгутиковый филамент

Класс III ßiC

Жгутиковый филамент

Класс IV flaB, С, А Е

Дополнительные флагеллины

активаторов в регуляторную систему полярных жгутиков, в дополнение к специфическому жгутиковому фактору а 28, который также участвует в каскаде латеральных жгутиков. Мотор латеральных жгутиков использует энергию градиента протонов, тогда как мотор полярных жгутиков например V. cholerae использует энергию градиента ионов натрия. Отличия в эффективности моторов выражаются в разных скоростях вращения около 15000 или 100000 вращений в минуту, соответственно. Несмотря на эти различия, обе системы имеют функциональные сходные черты. Во-первых, жгутиковые гены организованы в координированный каскад со специфическими регуляторами на вершине. Такая иерархическая организация предполагает, что первый уровень представляет собой важную мишень для регуляции внешними факторами, даже если они и различны для разных систем. Так, в С. crescentus это сигналы клеточного цикла, а в энтеробактериях это факторы окружающей среды. Наши результаты (Soutourina et al, 2001) предполагают, что условия окружающей среды влияют на подвижность сходным образом в бактериях рода Enterobacter и Pseudomonas, имеющих разные типы жгутиков. Во-вторых, регуляция жгутиковых генов связана с клеточным циклом. Так, в Е. coli и С. crescentus (Pruss and Matsumura, 1997 ; Wu and Newton, 1997) биосинтез жгутиков ассоциирован с клеточным делением. Экспрессия жгутиковых генов зависит от фазы роста в Е. coli, причем максимум экспрессии регуляторного оперона первого класса наблюдается в середине логарифмической фазы роста. Кроме того Pruss и Matsumura (Pruss and Matsumura, 1996) показали, что FlhD является регулятором клеточного деления в Е. coli. Подобно этому, регуляторный белок системы полярных жгутиков FlrC возможно влияет на клеточное деление в V. cholerae (Klose and Mekalanos, 1998). Данные, представленные в настоящей работе, предполагают, что транскрипция регуляторных генов на вершине каскада также зивисит от фазы роста в штаммах Enterobacter sp. и Pseudomonas sp.

Сравнительный анализ с одной стороны между лабораторными и природными бактериальными штаммами и с другой стороны между бактериями с разными типами жгутиков необходим для понимания общих механизмов контроля подвижности и их развития в ходе эволюции. Кроме того, подвижность является одним из факторов вирулентности, поэтому исследование механизмов ее регуляции в разных условиях окружающей среды может быть полезным для понимания этого процесса в патогенных бактериях. В более общем смысле, координация экспрессии генов в составе сложных регуляторных сетей очень широко распространена как в прокариотах, так и в эукариотах.

Такие системы регуляции часто организованы сходным образом в разных организмах со специфическими регуляторами на вершине иерархии, что позволяет интеграцию внешних сигналов для адекватных клеточных ответов. Так прокариотические системы могут служить общими моделями для сложных процессов регуляции экспрессии генов. С этой точки зрения исследование биосинтеза жгутиков, вовлекающего многие компоненты бактериальной физиологии может служить хорошей моделью для понимания общего функционирования регуляторных сетей.

Полученные результаты позволяют сделать следующие выводы:

1. Исследование роли белков H-NS и САР в регуляции подвижности Е. coli показало, что

1) Оба регулятора осуществляют контроль синтеза жгутиков на уровне оперона flhDC, расположенного на вершине регуляторного каскада;

2) Комплекс цАМФ-САР активирует напрямую транскрипцию flhDC, связываясь с консенсусной последовательностью в промоторной области и взаимодействуя посредством первого регуляторного района с РНК полимеразой;

3) Для положительного эффекта H-NS необходимо присутствие полной регуляторной области, включающей 5'- нетранслируемую область flhDC.

2. Сравнительный анализ бактериальных последовательностей регуляторных областей оперонов, гомологичных flhDC Е. coli выявил :

1) присутствие во всех рассмотренных организмах протяженной области между точкой начала транскрипции и ATG инициирующим кодоном, длина которой варьирует от 197 до 261 п.о.;

2) консерватизм на уровне сайтов связывания САР, промоторных элементов в позициях -10 и -35, старта транскрипции, сайта связывания рибосом и ATG инициирующего кодона.

3. Глобальный анализ физиологических изменений в мутантном по гену hns штамме с использованием современных методов двумерного электрофореза белков и гибридизации на мембранах высокой плотности выявил:

1) важную роль белка H-NS в процессах, связанных с ответами на изменение условий окружающей среды, в частности, условий стресса кислого pH и высокой ионной силы;

2) высокое положение H-NS в иерархии регуляции бактериальной физиологии и возможный непрямой механизм действия посредством других специфических регуля торных факторов.

4. Анализ спонтанных ревертантных штаммов показал возможность существования координированной регуляции процессов подвижности и бактериальных ответов на условия кислого pH. Более того показано действие условий кислого pH в ингибировании

подвижности на уровне синтеза жгутиковых компонентов и в частности роль 5'-нетранслируемой области flhDC, подобно положительному эффекту H-NS. Предложен возможный механизм действия этих условий, а также белка H-NS на бактериальную подвижность посредством влияния на уровень суперскрученности ДНК.

5. Анализ регуляции подвижности в разных условиях окружающей среды природных байкальских грамотрицательных бактерий показал, что одни и те же факторы сходным образом влияют на подвижность бактерий с двумя разными типами регуляторного каскада для перитрического и полярного жгутикования, предложена общность регуляторных механизмов. Были охарактеризованы компоненты регуляции подвижности байкальских бактерий. С помощью молекулярных подходов были выявлены регуляторы на вершине каскада: FlhDC для Enterobacter 22 и FleQ для байкальской псевдомонады Y1000, а также Н-NS-подобные белки H-NS и StpA Enterobacter 22, новый регуляторный функционально родственный H-NS белок Y1000, H-NS-подобный белок в неподвижном штамме Acinetobacter 20. Структурный и функциональный анализ обнаруженных регуляторов позволит получить важную иформацию о механизмах бактериальной адаптации к условиям окружающей среды.

VI. Материалы и методы

Условия культивирования бактериальных штаммов

Штаммы Е. соП культивировались в среде ЬВ (Ьипа-ВеЛаш), в триптоновой среде, минимальных средах М9 или М63 с добавлением при необходимости 0,1% казаминокислот, 0,4% сукцината натрия, 0,4% глицерина или 0,4% глюкозы в качестве источника углерода.

Там где требовалось, антибиотики были добавлены в следующих концентрациях: хлорамфеникол 20 мкг/мл, канамицин 20 мкг/мл, ампициллин 50 мкг/мл, стрептомицин 50 мкг/мл, тетрациклин 15 мкг/мл.

Все эксперименты проводились в соответствии с Европейскими нормами использования генетически модифицированных организмов группы I и II.

Тест на бактериальную подвижность в полужидкой среде

Для измерения бактериальной подвижности использовались чашки с 25 мл полужидкой триптоновой среды, содержащей 1% Бакто-триптон, 0,5% ЫаС1 и 0,3% Бакто-агар. Для анализа подвижности в условиях кислого рН использовалась среда при рН 4,6, содержащая 0,5% Бакто-агар.

Тест на способность использования Р-глюкозида

Метаболизм Р-глюкозидов анализировался на индикаторных чашках МакКонки, содержащих 1% салицин в качестве источника углерода.

Выделение РНК

Общая РНК была выделена из 4 мл бактериальной культуры при оптической плотности 0,4 - 0,5 при 600 нм с использованием набора «High Pure RNA isolation kit (Boehringer Mannheim)». Чистота и концентрация РНК была определена по измерению оптической плотности при 260 и 280 нм.

Для анализа уровня экспрессии жгутиковых регуляторных генов в байкальских штаммах общая РНК была выделена из 20 мл культуры в минимальной среде М9 с добавлением 0,1% казаминокислот или в триптоновой среде при оптической плотности 0,3 при 600 нм с использованием системы FastPrep (Bio 101 Savant) и раствора Trizol (Gibco BRL).

Мечение зондов и олигонуклеотидов

Нерадиоактивномеченый ДНК зонд для выявления уровня мРНК, соответствующий 651 н. части кодирующей области гена fliC, был получен при ПЦР амплификации соответствующего фрагмента с олигонуклеотидными праймерами 5'-САТТААТАССААСAGCCTCTCGC-3' и 5'-ATTGAAGCTGGGTTAGTTCCGCC-3' при использовании набора мечения диоксигенином « PCR DIG Probe synthesis kit (Boehringer Mannheim)».

Олигонуклеотиды, использованные в экспериментах по футпринтингу и по определению точки начала транскрипции, были радиоактивно помечены с

использованием полинуклеотид-киназы фага Т4 и (у- Р)-АТФ согласно стандартным методикам (Sambrook et al, 1989).

Количественный анализ мРНК

ПЦР амплификация и клонирование

Плазмида pDIA525, использованная для экспериментов по задержке электрофоретической подвижности фрагментов ДНК в комплексе с белками и для транскрипции in vitro, была сконструирована с помощью ПЦР амплификации следующим образом. Фрагмент ДНК, содержащий промоторную область flhDC, был получен в ходе ПЦР амплификации с праймерами 01 и 02 (Рис. 11) на геномной ДНК штамма Е. coli дикого типа. Полученный фрагмент ПЦР в 308 п.о. был очищен с помощью набора « High Pure PCR purification kit (Boehrihger Mannheim)» и клонирован в плазмиду pSR (производная плазмиды pBR322, S. Rimsky) между рестрикционными сайтами ЕсоШ и Hindill.

Плазмида pDIA528 была сконструирована клонированием пободного фрагмента ДНК в вектор рКК232-8 (Pharmacia) для анализа промоторной активности с помощью репортерного гена cat, после ПЦР амплификации с праймерами 01' и 02 (Рис. 11). Праймер 01' содержит рестрикционный сайт ВатШ вместо EcoRl в 01. Плазмида pDIA545 была сконструирована с помощью ПЦР амплификации полной регуляторной области flhDC с праймерами 01' и 03 (Рис. 11). Полученный фрагмент в 435 п.о. был клонирован в плазмидный вектор рКК232-8 (Pharmacia). Плазмида pDIA546 была сконструирована клонированием фрагмента в 423 п.о. между сайтами ВатШ/Nsil содержащего регуляторную область flhDC плазмиды pDIA545, в вектор pJCDOl для транскрипции in vitro. Фрагмент был выделен из агарозного геля с помощью набора JETsorb (GENOMED).

Плазмида pDIA551, использованная в экспериментах по определению точки инициации транскрипции и содержащая промоторную область и часть кодирующей области flhDC, была сконструирована ПЦР амплификацией фрагмента в 1048 п.о. с праймерами 01' и 04. Полученный фрагмент был клонирован в сайты ВатШ и Я/жИИ плазмиды рКК232-8.

Плазмида pDIA559 для анализа промоторной активности fliC была сконструирована ПЦР амплификацией промотора fliC с праймерами 5'-GGG ATCCGT AAAACGAAT ACCGGG-3' и 5'-

СССAAGCTTGGTATTAATGACTTGTGCC-3'. Полученный фрагмент ДНК в 276 п.о. был клонирован в сайты ВатШ и Hindill плазмиды рКК232-8.

Вырожденные праймеры 5' - AAACTCTTGCTGATTG ASGACRAT-3' и 5'-С ATG YYGT А YTTGCGC АТСТТСТС-3', выбранные на основе специфических консервативных областей гомологичных генов регуляторов первого класса каскада полярных жгутиков, были использованы для ПЦР амплификации гомологичного fleQ гена в байкальском штамме Pseudomonas Y1000.

Плазмида pDIA575 была сконструирована в ходе ПЦР амплификации фрагмента flhDC с праймерами 5'-GCTCTAGAGAAATGAGCGTGAGGCACTTTATGG-3' и 5'-CCGCTCGAGGAATGATTGACCGGAAAATGCGGGG-3' на хромосомной ДНК байкальского штамма Enterobacter 22. Полученный фрагмент ДНК в 1481 п.о. был клонирован в сайты Xbal и Xhol вектора pBBRl-MCS-3.

Плазмида pDIA576 была сконструирована в ходе ПЦР амплификации фрагмента fleQ с праймерами 5'-GCTCTAGATGCGTTGCGCGATAACCTTGAGG-3' и 5'-CCGCTCGAGGTGCTCTCTCGCTTGGCTGACCG-3' на хромосомной ДНК байкальского штамма Pseudomonas Y1000. Полученный фрагмент ДНК в 1922 п.о. был клонирован в сайты Xbal и Xhol вектора pBBRl-MCS-З. Для экспрессии fleQ плазмида pDIA576 была введена в ходе конъюгации в штамм Pseudomonas Y1000 из штамма Е. coli SM10.

Эксперименты по задержке электрофоретической подвижности фрагментов ДНК в комплексе с белками

Плазмида pDIA525, содержащая промоторную область flhDC, была обработана ферментами рестрикции ЕсоШ, Hindlll, Ndel и Sspl. Полученные фрагменты ДНК (100 нг) инкубировались с белком H-NS в течение 15 минут при комнатной температуре в

описанном ранее буфере (Goyard and Bertin, 1997). ДНК-белковые комплексы были проанализированы электрофорезом в 3% агарозном геле (агароза MetaPhor) в буфере Трис-борат-ЭДТА. Сходные экспериментальные условия были использованы в случае анализа связывания белка САР за исключением того, что реакционная смесь и электрофоретический буфер содержали 200 мкМ цАМФ.

Определение точки инициации транскрипции

Для определения точки начала транскрипции flhDC байкальского штамма Enterobacter 22 и fleQ байкальского штамма Pseudomonas Y1000 реакции обратной транскрипции были проведены с 10 и 20 мкг РНК, соответственно, с радиоактивно мечеными по 5'-концу олигонуклеотидными праймерами Е1 и Y1 или Y2 (Рис. 32). Реакции секвенирования были проведены на плазмидной ДНК pDIA575 или pDIA576. Интенсивность полос для определения уровня экспрессии была определена после

сканирования соответствующих пленок Hyperfilm-MP (Amersham) с использованием сканера JX-330 SHARP с последующей количественной обработкой данных с использованием программы PDI PDQuest на компьютерной системе SUN.

Анализ футпринтинга

Транскрипция in vitro

Определение активности репортерного гена сШ

Выделение геномной ДНК

Прямое секвенирование геномной ДНК

Построение геномной библиотеки Е. coli и других бактериальных штаммов

среде и использовано для выделения плазмидной ДНК с использованием набора JetStar (Genomed).

Тест устойчивости к условиям высокой осмолярности

Тест устойчивости к кислому pH

Двумерный электрофорез белков

Белковые экстракты были проанализированы с помощью двумерного электрофореза согласно процедуре, описанной ранее (Laurent-Winter et al, 1997). Белковые экстракты были приготовлены из клеток Е. coli, выращенных до оптической плотности 0,6 при 600 нм, и 50 мкг было нанесено на гель для изоэлектрофокусировки, содержащий амфолины с pH от 3,5 до 10 (Millipore). Электрофорез во втором направлении был проведен в 12,5% акриламидном геле. Детекция белков проводилась с помощью окраски нитратом серебра. Анализ гелей и количественная обработка интенсивности зон, соответствующих отдельным белкам, были проведены с помощью пакета программ Melanie II software (Bio-Rad). Зоны для отдельных белков были вырезаны из геля, обработаны трипсином, очищены с использованием Zip Tips CI8 (Millipore) и элюированы 50% ацетонитрилом. Спектры MALDI-TOF пептидов были получены с помощью масс спектрометра STR-DE (Perspective Biosystems) с использованием 2,5-

дигидроксибензойной кислоты в качестве матрицы. Белки были идентифицированы сравнением спектров с базами данных (SWISSPROT, Trembl, GenBank) с использованием серверов интернет ProFound, Peptident, MS-Fit (http://prowl.rockefeller.edu/cgi-bin/ProFound, http://www.expasy.ch/tools/peptident.html, http://pTQspector.ucsf.edU/ucsfhtml3.2/msfit.htm).

N-концевые фрагменты белков были просеквенированы в лаборатории микросеквенирования белков в Институте Пастера в Париже.

Гибридизация на мембранах высокой плотности

Для проведения гибридизации использовались мембраны высокой плотности (Panorama Е. coli gene arrays, Sigma-GenoSys Biotechnologies). Прегибридизация и

гибридизация проводилась согласно рекомендациям изготовителя. Гибридизация и этапы промывки проводились с использованием раствора SSPE (0,18 M NaCl, 10 мМ ЫаНгРОд, 1 мМ ЭДТА, рН 7,7). Прегибридизация мембран проводилась в 15 мл раствора для гибридизации (5xSSPE, 2% додецил сульфат натрия, 1х реактив Денхардта, 100 мкг/мл ДНК спермы лосося) в рулоне с перемешиванием при вращении, и гибридизация проводилась в течение 16 часов в 10 мл раствора для гибридизации, содержащего кДНК зонды. Мембраны промывались в растворе 0,5xSSPE, 0,2% додецил сульфат натрия, слегка просушивались на бумаге Ватман, оборачивались и герметично закрывались в прозрачную пленку Saran 25 мкм (Dow). Экспозиция мембран проводилась с экраном Phosphorlmager (Molecular Dynamics) в течение 22 часов. Для повторного использования мембраны обрабатывались в кипящем буфере (10 мМ Трис, рН 7,6, 1 мМ ЭДТА, 1% додецил сульфат натрия) четыре раза по 15 минут и хранились при комнатной температуре в запаяных пластиковых упаковках в 20 мл 0,5х SSPE, 0,2% додецил сульфат натрия. Одна мембрана использовалась до 10 раз.

После экспозиции экраны Phosphorlmager сканировались на аппарате 445SI PHosphorlmager (Molecular Dynamics) с разрешением в 177 мкм. Интенсивность сигнала на полученном файле в формате TIFF была определена с помощью пакета программ XDOTSREADER (Cose) и проанализирована с использованием программы Excel. Точность и воспроизводимость результатов была проверена при сравнении распределения интенсивности, соответствующей каждой открытой рамке считывания, между двумя нанесениями на мембране и между независимыми гибридизациями. Во всех экспериментах с 1 и 10 мкг РНК были получены результаты с высокой степенью корреляции (>0,8). Фоновой уровень был определен по зонам мембраны без нанесения ДНК и его значение было вычтено из полученных данных. Интенсивность каждой зоны, соответствующей открытой рамке считывания, была нормализована по отношению к среднему значению общей интенсивности сигналов на каждой ммбране для прямого сравнения результатов, полученных для разных штаммов Е. coli. Сравнение профилей экспрессии в штамме дикого типа и в мутанте hns было проведено с использование непараметрического статистического метода Вилкоксона с помощью пакета программ STATVIEW 5.0.1. В каждом случае проверялась гипотеза, что одна из пары переменных величин больше или меньше другой по отношению к амплитуде различий, этот метод приспособлен для анализа ограниченных по размеру совокупностей экспериментальных данных.

Измерение уровня суперскрученности плазмидной ДНК

Филогенетический анализ байкальских бактериальных штаммов

Фрагменты ДНК в 1380 п.о., соответствующие фрагментам генов 16 S рРНК были амплифицированы в ходе ПЦР и их нуклеотидная последовательность определена по обеим цепям. Сравнение полученных последовательностей с имеющимися в банках данных (GenBank, EMBL, DDBJ) было проведено с использованием программы BLASTN. Для выравнивания последовательностей использовалась программа CLUSTAL W, затем набор выравненных последовательностей проверялся вручную на основе данных о вторичной структуре. Филогенетический анализ выполняли с помощью пакета программ TREECON. Для вычисления эволюционных дистанций использовали модель Джукса и Кантора. Филогенетические деревья строили по методу объединения ближайших соседей, достоверность филогенетических связей определяли с помощью бутстрэпанализа.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Сутурина, Ольга Александровна, 2001 год

1. Adler, J. & Templeton, B. (1967). The effect of environmental conditions on the motility of Escherichia coli. J. Gen. Microbiol. 46,175-184.

2. Aizawa, S.-I. (1996). Flagellar assembly in Salmonella typhimarium. Mol. Microbiol. 19, 1-5.

3. Akerley, B. J., Cotter, P. A. & Miller, J. F. (1995). Ectopic expression of the flagellar regulon alters development of the Bordetella-host interaction. Cell 80, 611-620.

4. Akerley, B. J. & Miller, J. F. (1993). Flagellin gene transcription in Bordetella bronchiseptica is regulated by the BvgAS virulence control system. /. Bacteriol. 175,2468-2479.

5. Akerley, B. J. & Miller, J. F. (1996). Understanding signal transduction during bacterial infection. Trends Microbiol. 4,141-146.

6. Akerley, B. J., Monack, D. M., Falkow, S. & Miller, J. F. (1992). The bvgAS locus negatively controls motility and synthesis of flagella in Bordetella bronchiseptica. }. Bacteriol. 174, 980-990.

7. Alberti, L. & Harshey, R. M. (1990). Differentiation of Serratia marcescens 274 into swimmer and swarmer cells. /. Bacteriol. 172, 4322.

8. Allison, C., Lai, H.-C., Gygi, D. & Hughes, C. (1993). Cell differentiation of Proteus mirabilis is initiated by glutamine, a specific chemoattractant for swarming cells. Mol Microbiol. 8,53.

9. Allison, C., Lai, H.-C. & Hughes, C. (1992). Co-ordinate expression of virulence genes during swarm-cell differentiation and population migration of Proteus mirabilis. Mol Microbiol 6,1583-1591.

10. Anderson, P. & Bauer, W. (1978). Supercoiling in closed circular DNA: dependence upon ion type and concentration. Biochemistry 17,594-601.

11. Ang, S„ Horng, Y. T., Shu, J. C., Soo, P. C., Liu, J. H., Yi, W. C., Lai, H. C., Luh, K. T., Ho, S. W. & Swift, S. (2001). The role of RsmA in the regulation of swarming motility in Serratia marcescens.}. Biomed. Sci. 8(2), 160-169.

12. Armitage, J. P. & Macnab, R. M. (1987). Unidirectional, intermittent rotation of the flagellum of Rhodobacter sphaeroides. J. Bacteriol. 169, 514-518.

13. Arnqvist, A., Olsen, A. & Normark, S. (1994). crS-dependent growth-phase induction of the csgBA promoter in Escherichia coli can be achieved in vivo by o70 in the absence of the nucleoid-associated protein H-NS. Mol. Microbiol 13,1021-1032.

14. Arora, S. K., Ritchings, B. W., Almira, E. G, Lory, S. & Ramphal, R. (1997). A transcriptional activator, FleQ, regulates mucin adhesion and flagellar gene expression in Pseudomonas aeruginosa in a cascade manner. J. Bacteriol. 179, 55745581.

15. Ashraf, S. I., Kelly, M. T., Wang, Y.-K. & Hoover, T. R. (1997). Genetic analysis of the Rhizobium meliloti nifH promoter, using the P22 challenge phage system. J. Bacteriol. 179,2356-2362.

16. Atlung, T., Clausen, E. S. & Hansen, F. G. (1985). Autoregulation of the dnaA gene of Escherichia coli K12. Mol Gen. Genet. 200,442-450.

17. Atlung, T. & Ingmer, H. (1997). H-NS: a modulator of environmentally regulated gene expression. Mol Microbiol 24,7-17.

18. Atsumi, T., McCarter, L. & Imae, Y. (1992). Polar and lateral flagellar motors of marine Vibrio are driven by different ion-motive forces. Nature 355,182-184.

19. Azam, T. A., Iwata, A., Nishimura, A., Ueda, S. & Ishihama, A. (1999). Growth phase-dependent variation in protein composition of the Escherichia coli nucleoid. /. Bacteriol. 181, 6261-6370.

20. Badger, J. & Miller, V. L. (1998). Expression of invasin and motility are coordinately regulated in Yersinia enterocolitica. J. Bacteriol 180, 793-800.

21. Balandina, A., Claret, L., Hengge-Aronis, R. & Rouviere-Yaniv, J. (2001). The Escherichia coli histone-like protein HU regulates rpoS translation. Mol. Microbiol. 39,1069-1079.

22. Ballado, T., Camarena, L., Gonzalez-Pedrajo, B., Silva-Herzog, E. & Dreyfus, G. (2001). The hook gene (flgE) is expressed from the flgBCDEF operon in Rhodobacter sphaeroides : study of an flgE mutant. J. Bacteriol. 183,1680-1687.

23. Bartlett, D. H., Frantz, B. B. & Matsumura, P. (1988). Flagellar transcriptional activators FlbB and Flal: gene sequences and 5' consensus sequences of operons under FlbB and Flal control. J. Bacteriol. 170,1575-1581.

24. Belas, R., Simon, M. & Silverman, M. (1986). Regulation of lateral flagella gene transcription in Vibrio parahaemolyticus. J. Bacteriol. 167,210-218.

25. Bell, A., Gaston, K. & Williams, R. et al (1990). Mutations that alter the ability of the Escherichia coli cyclic AMP receptor protein to activate transcription. Nucleic Acids Res. 18, 7243-7250.

26. Berg, H. C. & Brown, D. A. (1972). Chemotaxis in Escherichia coli analysed by three-dimensional tracking. Nature 239,500-504.

27. Berg, O. G. & von Hippel, P. H. (1988). Selection of DNA binding sites by regulatory proteins. II The binding specificity of cyclic AMP receptor protein to recognition sites. J. Mol Biol 200, 709-723.

28. Bergman, K., Nulty, E. & Su, L. (1991). Mutations in the two flagellin genes of Rhizobium meliloti. J. Bacteriol. 173,3716-3723.

29. Bertin, P., Lejeune, P., Laurent-Winter, C. & Danchin, A. (1990). Mutations in bglY, the structural gene for the DNA-binding protein HI, affect expression of several Escherichia coli genes. Biochimie 72,889-891.

30. Bertin, P., Terao, E., Lee, E. H., Lejeune, P., Colson, C., Danchin, A. & Collatz, E. (1994). The H-NS protein is involved in the biogenesis of flagella in Escherichia coli.}. Bacteriol. 176,5537-5540.

31. Bowra, B. J. & Dil worth, M. J. (1981). Motility and Chemotaxis towards sugars in Rhizobium leguminosarum. J. Gen. Microbiol. 126,231-235.

32. Bracco, L., Kotlarz, D., Kolb, A., Diekman, S. & Buc, H. (1989). Synthetic curved DNA sequences can act as transcriptional activators in Escherichia coli. EMBO J. 13, 4289-4296.

33. Brandi, A., Pon, C. L. & Gualerzi, C. O. (1994). Interaction of the main cold shock protein CS7.4 (CspA) of Escherichia coli with the promoter region of hns. Biochimie 76,1090-1098.

34. Braun, R. E., O'Day, K. & Wright, A. (1985). Autoregulation of the DNA replication gene dnaA in E.coli K-12. Cell 40,159-169.

35. Braun, T. F., Poulson, S., Gully, J. B., Empey, J. C., Van Way, S., Putman, A. & Blair, D. F. (1999). Function of proline residues of MotA in torque generation by the flagellar motor of Escherichia coli. J. Bacteriol. 181,3542-3551.

36. Brun, Y. V. & Shapiro, L. (1992). A temporally controlled a-factor is required for polar morphogenesis and normal cell division in Caulobacter. Genes Dev. 6, 23952408.

37. Bukau, B. & Walker, G. (1989). Cellular defects caused by deletion of the Escherichia coli dnaK gene indicate roles for heat-shock protein in normal metabolism. /. Bacteriol. 171, 2337-2346.

38. Busby, S. & Kolb, A. (1996). The CAP modulon. In Regulation of gene expression in Escherichia coli (Lin, E. C. C. & Lynch, A. S., eds.), pp. 255-279. Landes, R.C., New York, N.Y.

39. Busby, S., West, D., Lawes, M., Webster, C., Ishihama, A. & Kolb, A. (1994). Transcription activation by the E. coli cyclic AMP receptor protein: receptors bound in tandem at promoters can interact synergistically. /. Mol. Biol. 241, 341352.

40. Bustamante, V. H., Santana, F. J., Calva, E. & Puente, J. L. (2001). Transcriptional regulation of type HI secretion genes in enteropathogenic Escherichia coli: Ler antagonizes H-NS-dependent repression. Mol. Microbiol. 39(3), 664-678.

41. Camilli, A. & Mekalanos, J. J. (1995). Use of resombinase gene fusions to identify Vibrio cholerae genes induced during infection. Mol. Microbiol. 18, 671-683.

42. Campos, A. & Matsumura, P. (2001). Extensive alanine scanning reveals proteinprotein and protein-DNA interaction surfaces in the global regulator FlhD from Escherichia coli. Mol. Microbiol. 39(3), 581-594.

43. Campos, A., Matsumura, P. & Volz, K. (1998). Crystallization and preliminary X-ray analysis of FlhD from Escherichia coli. . Struct. Biol. 12, 269-271.

44. Campos, A., Zhang, R., Alkire, R., Matsumura, P. & Westbrook, E. (2001). Crystalostructure of the global regulator FlhD from Escherichia coli at 1.8 A resolution. Mol. Microbiol. 39(3), 567-580.

45. Canale-Parola, E. (1978). Motility and chemotaxis of spirochetes. Annu. Rev. Microbiol. 32,69-99.

46. Casaz, P., Happel, A., Keithan, J., Read, D. L., Strain, S. R. & Levy, S. B. (2001). The Pseudomonas fluorescens transcription activator AdnA is required for adhesion and motility. Microbiology 147(Part 2), 355-361.

47. Ceschini, S., Lupidi, G., Coletta, M., Pon, C. L., Fioretti, E. & Angeletti, M. (2000). Multimeric self-assembly equilibria involving the histone-like protein H-NS - A thermodynamic study. J. Biol Chem. 275(2), 729-734.

48. Chilcott, G. S. & Hughes, K. T. (2000). Coupling of flagellar gene expression to flagellar assembly in Salmonella enterica Serovar typhimurium and Escherichia coli. Microbiol. Mol Biol Rev. 64(4), 694-708.

49. Ciacci-Woolwine, F., Blomfield, I. C., Richardson, S. H. & Mizel, S. B. (1998). Salmonella flagellin induces tumor necrosis factor alfa in a human promocytic cell line. Infect. Immun. 6,1127-1134.

50. Claret, L. & Hughes, C. (2000a). Functions of the subunits in the FlhD(2)C(2) transcriptional master regulator of bacterial flagellum biogenesis and swarming. J. Mol Biol 303(4), 467-478.

51. Claret, L. & Hughes, C. (2000b). Rapid turnover of FlhD and FlhC, the flagellar regulon transcriptional activator proteins, during Proteus swarming. J. Bacterid 182, 833-836.

52. Correa, N. E., Lauriano, C. M., McGee, R. & Klose, K. E. (2000). Phosphorylation of the flagellar regulatory protein FlrC is necessary for Vibrio cholerae motility and enhanced colonization. Mol Microbiol. 35(4), 743-755.

53. Cowing, D. W., Bardwell, J. C. A., Craig, E. A., Woolford, C., Hendrix, R. W. & Gross, C. (1985). Consensus sequence for Escherichia coli heat-shock gene promoters. Proc. Natl Acad. Sci. USA 82,2679-2683.

54. Craig, E. A. & Gross, C. A. (1991). Is hsp70 the cellular thermometer? Trends Biochem. Sci. 16,135-140.

55. D'Mello, A. & Yotis, W. W. (1987). The action of sodium deoxycholate on Escherichia coli. Appl. Environ. Microbiol 53,1944-1946.

56. Dame, R. T., Wyman, C. & Goosen, N. (2000). H-NS mediated compaction of DNA visualised by atomic force microscopy. Nucleic Acids Res. 28(18), 3504-3510.

57. Das, M., Chopra, A. K., Wood, T. & Peterson, J. W. (1998). Cloning, sequencing and expression of the flagellin core protein and other genes encoding structural proteins of the Vibrio cholerae flagellum. FEMS Microbiol Lett. 165,239-246.

58. Dasgupta, N., Arora, S. K. & Ramphal, R. (2000). fleN, a gene that regulates flagellar number in Pseudomonas aeruginosa.}. Bacteriol 182(2), 357-364.

59. Dean, F., Krasnow, M., Otter, R., Matzuk, M., Spengler, S., Pastorcio, M. & Cozzarelli, N. (1983). Escherichia coli type I topoisomerases: identification, mechanism and role in recombination. Cold Spring harbor Symp. Quant. Biol 47, 769-777.

60. Dean, G. E., Macnab, R. M., Stader, J., Matsumura, P. & Burks, C. (1984). Gene sequence and predicted amino acid sequence of the mot A protein, a membrane-associated protein required for flagellar rotation in Escherichia coli. J. Bacteriol 159, 991-999.

61. Deighan, P., Free, A. & Dorman, C. J. (2000). A role for the Escherichia coli H-NS-like protein StpA in OmpF porin expression through modulation of micF RNA stability. Mol Microbiol 38(1), 126-139.

62. DePamphilis, M. L. & Adler, J. (1971). Fine structure and isolation of the hook-basal body complex of flagella from Escherichia coli and Bacillus subtilis. J. Bacteriol. 105,384-395.

63. Dersch, P., Schmidt, K. & Bremer, E. (1993). Synthesis of the Escherichia coli K-12 nucleoid-associated DNA-binding protein H-NS is subjected to growth-phase control and autoregulation. Mol. Microbiol. 8, 875-889.

64. Dietrich, C., Heuner, K., Brand, B. C., Hacker, J. & Steinert, M. (2001). Flagellum of Legionella pneumophila positively affects the early phase of infection of eukaryotic host cells. Infect. Immun. 69(4), 2116-2122.

65. Dilworth, M. J. & Glenn, A. R. (1999). Problems of adverse pH and bacterial strategies to combat it. In Bacterial responses to pH. Novartis foundation symposium 221 (Chadwick, D. J. & Cardew, G., eds.), pp. 4-18. John Wiley and Sons, Chichester.

66. Donato, G. M. & Kawula, T. H. (1998). Enhanced binding of altered H-NS protein to flagellar rotor protein FUG causes increased flagellar rotation speed and hypermotility in Escherichia coli. . Biol. Chem. 273,24030-24036.

67. Donato, G. M. & Kawula, T. H. (1999). Phenotypic analysis of random hns mutations differentiate DNA-binding activity from properties of fimA promoter inversion modulation and bacterial motility. . Bacteriol. 181(3), 941-948.

68. Driks, A., Bryan, R., Shapiro, L. & DeRosier, D. J. (1989). The organization of the Caulobacter crescentus flagellar filament. /. Mol. Biol. 206,627-636.

69. Drlica, K. (1984). Biology of bacterial deoxyribonucleic acid topoisomerases. Microbiol. Rev. 48,273-289.

70. Drlica, K. (1992). Control of bacterial DNA supercoiling. Mol. Microbiol. 6,425-433.

71. Drlica, K. & Rouviere-Yaniv, J. (1987). Histone-like proteins of bacteria. Microbiol. Rev. 51,301-319.

72. Dubrac, S. & Touati, D. (2000). Fur positive regulation of iron superoxide dismutase in Escherichia coli: Functional analysis of the sodB promoter. /. Bacteriol. 182(13), 3802-3808.

73. Dufour, A., Furness, R. B. & Hughes, C. (1998). Novel genes that upregulate the Proteus mirabilis flhDC master operon controlling flagellar biogenesis and swarming. Mol. Microbiol. 29, 741-751.

74. Eaton, K. A., Suerbaum, S., Josenhans, C. & Krakowka, S. (1996). Colonization of gnotobiotic piglets by Helicobacter pylori deficient in two flagellin genes. Infect. Immun. 64,2445-2448.

75. Eberl, L., Christiansen, G., Molin, S. & Givskov, M. (1996). Differentiation of Serratia liquefaciens into swarm cells is controlled by the expression of the flhDC master operon. /. Bacteriol. 178,554-559.

76. Eberl, L., Molin, S. & Givskov, M. (1999). Surface motility of Serratia liquefaciens MG1. /. Bacteriol. 181(6), 1703-1712.

77. Ebright, R. H. (1993). Transcription activation at class I CAP-dependent promoters. Mol. Microbiol. 8, 797-802.

78. Elliott, S. J., Sperandio, V., Giron, J. A., Shin, S., Mellies, J. L., Wainwright, L., Hutcheson, S. W„ McDaniel, T. K. & Kaper, J. B. (2000). The locus of enterocyte effacement (LEE)-encoded regulator controls expression of both LEE- and non

79. E-encoded virulence factors in enteropathogenic and enterohemorrhagic Escherichia coli. Infect. Immun. 68(11), 6115-6126.

80. Eschenlauer, A. C. & Reznikoff, W. S. (1991). Escherichia coli catabolite gene activator protein mutants defective in positive control of lac operon transcription. J. Bacteriol. 173,5024-5029.

81. Falconi, M., Gualtieri, M. T., La Teana, A., Losso, M. A. & Pon, C. L. (1988). Proteins from the procaryotic nucleoid: primary and quaternary structure of the 15-kDa Escherichia coli DNA binding protein H-NS. Mol. Microbiol. 2,323-329.

82. Falconi, M., Higgins, N. P., Spurio, R., Pon, C. L. & Gualerzi, C. O. (1993). Expression of the gene encoding the major bacterial nucleoid protein H-NS is subject to transcriptional autorepression. Mol. Microbiol. 10,273-282.

83. Feldman, M., Bryan, R., Rajan, S., Scheffer, L., Brunnert, S., Tang, H. & Prince, A. (1998). Role of flagella in the pathogenesis of Pseadomonas aeruginosa pulmonary infection. Infect. Immun. 66,43-51.

84. Fleischmann, J., Adams, M. D., White, O., Clayton, R. A., Kirkness, E. F. & Kerlavage, A. R. et al. (1995). Whole-genome random sequencing and assembly of Haemophilus influenzae. Science 269, 496-512.

85. Fletcher, S. A. & Csonka, L. N. (1995). Fine-structure deletion analysis of the transcriptional silencer of the proU operon of Salmonella typhimurium. J. Bacteriol. 177,4508-4513.

86. Forsman, K., Sonden, B., Gorannson, M. & Uhlin, B. E. (1992). Antirepression function in Escherichia coli for the cAMP-cAMP receptor protein transcription activator. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 9880-9884.

87. Fraser, G. M. & Hughes, C. (1999). Swarming motility. Curr. Opin. Microbiol. 2, 630635.

88. Free, A. & Dorman, C. J. (1995). Coupling of Escherichia coli hns mRNA levels to DNA synthesis by autoregulation: implications for growth-phase control. Mol. Microbiol. 18,101-113.

89. Fretter, R., O'Brien, P. C. & Mascai, M. S. (1981). Role of chemotaxis in the association of motile bacteria with intestinal mucosa: in vivo studies. Infect. Immun. 34, 234240.

90. Friedrich, K., Gualerzi, C. O., Lammi, M., Losso, M. A. & Pon, C. L. (1988). Proteins from the prokaryotic nucleoid. Interaction of nucleic acids with 15 kDa Escherichia coli histone-like protein H-NS. FEBS Lett. 229,197-202.

91. Fuller, R. S. & Kornberg, A. (1983). Purified dnaA protein in initiation of replication at the Escherichia coli chromosomal origin of replication. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80,5817-5821.

92. Furness, R. B., Fraser, G. M., Hay, N. A. & Hughes, C. (1997). Negative feedback from a Proteus class n flagella export defect to the flhDC master operon controlling cell division and flagellum assembly. }. Bacteriol. 179,5585-5588.

93. Garcia, N., Campos, A., Osorio, A., Poggio, S., Gonzalez-Pedrajo, B., Camarena, L. & Dreyfus, G. (1998). The flagellar switch genes fliM and fliN of Rhodobacter sphaeroides are contained in a large flagellar gene cluster. J. Bacteriol. 180, 39783982.

94. Gardel, C. L. & Mekalanos, J. J. (1996). Alterations in Vibrio cholerae motility phenotypes correlate with changes in virulence factor expression. Infect. Immun. 64,2246-2255.

95. Gerl, L. & Sumper, M. (1988). Halobacterial flagellins are encoded by a multigene family. /. Biol. Chem. 263,13246-13251.

96. Gill, P. R. & Agabian, N. (1983). The nucleotide sequence of the Mr = 28,500 flagellin gene of Caulobacter crescentus. J. Biol. Chem. 258,7395-7401.

97. Gillen, K. L. & Hughes, K. T. (1993). Transcription from two promoters and autoregulation contribute to the control of expression of the Salmonella typhimurium flagellar regulatory geneflgM. J. Bacteriol 175, 7006-7015.

98. Givaudan, A. & Lanois, A. (2000). flhDC, the flagellar master operon of Xenorhabdus nematcrphilus: Requirement for motility, lipolysis, extracellular hemolysis, and full virulence in insects. J. Bacteriol. 182(1), 107-115.

99. Givaudan, A., Lanois, A. & Boemare, N. (1996). Cloning and nucleotide sequence of a flagellin encoding genetic locus from Xenorhabdus nematophilus: phase variation leads to differential transcription of two flagellar genes (fliCD). Gene 183, 243253.

100. Givskov, M., Ebert, L., Christiansen, G., Benedik, M. J. & Molin, S. (1995). Induction of phospholipase- and flagellar synthesis in Serratia liquefaciens is controlled by expression of the flagellar master operon flhDC. Mol. Microbiol. 15,445-454.

101. Givskov, M. & Molin, S. (1992). Expression of extracellular phospholipase from Serratia liquefaciens is growth-phase dependent, catabolite repressed and regulated by anaerobiosis. Mol Microbiol 6,1363-1374.

102. Glagolev, A. N. & Skulachev, V. P. (1978). The proton pump is a molecular engine of motile bacteria. Nature 272, 280-282.

103. Goodier, R. I. & Ahmer, B. M. M. (2001). Sir A orthologs affect both motility and virulence. J. Bacteriol 183(7), 2249-2258.

104. Goransson, M., Sonden, B., Nilsson, P., Dagberg, B., Forsman, K., Emanuelsson, K. & Uhlin, B. E. (1990). Transcriptional silencing and thermoregulation of gene expression in Escherichia coli. Nature 344, 682-685.

105. Gosink, K. K. & Hase, C. C. (2000). Requirements for conversion of the Na+-driven flagellar motor of Vibrio cholerae to the H+-driven motor of Escherichia coli. J. Bacterial. 182(15), 4234-4240.

106. Govantes, F., Orjalo, A. V. & Gunsalus, R. P. (2000). Interplay between three global regulatory proteins mediates oxygen regulation of the Escherichia coli cytochrome d oxidase (cydAB) operon. Mol. Microbiol. 38(5), 1061-1073.

107. Goyard, S. & Bertin, P. (1997). Characterization of BpH3, an H-NS-like protein in

108. Bordetella pertussis. Mol. Microbiol 24, 815-823.

109. Graf, J., Dunlap, P. V. & Ruby, E. G. (1994). Effect of transposon-induced motility mutations on colonization of the host light organ by Vibrio fischeri. }. Bacteriol. 176,6986-6991.

110. Grossman, A. D., Straus, D. B., Walter, W. A. & Gross, C. A. (1987). Sigma-32 synthesis can regulate the synthesis of heat-shock proteins in Escherichia coli. Genes Dev. 1,179-184.

111. Gryllos, I., Shaw, I. G., Gavin, R., Merino, S. & Tomas, J. M. (2001). Role of flm locus in mesophilic Aeromonas species adherence. Inject. Immun. 69(1), 65-74.

112. Guerry, P., Aim, R. A., Power, M. E„ Logan, S. M. & Trust, T. J. (1991). Role of two flagellin genes in Campylobacter motility. J. Bacteriol. 173,4757-4764.

113. Gunasekera, A., Ebright, Y. W. & Ebright, R. H. (1992). DNA sequence determinants for binding of the Escherichia coli catabolite gene activator protein. J. Biol Chem. 267,14713-14720.

114. Han, Y. W., Uhl, M. A., Han, S. J. & Shi, W. (1999). Expression of bvgAS of Bordetella pertussis represses flagellar biosynthesis of Escherichia coli. Arch. Microbiol 171, 127-130.

115. Harkey, C. W., Everiss, K. D. & Peterson, K. M. (1994). The Vibrio cholerae toxin-coregulated pilus gene tcpl encodes a homologue of methyl-accepting Chemotaxis protein. Infect. Immun. 62, 2669-2678.

116. Hase, C. C. & Mekalanos, J. J. (1999). Effects of changes in membrane sodium flux on virulence gene expression in Vibrio cholerae. Proc. Natl Acad. Sei. USA 96, 31833187.

117. Hay, N. A., Tipper, D. J., Gygi, D. & Hughes, C. (1997). A nonswarming mutant of Proteus mirabilis lacks the Lrp global transcriptional regulator. J. Bacteriol. 179, 4741-4746.

118. Hayashi, F., Smith, K. D., Ozinsky, A., Hawn, T. R., Yi, E. C., Goodlett, D. R., Eng, J. K., Akira, S., Underhill, D. M. & Aderem, A. (2001). The innate immune response to bacterial flagellin is mediated by Toll-like receptor 5. Nature 410, 1099-1103.

119. Hengge-Aronis, R. (1996). Back to Log phase: sigma (S) as a global regulator in the osmotic control of gene expression in Escherichia coli. Mol Microbiol 21,887-893.

120. Henrichsen, J. (1972). Bacterial surface translocation: a survey and a classification. Bacteriol Rev. 36,478-503.

121. Higgins, C. F., Cairney, J., Stirling, D. A., Sutherland, L. & Booth, I. R. (1987). Osmotic regulation of gene expression: ionic strength as an intracellular signal? Trends. Biochem. Sei. 12,339-344.

122. Higgins, C. F., Dorman, C. J., Stirling, D. A., Waddell, L., Booth, I. R., May, G. & Bremer, E. (1988). A physiological role for DNA supercoiling in the osmotic regulation of gene expression in S. typhimurium and E. coli. Cell 52,569-584.

123. Higgins, C. F., Hinton, J. C. D., Hulton, C. J. S., Owen-Hughes, T., Pavitt, G. D. & Seirafi, A. (1990). Protein HI: a role for chromatin structure in the regulation of bacterial gene expression and virulence. Mol Microbiol. 4,2007-2014.

124. Hinton, J. C. D., Santos, D. S., Seirafi, A., Hulton, C. J., Pavitt, G. D. & Higgins, C. F. (1992). Expression and mutational analysis of the nucleoid-associated protein H-NS of Salmonella typhimurium. Mol. Microbiol. 6,2327-2337.

125. Hirota, Y., Mordoh, J. & Jacob, F. (1970). On the process of cellular division in Escherichia coli. Thermosensitive mutants of Escherichia coli altered in the process of DNA initiation. J. Mol. Biol. 53,369-387.

126. Homma, M., DeRosier, D. J. & Macnab, R. M. (1990a). Flagellar hook and hook-associated proteins of Salmonella typhimurium and their relationship to other axial components of the flagellum. J. Mol. Biol. 213, 819-832.

127. Homma, M., Kutsukake, K., Hasebe, M., lino, T. & Macnab, R. M. (1990b). FlgB, FlgC, FlgF and FlgG. A family of structurally related proteins in the flagellar basal body of Salmonella typhimurium. J. Mol. Biol. 211,465-477.

128. Htun, H. & Dahlberg, J. E. (1988). Single strands, triple strands, and kinks in H-DNA. Science 241,1791-1796.

129. Jacquet, M., Cukier-Kahn, R., Pia, R. & Gros, F. (1971). A thermostable protein factor acting on in vitro DNA transcription. Biochem. Biophys. Res. Commun. 45, 15971607.

130. Jagannathan, A., Constantinidou, C. & Penn, C. W. (2001). Roles of rpoN, fliA, and flgR in expression of flagella in Campylobacter jejuni. J. Bacteriol. 183,2937-2942.

131. Johansson, J., Dagberg, B., Richet, E. & Uhlin, B. E. (1998). H-NS and StpA proteins stimulate expression of the maltose regulon in Escherichia coli. J. Bacteriol 180, 6117-6125.

132. Johansson, J., Eriksson, S., Sonden, B., Wai, S. N. & Uhlin, B. E. (2001). Heteromeric interactions among nucleoid-associated bacterial proteins: localization of StpA-stabilizing regions in H-NS of Escherichia coli. J. Bacteriol. 183,2343-2347.

133. Johansson, J. & Uhlin, B. E. (1999). Differential protease-mediated turnover of H-NS and StpA revealed by a mutation altering protein stability and stationary-phase survival of Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96(19), 10776-10781.

134. Jones, C. J. & Aizawa, S.-I. (1991). The bacterial flagellum and flagellar motor: structure, assembly and function. Adv. Microb. Physiol. 32,110-163.

135. Jones, C. J., Homma, M. & Macnab, R. (1989). L-, P-, and M-ring proteins of the flagellar basal body of Salmonella typhimurium: gene sequences and deduced protein sequences. J. Bacteriol. 171,3890-3900.

136. Jones, C. J., Macnab, R. M., Okino, H. & Aizawa, S.-I. (1990). Stoichiometric analysis of the flagellar hook-(basal-body) complex of Salmonella typhimurium. J. Mol. Biol. 212,377-387.

137. Jordi, B., Owen-Hughes, T. A., Hulton, C. & Higgins, C. F. (1995). DNA twist, flexibility and transcription of the osmoregulated proU promoter of Salmonella typhimurium. EMBO }. 14,5690-5700.

138. Jordi, B. J. A. M., Fielder, A., Burns, C. M., Hinton, J. C. D., Dover, N., Ussery, D. W. et al. (1997). DNA binding is not sufficient for H-NS-mediated repression of proU expression. J. Biol. Chem. 272,12083-12090.

139. Jordi, J. A. M. & Higgins, C. F. (2000). The downstream regulatory element of the proU operon of Salmonella typhimurium inhibits open complex formation by RNA polymerase at a distance. J. Biol. Chem. 275(16), 12123-12128.

140. Joys, T. M. (1988). The flagellar filament protein. Can. J. Microbiol 34,452-458.

141. Kapatral, V. & Minnich, S. A. (1995). Co-ordinate, temperature-sensitive regulation of the three Yersinia enterocolitica flagellin genes. Mol. Microbiol. 17,49-56.

142. Kapatral, V., Olson, J. W., Pepe, J. C., Miller, V. L. & Minnich, S. A. (1996). Temperature-dependent regulation of Yersinia enterocolitica class IE flagellar genes. Mol. Microbiol 19,1061-1071.

143. Karem, K. & Foster, J. W. (1993). The influence of DNA topology on the environmental regulation of a pH-regulated locus in Salmonella typhimurium. Mol Microbiol 10,75-86.

144. Kelly-Wintenberg, K., South, S. L. & Montie, T. C. (1993). Tyrosine phosphate in a-and b-type flagellins of Pseudomonas aeruginosa.}. Bacteriol. 172,2458-2461.

145. Khan, S. & Macnab, R. M. (1980). Proton chemical potential, proton electrical potential and bacterial motility. J. Mol. Biol 138,599-614.

146. Kihara, M., Homma, M., Kutsukake, K. & Macnab, R. (1989). Flagellar switch of Salmonella typhimurium: gene sequences and deduced protein sequences. J. Bacteriol 171,3247-3257.

147. Kihara, M. & Macnab, R. M. (1981). Cytoplasmic pH mediates pH taxis and weak-acid-repellent taxis of bacteria. J. Bacteriol 145,1209-1221.

148. Kiiyukia, C., Kawakami, H. & Hashimoto, H. (1993). Effect of sodium chloride, pH and organic nutrients on the motility of Vibrio cholerae non-01. Microbios 73, 249255.

149. Kim, Y. K. & McCarter, L. L. (2000). Analysis of the polar flagellar gene system of Vibrio parahemolyticus.}. Bacterid. 182(13), 3693-3704.

150. Klose, K. E. & Mekalanos, J. J. (1998a). Differential regulation of multiple flagellins in Vibrio cholerae. J. Bacterial. 180, 303-316.

151. Klose, K. E. & Mekalanos, J. J. (1998b). Distinct roles of an alternative sigma factor during free-swimming and colonizing phases of the Vibrio cholerae pathogenic cycle. Mol. Microbiol. 28, 501-520.

152. Ko, M. & Park, C. (2000a). H-NS-dependent regulation of flagellar synthesis is mediated by a LysR family protein. J. Bacteriol. 182(16), 4670-4672.

153. Ko, M. & Park, C. (2000b). Two novel flagellar components and H-NS are involved in the motor function of Escherichia coli. J. Mol Biol. 303(3), 371-382.

154. Kolb, A., Busby, S., Buc, H., Garges, S. & Adhya, S. (1993). Transcriptional regulation by cAMP and its receptor protein. Annu. Rev. Biochem. 62, 749-795.

155. Komeda, Y. (1982). Fusions of flagellar operons to lactose genes on a Mu lac bacteriophage. J. Bacteriol. 150,16-26.

156. Komeda, Y. (1986). Transcriptional control of flagellar genes in Escherichia coli K-12. J. Bacteriol. 168,1315-1318.

157. Komeda, Y., H., S., Ishidsu, J. I. & lino, T. (1975). The role of cAMP in flagellation of Salmonella typhimurium. Mol. Gen. Genet. 142(4), 289-298.

158. Komeda, Y., Kutsukake, K. & lino, T. (1980). Definition of additional flagellar genes in Escherichia coli K12. Genetics 94,277-290.

159. Kondoh, H. & Hotani, H. (1974). Flagellin from Escherichia coli K12: polymerization and molecular weight in comparison with Salmonella flagellins. Biochim. Biophys. Acta 336,117-139.

160. Korber, D. R„ Lawrence, J. R., Sutton, B. & Caldwell, D. E. (1989). Effect of laminar flow velocity on the kinetics of surface recolonization by Mot+ and Mot

161. Pseudomonas fluorescens. Microbiol. Ecol. 18,1.

162. Krikos, A., Mutoh, N., Boyd, A. & Simon, M. I. (1983). Sensory transducers of E. coli are composed of discrete structural and functional domains. Cell 33,615-622.

163. Kucherer, C., Lother, H., Kolling, R., Schauzu, M. A. & Messer, W. (1986). Regulation of transcription of the chromosomal dnaA gene of Escherichia coli. Mol. Gen. Genet 205,115-121.

164. Kunin, C. M., Hua, T. H. & Bakaletz, L. O. (1995). Effect of salicylate on expression of flagella by Escherichia coli and Proteus, Providencia, and Pseudomonas spp. Infect Immun. 63(5), 1796-1799.

165. Kustu, S., Santero, E., Keener, J., Popham, D. & Weiss, D. (1989). Expression of sigma 54 (nfrA)-dependent genes is probably united by a common mechanism. Microbiol. Rev. 53,367-376.

166. Kutsukake, K. (1994). Excretion of the anti-sigma factor through a flagellar structure couples flagellar gene expression with flagellar assembly in Salmonella typhimurium. Mol. Gen. Genet. 243,605-612.

167. Kutsukake, K. & Doi, H. (1994). Nucleotide sequence of the flgD gene of Salmonella typhimurium which is essential for flagellar hook formation. Biochim. Biophys. Acta 1218, 443-446.

168. Kutsukake, K., Iyoda, S., Ohnishi, K. & lino, T. (1994). Genetic and molecular analyses of the interaction between the flagellum-specific sigma and anti-sigma factors in Salmonella typhimurium. EMBO J. 13,4568-4576.

169. Kutsukake, K., Ohya, Y. & lino, T. (1990). Transcriptional analysis of the flagellar regulon of Salmonella typhimurium. J. Bacteriol. 172, 741-747.

170. Kutsukake, K., Ohya, Y., Yamagushi, S. & lino, T. (1988). Operon structure of flagellar genes in Salmonella tyiphimurium. Mol. Gen. Genet 214,11-15.

171. Macnab, R. (1999). The bacterial flagellum: reversible rotary propellor and type m export apparatus. J. Bacteriol. 181, 7149-7153.

172. Macnab, R. M. & Koshland, D. E. (1972). The gradient-sensing mechanism in bacterial chemotaxis. Proc. Natl Acad. Sci. USA 69,2509-2512.

173. Magariyama, Y., Sugiyama, S., Muramoto, K., Maekawa, I., Kawagishi, I. & Imae, Y. (1994). Very fast flagellar rotation. Nature 371,752.

174. Mandecki, W. & Caruthers, M. H. (1984). Mutants of the lac promoter with large insertions and deletions between the CAP binding site and the -35 region. Gene 31,263-267.

175. Manson, M. D., Tedesco, P. & Berg, H. C. (1980). Energetics of flagellar rotation in bacteria. J. Mol. Biol 138,541-561.

176. Manson, M. D., Tedesco, P., Berg, H. C., Harold, F. M. & van der Drift, C. (1977). A proton motive force drives bacterial flagella. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 30603064.

177. Martinez, A., Torello, S. & Kolter, R. (1999). Sliding motility in mycobacteria. J. Bacteriol. 181, 7331-7338.

178. Marykwas, D. L., Schmidt, S. A. & Berg, H. C. (1996). Interacting components of the flagellar motor of Escherichia coli revealed by the two-hybrid system in yeast. J. Mol Biol 256,564-576.

179. Matsuyama, T., Takagi, Y., Nakagawa, Y., Itoh, H., Wakita, J. & Matsushita, M. (2000). Dynamic aspects of the structured cell population in a swarming colony of Proteus mirabilis. J. Bacteriol 182(2), 385-393.

180. McCarter, L., Hilmen, M. & Silverman, M. (1988). Flagellar dynamometer controls swarmer cell differentiation of Vibrio parahaemolyticus. Cell 54,345-351.

181. McCarter, L. L. (1995). Genetic and molecular characterization of the polar flagellum of Vibrio parahaemolyticus. J. Bacteriol. 177,1595-1609.

182. McCarter, L. L. (1999). The multiple identities of Vibrio parahaemolyticus. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 1,51-57.

183. McGee, K., Horstendt, P. & Milton, D. L. (1996). Identification and characterization of additional flagellin genes from Vibrio anguillarum. J. Bacteriol. 178,5188-5198.

184. Menzel, R. & Geliert, M. (1983). Regulation of the genes for E. coli DNA gyrase: homeostatic control of DNA supercoiling. Cell 34,105-113.

185. Menzel, R. & Geliert, M. (1987a). Fusions of the Escherichia coli gyrA and gyrB control regions to the galactokinase gene are inducible by coumermycin treatment. J. Bacteriol. 169,1272-1278.

186. Menzel, R. & Geliert, M. (1987b). Modulation of transcription by DNA supercoiling: a deletion analysis of the Escherichia coli gyrA and gyrB promoters. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84,4185-4189.

187. Miller, J. F., Mekalanos, J. J. & Falkow, S. (1989). Coordinate regulation and sensory transduction in the control of bacterial virulence. Science 243,916-922.

188. Minamino, T., Chu, R., Yamaguchi, S. & Macnab, R. M. (2000). Role of FliJ in flagellar protein export in Salmonella. J. Bacteriol. 182(15), 4207-4215.

189. Minamino, T., lino, T. «Sc Kutsukake, K. (1994). Molecular characterisation of the Salmonella typhimurium flhB operon and its protein products. J. Bacteriol. 176, 7630-7637.

190. Minamino, T. & Macnab, R. M. (2000a). Domain structure of Salmonella FlhB, a flagellar export component responsible for substrate specificity switching. J. Bacteriol 182(17), 4906-4914.

191. Minamino, T. & Macnab, R. M. (2000b). Interactions among components of the Salmonella flagellar export apparatus and its substrates. Mol. Microbiol 35(5), 1052-1064.

192. Misawa, N. & Blaser, M. J. (2000). Detection and characterization of autoagglutination activity by Campylobacter jejuni. Infect. Immun. 68(11), 61686175.

193. Mizushima, T., Koyanagi, R., Katayama, T., Miki, T. & Sekimizu, K. (1997). Decrease in expression of the master operon of flagellin synthesis in a dnaA46 mutant of Escherichia coli. Biol Pharm. Bull 20,327-331.

194. Mizushima, T., Koyanagi, R., Suzuki, E., Tomura, A., Kutsukake, K., Miki, T. & Sekimizu, K. (1995). Control by phosphatidylglycerol of expression of the flhD gene in Escherichia coli. Biochim. Biophys. Acta 1245,397-401.

195. Mizushima, T., Tanino, J., Miki, T. & Sekimizu, K. (1996). Decrease in the linking number of plasmid DNA in dnaA mutants of Escherichia coli. Biochem. Biophys. Res. Commun. 218,137-141.

196. Moens, S. & Vanderleyden, J. (1996). Function of bacterial flagella. Crit. Rev. Microbiol 22(2), 67-100.

197. Morett, E. & Buck, M. (1989). In vivo studies on the interaction of RNA polymerase-o54 with the Klebsiella pneumoniae and Rhizobium meliloti nifH promoters: the role of NIFA in the formation of an open promoter complex. /. Mol Biol 210,6577.

198. Morrison, R. B. & McCapra, J. (1961). Flagellar changes in Escherichia coli induced by temperature of the environment. Nature 192, 774-776.

199. Mutoh, N. & Simon, M. I. (1986). Nucleotide sequences corresponding to five chemotaxis genes in Escherichia coli. J. Bacteriol 165,161-166.

200. Namba, K., Yamashita, I. & Vonderviszt, F. (1989). Structure of the core and central channel of bacterial flagella. Nature 342, 648-654.

201. Nambu, T., Minamino, T., Macnab, R. & Kutsukake, K. (1999). Peptidoglycan-hydrolyzing activity of the FlgJ protein, essential for flagellar rod formation in Salmonella typhimurium.}. Bacteriol 181,1555-1561.

202. Nasser, W., Faelen, M., Hugouvieux-Cotte-Pattat, N. & Reverchon, S. (2001). Role of the nucleoid-associated protein H-NS in the synthesis of virulence factors in the phytopathogenic bacterium Erwinia chrysanthemi. Mol Plant. Microbe In. 14(1), 10-20.

203. Newman, E. B. & Lin, R. (1995). Leucine-responsive regulatory protein: a global regulator of gene expression in E. coli. Annu. Rev. Microbiol 49, 747-775.

204. Nishida, S., Mizushima, T., Miki, T. & Sekimizu, K. (1997). Immotile phenotype of an Escherichia coli mutant lacking the histone-like protein HU. FEMS Microbiol Lett. 150, 297-301.

205. O'Toole, G. A. & Kolter, R. (1998). Flagellar and twitching motility are necessary for Pseudomonas aeruginosa biofilm development. Mol. Microbiol. 30,295-304.

206. O'Toole, R., Milton, D. L. & Wolf-Watz, H. (1996). Chemotactic motility is required for invasion of the host by fish pathogen Vibrio anguillarum. Mol. Microbiol. 19, 625-637.

207. Ohnishi, I., Kutsukake, K., Suzuki, H. & lino, T. (1990). Gene fliA encodes an alternative sigma factor specific for flagellar operons in Salmonella typhimurium. Mol. Gen. Genet. 221,1139-1147.

208. Okazaki, N., Matsuo, S., Saito, K., Tominaga, A. & Enomoto, M. (1993). Conversion of the Salmonella phase 1 flagellin gene fliC to the phase 2 gene fljB on the Escherichia coli K-12 chromosome. J. Bacteriol. 175, 758-766.

209. Ormonde, P., Horstedt, P., O'Toole, R. & Milton, D. L. (2000). Role of motility in adherence to and invasion of a fish cell line by Vibrio anguillarum. J. Bacteriol. 182(8), 2326-2328.

210. Osuna, R., Lienau, D., Hughes, K. T. & Johnson, R. C. (1995). Sequence, regulation, and function offis in Salmonella typhimurium. J. Bacteriol. 177,2021-2032.

211. Ott, M., Messner, P., Hessemann, J., Marre, R. & Hacker, J. (1991). Temperature dependent expression of flagella in Legionella. J. Gen. Microbiol. 137,1955-1961.

212. Ottemann, K. M. & Miller, J. F. (1997). Roles for motility in bacteria-host interactions. Mol. Microbiol 24,1109-1117.

213. Owen-Hughes, T.A., Pavitt, G. D., Santos, D. S., Sidebotham, J. M., Hulton, C. S. J. & Hinton, J. C. D. et al (1992). The chromatin-associated protein H-NS interacts with curved DNA to influence DNA topology and gene expression. Cell 71, 255265.

214. Packer, H. L., Harrison, D. M., Dixon, R. M. & Armitage, J. P. (1994). The effect of pH on the growth and motility of Rhodobacter sphaeroides WS8 and the nature of the driving force of the flagellar motor. Biochim. Biophys. Acta 1188,101-107.

215. Park, S. F., Purdy, D. & Leach, S. (2000). Localized reversible frameshift mutation in the flhA gene confers phase variability to flagellin gene expression in Campylobacter coli. J. Bacteriol. 182,207-210.

216. Parkinson, G., Wilson, G., Gunasekera, A., Ebright, Y., Ebright, R. & Berman, H. (1996). Structure of the CAP-DNA complex at 2,5 A resolution. J. Mol Biol 260, 395-408.

217. Peel, M., Donachie, W. & Shaw, A. (1988). Physical and antigenic heterogeneity in the flagellins of Listeria monocytogenes and L. ivanovii. J. Gen. Microbiol 134, 25932598.

218. Perez-Martin, J., Rojo, F. & De Lorenzo, V. (1994). Promoters responsive to DNA bending: a common theme in prokaryotic gene expression. Microbiol Rev. 58, 268-290.

219. Pleier, E. & Schmitt, R. (1991). Expression of two Rhizobium meliloti flagellin genes and their contribution to the complex filament structure. /. Bacteriol 173, 20772085.

220. Poggio, S., Aguilar, C., Osorio, A., Gonzalez-Pedrajo, B., Dreyfus, G. & Camarena, L. (2000). Sigma-54 promoters control expression of genes encoding the hook and basal body complex in Rhodobacter sphaeroides. J. Bacteriol. 182, 5787-5792.

221. Pon, C. L., Calogero, R. A. & Gualerzi, C. O. (1988). Identification, cloning, nucleotide sequence and chromosomal map localisation of hns, the structural gene for Escherichia coli DNA-binding protein H-NS. Mol. Gen. Genet. 212,199-202.

222. Popham, D. L., Szeto, D., Keener, J. & Kustu, S. (1989). Function of a bacterial activator protein that binds to transcriptional enhancers. Science 243,629-635.

223. Porter, S. C., North, A. K. & Kustu, S. (1995). Mechanism of transcriptional activation by NTRC. In Two-component signal transduction (Hoch, J. A. & Silhavy, T. J., eds.), pp. 147-158. American Society for Microbiology Press, Washington, DC.

224. Pratt, L. A. & Kotler, R. (1998). Genetic analysis of Escherichia coli biofilm formation: roles of flagella, motility, chemotaxis and type I pili. Mol. Microbiol. 30,285-293.

225. Prosseda, Gv Fradiani, P. A., Di Lorenzo, M., Falconi, M., Micheli, G., Casalino, M., Nicoletti, M. & Colonna, B. (1998). A role for H-NS in the regulation of the virF gene of Shigella and enteroinvasive Escherichia coli. Res. Microbiol. 149,15-25.

226. Prouty, M. G., Correa, N. E. & Klose, K. E. (2001). The novel a54- and a28-dependent flagellar gene transcription hierarchy of Vibrio cholerae. Mol. Microbiol. 39, 15951609.

227. Pruss, B. (2000). FlhD, a transcriptional regulator in bacteria. Recent Res. Devel. Microbiology 4,31-42.

228. Pruss, B. M. (1998). Acetyl phosphate and the phosphorylation of OmpR are involved in the regulation of the cell division rate in Escherichia coli. Arch. Microbiol. 170, 141-146.

229. Pruss, B. M., Liu, X., Hendrickson, W. & Matsumura, P. (2001). FlhD/FlhC-regulated promoters analysed by gene array and lacZ gene fusions. FEMS Microbiol. Lett. 9854,1-7.

230. Pruss, B. M., Markovic, D. & Matsumura, P. (1997). The Escherichia coli flagellar transcriptional activator flhD regulates cell division through induction of the acid response gene cadA. J. Bacterid. 179,3818-3821.

231. Pruss, B. M. & Matsumura, P. (1996). A regulator of the flagellar regulon of Escherichia coli, flhD, also affects cell division. }. Bacteriol. 178,668-674.

232. Pruss, B. M. & Matsumura, P. (1997). Cell cycle regulation of flagellar genes. /. Bacteriol. 179,5602-5604.

233. Pruss, B. M. & Wolfe, A. J. (1994). Regulation of acetyl phosphate synthesis and degradation, and the control of flagellar expression in Escherichia coli. Mol. Microbiol. 12, 973-984.

234. Rashid, M. H. & Kornberg, A. (2000). Inorganic polyphosphate is needed for swimming, swarming, and twitching motilities of Pseudomonas aeruginosa. Proc. Natl Acad. Sci. USA 97(9), 4885-4890.

235. Recht, J., Martinez, A., Torello, S. & Kolter, R. (2000). Genetic analysis of sliding motility in Mycobacterium smegmatis. J. Bacteriol 182,4348-4351.

236. Reitzer, L. J. & Magasanik, B. (1986). Transcription of glnA in E. coli is stimulated by activator bound to sites far from the promoter. Cell 45, 785-792.

237. Richardson, K. (1991). Roles of motility and flagellar structure in pathogenicity of Vibrio cholerae : analysis of motility mutants in three animal models. Infect. Immun. 59,2727-2736.

238. Richet, E., Vidal-Ingigliardi, D. & Raibaud, O. (1991). A new mechanism for coactivation of transcription: repositioning of an activator triggered by the binding of a second activator. Cell 66,1185-1195.

239. Ritchings, B. W., Almira, E. C., Lory, S. & Ramphal, R. (1995). Cloning and phenotypic characterization of fleS and fleR, new response regulators of Pseudomonas aeruginosa which regulate motility and adhesion to mucin. Infect. Immun. 63,4868-4876.

240. Rohde, J. R, Fox, J. M. & Minnich, S. A. (1994). Thermoregulation in Yersinia enterocolitica is coincident with changes in DNA supercoiling. Mol. Microbiol. 12, 187-199.

241. Rohde, J. R., Luan, X. S., Rohde, H., Fox, J. M. & Minnich, S. A. (1999). The Yersinia enterocolitica pYV virulence plasmid contains multiple intrinsic DNA bends which melt at 37 degrees C. J. Bacterid. 181(14), 4198-4204.

242. Romeo, T. (1998). Global regulation by the small RNA-binding protein CsrA and the non-coding RNA molecule CsrB. Mol. Microbiol. 29,1321-1330.

243. Samatey, F., Imada, K., Nagashima, S., Vonderviszt, F., Kumasaka, T., Yamamoto, M. & Namba, K. (2001). Structure of the bacterial flagellar protofilament and implications for a switch for supercoiling. Nature 410, 331-337.

244. Schmiel, D. H., Young, G. M. & Miller, V. L. (2000). The Yersinia enterocolitica phospholipase gene yplA is part of the flagellar regulon. J. Bacteriol. 182, 23142320.

245. Schmitt, C. K., Darnell, S. C. & O'Brien, A. D. (1996). The attenuated phenotype of a Salmonella typhimurium flgM mutant is related to expression of FliC flagellin. J. Bacteriol. 178,2911-2915.

246. Schultz, S., Shields, G. & Steitz, T. (1991). Crystal structure of a CAP-DNA complex: the DNA is bent by 90 degrees. Science 253,1001-1007.

247. Sekimizu, K., Bramhill, D. & Kornberg, A. (1987). ATP activates dnaA protein in initiating replication of plasmids bearing the origin of the E. coli chromosome. Cell 50, 259-265.

248. Sekimizu, K., Yung, B. Y. & Kornberg, A. (1988). The dnaA protein of Escherichia coli. Abundance, improved purification, and membrane binding. J. Biol. Chem. 263, 7136-7140.

249. Shah, D. S. H., Perehinec, T., Stevens, S. M., Aizawa, S. & Sockett, R. E. (2000). The flagellar filament of Rhodobacter sphaeroides: pH-induced polymorphic transitions and analysis of the fliC gene. J. Bacteriol. 182(18), 5218-5224.

250. Shi, W., Bogdanov, M., Dowhan, W. & Zusman, D. R. (1993a). The pss and psd genes are required for motility and Chemotaxis in Escherichia coli. J. Bacteriol. 175, 77117714.

251. Shi, W., Li, C., Louise, C. & Adler, J. (1993b). Mechanism of adverse conditions causing lack of flagella in Escherichia coli. . Bacteriol. 175,2236-2240.

252. Shi, W., Zhou, Y., Wild, J., Adler, J. & Gross, C. A. (1992). DnaK, DnaJ, and GrpE are required for flagellum synthesis in Escherichia coli. J. Bacteriol. 174, 6256-6263.

253. Shiga, Y., Sekine, Y., Kano, Y. & Ohtsubo, E. (2001). Involvement of H-NS in transpositional recombination mediated by IS2. J. Bacteriol 183,2476-2484.

254. Shin, S. & Park, C. (1995). Modulation of flagellar expression in Escherichia coli by acetyl phosphate and the osmoregulator OmpR. J. Bacteriol 177,4696-4702.

255. Shindo, H„ Ohnuki, A., Ginba, H., Katoh, E., Ueguchi, C, Mizuno, T. & Yamazaki, T. (1999). Identification of the DNA binding surface of H-NS protein from Escherichia coli by heteronuclear NMR spectroscopy. FEBS Lett 455(1-2), 63-69.

256. Silverman, M. & Simon, M. (1974). Characterization of Escherichia coli flagellar mutants that are insensitive to catabolite repression. J. Bacteriol. 120,1196-1203.

257. Silverman, M. & Simon, M. (1977a). Identification of polypeptides necessary for Chemotaxis in Escherichia coli. J. Bacteriol. 130,1317-1325.

258. Silverman, M. & Simon, M. I. (1977b). Bacterial flagella. Annu. Rev. Microbiol. 31, 397419.

259. Sjoblad, R. D., Emala, C. W. & Doetsch, R. N. (1983). Bacterial flagellar sheaths: structures in search of a function. Cell Motil. 3,93-103.

260. Sonden, B. & Uhlin, B. E. (1996). Coordinated and differential expression of histone-like proteins in Escherichia coli : regulation and function of the H-NS analog StpA. EMBO J. 15,4970-4980.

261. Sourjik, V., Muschler, P., Scharf, B. & Schmitt, R. (2000). VisN and VisR are global regulators of Chemotaxis, flagellar, and motility genes in Sinorhizobium (Rhizobium) meliloti. J. Bacteriol. 182(3), 782-788.

262. Spassky, A., Rimsky, S., Garreau, H. & Buc, H. (1984). Hla, an E. coli DNA-binding protein which accumulates in stationary phase, strongly compacts DNA in vitro. Nucleic Acids Res. 12, 5321-5340.

263. Spohn, G. & Scarlato, V. (1999). Motility of Helicobacter pylori is coordinately regulated by the transcriptional activator FlgR, an NtrC homolog. J. Bacteriol. 181, 593-599.

264. Spurio, R., Falconi, M., Brandi, A., Pon, C. L. & Gualerzi, C. O. (1997). The oligomeric structure of nucleoid protein H-NS is necessary for recognition of intrinsically curved DNA and for DNA bending. EMBO J. 16,1795-1805.

265. Srivenugopal, K. S., Lockshon, D. & Morris, D. R. (1984). Escherichia coli DNA topoisomerase EI: purification and characterization of a new type 1 enzyme. Biochemistry 23,1899-1906.

266. Stader, J., Matsumura, P., Vacante, D., Dean, E. & Macnab, R. (1986). Nucleotide sequence of the Escherichia coli motB gene and site-limited incorporation of its product into cytoplasmic membrane. /. Bacteriol. 166,244-252.

267. Stanley, P. M. (1983). Factors affecting the irreversible attachment of Pseudomonas aeruginosa to stainless steel. Can. J. Microbiol. 29,1493-1499.

268. Stambach, M. N. & Lory, S. (1992). The fliA(rpoF) gene of Pseudomonas aeruginosa encodes an alternative sigma factor required for flagellin synthesis. Mol. Microbiol 6,459-469.

269. Stewart, B. J. & McCarter, L. L. (1996). Vibrio parahemolyticus FlaJ, a homologue of FliS, is required for production of a flagellin. Mol Microbiol 20,137-149.

270. Stim, K. P. & Bennett, G. N. (1993). Nucleotide sequence of the adi gene, which encodes the biodegradative acid-induced arginine decarboxylase of Escherichia coli. J. Bacteriol 175,1221-1234.

271. Stocker, B. A. D. & Campbell, J. C. (1959). The effect of non-lethal deflagellation on bacterial motility and observations on flagellar regeneration. /. Gen. Microbiol 20, 670.

272. Straney, D. C., Straney, S. B. & Crothers, D. M. (1989). Synergy between Escherichia coli CAP protein and RNA polymerase in the lac promoter open complex. /. Mol. Biol. 206, 41-57.

273. Strauss, E. J. (1995). Bacterial pathogenesis. When a turn off is a turn on. Curr. Biol. 5, 706-709.

274. Suzuki, T., Ueguchi, C. & Mizuno, T. (1996). H-NS regulates OmpF expression through micF antisense RNA in Escherichia coli. . Bacteriol. 178,3650-3653.

275. Tendeng, C., Badaut, C, Krin, E., Gounon, P., Ngo, S., Danchin, A., Rimske, S. & Bertin, P. (2000). Isolation and characterization of vicH, encoding a new pleiotropic regulator in Vibrio cholerae.}. Bacteriol 182(7), 2026-2032.

276. Thomas, N. A., Bardy, S. L. & Jarrell, K. F. (2001). The archaeal flagellum: a different kind of prokaryotic motility structure. FEMS Microbiol Rev. 25(2), 147-174.

277. Tippner, D., Afflerbach, H., Bradaczek, C. & Wagner, R. (1994). Evidence for a regulatory function of the histone-like Escherichia coli protein H-NS in ribosomal RNA synthesis. Mol. Microbiol 11, 589-604.

278. Tippner, D. & Wagner, R. (1995). Fluorescence analysis of the Escherichia coli transcription regulator H-NS reveals two distinguishable complexes dependent on binding to specific or non-specific DNA sites. /. Biol. Chem. 270,22243-22247.

279. Tobe, T., Yoshikawa, M., Mizuno, T. & Sasakawa, C. (1993). Transcriptional control of the invasion regulatory gene virB of Shigella flexneri: activation by VirF and repression by H-NS. /. Bacteriol. 175,6142-6149.

280. Toguchi, A., Siano, M., Burkart, M. & Harshey, R. M. (2000). Genetics of swarming motility in Salmonella enterica serovar Typhimurium: Critical role for lipopolysaccharide. J. Bacteriol. 182(22), 6308-6321.

281. Tomashow, L. S. & Rittenberg, S. C. (1985). Waveform analysis and structure of flagella and basal complexes from Bdellovibrio bacteriovorus 109J. /. Bacteriol. 163, 1038-1046.

282. Tominaga, A., Mahmoud, M. A., Mukaihara, T. & Enomoto, M. (1994). Molecular characterization of intact, but cryptic, flagellin genes in the genus Shigella. Mol. Microbiol. 12,277-285.

283. Tomuro, A., Ishikawa, T., Sagara, Y., Miki, T. & Sekimizu, K. (1993). Requirement of phosphatidylglycerol for flagellation of Escherichia coli. FEBS Lett. 329,287-290.

284. Totten, P. A., Lara, J. C. & Lory, S. (1990). The rpoN gene product of Pseudomonas aeruginosa is required for expression of diverse genes, including the flagellin gene. /. Bacteriol 172,389-396.

285. Totten, P. A. & Lory, S. (1990). Characterization of the type a flagellin gene from Pseudomonas aeruginosa PAK. f. Bacteriol 172,7188-7199.

286. Trachtenberg, S., DeRosier, D. J. & Macnab, R. M. (1987). Three dimensional structure of the complex flagellar filament of Rhizobium lupini and its relation to the structure of the plain filament. }. Mol Biol 195,603-609.

287. Tse-Dinh, Y. (1985). Regulation of the Escherichia coli DNA topoisomerase 1 gene by DNA supercoiling. Nucleic Acids Res. 13,4751-4763.

288. Tse-Dinh, Y. C., Qi, H. & Menzel, R. (1997). DNA supercoiling and bacterial adaptation: thermotolerance and thermoresistance. Trends Microbiol 5(8), 323326.

289. Tso, W.-W. & Adler, J. (1974). Negative Chemotaxis in Escherichia coli. J. Bacteriol. 118, 560-576.

290. Tupper, A. E., Owen-Hughes, T. A., Ussery, D. W., Santos, D. S., Ferguson, D. J. P., Sidebotham, J. M., Hinton, J. C. D. & Higgins, C. F. (1994). The chromatin-associated protein H-NS alters DNA topology in vitro. EMBO J. 13,258-268.

291. Turnbull, G. A., Morgan, J. A. W., Whipps, J. M. & Saunders, J. R. (2001). The role of motility in the in vitro attachment of Pseudomonas putida PaW8 to wheat roots. FEMS Microbiol Ecol. 35(1), 57-65.

292. Uegushi, C., Kakeda, M. & Mizuno, T. (1993). Autoregulatory expression of the Escherichia coli hns gene encoding a nucleoid protein: H-NS functions as a repressor of its own transcription. Mol. Gen. Genet. 236,171-178.

293. Uegushi, C. & Mizuno, T. (1993). The Escherichia coli nucleoid protein H-NS functions directly as a transcriptional repressor. EMBO J. 12,1039-1046.

294. Uegushi, C., Suzuki, T., Yoshida, T., Tanaka, K. & Mizuno, T. (1996). Systematic mutational analysis revealing the functional domain organization of Escherichia coli nucleoid protein H-NS. . Mol Biol 263,149-162.

295. Ushida, C. & Aiba, H. (1990). Helical phase dependent action of CRP: effect of the distance between the CRP site and the -35 region on promoter activity. Nucleic Acids Res. 18, 6325-6330.

296. Ussery, D. W., Higgins, C. F. & Bolshoy, A. (1999). Environmental unfluences on DNA curvature. . Biomol Struct Dyn 16,811-823.

297. Vogler, A. P. & Lengeier, J. W. (1987). Indirect role of adenylate cyclase and cyclic AMP in Chemotaxis to phosphotransferase system carbohydrates in Escherichia coli K-12. J. Bacterial. 169,593-599.

298. Wall, D. & Kaiser, D. (1999). Type IV pili and cell motility. Mol. Microbiol 32,1-10.

299. Wang, Q. P. & Kaguni, J. M. (1987). Transcriptional repression of the dnaA gene of Escherichia coli by dnaA protein. Mol. Gen. Genet. 209,518-525.

300. Watnick, P. I., Lauriano, C. M., Klose, K. E., Croal, L. & Kolter, R. (2001). The absence of a flagellum leads to altered colony morphology, biofilm development and virulence in Vibrio cholerae 0139. Mol. Microbiol 39(2), 223-235.

301. Wei, B. L., Brun-Zinkernagel, A.-M., B., Simecka, J. W., Pruss, B., Babitzke, P. & Romeo, T. (2001). Positive regulation of motility and flhDC expression by the RNA-binding protein CsrA of Escherichia coli. Mol Microbiol 40(1), 245-256.

302. Weibull, C. (1948). Some chemical and physico-chemical properties of the flagella of

303. Proteus vulgaris. Biochim. Biophys. Acta 2,351.

304. Weiss, A. A., Hewlett, E. L., Myers, G. A. & Falkow, S. (1983). Tn5-induced mutations affecting virulence factors of Bordetella pertussis. Infect. Immun. 42,33-41.

305. Weiss, D. S., Batut, J., Klose, K. E., Keener, J. & Kustu, S. (1991). The phosphorylated form of the enhancer-binding protein NTRC has an ATPase activity that is essential for activation of transcription. Cell 67,155-167.

306. Whitfield, C. & Roberts, I. S. (1999). Structure, assembly and regulation of expression of capsules in Escherichia coli. Mol Microbiol 31,1307-1319.

307. Williams, R. M. & Rimsky, S. (1997). Molecular aspects of the Escherichia coli nucleoid protein, H-NS: a central controller of gene regulatory networks. FEMS Microbiol. Lett. 156,175-185.

308. Williams, R. M., Rimsky, S. & Buc, H. (1996). Probing the structure, function, and interactions of the Escherichia coli H-NS and StpA proteins by using dominant negative derivatives. J. Bacteriol. 178,4335-4343.

309. Wilson, D. R. & Beveridge, T. J. (1993). Bacterial flagellar filaments and their component flagellins. Can. J. Microbiol. 39,451-472.

310. Wu, J. & Newton, A. (1997). Regulation of the Caulobacter flagellar gene hierarchy: not just for motility. Mol. Microbiol. 24,233-239.

311. Wyant, T. L., Tanner, M. K. & Sztein, M. B. (1999). Potent immunoregulatory effects of Salmonella typhi flagella on antigenic stimulation of human peripheral blood mononuclear cells. Infect. Immun. 67,1338-1346.

312. Yamada, H., Yoshida, T., Tanaka, K. I., Sasakawa, C. & Mizuno, T. (1991). Molecular analysis of the Escherichia coli hns gene encoding a DNA-binding protein, which preferentially recognizes curved DNA sequences. Mol. Gen. Genet. 230,332-336.

313. Yanagihara, S., Iyoda, S., Ohnishi, K., lino, T. & Kutsukake, K. (1999). Structure and transcriptional control of the flagellar master operon of Salmonella typhimurium. Genes Genet. Syst. 74,105-111.

314. Yasuzawa, K., Hayashi, N., Goshima, N., Kohno, K., Imamoto, F. & Kano, Y. (1992). Histone-like proteins are required for cell growth and constraint of supercoils in DNA. Gene 122, 9-15.

315. Yokota, T. & Gots, J. (1970). Requirement of adenosine 3',5'-cyclic monophosphate for flagellation in Escherichia coli and Salmonella typhimurium. J. Bacteriol. 103, 513-516.

316. Youderian, P. (1998). Bacterial motility: secretory secrets of gliding bacteria. Curr. Biol 8, R408-R411.

317. Young, G. M., Schmiel, D. H. & Miller, V. L. (1999a). A new pathway for the secretion of virulence factors by bacteria: the flagellar export apparatus functions as a protein-secretion system. Proc. Natl Acad. Sci. USA 96, 6456-6461.

318. Young, G. M., Smith, M. J., Minnich, S. A. & Miller, V. L. (1999b). The Yersinia enterocolitica motility master regulatory operon, flh.DC, is required for flagellar production, swimming motility, and swarming motility. }. Bacteriol 181, 28232833.

319. Zechiedrich, E. L., Khodursky, A. B., Bachellier, S., Schneider, R., Chen, D., Lilley, D. M. J. & Cozzarelli, N. R. (2000). Roles of topoisomerases in maintaining steady-state DNA supercoiling in Escherichia coli.}. Biol Chem. 275, 8103-8113.

320. Zhang, A., Rimsky, S., Reaban, M. E., Buc, H. & Belfort, M. (1996). Escherichia coli protein analogs StpA and H-NS: regulatory loops, similar and disparate effects on nucleic acid dynamics. EMBO /. 15,1340-1349.